CA2139665A1 - Clonage et expression du gene de l'enzyme malolactique de lactococcus lactis - Google Patents

Abstract

2139665 9426879 PCTABS00168 L'invention est relative à l'obtention d'un fragment d'ADN comprenant le gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, et au clonage et à l'expression de ce gène chez E. coli et chez des levures, en particulier des genres Saccharomyces et Schizosaccharomyces.

Description

213~6~
PCT~94/~S89 )W094/~879 CLON~GE ET EXPRESSION DU GENE DE L'~NZYME MALOLACTIQUE DE
LACTOCOCCUS LAC~IS.
La présente Invention est relative au clonage du gène de structure de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, à sa séquence nucléotidique complète et à la séquence protéique déduite, ainsi qu'à des fragments d'ADN portant la séquence codant pour ce gène.
Elle est relative également à l'expression de ce gène dans différents h8tes procaryotes ou eucaryotes, et en ~ 10 particulier dans Saccharomyces et Schizosaccharomyces.
¦ La fermentation malolactique, fermentation ! secondaire gui est observée au cours du processus de vinification en addition de la fermentation alcoolique réalisée par des levures, consiste en la dégradation par certaines bactéries lactiques de l'acide malique présent dans les vins, en acide lactique et CO2. Les espèces : bactériennes naturellement présentes dans la flore fermentaire et responsables de la fermentation : malolactique appartiennent aux genres Lactobacillus, Leuconostoc et Pediococcus.
. Cette réaction présente deux avantages ~; principaux :
- Elle conduit à une désacidification du vin par transformation d'un diacide (L-malate) en un monoacide (L-lactate), dont les conséquences sont ¦ avantageuses au niveau organoleptique, pour la majorité
I des vins rouges et certains vins blancs, - Elle permet la stabilisation microbiologique du vin, et donc une meilleure conservation, par utilisation d'un substrat fermentescible, ce qui empêche 1 des fermentations ultérieures par d'autres souches de microorganismes indésirables. Enfin la fermentation - malolactique peut avoir une; influence sur la ~ualité du vin au niveau aromatique.

wo94n~879 213 9 ~ ~ ~ PCTn~g4/00589 Cette réaction pose toutefois un certain nombre de problèmes, du fait de sa lenteur et de son caractère incontrôlable.
La fermentation malolactique ne se produit spontanément qu'à la fin du processus naturel de vini-fication ; en effet, le pH, la teneur en éthanol et la présence de S02 dans le vin ralentissent considérablement la croissance des bactéries lactiques naturellement présentes dans la masse fermentaire et responsables de la fermentation malolactique. Pour tenter d'accélérer cette fermentation, la techni~ue la plus couramment employée réside en l'adjonction au milieu fermentaire, d'un inoculat de bactéries lactiques.
Toutefois, cette technique ne résout pas toujours les problèmes d'implantation des bactéries lactigues, en raison de leur difficulté à s~adapter au milieu vin. D~autre part, l'introduction de bactéries lactiques revient à introduire, outre 1'enzyme malolacti~ue dont llactivite est recherchée, de nombreuses autres enzymes, dont l'action sur les-nombreux substrats présents dans le vin, peut aboutir à une évolution très difficilement contrôlable des qualités organoleptiques du produit.
Il serait donc souhaitable d'avoir la possibi-lité de mettre en oeuvre la fermentation malolactique defaçon à aboutir rapidement, et en éliminant des variables incontrôlables, à une amélioration du produit obtenu.
Dans le but de mieux contrôler la fermentation malolactique, `il a été proposé de cloner les gènes des enzymes malolactiques des bactéries lactiques, de les -i introduire et exprimer dans un microorganisme normalement impligué dans la fabrication du vin, tel que S. Cere~isiae.
WILLIAMS et al. ~App. Environ. Microbiol. 47 :
288-293 (1984)], ainsi que la Demande Européenne 103300 décrivent le clona~e d'un fragment d'ADN de 5 kb portant ~l Wog4~6879 21 3 9 S ~ ~ PCT~R~l/~589 le gène de 1'enzyme malolactique de L. delbruec~ii chez S. Cerevisiae et chez E. coli.
Le gène de l'enzyme malolactique de L. oenos a également été cloné chez E. Coli ~LAUTEN~CH et al., Microbiol., 39 : 29-39 (1984)].
Toutefois, les souches de microorganismes transformés n'expriment le gène qu'à un taux très faible, insuffisant pour permettre son utilisation dans la fabri-cation du vin.
En outre dans les 2 cas, une instabilité de 1'ADN cloné chez E. Coli a été observée, allant même jusqu'à entralner une perte complète du gène.
D'autre part une enzyme malolactique, présentant une a~tivité d'un niveau comparable à celle de l~enzyme malolactique des bactéries des genres Leuconostoc, Pediococcus et Lact~acillus mentionnés plus _ haut a récemment été purifiée à partir de Lactococcus lactis. C'est une protéine d'environ 230 kDa, i constituée de sous-unités d'environ 56 kDa. Son pHi est d'environ 4,3, et son Km pour l'acide malique est d'environ 10 à 12 mM. Sa séquence N-terminale a également été déterminée ~RENAULT, Malolactic fermentation Genetics and Genetic Engineering, GrM90, 6th International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms, Strasbourg (1990)].
A partir d'une préparation purifiée de cette enzyme mal~lactique, les Inventeurs ont obtenu des préparations d'anticorps polyclonaux spécifiquement dirigés contre cette enzyme. Une banque d'ADN de Lactococcus lactis a ensuite été réalisée dans le ~ecteur ~gtll, dans E. coli. Le criblage de cette banque avec les anticorps obtenus a permis de cloner des fragments d'AD~, qui représentent à eux tous 4.5 kb d'une même région d'ADN génomique de Lactococcus lactis, contenant le gène malolactique, et un fragment du gène de la malate perméase, ces gènes étant organisés en opéron. Les W094/26879 PCT~V4/~589 .-~

Inventeurs ont identifié un fragment d'ADN de 26~4 p~
incluant la totalité du gène de l'enzyme malolacti~ue, et ont déterminé la séguence de ce fragment, ~ui est représentée dans la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ.ID.NO.1. En outre, 1'expression du gène malolactique a été obtenue dans différents hôtes, procaryotes et eucaryotes. Ainsi, 1'introduction du gène malolactique de Lactococcus lactis dans E. coli, sous contrôle de ses propres éléments de régulation ainsi que - 10 1'expression dudit gène dans la le w re sous contrôle d'éléments de régulation de levure font été réalisées.
La présente Invention a pour objet un fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence du gene de 1'enzyme malolactique de Lactococcus 15 lactis.
¦ Par "séquence du gène de 1'enzy~e malolactique de Lactococcus lactis" on entend en particulier la ~ séquence codante siétendant des nucléotides 466 à 2085 I (inclus) de la séquence SEQ. ID. NO 1 représentée dans la liste des séquences en annexe, ainsi gue toute séquence gui, compte tenu de la dégénérescence du code genétique, code pour le même po~ypeptide ; cette définition comprend I également les séguences portant des modifications ¦ mineures destinées à permettre une meilleure expression du gène dans un hôte déterminé.
L~Invention englobe également des fragments d'acide nucléique comprenant une séquence homologue ou complémentaire de la séquence du gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, telle que définie ci-30 dessus, ou d'un fragment d'au moins 10-mères, ~, préférentiellement au moins 20-mères, de ladite séquence, et utilisables en particulier comme sondes pour la localisation dudit gène et/ou comme amorces pour son : amplification.
L'Invention a également pour objet des cassettes d'expression, comprenant la sé~uence du gène de ~ W094/26879 21~ 9 6 ~ 5 PCTn~V4/~89 1~enzyme malolactique de Lactococcus lactis, sous contrôle de séquences propres à réguler l'expression dudit gène.
Par "sé~uences régulant 1'expression d'un - 5 gène" on entend des séguences de typ,e promoteur et termi-nateur actives chez l'hôte dans le~uel on souhaite obtenir l'expression dudit gêne. Les promoteurs et terminateurs de différents gènes peuvent être utilisés, associés dans des comk,inaisons différentes.
Parmi les sé~uences utilisables pour obtenir l'expression dans la levure du gène de l'enzyme malolactique de Lactococcus lac~is, on citera, à titre d'exemple non limitatif, les promoteurs et terminateurs, connus en eux-mêmes, des gènes de 1'alcool-deshydrogénase I (ArHI)~ de la phosphoglycérate kinase (PGK), et de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase - (GAPDH).
Les cassettes d'expression conformes à
1'invention peuvent 8tre portées par des plasmides, ou intégrées dans l'ADN chromosomi~ue de la levure'hôte.
L'Invention a égal~ment pour objet des vec-teurs recombinants caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un fragment d'ADN comportant la sé~uence du gène de 1'enzyme malolactique de Lactccoccus lactis, tel que défini ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, lesdits vecteurs sont des vecteurs d'expression, comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, lesdits vecteurs comprennent des séquences de régulation actives dans la levure.
Avantageusement, les vecteurs conformes à
l'Invention sont des vecteurs navette, possédant égale-ment une origine de réplication bactérienne et un mar-W094/26879 PCT~41~589 ~~
.~13~6~
queur de sélection dans une bactérie (par exemple, gène de résistance à un antibiotique).
Ces vecteurs pourxont être sélectionnés sur la base de la nature et de la force des éléments régulateurs qui entrent dans la cassette d'expression. On peut choi-sir les promoteurs et terminateurs décrits plus haut, ou toute autre séquence permettant de contrôler et de réguler 1'expression d'un gène dans la lew re.
Un autre critère du choix des vecteurs réside dans le nombre de copies de ceux-ci, qui est conditionné
par le choix de l'origine de réplication.
A titre d'exemple, un choix peut être fait entre les vecteurs suivants :
. Vecteur réplicatif ~Y~p) à haut nombre de copies, possédant comme origine de réplication dans la levure une partie du plasmide 2~ endogène.
- - . Vecteur réplicatif tYRp) à haut nombre de copies, possédant comme ori~ine de réplication une sé-quence ARS chromosomique.
: 20 . Vecteur réplicatif (YLp) linéaire à haut nombre de copies possédant des séguences télomérigues comme origine de réplication.
. Vecteur réplicatif (YCp) à bas nombre de copies, possédant une séguence ARS chromosomique et une séquence centromérique.
Préférentiellement, les vecteurs conformes à
l'Invention comportent également des marqueurs de sélec-tion dans la levure, tels gue des marqueurs d'auxotrophie : URA3, LEU2, HIS3, TRPl, ADE, etc ...et/ou des marqueurs de résistance à des antibiotigues (G418, hygromycine B, chloramphénicol, phléomycine), à des herbicides (sulfométuron methyl), au cuivre, etc...
Des vecteurs conformes à l'Invention, portant le gène codant pour l'enzy~.e malolactique de Lactococcus 35 lactis peuvent atre introduits dans toutes souches de le w re, par différentes techniques de transformation.

-~ wOg4/26879 213 9 ~ 6 5 PCT~4/~589 , Parmi les techni~ues de transformation les plus courantes utilisables on citera la techni~ue des protoplastes, la technique de perméabilisation aux sels de lithium et l~éle~troporation.
5Dans tous les cas, le procédé de cette construction comprend les étapes suivantes :
- construct~.on d'une cassette d'expression comprenant le gène de l'enzyme malolacti~ue et des élements régulateurs de force variable i 10- introduction de cette cassette soit en mono-copie, soit en multicopie dans la levure.
On peut également choisir d'intégrer le gène de l'enzyme malolactigue de Lactococcus lactis, muni de ses séquences de contrBle, dans le génome de la levure, auquel cas on choisira par exemple un vecteur intégratif (YIp) ne possédant pas d'origine de rép~ication dans la - levure ; il est également possible d'intégrer ce gène en utilisant d'autres te~hni~ues, par exemple la co-transformation.
20Il est possible de moduler le taux d'expres-sion du gène codant pour l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, en jouant notamment sur le nombre de copies du gene introduites dans la levure, et/ou sur la force des éleme~ts de régulation qui y sont associés.

2~La présente Invention a é~alement pour objet des souches de cellules eucaryotes ou procaryotes transformées, caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un fragment d'ADN hétérologue portant au moins une copie d'un gène codant pour l'enzyme malolactique de 30 Lactococcus lactis, sous contrôle de séquences régulant 1'expression dudit gène dans ladite cellule.
Selon un mode de réalisaSion préféré de la présente Invention, lesdites cellules sont des cellules de levure.
35Les souches de lew re conformes à l'invention ~rouvent de nombreuses applications dans l'agro-alimen-W094/26879 2 1~ 9 6 6 5 pcTn~94l~s89 taire et en particulier dans le domaine de l'oenologie pour accomplir la fermentation malolactique.
Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, lesdites levures appartiennent au genre Saccharomyces.
Selon une autre disposition préférée de ce mode de réalisation, lesdites levures appartiennent au genre Schizosaccharomyces.
Schizosaccharomyces est parfois utilisée en oenologie pour sa capacité à dégrader le malate.
Cependant, son utilisation est limitée, car cette dégradation qui est effectuée par la voie de l'enzyme malique ne produit pas de lactate, mais de l'éthanol et du CO2, ce qui entraîne une désacidification importante, pouvant avoir des influences négatives sur les caractéristiqùes du vin.
Des souches de Schizosacch~romyces obtenues conf~onme'm#nt ~à l'Invention et~ exprimant le gène de enzyme malolactique, réalisent la fermentation 20 ~malolactique~ avec dégradation du L-malate en L-lactate, S~ et~ présentent ainsi l~avantage de permettre une dés~cidificat~ion beaucoup moins importante que celle qui résulte de la conversion malate/~thanol.
?~ Ces souches de Schizosacch~romyces peuvent 2~ avoir~ de~ nombreuses~ utilisations en oenologie ; elles peûvent~être par exemple utilisées .
en co-culture avec une souche oenologique de Saccharomyces cerevisiae ;
- en cellules fixées.
~- 30 ~a présente Invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples décrivant le clonage du gène de 1'enzyme malolactigue de Lactococcus lactis et son expression dans des bactéries et des levures.
, ~ .
,~

, W094t26879 21 ~ 9 5 6 5 PCT~34/~89 . - M~tho~e~_ ; L'enzyme malolactique a été puri~iée comme décrit par RENAULT (1990, communication précitee) ; cf.
aussi C. ROULLAND, (DEA d'oenologie-ampélologie, 5 Septembre 1988, Université de Bordeaux II) Les techniques générales de manipulation des acides nucléiques et de clonage moléculaire auquelles il est fait référence dans les exemples ~ui sui~ent sont celles décrites par SAMBROOK et al.[ Molécular Cloning :
A Laboratory Nanual (second edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (1989)~
EXEMPLE 1 - P~RIFICATION DE ~N~YX~LMA~U~ IO~E
Le protocole d~extraction est brièvement rappele ci-après :
Sou~e - ~ond~tiona de ~ ur~
Lactococcus lac~is ~ IL 1441) est cultivé dans -- le milieu suivant :
Extrait de levure 6 g Tryptone 2 g 20 Glucose 15 g Acide DL Maligue 15 g K2HPO4 0~5 g KH2P04 0,5 g MgSO4 0,4 g 25 NaCl 0,02 g FeSO4 0'004 g MnSO4 0,02 g H2O qsp 1 1 Le pH est ajusté à 5%. Le milieu stérile est inoculé avec 10% (v/v) d'une pr~culture.
- Pr~arat~on ~'u~nK~ra~t brut ot do~a~es Les cellules sont cultivées dans 3 litxes du milieu ci-dessus à 28 C, pendant 24 heures, récoltées par centrifugation à 1000 g pena~nt 10 mn à 4'C, et lavées 2 fois avec NaCl 0,9~.
-WOg4/26879 ; PCTn~94l~589 ~' 2139S~
Le culot est repris dans 30 ml de tamponphosphate (0,1 M, pH 6,0). Les cellules sont broyées aux ultrasons pendant 6 mn à 0C. Après centrifugation (30 000g, 15 mn, à 4 C) le surnageant constitue l'extrait brut.
Les protéines sont dosées par le BCA Protein Assay Reagent (PIERCE).
L~acti~ité malolactique est mesurée par la décarboxylation de l'acide malique suivie avec une électrode à C02 (EISCHWEILER).
- Purif$cation de l'enz~me Après traitement par la DNAse I (1 mg/ml et 15 mn d'incubation à température ambiantej, l'extrait brut est soumis à une précipitation fractionnée au sulfate d~ammonium (35% de saturation, puis 70%).
- Le surnageant de la précipitation à 70% n'a pas~ d'activité. Le culot, repris dans 2 ml de tampon phosphate 0,1 M pH 6,0, et ~ui contient toute l'activité
malolactique est déposé sur une colonne de filtration sur gel ACA 34 ~ULTROGEL ; domaine de fractionnement de 20 000 à 350 000) de 40 cm de longueur et 2,6 cm de diamètre, préalablement équilibrée par le tampon d'élution : tampon phosphate O,01 N, pH 6,0, KCl 0,1 M.
L~élution est effectuée avec un débit de 18 ml/h. Le volume des fractions collectées est de 2,4 ml.
Dans ces conditions les fractions les plus actives correspondent aux fractions 50 à 54. Elles sont rassemblées en vue dlune purification complémentaire par électrofocalisation.
L'électrofocalisation est réalisée sur colonne LKB de 110 ml. Le gradient de pH est formé grâce aux ampholines utilisées à 2% et stabilisé par un gradient de densité de glycérol établi lors du remplissage de la colonne. La fraction la plus active qui focalise au pH de 4,3, pHi de la protéine, est récupérée, puis subit une étape supplémentaire de purification par chromatographie :~ W094126879 ~13 9 6 ~ 5 PCTn~941~589 d'échange d'ions (colonne échangeuse d'anions SEPHAROSE Q, PHARNACIA).
L~élution est ef~ectuee par un gradient de 0 à
0,5 M NaCl, dans un tampon Tris-Hcl 50 mM, pH 7,6, EDTA
0,l mM, ~-mercaptoéthanol 1 mM .
La fraction renfermant l'acti~ité malolacti~ue est éluée à une concentration en NaCl de 0,33 M. C'est cette fraction qui est utilisée pour l'obtention d'anticorps.
10 EXE~lPI.E 2 : OBTE~I.QN D ' *~TICOR~ POI~O~C DIRIGE:S
CONTR~S Il ' E:NZY~ ~AI.OI~C~TIQl~E D~S ~A~OCOCC~S l ACq~IS
Les anticorps ont été obtenus par injection à
deux lapins d~une partie de la préparation purifiée de protéine malolactigue selon le protocole suivant :
- Injection sous-cutanée de 2 ml de solution de protéine malolactique (l00 ~g dans tampon NaCl 0,3 M) additionnés de 2 ml d'adjuvant de Freund complet.
- Deuxième injection 40 jours après, avec la même quantité de protéine malolactique et 2 ml d'adjuvant de Freund incomplet.
Le sang des deux lapins est récupé~é 12 jours après la 2ème injection, laissé 24 h à 4-C pour permettre la coagulation, centrifugé à l0 000 g pendant 10 mn à 4 , et le sérum récupéré est aliquoté et stocké à -20'C.
Les anticorps anti-enzyme malolactique ont ensuite été testés par test ELISA réalisé sur les deux sérums (appelés 120 et ll9) obtenus à partir du sérum des lapins selon le protocole décrit par SANBROOK et al.[(1989)]. Cette analyse a permis de déterminer gue la dilution optimale pour 1'utilisation des anticorps était de l/lOOOème.
La spécificité des anticorps a alors été
déterminée par transfert immunoélectrophorétique ~Western blot).
Les protéines d'un extrait brut de r actococcus lactis (préparé comme décrit à l'Exemple l) d'une part, , -- = ,,,, ., . , ... . . .. . , ~ .

W094t2687~ 213 9 ~ ~ ~ pcTn~s4l~89 ~

et de la préparation purifiée d'enzyme malolactique d'autre part, ont été séparées par électrophorèse SDS-P~GE et transférées sur membrane de nitrocellulose.
Les anticorps polyclonaux obtenus sont alors fixés sur la membrane et revélés par des anticorps anti-lapin couplés à la phosphatase alcaline.
Le sérum 120 reconnait sur l'extrait brut et sur la fraction purifiée, une bande ma~oritaire de poids moléculaire environ 60kD correspondant à l'enzyme malolactique, et plusieurs bandes contaminantes de poids moléculaire inférieur.
En revanche, le sérum 119 reconnait sur la fraction purifiée, comme sur l'extrait brut, une seule bande, correspondant à l'enzyme malolactique ; ce sérum très spécifique a donc été utilisé pour les expériences ultérieures.
E$EMPLæ 3 : CONS~R~rION D~ na~ggE ~'E~ S~IO~ D'ADN
GENO~IO~E DE ~TQ ÇO~C~S ~aC~IS Da~ ~. COI I
a) Extra~tion ~ l'ADN ~o ~actococcus ~CtiB
La banque d'ADN génomique de Lactococcus lactis a été réalisée dans le vecteur Agtll.
L'ADN gé~omique de Lactococcus lactis IL 1441 ¦ a, dans un premier temps, été extrait et purifié. Pour ¦ cela, 500 ml d'une culture en phase exponentielle sont ¦ 25 centrifugés à 5000g pendant 10 mn. Le culot est repris dans 5 ml de TE (Tris 10 mM EDTA 1 mM pH 8) contenant 150 mM de NaCl et 1 mg/ml de lysozyme, et incubé lQ ~in à
37 C. 1 ml de SDS, 25% dans de l'EDTA, 0,1 M pH 8 sont ajoutés et le mélange est incubé 15 min à 60'C. L'ADN est purifié par deux extractions au ph~nol-chloroforme, suivies de deux autres au chloroforme-alcool isoamylique (24:1). Une purification finale est réalisée sur gradient de chlorure de césium en présence de bromure d'éthidium.
Le bromure d~éthidium est extrait à l'alcool isoamylique.
Après dilution par 2 volumes d'eau, l'ADN est précipité
par 6 volumes d'éthanol. Le précipité est récupéré à la w094l26879 213 9 6 3 5 PCT~4l00589 baguette et dissous dans 1 ml de TE. ~a concentration de l~ADN en solution a été déterminee (1 ~g/~l) par mesure de la DO à 260 nm.
~) Di~Q~ion ~ 1 ~ çtococ~u~ t~
125 ~g d'ADN de Lactococcus lactis sont digérés partiellement par deux unités d'enzyme AluI et deux unités de aeIII pendt~nt 35 min. à 37-C de maniere à
générer des extrémités à bouts francs. La digestion est arrêtée par addition d'EDT~ à 0,1 M final.
L~ADN digéré est précipité par 1/20 vol d'acétate de sodium 3 M et 2 volumes d'éthanol. Après centrifugation, l'ADN est repris dans 300 ~l de TE et les fragments séparés sur gradient de sucrose pendant 15 heures à 25000 rpm.
i5 Des fractions de 0,S ml sont récoltées et analysées sur gel d'agarose 0,8%. La fraction contenant - des fragments de 1,5 et 4 Kb est dialysée contre du TE
pendant 4 heures.
c) ti~atio~ ~ l'AD~ a~q~r~ au_v~eur ~g1 ~0 Le vecteur ~gtll ~dérivé du bactériophage ~) a été choisi pour réaliser la ban~ue d'expression. Le principe de réalisation de la banque consiste à insérer des fragments d'ADN dtans la région 3' de la phase codante du gène de la ~-galactosidase, de façon à exprimer des protéines hybrides sous contr81e du promoteur de la ~-galactosidase.
Un kit de clonage dans ~gtII ~AMERSHAN), a été
utilisé selon le protocole preconisé par le fournisseur.
1 ~g d'ADN digéré (à bouts francs) et dialysé
comme décrit ci-dessus a été inséré dans le vecteur ~gtll selon le principe suivant :
L'ADN est ligué à des adaptateurs déphosphorylés possédant une extrémité à bout franc et une autre extremité cohésive EÇQRI. Après élimination des ad~ptateurs libres par purification sur colonne d'exclusion, les fragments d'ADN ''adaptésll sont W094l26879 213 9 6 S 3 PcTn~g4t~s89 phosphorylés et ligués aux bras du vecteur également digérés par EcoR1 et déphosphorylés.
L'empaquetage in vitro des particules phagiques est ensuite réalisé. La banque ainsi obtenue a été titrée par infection de la souche bactérienne E. coli 1090 ~hSd (r~km+k~ lac U169, ProA+, lon~, araD139, StrA, SupF, trpC22 : TnlO(pMC9)] par une fraction aliquote de ~ la suspension phagique, et les transformants sélectionnés j sur milieu LB (bactotryptone 10 g/l, extrait de levure ¦ 10 5 g/l, NaCl 10 g/l) + ampicilline (5~ ~g/ml) à 43 C (pour ! induire la lyse bactérienne). Les plages de lyse sont obtenues après 4h d~incubation.
La ban~ue ainsi obtenue représente environ 3 fois le génome de Lactococcus lactis .
EXEMP1E 4 : CR~BL~GE DE LA BANO~E D'ADN GENOMI~Y~
a) Etaleme~t~ LL ~ L Dr~ ation de~
filtres 75000 plages de lyse ont été obtenues par étalement de la banque sur milieu LB+ ampicilline + MgC12 et incubation 3h30 à 43-C ~conditions de non-expression).
- Les boîtes sont recouvertes de filtres de nitrocellulose (C extra, AMERSHAMt, imprégnés d'IPTG 10 mM et incubées pendant 4 h à 37 C, de manière à induire l'expression.
Les filtres sont rincés dans du TNT ~Tris-HCl 10 mM pH 8, NaCl 150 mM, Tween 20 0,05~), puis incubés avec légère agitation 30 min à température ambiante dans le même tampon.
Afin de limiter la détection de clones "faux positifs" pouvant hybrider de manière non spécifique lors ~30 du criblage de la banque, une deuxième serie de filtres, -iconstituant des doubles de la première serie, ont été
:déposés sur les boîtes, incubés et traités de la même fa~on.
b? ~ ~ment ~u B~Um 112 Le criblage immunologique de la bangue est réalisé à l'aide du sérum 119 préalablement épuisé contre WO 94126B79 2 i 3 ~ 6 ~ 5 PCT/FRg4l0058g j;, les protéines de E. coli . L~épuisement du sérum est effectué comme suit :
Une culture de E. coli Y1090 est réalisée dans 100 ml de LB + ampicilline pendant 24h à 37-C. La culture est centrifugée à 5000 g pendant 10 min à 4 C. Le culot est repris dans 3 ml de tampon (Tris 50 mM EDTA 10 ~M pH
8), et la suspension congelée à -20 C et décongelée (plusieurs fois). Les cellules sont lysées complètement par sonication à O C (six fois 20 secondes), puis centrifugées à 12000 g pendant 10 min à 4 C. Le lysat est récupéré et incubé 4h à température ambiante en présence de 1 ml d~anticorps 119 dilué au 1/10 dans du tampon TNT
+ 1~ gélatine + 3% BSA + 5~ lait écrémé en poudre.
Le sérum épuisé est stocké à 4 C en présence d~azide de sodium (0,05%).
,c) Criblaao immunQ}Q~ig~e ~e 1~ banQue -Les filtres de nitrocellulose sont alors inc-~bés en présence du sérum 119 épuisé comme décrit ci-¦dessus, et la r~vélation des anticorps fixés est réalisée ¦~20 à l'aide d~anticorps anti-lapin couplés à la phosphatase alcaline, comme d~crit precédemment.
Seuls les clones montrant un signal positif ¦sur les deux filtres ont été pris en considération. 24 clones positifs ont ainsi ~té sélectionnés.
25Afin de ~érifier la spécificité du signal : obtenu, les clones positifs ont été sous-clonés et une deuxième détection à l'aide des anticorps a été réalisée.
Autour de chaque plage de lyse positi~e, une carotte d~agarose est prélevée et incubée dans 500 ~1 de tampon 30SM ~NaCl 6 g/l, MgS04 7H20 2 g/l, Tris base 6 g/l, gélatine 0,01 ~ pH 7,5), pendant 2 heures à 4-C afin de permettre la diffusion des particules phagiques. Cette suspension est de nouveau utilisée pour infecter E. coli 1090 et le mélange étalé sur boîte LB + ampicilline +
MgCl2 comme précédemment, de façon à obtenir des plages de lyses très isolées. Un deuxième criblage par le sérum W094/26879 - ' - ' PCTn~94/~589 -!
2139~

119 réalisé comme pré~édemment a permis d'éliminer 14 clones sur les 24 testés, qui ne présentaient plus de signaux significatifs. Les 10 autres clones, très nettement positifs ont été sélectionnés.
d) Caractérisation d~ clone~ recombinant~
L'ADN phagique des 10 clones positifs a été
extrait et analysé. Une plage de lyse positive bien isolée (sous-clone) a été systématiquement utilisée comme matériel de départ.
L'ADN est extrait à partir des plages de lyse confluantes sur boîtes LB + ampicilline. Les boîtes sont recouvertes de 5 ml de tampon SM et agitées à 4-C pendant 2 heures. La suspension est récupérée, additionnée de quelques gouttes de chloroforme, et centrifugée à 4000 g ¦ 15 pendant 10 min à 4 C pour éliminer les débris bactériens.
I L'ADN est extrait à partir de la suspension phagique ainsi purifiée.
-;La première analyse a consisté à amplifier par PCR les inserts portés par les phages recombinants pour en déterminer la taille.
Deux oligonucléotides ~lambda gtll Primer (forward) 24-NER et lambda gtll Primer (reverse) 24-MER, j Société BIOLABS] correspondant à des séquences de la ¦ ~-galactosidase entourant le site de clonage E~RI ont ¦ 25 été utilisés comme amorces dlamplification des inserts.
¦ L~analyse des produits d~amplification sur gel d'agarose (1,6%) a permis de déterminer gue les 10 clones ~gtll sélectionnés avaient des inserts de taille comprise entre 2 et 3,5 kb.
Afin d'établir la carte de restriction des fragments d'ADN clonés, les inserts des vecteurs ~gtll ont été sous-clonés dans le plasmide pUC18 [YANISH-PERRON
et al. Gene n- 33, p. 103-119, (1985)]. Le sous-clonage de 6 inserts a ainsi pu être obtenu.
La carte de restriction des 6 inserts a été
réalisée ; 5 des 6 inserts présentent une région commune, ` W094/26879 213 9 6 ~ 5 PCT~94/~589 suggérant que ces 5 inserts proviennent d'un même fragment génomique. Ceci a été vérifié par hybridation de - Southern de fragments de restriction d'ADN génomique de Lactococcus lactis séparés sur gel d'agarose et - 5 ~ransférés sur membrane de Nylon, avec les inserts marqués radioactivement au 32p Les cartes de restriction de 4 de ces 5 inserts sont représentées à la figure 1.
Les tailles des inserts représentés sont de 3 kb, 2,7 kb, 2 kb, et 3 kb. Ces inserts se chevauchant, la taille totale de la région clonée est de 4,5 kb.
- Le 6ème clone, qui présente un insert ayant une carte de restriction sans aucune similitude avec celle des 5 autres clones, provient d'un fragment d'ADN
génomique différent.
Afin de déterminer si l'un des deux types de - fragments d'ADN clonés contenait la région 5' du gène codant pour l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis, une hybridation de Southern des inserts séparés sur gel d'agarose et transférés sur membrane de nylon, avec une sonde d'oligonucléotides dérivés de la séquence protéique de 1'extrémité NH2 terminale de l'enzyme malolactique (P.
RENAULT, communication précitée) a été réalisée. La sonde choisie est un mélange d'oligonucléotides déduits de la séquence incluant les 6 premiers acides aminés :
ATG~A,C)G(G,A,T,C)GC(G,A,T,C)CA(T,C)GA(G,A)AT
Les 5 inserts provenant d'un même fragment d'ADN hybrident avec la sonde ; ce qui prouve que 1'extrémité 5' du gène codant pour l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis est contenue dans les 5 inserts clonés. Par contre, aucune hybridation n'a été détectée sur le 6ème clone.
e) ~ouence du clone P153A
La sé~uence nuciléotidique d'un des 5 clones P153A présentant un insert de 2,7 kb a été déterminée par la méthode de didéoxiterminaison sur un séquenceur .

W094/26879 PCT~4/~589 -l 213~S5 Applied Biosystem. La séquence totale de l~insert est représentée en annexe, sous le numéro d'identification SEQ ID NO 1, ainsi que la séquence en acides aminés qui en est déduite. La région codante du gène malolactique est de 1620 nucléotides. Les 20 premiers acides aminés déduits de la séquence nucléotidique obtenue sont identiques à la séquence protéique déterminée à partir de l'enzyme purifiée, à l'exception du 14ème acide aminé
(lysine au lieu de cystéine déterminée à partir de l'enzyme purifiée). Cette phase ouverte de lecture est susceptible de coder pour une protéine de 53 kD, ce qui est tout à fait compatible avec la taille de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis estimée par gel filtration et par électrophorèse SDS-PAGE (environ 60kD).
15La séquence SEQ ID NO 1 comprend en outre 465 nucléotides en amont du codon d'initiation de la traduction. Cette séquence comprend llintégralité du promoteur du gène de l'enzyme malolactique. Les ! promoteurs de Lactococcus lac~is ont une taille de ¦ 20 l~ordre de 150 nucléotides en amont du codon d'initiation. De plus, les signaux caractéristiques , d~initiation de transcription des gènes de Lactococcus ¦ lactis sont présents.
En aval de la phase ouverte de lecture, 596 nucléotides ont éte séquencés, et une autre phase ouverte de lecture de 581 nucléotides a été mise en évidence en

3 ' du gène malolactique dans un autre cadre de lecture.
La recherche d'homologies avec les gènes ou - protéines connues a été réalisée par comparaison de la 3 0 séquence nucleotidique SEQ ID NO 1, et des séquences - protéiques déduites avec des bases de données.
- En ce qui concerne la phase ouverte de lecture de 1620 nucléotides, des conservations très importantes en acides aminés et en nucléotides ont été
35 mises en évidence avec différentes enzymes maliques, responsables de la décarboxylation du malate en pyruvate.

) W094/26879 213 ~ ~ 6 5 PCT~94/~89 D~autre part, une séguence consensus de liaison du NAD a été retrouvée.
Ces homologies sont parfaitement en accord avec la fonction de 1'enzyme malolactique, qui utilise, comme l'enzyme malique, le malate comme substrat, et exige du NAD pour la transformation du substrat en lactate.
- En ce qui concerne le début de phase de lecture identifiée en aval du gène malolactique, des homologies en acides amines, également importantes (de l'ordre de 40%) ont été identifiées avec des citrate perméases. Il para~t extr^emement probable que cette phase ouverte de lecture puisse correspondre à la région 5 d~une malate perméase.
- 15 Il apparaît donc gue sont presents sur le fragment d~ADN séquencé le gène de structure codant pour -- 1'enzyme malolactique, et une partie du gène de la ma}ate perméase, et que ces gènes sont organisés en opéron.
~EMP~E 5 : E~R~SION D~ G~EE NAL~ 9: L 9l~ E. ~O~I
~'expression du gène malolactique a été
étudiée chez E. coli, chez diff~rents tranfoxmants de la souche bactérienne ~H5a: pl53A (clone séquencé), p5A, pl91A (voir cartes de restriction, Figure 1).~
Les transformants ainsi que la souche témoin ~5a transfolLl-ée par pUC18, ont été ensemencés dans une gamme de milieux de culture à concentration croissante en malate : 3 ml de milieu M9 (Na2HP04,7H20 6g/1, KH2PO4 3g/1, NaCl 0,5g/l, NH4Cl lg/l, glucose 4g/l), additionné
de thiamine lmg/l, acide aspartique 20mg/1 et d'ampicilline 20mg/1, et contenant 0 ; 0,3 ; 0,5 ou 1% de malate (p/v). Le milieu est tamponné à pH 6,5 par addition d'acide citrique.
Les cultures ont ëté incubées à 37 C, avec agitation, pendant 48h.
A titre de témoin, Lactococcus lactis a été
cultivé dans 8 ml de milieu M9 contenant 5g/l de UYEAST

.. . . . - -. . - . .. .

wO94n687g PCT~94/~589 2139S~S

EXTRACT" et la même gamme de malate. Les cultures ont été
incubées à 28 C, pendant 48 h, en anaérobiose.
Les cultures ont alors été centrifugées 10 min à 4000g. Les surnageants ont été récupérés et testés pour la présence de ~-lactate. Le dosage du L-lactate a été
réalisé à l'aide d'un kit (BOEHRINGER), selon le protocole décrit par le fournisseur.
Les résultats, présentés dans le tableau I ci-- dessous ~exprimés en g/l), montrent une production très nette de lactate dans le surnageant de culture des transformants pl53A et pl91A, alors qu'aucune trace de lactate n~est détectée dans le surnageant de la souche témoin (E. coli DH5 transformée par pUC18). Un autre transformant, p5A, qui a été testé dans les mêmes conditions, ne produit par contre pas de lactate. Ceci s'explique par le fait que le gène malolactique porté par - le vecteur recombinant p5A présente une extrémité 3' i tronquée de 200 nucléotides. Cette région semble donc essentielle à l'activité malolactique.
¦~ 20En absence de malate, il n'y a pas de ~-i- production significative de lactate dans le surnageant de ~, culture des transformants pl53A et pl91A, ni de la souche i témoin transformée par pU~18. Ceci s'explique par le fait ¦ que E. coli ne produit pas de L-lactate dans ces conditions de culture.
En présence de malate, aucune production de lactate n'est observée pour la souche témoin. Par contre, en ce qui concerne les transformants pl53A et pl91A, une production significative de lactate est observée, en présence de 0,1, 0,3, et 1~ de malate.
Le taux de lactate produit est assez faible si on le compare à celui produit par la souche témoin de L. lactis testée dans les mêmes conditions et à partir des mêmes concentrations en malate. Cependant, il 3S convient de noter que la production de L-lactate dans L.
lactis correspond au L-lactate produit par fermentation , W094/26879 213 9 6 S S PCTn$941~589 malolactique, et également a une proportion importante de L-lactate prvduit par dégradation des sucres, via la - L-LDH gui convertit le pyruvate en lactate.
D~autre part, il est difficile de déterminer la part de malate qui est réellement disponible pour la fermen~ation malolactique. En effe~, dans les conditions de culture utilisées pour E. coli, une partie non négligeable du malate peut être utilisé via le cycle tricarboxyli~ue.
TABLEAU I
Souche bactérienne % malate dans le milieu de culture 0 0,3 0,5 . .
E. coli DH5a(pUC18) 0,001 0,017 0,008 0,015 . E. coli (pl53A) G,015 0,12 0,23 0,31 E. coli (pl91A) 0,017 0,17 0,15 0,2 Lactococcus lactis 2, 6 5, 09 8, 5 i EXEME~E 6 : EXPR~SSION D~ _G~E_ ~PLOL~ÇTIO~E DANS ~A

I Afin de réaliser l~expression du gène malolactique cloné dans la le~ure, la région codante a I été placée sous contrôle dléléments régulateurs j (promoteurs et terminateurs) de lew re, dans des vecteurs - navette levure/E. coli.
a) Introduction ~u ~ malolacti ~ ~ur le Dl~smide multicoDie ~VT100-U
Le plasmide d'expression pVT100-U a été
utilisé. Ce plasmide contient l'origine de réplication de levure 2~, le marqueur de sélection URA3 et les éléments régulateurs forts ADH ~promoteur et terminateur de l'alcool déshyrogénase I), ainsi que les éléments bactériens (origine de réplication et gène de résistance - à l'ampicilline).
Ce plasmide a eté décrit par VERNET et al [Gene 52 ; 225-233, (1987)]

W094/26879 213 3 6 ~ S pcTn~s4l~589 La région codante du gène malolaetique a été
amplifiée par PCR à partir du plasmide plS3A, à l'aide d'amorces constituées d'oligonucléotides d~rivés de la séquence du gène malolactique. Afin de faciliter le S clonage, l'introduetion de sites de restrietion 8hQI en amont et ~aI en aval de la région codante a été réalisée au cours des amplifications.
Les oligonucIéotides utilisés eomme amorees sont :
- un oligonucléotide permettant d'isoler la région eodante au niveau du eodon d'initiation de la traduetion ATG (amoree 1) et eomportant un site ~hoI
- Du eôté 3l, l'oligonucléotide choisi ~amorce 3l) est localisé à quelques nucléotides en aval du codon de terminaison de la traduction.
, Les séquenees ainsi que les positions exactes des amorees utilisées sont indiquées sur la figure 2.
- L~amplifieation a été réalisée de la manière suivante :
amoree 1 4 ~l (30pmoles) amoree 3 4 ~1(30pmoles) Taq buffer lOX 10 ~l ~ Taq poly,mérase (S~/~l) 0,S ~l -,~ ~ dNTP2~ 10 ~l , ~ 25 MgCl2~25mM 6 ~1 plS3A 4 ~l (40ng) H20 62 ~1 -i Conditions d'amplifieation : 30 secondes à
.,,, . I .
94 C, 30 seeondes à 40 C, 1 min à 72 C pendant 30 cycles.
30~ ~a taille des fragments amplifiés a ét~
vérifiée par analyse d'un aliquot sur gel d'agarose.
lOOng des fragments amplifiés ont été digérés -- par ~hQI et 8kaI et ligués à 50ng de veeteur pVTlO0-U
préalablement digéré par ~hQI et ~aI et déphosphorylé.
Le veeteur pVT100-U obtenu, dénommé pMl, est représenté à la figure 3.

:

2139~65 W094/26879 PCT~4/~589 La souche de levure Saccharomyces cerevisiae - SCV5M a été transformée par le vecteur pM1.
La souche SCV5M a été déposée le 18 juin 1992 - 5 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, tenue par l'Institut Pasteur, sous le numéro I-1222. Il s'agit d'une souche de laboratoire haploïde, ura~, MATa, dérivée d'une souche oenologique.
La méthode de transformation utilisée est celle de l'acétate de lithium décrite par ITO et al. [J.
Bacteriol. n- 153, pp. 163-168, tl983)1.
c) Obtention ~ la ferme~Sation malolac~iuue dans la levure Deux des transformants obtenus, dénommés ScV5M/pMIa et ScV5M/pMIb ont été testés pour ~eur capacité à réaliser la fermentation malolactique - (con~ersion du malate en lactate) ; ces transformants ont été cultivés dans les conditions suivantes :
- d'une part, sur milieu synthétique minimum YNB (6,7 g/1 UYeast nitrogen base without aminoacid"
(DIFCO~, 20 g/l glucose) contenant 0, 0,6 ou 1% de - malate, tamponné soit à pH 3, soit à pH 6 avec de l'acide citrique (6,3 g/l).
- d'autre part, sur milieu synthétique mimant la composition d'un moût de raisin, [SABLAYROLLES et BARRE, Sciences des Aliments, n- 6, p. 373-383 (1986)], tamponné à p~ 3,3.
Les deux milieux utilisés ne contiennent pas d'uracile, ce qui assure une pression de sélectlon pour les plasmides.
t Un transformant de ScVSM par le plasmide pVT100-U ne contenant pas d'insert a été utilisé comme témoin négatif.
CO~ CTIONS DE C~Tl~E ~$ D~: ~20SAGE:
8 ml de milieu sont ensemencés par les souches de levures (transformants et témoin). La croissance est W094l26879 PCT~R~4/00589 ~13366~

réalisée dans des tubes stéxiles de 10 ml, à 28 C, pendant 60 h, sans agitation.
Les cultures sont centri~ugées 5 min à 4000 g et le surnageant testé pour la production de L-lactate en utilisant un kit Boehringer, comme indiqué à 1'Exemple 5.
RES~ TS
Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau II.
Sur milieu synthétique minimum YNB
(Tableau II~, en absence comme en présence de malate (0,3 et 1~), aucune trace de L-lactate n'est détectée avec la levure témoin (ScV5M/pVTU). Ceci est tout à fait en accord avec le fait que S. cerevisiae est incapable de réaliser la transformation du malate en lactate, et gue, d~autre part, en anaérobiose, elle ne produit que des traces de l~ctate à partir du glucose, principalement - sous forme de D-lactate.
Les souches transformées pMla et pMlb, en l'absence de malate, produisent des traces de L-lactate, de l'ordre d'une cinquantaine à une centaine de milligr~mmes. Il est probable que cette légère production provient de la conversion par 1'enzyme malolactique d~une ; partie du malate endogène de la levure, m~tabolisé à
partir du glucose. En présence de malate dans le milieu de culture (O,6 et 1~ de malate), et dans les milieux YNB
tamponnés à pH 3, ou sur moût synthétique (pH 3,3, 3g~1 de malate), une production très significati~e de L-lactate (de 0,5 à 0,7 g/l pour le clone pMla dans ces conditions expérimentales) est observée.
La production la plus importante est o~ser~ée sur moût synthétique dont la composition est très proche de celle des moûts de raisin (0,7 g/l de L-lactate soit 7,7 ~moles/ml).
Dans les mêmes conditions de culture (YNB) mais à pH 6, la production de L-lactate est très faible, du même ordre de grandeur qu'en llabsence de malate. La j wog4n6879 21~ 9 S 6 5 PCT~V4/~589 différence de production de L-lactate selon le pH du milieu de culture pourrait s'expliquer par un problème de perméation du malate chez S. cerevisiae à pH 6. ~ pH 3 ou 3,3, une grande partie du malate (pK 3,5) se trouvant sous forme non-dissociée peut entrer à l'intérieur de la cell~lle par simple diffusion. Par contre à pH 6 le ~ malate, principalement sous forme dissociée entrerait I moins facilement à l'intérieur de la cellule.
Les souches recombinantes dégradent donc le malate en lactate par fermentation malolactique, et avec une efficacité plus grande à pH acide, donc en conditions proches de celles de l'oenologie.

~1 ~

W094l26879 213 3 6 S 5 PCT~94/~S89 TABLEAU II : DOSA~E DU LACTATE CHEZ S. CEREVISIAE
. _ . .
Souches de levure L-lactate produi L-lactate produit (g/1) (~mole/ml) _ _ ScVRM/~VT100-~
- dans (pH = 3) :
0% malate 2,4.10-3 0,02 0,6% malate l 7.10-3 0,07 1% malate 9.10-3 0,1 - dans (pH = 6) :
0% malate 3.10-3 0,03 0,6% malate 6.10-3 0,06 1% malate 10.10-3 0,11 - Moût synthétigu (pH = 3,3) 9.10-3 0,1 , ScV5M/~Mla .
~ - dans (pH = 3) :
:~ 0% malate 0,15 1,66 ::! o 6% malate 0,4 4,4 1% malate 0,52 5,7 ~: - dans (pH ~ 6) :
!:~ o% malate 0,1 ~ 1,1 0,6% malate 0,07 0,77 1% malate 0,05 0,55 -~ 25 - Moût synthétiqu . (pH = 3,3) 0,7 7,7 ., , .
'., ----`! WOg4~6~79 2 1 3 9 6 ~ ~ PCT~4/~589 TABLEAU II (suite~
_ _ _ . .
Souches de lew re L-lactate produit L-lactate produit (g/l) (~mole/ml) _ _ ~
Sc~5M/pMlb - dans (pH = 3) :
0% malate 0,15 1,66 0,6% malate 0,40 4,4 1~ malate 0,48 5,3 - dans (pH = 6) :
0% malate 0,11 1,22 0,6% malate 0,08 0,88 1% malate 0,056 0,62 - Moût synthétique (pH = 3,3) 0,51 5,66 _ ~
La même expérimentation a été effectuée sur moût synthétique, et la production de lactate mesurée au bout dè 10 jours de culture ; 1,5g/1 (soit 17 ~moles/ml) de lactate ont été produits dans ces conditions.
EXEMPLE 7 : EXPRESSION D~ QE~ _ NALOLACTIO~E C~EZ
SC~I~OSA~C=~=~E
L'expression du gène malolactique a été
également étudiée chez Schizosaccharomyces pombe. Dans ce but, la région codante du gene malolactique a été placée sous contrôle d'un promoteur de S. pombe, dans un vecteur navette S. pombe/E, coli.
a) Intro~uction ~u a~e malolacti~uq sur_le Dlasmide mNlt$co~ie ~ARTl Le plasmide d'expression pART1 a été utilis~.
Ce plasmide contient llorigine de réplication de levure ARS1, le marqueur de sélection LEU2 et le promoteur de 1'alcool déshydrogénase de S. pombe, ainsi que des éléments bactériens (origin~ de réplication et gène de résistance à llampicilline).

W094/26879PCT~R941~589 ~-~
2139~65 Ce plasmide a été décrit par McLeod et al., (EMBO ~. 6; 729-736, 1987).
La région codante du gène malolactique a été
Iamplifiée par PCR à partir du plasmide pl53A, à l'aide ;5 d'amorces constituées d'oligonucléotides dérivés de la séquence du gène malolactigue. Afin de faciliter le clonage, l'introduction de sites de restriction ~EHI en amont et SacI en aval de la région codante a été réalisée au cours des amplifications.
Les oligonucléotides utilisés comme armorces sont :
- un oli~onucléotide permettant d'isoler la région codante au niveau du codon d' initiation de la traduction ATG (amorce 12) et comportant un site ~HI
i 15 - du c8té 3~ oligonucléotide choisi (amorce 1 13) est localisé à quelques nucléotides en aval du codon de terminaison de la traduction et comporte un site Sa~I.
Les séquences ainsi que les positions exactes ~ des amorces utilisées sont indiquées sur la figure 2 -~ ~ 20 L'amplification a été réalisée de la manière ;~ suivante :
~ . amorce 12 4~1 (2Opmoles) :~ . amorce 13 4~1 (20pmoles) . Taq buffer lOX 10~1 . Taq polymérase ~5UJ~1) 0,5~1 . dNTP 2~M 10~1 . mgC12 25mM 6~1 . pl53A 10~1 (lOOng) . H20 65,5~1 Conditions d'amplication : 30 secondes à 94 C, 30 secondes à 37 C, 1 minute à 72 C pendant 30 cycles.
La taille des fragments amplifiés a été
vérifiée par analyse d'un aliquot sur gel d'agarose.
100 ng de fragments amælifiés ont été digérés par ~mHI et ~acI et ligués à 50 ng de vecteur pAARTl préalablement digéré par ~mHI et SacI et dephosphorylé.

'\ W094/~6879 213 9 ~ 6 5 PCT~94/~589 :, , . . ;

Le vecteur obtenu, dénommé pD4, est représenté
à la figure 4.
b) Tran~formatio~_9~L~ hv Une souche S. pombe auxotrope pour la leucine - 5 a été transformée par le vecteur pD4 et par le vecteur pART1. I1 s'agi~ de la souche de laboratoire leul-32 h+, gui a été fournie par J. KOHLI, Institute of General Microbiology, Raltzerstrasse 4, C~-3012, Bern, Switzerland.
La méthode de transformation utilisée est celle de transformation à l'acétate de lithium adaptée de ITO et al. [Journal of Bacteriology 153, 163-168, (1983)].
c) Obte~tio~ ~ la ferment4~æn ~al~lactioue aan~ s. T~O~
Un des transformants obtenus, dénommé Sp/D42 a été testé pour sa capacité à réaliser la fermentation malolactique (conversion du malate en lactate). Le transformant a été cultivé dans les conditions suivantes :
- sur milieu synthétique min~mum YNB contenant 50 g/l de glucose et 5,5 g/l de L-malate, tamponné soit à
à pH 3,~, soit à pH 6. Ce milieu ne contient pas de leucine, ce qui assure une pression de sélection pour les plasmides introduits.
Un transformant de la même souche par le plasmide pART1 ne contenant pas d'insert a été utilisé
comme témoin négatif.
8ml de milieu sont ensemencés par les souches de levure (transformant et temoin). La croissance est réalisée dans des tubes stériles de 10 ml, à 40'C, pendant une semaine, sans agitation.
~ es cultures sont centrifugées 5min à 4000g et le surnageant testé pour la production de L-lactate en utilisant un kit BOEHRINGER, comme indiqué précédemment.
La dégradation du L-malate a ét~ étudiée par dosage du L-~ .
WO ~/2~79 213 3 5 ~ S ~CT~4/~589 malate residuel dans le milieu de culture à 1'aide d'un kit BOEHRINGER.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau III ci-dessous.
Dans les différentes conditions de culture testées, la levure témoin Sp/pART1 ne produit que des I traces de L-lactate (de l'ordre de 20 à 40 mg/l). En ¦ effet, de même que S. cerevisiae, S. pombe est incapable de transformer du malate en lactate, et, d'autre part ne j10 produit que des traces de lactate en anaérobiose à partir ¦ du glucose.
!La souche transformée par le gène malolactique (Sp/D42), en l'absence de malate, produit des quantités très faibles de L-lactate (de l'ordre de 170 à 300 mg/1).
Cette légère production provient très problablement de la conversion par 1'enzyme malolactique d'une partie du malate endogène de la levure, métabolisé à partir du glucose. Ceci a également été observé avec les transformants de S. cerivisiae ~ tableau II). En présence de 5,5 g/l de L-malate dans le milieu de culture, une production très importante de L-lactate est observée pour ~le transformant Sp/D42, de 2,4 à 3 g/l selon le pH du `~
milieu de culture. La production la plus forte est observée à pH acide, donc en condition de pH proches de celles de l'oenologie. La production obtenue à pH6 est aussi très forte, comparativement à celle obtenue pour les transformants de S. cere~isiae au même pH.
! D'autre part, en présence de 5,5 g/l de L-malate et à pH acide, le transformant Sp/D42 est capable de dégrader pratiquement tout le L-malate du milieu (à
! pH 3,5, seulement 150 mg/l de L-malate n'ont pas été
dégradés) et de plus, de convertir plus de 80~ du malate présent en L-lactate (3,05 g/l).

~, WO 94/26879 213 9 S 6 5 PCT/ERg4/00589 TABL~DOSAGE DIJ ~ACTAq!~ Z S. PO~BE
_ _ _ . ~
Souches de levure L-Lactate L-Malate produit (g/l) résiduel (g/l) :~
~ _ . ,_ ,, Sp~ARTl - dans (pH = 3,5) 0% malate ` non détecté
0,55% malate 0,04 1,4 - dans (pH = 6) 0% malate 0,02 0,55% malate 0,03 4,6 . _ Sp/D42 - dans (pH = 3,5) 0% malate - 0,17 0,55% malate 3,05 0,15 .
- dans ~pH = 6) : 0% malate 0,3 0,55% malate 2,4 1,5 \

\
\

WO 94126879 PCT~R94/00589 LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NON: INSTITUT NATIONA~ DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE
- I.N.R.A.
1 (B) RUE: 147, RUE DE h'UNIVERSITE
i (C) VILhE: PARIS
I (E) PAYS: FRANCE
! ( F) CODE POSTAL: 7534l CEDEX 07 (A) NOM: BARRE Pierre (B) RUE: 90, RUE DES LAVANDES
(C) VILLE: SAINT GEhY DU FESC
~E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 34980 1 (A) NOM: DEQUIN Syl~ie I (B) RUE: 7, RUE DU GENERAL RENE
(C) VILLE: MONTPELLIER
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 34000 (A) NOM: ANSANAY Virginie ~B) RUE: 60, COURS GAMBETTA
(C) VILhE: MONTPELLIER
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 34000 (ii) TITRE DE L' INVENTION: CLONAGE ET EXPRESSION DU GENE DE L'ENZYNE
MALOLACTIOUE DE LACTOCOCCUS LACTIS
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2 (iv) FORME LISI8LE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk ~B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTENE D' EXPLOITATION: PC-DOS~MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn ReleAse #l.0, Version #1.2S (OEB) (vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE DEPOT: FR 93 06003 (B) D~TE DE DEPOT: l8-MAY-l993 :
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: l:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2684 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOhECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON

(vi) ORIGINE:
~A) ORGANISME: Lactococcus lactis :

2 1 3 ~ 5 ~ 5 O 94l26879 PCT~FR94/0Q589 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONEhhE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 466..2085 (D) AUTRES RENSEIGNE~ENTS: /product= ~ENZYME MALOhACTIQUE~ :
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONE~LE:
(A~ NOM/CLE: -35_signal (B) EMPhACEMENT: 392..397 (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELhE:
(A) NOM/CLE: -10_signal (B) EMPhACFM~NT: 416..421 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

AAAA¢TAGAG TGATTTTACT CTACTTTTTT AGAATACTTT TATATAATAG GAAATATGAA 120 ATAGGAGGAG GACAGTTTAT CA m AATAG TTATAAGCTA ATTTTTACTA CCATTTCTTT 300 GATTAATATC ATCTAT m T ATATAGAGAC TTTTAAATAA ACATTGACAT TA m ATGCG 360 :TTATA~ATTA AATTTATCAA CACTAAGGAA TTTGACTATA ACGATAAAAG AAGTTTATAG 420 TAATAAAGTA ATAA~CATTAA TTATAATTTT AATGGAGGTT GTACG ATG CGT GCA 474 Met Arg Ala CAT GAA ATT TTA AAC AAT CCT m TTA AAT AAA GGA ACA GCT TTT ACT 522 His Glu Ile~Leu Asn Asn Pro Phe Leu Asn Lys Gly Thr Ala Phe Thr ATG AAA GAC CGT CAA GAA TT~ GGG TT~ ATT GGT CTT CTT CCA CCA ACT 570 Met Lys Asp Arg Gln Glu Leu Gly Leu Ile Gly Leu Leu Pro Pro Thr ~ 20 . 25 ~0 ~5 GTT CAA ACA ATT:GAG GAA CAA GCT GAA CAA ACT TAC GAA CAA TAT TTG 618 Val Gln Thr Ile Glu Glu Gln Ala Glu Gln Thr Tyr Glu Gln Tyr Leu 40 ~ 45 50 Thr Lys Pro Ser Asp Leu Glù Lys Arg His Phe Leu Met Glu Ile Phe Asn Thr Asn Arg Thr Leu Phe Tyr Tyr Leu Phe Asn Lys His Ile Val GAA m AAT CCA GTT GTT TAT GAT CCA ACA ATT GCT GAT ACA ATT GAA 762 Glu Phe Asn Pro Val Val Tyr Asp Pro Thr Ile Ala Asp Thr Ile Glu Asn Tyr Ser His Leu Phe Val Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Tyr Leu Asp WO 94/26879 213 9 G ~ S PCT~R94/00589 Ile Asn His Pro Glu Asn Ile Thr Glu Thr Leu Lys Ser Ala Ala Gly Asp Arg Glu Ile Arg Pro Ile Val Val Thr Asp Ala Glu Gly Thr Leu . GGT ATT GGA GAC TGG GGA ACT CAA GGT GTT GAT ATC TCA GTT GGT AAA 954 Gly Ile Gly Asp Trp Gly mr Gln Gly Val Asp Ile Ser Val Gly Lys Leu Met Ile Tyr Thr Ala Ala Ala Gly Ile Asp Pro Ala Ser Val Leu CCA GTT GTT ATT GAT GCA GGG ACA AAT AGG AAA GGA CTT TTA GAA GAT lOS0 Pro Val Val Ile Asp Ala Gly Thr Asn Arg Lys Gly Leu Leu Glu Asp 180 185 190 lg5 His Leu Tyr Leu Gly Asn His Gln Glu Arg Ile Tyr Gly Asp Gln Tyr .TAC AGT TTC GTC GAT CAA TTT GTA GAA ACT GCA GAA TCA ATT TTC CCT 1146 :~Tyr Ser Phe Val Asp Gln Phe Val Glu Thr Ala Glu Ser Ile Phe Pro ~215 220 225 .~

Lys Leu Tyr Leu His Trp Glu Asp Phe Gly Arg Ser Asn Ala Ala Thr ATT TTA AAT AAC TAC AAA ACA AAA ATC CCA ACA m AAT GAT GAC ATT 1242 Ile Leu Asn Asn Tyr Lys Thr Lys Ile Pro Thr Phe Asn Asp Asp Ile Gln Gly Thr Gly Ile Val Val Leu Gly Gly Ile Phe Gly Ser Leu Asp Ile Thr Gly Glu Lys Leu Thr Asp Gln Val Tyr Leu Cys Tyr Gly Gly IGly Ser Ala Gly Ala Gly Ile Ala Gly Arg Val His Ala Glu Met Val ',AGT GAA GGT CTT TCT GAA GAA GAA GCT TAC AAA CAT TTC TTC ATG ATT 1434 Ser Glu Gly Leu Ser Glu Glu Glu Ala Tyr Lys His Phe Phe Met Ile Asp Gln Gln Gly Leu Leu Phe Asp Asp Met Glu Asp Leu Thr Pro Ala Gln Lys Pro Phe Ala Lys Lys Arg Ala Asp Tyr Lys Asp Ala Gly Asp 340 3~5 350 355 Met Thr Asp Leu Leu Asn Val Val Lys Thr Val Lys Pro Thr Ile Leu WO 94l26879 PCT~R94/0058 Val Gly Thr Ser Thr Asn Pro Gly Ala Phe Thr Lys Glu Val Val Glu Ala Met Cys Ala Asn Thr Glu Arg Pro Val Ile Phe Pr~ Ile Ser Asn Pro Thr Lys Lys Met Glu Thr Thr Ala Glu Gln Val Ile Glu Trp Ser Asp Gly Lys Ala Phe Val Ala Thr Gly Val Pro Ser Gly Thr Ile Ser Tyr Lys Gly Val Asp Tyr Gln Ile Gly Gln Ala Asn Asn Ser Leu Ile His Pro Gly Leu Gly Leu Gly Met Leu Ala Ser Glu Ala Lys Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Gly Ala Ala Ala His Ser Leu Ser Gly Leu Val - Asp Pro Gly Lys Pro Gly Ala Pro Val Leu Pro Pro Phe Glu Phe Val Ala Asp Val Ser Ile Lys Val Ala Glu Ala Val Ala Lys Lys Ala Gln Glu Gln Gly Leu Thr Glu Ser Lys Glu Thr Asp Met Ala Lys Ala Val Arg Asp Leu Lys Trp Tyr Pro Glu Tyr TTCCACATTG TTCCTTCAAA TGTTATTGGA GCAGTTTCCA ATTTTATGGG TGGAAAA m 2405 GGATTTCTTG ATTTTTATAT AGCTGCACTT ATCTGTGGAT CTATTTTAGG AATGAACAGA 2g65 WO 94/26879 PCTn~94/00589 2139~6~

~2) INFORMATI~N POUR LA SEQ ID NO: 2:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 540 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Arg Ala His Glu Ile Leu Asn Asn Pro Phe Leu Asn Lys Gly Thr Ala Phe Thr Met Lys Asp Arg Gln Glu Leu Gly Leu Ile Gly Leu Leu Pro Pro Thr Val Gln Thr Ile Glu Glu Gln Ala Glu Gln Thr Tyr Glu Gln Tyr Leu Thr Lys Pro Ser Asp Leu Glu Lys Arg His Phe Leu Met Glu Ile Phe Asn Thr Asn Arg Thr Leu Phe Tyr Tyr Leu Phe Asn Lys His Ile Val Glu Phe Asn Pro Val Val Iyr Asp Pro Thr Ile Ala Asp Thr Ile Glu Asn Tyr Ser His Leu Phe Val Asp Pro Gln Tyr Ala Ala 100 , 105 110 Tyr Leu Asp Ile Asn His Pro Glu Asn Ile Thr Glu Thr Leu Lys Ser Ala Ala Gly Asp Arg Glu Ile Arg Pro Ile Val Val Thr Asp Ala Glu Gly Thr Leu Gly Ile Gly Asp Trp Gly Thr Gln Gly Val Asp Ile Ser 145 150 ` 155 16 Val Gly Lys Leu Met Ile Tyr Thr Ala Ala Ala Gly Ile Asp Pro Ala Ser Val Leu Pro Val Val Ile Asp Ala Gly Thr Asn Arg Lys Gly Leu Leu Glu Asp His Leu Tyr Leu Gly Asn His Gln Glu Arg Ile Tyr Gly Asp Gln Tyr Tyr Ser Phe Val Asp Gln Phe Val Glu Thr Ala Glu Ser Ile Phe Pro Lys Leu Tyr Leu His Trp Glu Asp Phe Gly Arg Ser Asn Ala Ala Thr Ile Leu Asn Asn Tyr Lys Thr Lys Ile Pro Thr Phe Asn Asp Asp Ile Gln Gly Thr Gly Ile Val Val Leu Gly Gly Ile Phe Gly Ser Leu Asp Ile Thr Gly Glu Lys Leu Thr Asp Gln Val Tyr Leu Cys -2 1 ~ 5 WO 94/26879 PCT~R94/00589 Tyr Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ala Gly Ile Ala Gly Arg Val His Ala Glu Met Val Ser Glu Gly Leu Ser Glu Glu Glu Ala Tyr Lys His Phe 305 310 3~5 320 Phe Met Ile Asp Gln Gln Gly Leu Leu Phe Asp Asp Met Glu Asp Leu Thr Pro Ala Gln Lys Pro Phe Ala Lys Lys Arg Ala Asp Tyr Lys Asp Ala Gly Asp Met Thr Asp Leu Leu Asn Val Val Lys Thr Val Lys Pro Thr Ile Leu Val Gly Thr Ser Thr Asn Pro Gly Ala Phe Thr Lys Glu Val Val Glu Ala Met Cys Ala Asn Thr Glu Arg Pro Val Ile Phe Pro - Ile Ser Asn Pro Thr Lys Lys Met Glu Thr Thr Ala Glu Gln Val Ile Glu Trp Ser Asp Gly Lys Ala Phe Val Ala Thr Gly Val Pro Ser Gly 420 425 . 430 Thr Ile Ser Tyr L~s Gly Val Asp Tyr Gln Ile Gly Gln Ala Asn Asn Ser Leu Ile His Pro Gly Leu Gly Leu Gly Met Leu Ala Ser Glu Ala 450 455 4bO
Lys Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Gly Ala Ala Ala His Ser Leu Ser Gly Leu Val Asp Pro Gly Lys Pro Gly Ala Pro Val Leu Pro Pro Phe Glu Phe Val Ala Asp Val Ser Ile ~ys Val Ala Glu Ala Val Ala hys ~ys Ala Gln Glu Gln Gly Leu Thr Glu Ser Lys ~lu Thr Asp Met Ala Lys Ala Val Arg Asp Leu Lys Trp Tyr Pro Glu Tyr

Claims (12)

REVENDICATIONS
1) Fragment d'acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de 1620 pb codant pour

1'enzyme malolactique de Lactococcus lactis.

2) Fragment d'acide nucléique, selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour le polypeptide SEQ. ID. NO 2.

3) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend les nucléotides 466 à 2085 de la séquence SEQ. ID. NO 1.

4) Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, placé sous contrôle de séquences de régulation de l'expression d'un gène.

5? Cassette d'expression selon la revendication 4, caractérisée en ce que lesdites séquences de régulation sont actives chez la levure.

6) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.

7) Vecteur recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5.

8) Cellule eucaryote ou procaryote transformée, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une cassette d'expression selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5.

9) Cellule transformée selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de levure.

10) Cellule de levure selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite levure appartient au genre Saccharomyces.

11) Cellule de levure selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite levure appartient au genre Schizosaccharomyces.

12) Utilisation d'au moins une cellule de levure selon 1' une quelconque des revendications 9 à 11 pour accomplir la fermentation malolactique.