CN112063646B

CN112063646B - 目的基因多拷贝整合的方法、重组菌以及重组人血清白蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN112063646B
Application number: CN202010799482.7A
Authority: CN
Inventors: 温廷益; 王来友; 邓爱华; 商秀玲
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2038-01-19
Also published as: CN110055283A; CN112063646A; CN110055283B

Abstract

本发明涉及目的基因多拷贝整合的方法、重组菌以及重组人血清白蛋白的制备方法。所述目的基因多拷贝整合的方法包括(A)构建表达Cas9核酸酶的酵母菌株；(B)向所述酵母菌株导入转录gRNA的载体，所述gRNA中的向导序列与所述酵母菌株的rDNA单元序列的片段互补；(C)向所述酵母菌株导入携带目的基因的修复模板；(D)去除所述酵母菌株中步骤(A)和步骤(B)导入的载体。本发明将CRISPR‑Cas9系统编辑基因组的高效性和rDNA重复单元的多拷贝特点相结合首次在酵母细胞中建立了能够同时在基因组上整合高达10余个拷贝目的基因的方法。

Description

目的基因多拷贝整合的方法、重组菌以及重组人血清白蛋白的制备方法

本申请是分案申请，其母案是发明名称为“目的基因多拷贝整合的方法、重组菌、白藜芦醇以及重组人血清白蛋白的制备方法”的发明专利申请，其申请号为201810054262.4，申请日为2018年01月19日。

技术领域

本发明总地涉及生物技术领域，具体来说涉及目的基因多拷贝整合的方法、重组菌以及重组人血清白蛋白的制备方法。

背景技术

酵母是一种单细胞真核生物，其作为表达系统，具有以下优势：具有与哺乳动物细胞相似的蛋白翻译后修饰系统，利于外源蛋白的稳定高效表达；是生物安全性微生物，不产生内毒素，合成的生物产品具有很高的安全性。目前，酵母已广泛用于生物制剂的合成，如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、汉逊酵母Hansenula polymorpha、毕赤酵母Pichiapastoris等。

汉逊酵母作为甲醇型酵母的模式菌株，在基础研究和工业应用领域发挥着重要作用。作为生产多种重要生物制剂的微生物细胞工厂，汉逊酵母具有高效、安全和经济等诸多优势，主要体现在以下几个方面：1)易于目的基因的高拷贝整合，通过非同源末端连接机制能够随机整合超过100个拷贝的目的基因，易于实现外源蛋白的高效表达；2)是生物安全性微生物(GRAS)，其蛋白糖基化水平与哺乳动物细胞相近，使得汉逊酵母生产的蛋白制剂具有较高的生物安全性；3)是最耐热的酵母，最高生长温度可以达到50℃，由此可以降低工业发酵的冷凝成本，适合大规模工业生产。然而，汉逊酵母缺少稳定的表达质粒，因此，需要通过在基因组上稳定整合目的基因。

酿酒酵母是一种具有生物安全性的模式真核生物，其遗传背景清晰，发酵方法成熟，已被广泛应用于多种生物制剂的合成，如青蒿素、紫杉醇、人参皂苷、番茄红素和β-胡萝卜素等。

rDNA是指细胞核中编码核糖体RNA的DNA序列。在酵母细胞中一般存在高拷贝的rDNA单元(也被称作rDNA重复单元)串联重复，所有rDNA单元相同，均由两个转录区5S和35SrDNA序列以及两个非转录区NTS1和NTS2组成。如在汉逊酵母中(图1),大约50～60个rDNA单元在II号染色体上串联重复，一个rDNA单元长达8kb左右；在酿酒酵母中，大约150～200个rDNA单元在第Ⅻ号染色体上串联重复，每个rDNA单元长达9.1kb左右。将rDNA作为整合位点以提高目的基因整合拷贝数的应用策略在多种酵母中均已展开研究，但其整合稳定性很难控制，目的基因的拷贝数会随着酵母繁殖世代的增加而减小或表达量降低，有研究指出目的基因的稳定性与整合载体的大小有关，即整合载体的大小不能超过rDNA单元的大小。

此外，目前文献报道的高拷贝整合目的基因的方法，一般均需采用遗传标记基因以指示目的基因是否整合至宿主细胞。因此在整合目的基因的同时，不可避免地在宿主细胞的基因组上整合多拷贝的遗传标记基因。尤其是在整合多个不同目的基因时，还需要选择多个不同的遗传标记基因以指示不同的目的基因。这样不但影响后续的遗传操作，而且带有遗传标记基因的菌株，尤其是带有抗生素抗性基因的菌株还可能存在生物安全性问题。

目的基因CRISPR/Cas是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种抵御外援DNA入侵的免疫防御系统。CRISPR是指规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats,CRISPR)；而Cas是指CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)，是一种核酸酶，能剪切双链DNA。目前，已发现了三种类型的CRISPR/Cas系统。其中，II型的CRISPR/Cas9系统发挥作用只需Cas9蛋白和引导Cas9的gRNA两种成分，gRNA包含crRNA和tracrRNA两部分。tracrRNA形成发卡型二级结构，与Cas9蛋白相结合形成Cas9-gRNA复合体；crRNA含有20个碱基的向导序列(N₂₀)，该20个碱基与靶位点DNA的序列互补，并介导Cas9-gRNA复合体特异性识别和结合靶位点DNA。该复合体与靶位点DNA结合后，Cas9发挥核酸酶的功能切割双链DNA，造成双链DNA断裂(DSB)。细胞利用同源重组(HR)或非同源末端连接机制(NHEJ)修复DSB，实现基因组编辑。

白藜芦醇是一种具有较高生物活性的天然多酚类物质，主要来源于葡萄、虎杖及桑椹等植物。作为一种天然的抗氧化剂，白藜芦醇具有广泛的药理作用：对肝癌、乳腺癌、白血病等多种肿瘤细胞产生不同程度的抑制作用；促进血管舒张，防治冠状动脉粥样硬化；减少细胞因子生成量，抑制炎症的发生。基于其重要的生理作用，白藜芦醇被广泛应用于医药、食品、化妆品等行业。目前，白藜芦醇的生产方法是植物提取，但因植物中白藜芦醇的含量低、植物生长周期长等而成本较高。相比之下，微生物发酵法具有工艺简单、不受气候等环境条件的影响、生产成本低、周期短、污染少的诸多优势。白藜芦醇的生物合成途径如图3所示，可以以酪氨酸为底物，酪氨酸解氨酶(TAL)催化生成4-香豆酸，再经4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、芪合酶(STS)，最终生成白藜芦醇；也可以以苯丙氨酸为底物，苯丙氨酸氨解酶(PAL)催化生成桂皮酸，经肉桂酸-4-羟化酶(C4H)催化生成4-香豆酸，再经4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、芪合酶(STS)，最终生成白藜芦醇。由于C4H属于P450酶系，很难在微生物中实现异源表达，因此研究较多的是以酪氨酸为底物的代谢途径。目前白藜芦醇重组工程菌株的构建多使用大肠杆菌或酿酒酵母，虽然众多的研究结果显示表达相同的基因大肠杆菌产量约为酵母的3倍左右，但酵母在生物安全方面的优势是大肠杆菌不可比拟的。所以，如何采用酵母获得产量较高的白藜芦醇成为现在亟需解决的技术问题。

人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)是血液系统的重要组成部分，具有结合、运输物质，维持血液渗透压，清除自由基，抗凝血等功能。在临床上广泛应用于高胆红素血症、白细胞增多症、人血清白蛋白过少症、以及呼吸窘迫综合征等多种疾病的治疗。因此，HSA是现代医学中临床用量最大的重要的生物制剂。血浆来源的人血清白蛋白存在HIV、HBV等多种病毒传播的风险，相比之下，应用生物工程合成的重组人血清白蛋白从根源上避免了病毒的污染，具有很高的安全性。尽管已经在酵母等菌株中成功表达过人血清白蛋白，但表达的效率以及表达的规模仍然不够理想。

发明内容

本发明的目的在于提供目的基因多拷贝整合的方法、重组菌、白藜芦醇以及重组人血清白蛋白的制备方法

本发明提供了一种介导目的基因在酵母中多拷贝整合的方法，其中，包括：

(A)构建表达Cas9核酸酶的酵母菌株；

(B)向所述酵母菌株导入转录gRNA的载体，所述gRNA中的向导序列与所述酵母菌株的rDNA单元序列的片段互补；

(C)向所述酵母菌株导入携带目的基因的修复模板；

(D)去除所述酵母菌株中步骤(A)和步骤(B)导入的载体。

优选地，根据前述的方法，其中，步骤(A)为将携带Cas9表达盒的表达载体导入所述酵母菌株；或将Cas9表达盒整合至所述酵母菌株的染色体上；步骤(D)为通过将所述酵母菌株在无筛选压力的培养基中培养进行载体的消除，或通过同源重组将整合至染色体上的所述表达盒替换为染色体上整合位点的原始DNA片段。

优选地，根据前述的方法，其中，在步骤(C)后还包括：(E)筛选酵母菌株；优选地，所述筛选为筛选表达Cas9核酸酶的酵母菌株，筛选转录gRNA的酵母菌株，筛选目的基因整合成功的酵母菌株，和/或筛选至少整合目的基因两个拷贝的酵母菌株。

优选地，根据权利要求1所述的方法，其中，所述酵母为汉逊酵母Hansenulapolymorpha、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、毕赤酵母Pichia pastoris、念珠菌属酵母Candida species、裂殖酵母Schizosaccharomyces Pombe或克鲁维亚酵母Kluyveromyces。

或优选地，根据前述的方法，其中，所述目的基因选自编码酪氨酸氨解酶的基因TAL、编码4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL、编码芪合酶基因STS和编码人血清白蛋白基因HSA中的一种或多种；优选地，TAL来源于橙色柱滑菌Herpetosiphon aurantiacus，4CL来源于拟南芥Arabidopsis thaliana，STS来源于葡萄Vitis vinifera，HSA基因来源于人细胞；更优选地，所述TAL如序列表中序列17所示，所述4CL如序列表中序列18所示，所述STS如序列表中序列19所示，所述HSA如序列表中序列20所示。

本发明还提供了一种根据上述方法构建的重组菌，所述重组菌的rDNA单元包含所述目的基因的至少两个拷贝，且不包含外源遗传标记基因。

优选地，根据前述的重组菌，其中，所述目的基因为编码酪氨酸氨解酶的基因TAL、编码4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL和编码芪合酶基因STS。优选地，TAL来源于橙色柱滑菌Herpetosiphon aurantiacus，4CL来源于拟南芥Arabidopsis thaliana，STS来源于葡萄Vitis vinifera；更优选地，所述TAL如序列表中序列17所示，所述4CL如序列表中序列18所示，所述STS如序列表中序列19所示。

或优选地，根据前述的重组菌，其中，所述目的基因为HSA基因；HSA基因优选来源于人细胞；更优选如序列表中序列20。

本发明还提供了一种白藜芦醇的制备方法，其中，包括发酵前述的重组菌。

本发明还提供了一种重组人血清白蛋白的制备方法，其中，包括发酵前述的重组菌。

本发明将CRISPR-Cas9系统编辑基因组的高效性和rDNA重复单元的多拷贝特点相结合首次在酵母细胞中建立了能够同时在基因组上整合高达10余个拷贝目的基因的方法，为目的基因的高效表达和生物制剂的高效合成提供了技术保障。

采用本发明提供的方法得到的多拷贝整合子中不含遗传标记基因，不影响重组菌株后续的遗传改造，而且能够有效避免抗生素抗性基因在生物制剂合成中存在的潜在风险。

本发明得到的含多拷贝白藜芦醇合成基因的重组菌的白藜芦醇的产量相对于单拷贝整合重组菌提高了近20倍，显著提高了重组菌的白藜芦醇的产量。

本发明提供的基因多拷贝整合方法不仅能够应用于酵母高效合成白藜芦醇和重组人血清白蛋白，也能够广泛应用于其它生物制剂的合成。

附图说明

图1为汉逊酵母一个rDNA单元的示意图；

图2为本发明提供的目的基因多拷贝整合方法的原理图；

图3为在汉逊酵母里建立的白藜芦醇合成途径示意图；

图4为表达Cas9的质粒pWYE3219示意图；

图5为转录rDNA-gRNA的载体pWYE3220示意图；

图6和图7为基因gfpmut3a在汉逊酵母rDNA位点整合效率图；

图8为汉逊酵母中基因gfpmut3a整合拷贝数测定结果图；

图9为汉逊酵母中绿色荧光蛋白流式细胞仪检测结果图；

图10为转录rDNA-gRNA线性载体去除验证图；

图11为表达Cas9的线性载体去除验证图；

图12为多拷贝gfpmut3a在汉逊酵母基因组上的稳定性验证结果图；

图13为融合表达盒PscTEF1-TAL-PscTPI1-4CL-PscTEF2-STS的拷贝数测定结果图；

图14为HPLC检测白藜芦醇的峰图；

图15为白藜芦醇的摇瓶发酵产量图；

图16为基因HSA整合拷贝数测定结果图；

图17为重组人血清白蛋白摇瓶发酵产量图；

图18和图19为基因gfpmut3a在酿酒酵母rDNA位点整合效率图；

图20为酿酒酵母中基因gfpmut3a拷贝数测定图；

图21为酿酒酵母中绿色荧光蛋白流式细胞仪检测结果图；

图22为多拷贝gfpmut3a在酿酒酵母基因组上的稳定性验证结果图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

虽然在本发明中给出了启动子的示例，但在本发明中并没有特别限制，只要能够起到启动基因的表达即可。可以列举的可用于本发明的启动子有酵母的P_scTEF1、P_scTPI1、P_scTEF2、P_scADH1、P_scPGK1、P_GAL1、P_MOX启动子等，但不限于此。

虽然在本发明中给出了CRISPR/Cas9系统的具体示例，但在本发明中并没有特别限制，只要能够在酵母菌株中起到定点剪切作用即可。

本申请利用CRISPR/Cas9系统和多拷贝的rDNA单元实现目的基因的多拷贝整合。其基本原理如图2所示，在由Cas9核酸酶和rDNA-gRNA(靶向rDNA单元的gRNA)组成的复合体的作用下，多个rDNA单元上同时发生DNA双链断裂，含有目的基因的修复模板在每处DNA双链断裂处通过同源双交换完成DNA修复，使得多个修复模板上的目的基因同时整合到rDNA单元上，从而实现目的基因的多拷贝整合。

其中，可以仅有目的基因以及其表达的必需元件整合至rDNA单元上，从而降低了rDNA单元上的整合片段长度，提高了目的基因在酵母细胞内整合的稳定性。所以，在对酵母菌株进行改造时，可以导入目的基因的多个拷贝或多个目的基因，而不影响其稳定性。

本发明将CRISPR/Cas9系统编辑基因组的高效性和rDNA单元的多拷贝特点相结合，首次在酵母细胞中建立了能够同时在基因组上无痕整合高达10余个拷贝目的基因的方法，为目的基因的高效表达和生物制剂的高效合成提供了技术保障。

总地来说，本申请提供的介导目的基因在酵母中多拷贝整合的方法包括：1)构建表达Cas9基因的酵母菌株。2)构建携带rDNA-gRNA的载体和携带目的基因修复模板，将所述载体和修复模板共转化进步骤1)所得酵母菌株。3)去除步骤2)所获得的酵母菌株中携带的转录rDNA-gRNA的载体和表达Cas9的载体。该方法还可以包括筛选多拷贝目的基因整合成功的酵母菌株。根据重组手段、转化手段、转化成功率等，筛选方法具体可为采用遗传标记基因平板筛选成功表达Cas基因的酵母菌株、遗传标记基因平板筛选成功转录rDNA-gRNA的酵母菌株、PCR筛选成功整合目的基因的酵母菌株、qPCR筛选至少整合目的基因两个拷贝的酵母菌株等。

从上述描述可知，即使采用遗传标记基因指示载体是否成功进入酵母菌株，在步骤(3)中遗传标记基因也随载体的去除而去除，因此通过此方法得到的多拷贝整合子中不含遗传标记基因，不影响重组菌株后续的遗传改造，而且能够有效避免抗生素抗性基因在生物制剂合成中存在的潜在风险。

在一种实施方案中，上述目的基因多拷贝整合的方法具体流程包括：构建表达Cas9核酸酶的线性化载体，将其整合至酵母菌株的染色体上使酵母菌株表达Cas9核酸酶；构建转录rDNA-gRNA的线性化载体和携带目的基因的修复模板，其修复模板的结构为CRISPR/Cas9剪切位点的上游同源臂-目的基因表达盒-CRISPR/Cas9剪切位点的下游同源臂；将转录rDNA-gRNA的线性化载体和修复模板共转化至酵母菌株，转录rDNA-gRNA的线性化载体整合至酵母菌株染色体上使酵母菌株转录rDNA-gRNA，在Cas9核酸酶和rDNA-gRNA的共同作用下，酵母菌株中的多个rDNA单元上同时发生DNA双链断裂，通过酵母菌株的自身DNA修复功能，使修复模板与rDNA单元的断裂处进行同源重组，进而让多个修复模板上的目的基因同时整合到rDNA单元上；筛选出多拷贝目的基因整合成功的酵母菌株；通过同源重组上述线性化载体的整合位点的原始DNA片段去除酵母菌株染色体上整合的线性化载体。其中，Cas9核酸酶的线性化载体以及转录rDNA-gRNA的线性化载体在酵母菌株染色体上的整合位点在本发明中并没有限制。

可将上述实施方案应用于制备合成白藜芦醇的重组菌。则酵母菌株具体可采用汉逊酵母。野生型汉逊酵母里不存在白藜芦醇合成途径，因此应用汉逊酵母合成白藜芦醇需要把三个目的基因：TAL(编码酪氨酸氨解酶)、4CL(编码4-香豆酸辅酶A连接酶)和STS(编码芪合酶)引入汉逊酵母中。优选地，TAL来源于橙色柱滑菌Herpetosiphon aurantiacus，4CL来源于拟南芥Arabidopsis thaliana，STS来源于葡萄Vitis vinifera。更优选地，前述基因为根据酵母密码子偏好性进行密码子优化获得的基因。具体可为TAL如序列表中序列17自5’末端第11-1669位核苷酸所示，4CL如序列表中序列18自5’末端第11-1696位核苷酸所示，STS如序列表中序列19自5’末端第11-1189位核苷酸所示。本发明得到的含多拷贝白藜芦醇合成基因的重组菌，其白藜芦醇产量相对于单拷贝整合重组菌提高了近20倍，显著提高了重组菌的白藜芦醇产量。

也可将上述实施方案应用于制备合成重组人血清白蛋白的重组菌，酵母菌株具体可采用汉逊酵母。目的基因为HSA基因，来源于人细胞。优选地，HSA基因为根据酵母密码子偏好性进行密码子优化获得的基因。具体可为序列表中的序列20自5’末端第24-1853位核苷酸。

此外，本发明提供的目的基因多拷贝整合方法不仅能够应用于酵母高效合成白藜芦醇和重组人血清白蛋白，也能够广泛应用于其它生物制剂的合成。

在一种实施方案中，上述目的基因多拷贝整合的方法具体流程包括：构建Cas9核酸酶的表达载体，将前述表达载体转化至酵母菌株以表达Cas9核酸酶，构建转录rDNA-gRNA的载体和携带目的基因的修复模板，其修复模板的结构为CRISPR/Cas9剪切位点的上游同源臂-目的基因表达盒-CRISPR/Cas9剪切位点的下游同源臂；将转录rDNA-gRNA的载体和修复模板共转化至酵母菌株，转录rDNA-gRNA的载体在酵母菌株中转录rDNA-gRNA，在Cas9核酸酶和rDNA-gRNA的共同作用下，酵母菌株中的多个rDNA单元上同时发生DNA双链断裂，通过酵母菌株的自身DNA修复功能，使修复模板与rDNA单元的断裂处进行同源重组，进而让多个修复模板上的目的基因同时整合到rDNA单元上；筛选出多拷贝目的基因整合成功的酵母菌株；通过将多拷贝目的基因整合成功的酵母菌株在无筛选压力的培养基中培养进行前述表达载体的消除。其中，酵母菌株具体可采用酿酒酵母。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等。实施例中所用仪器设备和试剂为市售的常用仪器、试剂。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

汉逊酵母HP001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC7.89。pCRCT质粒：Addgene plasmid#60621。pAD123：北京华越洋VECT75424。质粒pWYE3200(pMOXZ-mazF)在专利号为“CN 103667274 B”，发明名称为“一种多形汉逊酵母遗传操作策略及其应用”的专利中公开过。质粒pWYE3201：将质粒pWYE3200上的博来霉素抗性基因zeo^R替换为遗传霉素抗性基因G418^R即得到质粒pWYE3201。酿酒酵母SC001(DAY414)：该菌株在文献“Zhang,G.et al.A mimicking-of-DNA-methylation-patterns pipelinefor overcoming the restriction barrier of bacteria.PLoS Genet 8,e1002987,(2012)”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所所得。pWYE3222(pYES2.0/CT)：Invitrogen。pWYE3223(pESC-LEU)：AddgenePlasmid#20120。

Gibson组装试剂盒购自美国NEB公司(NEBuilder HiFi DNA Assembly MasterMix,NEB#E2621)。色谱级乙腈和甲醇购自美国赛默飞世尔科技有限公司(FisherScienfitic)公司。

Gibson组装反应体系

Gibson组装反应条件：50℃水浴反应2h。

实施例中所用引物序列见引物序列表。下述实施例中的PCR产物均为采用相应引物扩增序列表中相应序列所得，本领域技术人员根据PCR原理可不付出创造性劳动且毫无疑义地确定PCR产物的具体序列。

实施例1汉逊酵母无痕多拷贝基因整合方法的建立

一、表达Cas9的线性化载体的获得

以汉逊酵母HP001基因组为模板，以HP230和HP231为引物扩增基因MET2下游同源臂，得到长1570bp的PCR产物(序列1)；以HP232和HP233为引物扩增基因MET2上游同源臂，得到长1535bp的PCR产物(序列2)；以HP234和HP235为引物扩增甲醇诱导型启动子P_MOX，得到长1528bp的PCR产物(序列3)。以质粒pCRCT为模板，以HP236和HP237为引物扩增基因Cas9，得到长4255bp的PCR产物(序列4)。将上述四个PCR产物进行纯化。以限制性内切酶BglII和XbaI对质粒pWYE3200进行双酶切，得到长度为2325bp的片段，并对该片段进行纯化。将纯化后的四个PCR产物和双酶切质粒所得片段进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含博来霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以HP232和HP233为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE3219(MET2upHA-P_MOX-Cas9-MET2downHA)(图4)。以限制性内切酶SpeI酶切质粒pWYE3219，纯化后获得表达Cas9的线性化载体。

二、表达Cas9的汉逊酵母菌株的构建

将上步所得表达Cas9的线性化载体转化到汉逊酵母HP001中，在含博来霉素(100μg/mL)的YPD平板上筛选重组菌转化子。提取转化子基因组，以HP384和HP385为引物进行PCR验证，并纯化PCR产物送测序。将测序结果正确的重组菌命名为HP022(HP001ΔMET2::P_MOX-Cas9)。

三、携带rDNA-gRNA的线性化载体的获得

以汉逊酵母HP001基因组为模板，以HP141和HP272为引物扩增基因ADE2下游同源臂，得到长1558bp的PCR产物(序列5)；以HP273和HP144为引物扩增基因ADE2上游同源臂，得到长1570bp的PCR产物(序列6)；以酿酒酵母基因组为模板，以HP145和HP202为引物扩增启动子P_scSNR52，得到长317bp的PCR产物(序列7)；以质粒pCRCT为模板，以HP203和HP86为引物扩增gRNA转录盒(包括包含N20的crRNA、trancrRNA和终止子SUP4t，其中N₂₀设计在引物HP203里，其具体序列为ATAGACGTTTGGATAGACAA，即序列23)，得到长179bp的片段(序列8)。将上述四个PCR产物进行纯化。以限制性内切酶BglII和BamHI对质粒pWYE3201进行双酶切，得到长度为2648bp的片段，并对该片段进行纯化。将纯化后的四个PCR产物和双酶切质粒所得片段进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以HP145和HP86为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE3220(ADE2upHA-P_scSNR52-rDNAgRNA-ADE2downHA)(图5)。以限制性内切酶KpnI酶切质粒pWYE3220，纯化后获得转录rDNA-gRNA的线性化载体。

四、rDNA位点多拷贝整合gfpmut3a基因所用的修复模板的获得

以汉逊酵母HP001基因组为模板，以HP208和HP209为引物，扩增rDNA位点上游同源臂，得到长1045bp的PCR产物(序列9)；以HP210和HP211为引物，扩增rDNA位点下游同源臂，得到长1057bp的PCR产物(序列10)。以酿酒酵母SC001基因组为模板，以HP164和HP60为引物，扩增启动子P_scTEF1，得到长635bp的PCR产物(序列11)。以质粒pAD123为模板，以HP61和HP165为引物扩增基因gfpmut3a，得到长727bp的PCR产物(序列12)；将上述四个PCR产物进行纯化。以限制性内切酶BglII和BamHI双酶切质粒pWYE3200得到长度为1920bp的片段并进行纯化。将纯化后的四个PCR产物和双酶切质粒所得片段进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含博来霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以HP164和HP165为引物，采用菌落PCR鉴定转化子。对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE3221(rDNAupHA-P_scTEF1-gfpmut3a-rDNAdownHA)。以质粒pWYE3221为模板，以HP208和HP211为引物进行PCR扩增，得到DNA片段rDNAupHA-P_scTEF1-gfpmut3a-rDNAdownHA。将该片段作为在汉逊酵母rDNA位点整合基因gfpmut3a的修复模板。

五、基因gfpmut3a在rDNA位点的多拷贝整合

将线性化的质粒pWYE3220和整合gfpmut3a的修复模板共转化到汉逊酵母HP022中。在含G418(200μg/mL)的YPD平板上筛选重组菌转化子。随机挑选24个转化子，提取它们的基因组，以HP380和HP376为引物进行PCR验证。结果如图6和图7所示，在被鉴定的转化子中75.00±12.5％成功整合了目的基因gfpmut3a。随机挑选8个整合子，通过qPCR对其进行拷贝数测定，基因MOX被选为内参基因，其检测引物为HP45和HP46，目的基因gfpmut3a的检测引物为HP258和HP259，具体方法参考文献(Kolacsek,O.,Pergel,E.,Varga,N.,Apati,A.&Orban,T.I.Ct shift:A novel and accurate real-time PCR quantification modelfor direct comparison of different nucleic acid sequences and its applicationfor transposon quantifications.Gene 598,43-49,2017)。结果如图8所示，基因gfpmut3a的拷贝数，由2.42±0.47(1号菌落)到11.15±1.10不等(8号菌落)。通过流式细胞仪检测8个整合子的GFP荧光强度。结果如图9所示，所有整合子中的绿色荧光蛋白均正常表达，而且荧光强度随着拷贝数的增加而增加。将整合有11.15±1.10个拷贝gfpmut3a的菌株命名为HP023(HP001ΔMET2::P_MOX-Cas9ΔADE2::rDNAgRNA rDNA::gfpmut3a)。

六、基因组上线性化载体的去除

以汉逊酵母HP001基因组为模板，以HP226和HP227为引物扩增ADE2基因及其上下游同源臂，得到长4821bp的PCR产物(序列13)。将该产物纯化后转化入菌株HP023中。在腺嘌呤营养缺陷型平板SC-ADE上筛选重组菌转化子。随机挑选8个转化子，提取它们的基因组，以HP380和HP376为引物进行PCR验证，并对PCR产物进行测序，测序结果正确的菌株命名为HP024(HP001ΔMET2::P_MOX-Cas9 HP001rDNA::gfpmut3a)，并进一步在腺嘌呤营养缺陷型平板SC-ADE上验证ADE2基因的回复。结果如图10所示，菌株HP024能在腺嘌呤营养缺陷型平板上正常生长，表明转录rDNA-gRNA的线性化载体已成功去除并且回复了ADE2基因。以汉逊酵母HP001基因组为模板，以HP389和HP390为引物扩增MET2基因及其上下游同源臂，得到长4560bp的PCR产物(序列14)。将该产物纯化后转入菌株HP024中，在蛋氨酸营养缺陷型平板SC-MET上筛选重组菌转化子。随机挑选8个转化子，提取它们的基因组，以HP384和HP392为引物进行PCR验证，并对PCR产物进行测序，测序结果正确的菌株命名为HP025(HP001rDNA::gfpmut3a)，并进一步在蛋氨酸营养缺陷型平板SC-MET上验证MET2基因的回复。结果如图11所示，菌株HP025能在蛋氨酸营养缺陷型平板上正常生长，表明表达Cas9的线性化载体已成功去除并且回复了MET2基因。

七、多拷贝gfpmut3a基因在汉逊酵母基因组上的稳定性检测

1、取菌株HP025，划线接种于固体YPD培养基平板，37℃静置培养48小时。

2、完成步骤1后，挑取平板上的菌落，接种至5mL液体YPD培养基中，37℃、220rpm振荡培养12h。

3、完成步骤2后，将步骤1中所得菌液按照1％的接种量接种至50mL液体YPD培养基中37℃、220rpm震荡培养。

培养过程中，每隔12h取菌液1mL，12000g离心2分钟，弃上清液留取菌体沉淀。提取菌体基因组冻存于-20℃以备检测基因gfpmut3a的拷贝数。

4、以提取的基因组为模板，通过qPCR检测基因gfpmut3a的拷贝数。

结果如图12所示，在无选择压力的培养基里培养96h，基因gfpmut3a的拷贝数基本恒定。这一结果证明了使用该多拷贝无痕整合方法整合的多个拷贝的目的基因在基因组上具有稳定性。

实施例2、汉逊酵母中白藜芦醇的高效合成

一、整合融合表达盒P_scTEF1-TAL-P_scTPI1-4CL-P_scTEF2-STS修复模板的获得

参照实施例1中方法扩增序列9；以HP324和HP211为引物，扩增rDNA位点下游同源臂，得到长1057bp的PCR产物(序列10)。以酿酒酵母SC001基因组为模板，以HP164和SC31为引物扩增启动子P_scTEF1，得到长732bp的PCR产物(序列11)；以HP398和SC23为引物扩增启动子P_scTPI1，得到长450bp的PCR产物(序列15)；以SC26和SC27为引物扩增启动子P_scTEF2，得到长707bp的PCR产物(序列16)。以合成的基因TAL为模板，以SC20和HP397为引物扩增基因TAL片段，得到长1738bp的PCR产物(序列17)；以合成的基因4CL为模板，以SC24和SC25为引物扩增基因4CL片段，得到长1745bp的PCR产物(序列18)；以合成的基因STS为模板，以SC28和HP399为引物扩增基因STS片段，得到长1281bp的PCR产物(序列19)。以限制性内切酶BglII和BamHI双酶切质粒pWYE3200得到长度为1920bp的片段。将上述PCR产物及酶切片段纯化后进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含博来霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以HP164和SC31为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE3230(rDNAupHA-P_scTEF1-TAL-P_scTPI1-4CL-P_scTEF2-STS-rDNAdownHA)。以质粒pWYE3230为模板，以HP208和HP211为引物进行PCR扩增，得到DNA片段rDNAupHA-P_scTEF1-TAL-P_scTPI1-4CL-P_scTEF2-STS-rDNAdownHA。将该片段作为融合表达盒P_scTEF1-TAL-P_scTPI1-4CL-P_scTEF2-STS在汉逊酵母rDNA位点整合的修复模板。

二、融合表达盒P_scTEF1-TAL-P_scTPI1-4CL-P_scTEF2-STS在汉逊酵母rDNA位点的多拷贝整合

将线性化的质粒pWYE3220和整合P_scTEF1-TAL-P_scTPI1-4CL-P_scTEF2-STS的修复模板共转化到汉逊酵母HP022中。在含G418(200μg/mL)的YPD平板上筛选重组菌转化子。随机挑选24个转化子，提取它们的基因组，以HP380和HP404为引物进行PCR验证。以正确的转化子基因组为模板，通过qPCR对融合表达盒进行拷贝数测定。基因MOX被选作内参基因，其检测引物为HP45和HP46，P_scTEF1-TAL-P_scTPI1-4CL-P_scTEF2-STS表达盒的检测引物为HP47和HP48。实验结果如图13所示。

三、基因组上线性化载体的去除

参照实施例1中方法将上述转化子中选出整合有1到10个拷贝融合表达盒的整合子进行rDNA-gRNA的线性化载体和表达Cas9的线性化载体的去除。

四、白藜芦醇工程菌的摇瓶发酵

1、取上述去除线性载体的整合子作为试验菌株，划线接种于固体YPD培养基平板，37℃静置培养48小时。

2、完成步骤1后，挑取平板上的菌落，接种至5mL液体YPD培养基中，37℃、220rpm振荡培养12h，得到种子液。

3、完成步骤2后，将种子液按照1％的接种量接种至50mL液体YPD培养基中，同时向培养基中添加酪氨酸，使酪氨酸初始浓度为10mM，37℃、220rpm震荡培养。

培养过程中，每隔12h取样一次。使用分光光度计在波长663nm下测测菌液OD值。12000g离心菌液2分钟，取上清液，加入等体积无水乙醇，混匀后12000g离心2分钟，取上清液冻存于-20℃以备检测白藜芦醇浓度。

五、白藜芦醇的检测

白藜芦醇浓度的检测方法：高效液相法，在参考文献(Li,M.et al.De novoproduction of resveratrol from glucose or ethanol by engineered Saccharomycescerevisiae.Metab Eng 32,1-11,2015)中白藜芦醇检测方法的基础上略有变动，具体方法如下：

所用色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm,Agilent,USA)；柱温：40℃；紫外检测波长：306nm；流动相A为0.1％磷酸(V/V)水溶液。流动相A：流动相B＝70：30，流动相总流量为1mL/min。

以市售白藜芦醇(SIGMA)为标准品制作标准曲线，计算样品的白藜芦醇浓度。

结果如14所示，HPLC成功检测到了白藜芦醇。白藜芦醇产量随着融合表达盒拷贝数的增加而增加，整合有9.81±0.55个拷贝表达盒的菌株产量最高为97.23±4.84mg/L，其与整合有一个拷贝表达盒的菌株相比，白藜芦醇产量提高了20.73倍(图15)。

实施例3、汉逊酵母中重组人血清白蛋白的生物合成

一、整合HSA基因修复模板的获得

参照实施例1中方法扩增rDNA位点上游同源臂(序列9)；参照实施例2中方法扩增rDNA位点下游同源臂(序列10)。以酿酒酵母SC001基因组为模板，以HP164和HP321为引物扩增启动子P_scTEF1，得到长622bp的PCR产物(序列11)。以合成HSA基因为模板，以HP325和HP326为引物扩增HSA基因，得到长1892bp的PCR产物(序列20)。以限制性内切酶BglII和BamHI双酶切质粒pWYE3200得到长度为1920bp的片段。将上述PCR产物及酶切片段纯化后进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含博来霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以HP325和HP326为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE3232(rDNAupHA-P_scTEF1HSA-rDNAdownHA)。以质粒pWYE3232为模板以HP208和HP211为引物进行PCR扩增，得到DNA片段rDNAupHA-P_scTEF1-HSA-rDNAdownHA。将该片段作为在汉逊酵母rDNA位点整合基因HSA的修复模板。

二、HSA基因在汉逊酵母rDNA位点的多拷贝整合

将线性化的质粒pWYE3220和整合P_scTEF1-HSA的修复模板共转化到汉逊酵母HP022中。在含G418(200μg/mL)的YPD平板上筛选重组菌转化子。随机挑选24个转化子，提取它们的基因组，以HP380和HP383为引物进行PCR验证。随机挑选8个正确的转化子，以它们的基因组为模板，通过qPCR检测基因HSA的拷贝数。基因MOX被选作内参基因，其检测引物为HP45和HP46，目的基因HAS的检测引物为HP339和HP340。结果如图16所示，HSA的拷贝数由2.48±0.42到10.24±1.26不等。

三、基因组上线性化载体的去除

参照实施例1中方法将整合有10.24±1.26个拷贝HSA基因的菌株进行rDNA-gRNA的线性化载体和表达Cas9的线性化载体的去除，将所得菌株命名为HP031(HP001rDNA::HSA)。

四、重组人血清白蛋白的摇瓶发酵试验

1、取上HP031作为试验菌株，划线接种于固体YPD培养基平板，37℃静置培养48小时。

3、完成步骤2后，将种子液按照1％的接种量接种至50mL液体YPD培养基中37℃、220rpm震荡培养。

培养过程中，每隔12h取样一次。使用分光光度计在波长663nm下测菌液OD值。12000g离心2分钟，收集上清冻存于-80℃以备检测重组人血清白蛋白浓度。

五、重组人血清白蛋白的检测：

1、样品处理：取450μL样品于1.5mL离心管中，加入50μL三氯乙酸，冰浴静置5小时。12000rpm、4℃离心2分钟。弃上清，加1mL丙酮重悬沉淀，-20℃静置1小时。12000rpm、4℃离心2分钟。弃上清，加入50μLPBS重悬沉淀。

2、浓度检测：以试剂盒Quantichrom BCG Albumin Assay Kit(DIAG-250)检测重组人血清白蛋白浓度。

结果如图17所示，摇瓶发酵72h时重组人血清白蛋白产量最高为97.09±2.45mg/L。

实施例4、基因多拷贝整合方法在酿酒酵母中的建立

一、表达Cas9质粒的构建

以质粒pCRCT为模板，以SC77和SC78为引物扩增基因Cas9，得到长4259bp的PCR产物(序列4)。将上述PCR产物进行纯化。以限制性内切酶BamHI和EcoRI对质粒pWYE3222(pYES2.0/CT)进行双酶切，得到长度为5932bp的片段，并对该片段进行纯化。将纯化后的PCR产物和双酶切质粒所得片段进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以SC77和SC78为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE3224(P_GAL1-Cas9)。

二、表达Cas9菌株的获得

将质粒pWYE3224转化到酿酒酵母SC001中，在尿嘧啶营养缺陷型平板上筛选转化子。提取转化子内的质粒，以质粒为模板，以SC77和SC78为引物进行验证。将验证正确的转化子命名为SC006(SC001/pWYE3224)。三、转录SCrDNA-gRNA载体的构建

以酿酒酵母SC001基因组为模板，以SC86和SC81为引物扩增启动子P_scSNR52，得到长327bp的PCR产物(序列7)。以质粒pCRCT为模板，以SC82和SC87为引物扩增gRNA转录盒(包括包含N20的crRNA、trancrRNA和终止子SUP4t，其中N₂₀设计在引物SC82里，其具体序列为ATCTATTATAATATACGATG，即序列24)，得到长179bp的片段(序列8)，将两个PCR产物进行纯化。以限制性内切酶XhoI和KpnI对质粒pWYE3223(pESC-LEU)进行双酶切，得到长度为635bp的片段，并对该片段进行纯化。将纯化后的PCR产物和双酶切质粒所得片段进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以SC86和SC87为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE3225(P_scSNR52-SCrDNAgRNA)。

四、在酿酒酵母rDNA位点多拷贝整合gfpmut3a基因所用修复模板的获得

以酿酒酵母SC001基因组为模板，以HP262和HP263为引物，扩增rDNA位点上游同源臂，得到长1128bp的PCR产物(序列21)；以HP264和HP265为引物，扩增rDNA位点下游同源臂，得到长1097bp的PCR产物(序列22)。以实施例1中方法扩增启动子P_scTEF1(序列11)和基因gfpmut3a(序列12)。将上述四个PCR产物进行纯化。以限制性内切酶BglII和BamHI双酶切质粒pWYE3200得到长度为1920bp的片段并进行纯化。将纯化后的四个PCR产物和双酶切质粒所得片段进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含博来霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以HP164和HP165为引物，采用菌落PCR鉴定转化子。对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE3226(SCrDNAupHA-P_scTEF1-gfpmut3a-SCrDNAdownHA)。以质粒pWYE3226为模板，以HP262和HP265为引物进行PCR扩增，得到DNA片段SCrDNAupHA-P_scTEF1-gfpmut3a-SCrDNAdownHA。将该片段作为在酿酒酵母rDNA位点整合基因gfpmut3a的修复模板。

五、基因gfpmut3a在酿酒酵母rDNA位点的多拷贝整合

将质粒pWYE3225和整合gfpmut3a的修复模板共转化到酿酒酵母SC006中。在尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型平板SC-URA-LEU上筛选重组菌转化子。随机挑选24个转化子，提取它们的基因组，以SC90和HP376为引物进行PCR验证。结果如图18和图19所示，在被鉴定的转化子中45.83±7.22％成功整合了目的基因gfpmut3a。随机挑选8个整合子，通过qPCR对其进行拷贝数测定，基因ALG9被选为内参基因，其检测引物为HP282和HP283，目的基因gfpmut3a的检测引物为HP258和HP259。结果如图20所示，基因gfpmut3a的拷贝数，由1.25±0.22(4号菌落)到9.74±0.79不等(3号菌落)。通过流式细胞仪检测8个整合子的GFP荧光强度。结果如图21所示，所有整合子中的绿色荧光蛋白均正常表达，而且荧光强度随着拷贝数的增加而增加。

六、表达Cas9载体和转录SCrDNA-gRNA载体的去除

在无选择压力的YPD液体培养基中过夜培养整合有9.74±0.79个拷贝gfpmut3a的菌株，用YPD平板和尿嘧啶营养缺陷型平板SC-URA筛选去除Cas9表达载体的菌株。将去除Cas9表达载体的菌株在YPD液体培养基中过夜培养，用YPD平板和亮氨酸营养缺陷型平板SC-LEU平板筛选去除转录SCrDNA-gRNA载体的菌株，将所得菌株命名为SC007(SC001rDNA::gfpmut3a)。

七、多拷贝gfpmut3a基因在酿酒酵母基因组上的稳定性检测

1、取菌株SC007，划线接种于固体YPD培养基平板，30℃静置培养48小时。

2、完成步骤1后，挑取平板上的菌落，接种至5mL液体YPD培养基中，30℃、220rpm振荡培养12h。

3、完成步骤2后，将步骤1中所得菌液按照1％的接种量接种至50mL液体YPD培养基中30℃、220rpm震荡培养。

结果如图22所示，在无选择压力的培养基里培养96h，基因gfpmut3a的拷贝数基本恒定。这一结果证明了使用该多拷贝无痕整合方法整合的多个拷贝的目的基因在基因组上具有稳定性。

引物序列表

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 目的基因多拷贝整合的方法、重组菌以及重组人血清白蛋白的制备方法

<130> A170794CIDI

<141> 2020-08-11

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1526

<212> DNA

<213> 汉逊酵母(Hansenula polymorpha)

<400> 1

tagagtgtat aacaaaggat attattaatt gacaagtatt tcaaaccagt aaccacgagc 60

cttcaacttc ctcgtcttta tcgtcatcaa actcctcgtc gctctttaca acagaaactg 120

gtttcacctt gctgattgat aaactccgag cgtactccat ttcgttgtaa attgtttcaa 180

tggcagtttg aacgcctgtt tcggaccgga ttctcgctcc cacaagttta gccttttcga 240

taatccttgt gttggtggtc acctccttga gagccctcgc cagactctta tagttcaaat 300

ctttcagact aacaccacat ccaaggtctt cgactcttcc tgcataaaac ttctggtctc 360

caaaaaacgg cttgatgatt gtcggcaccc cgaaccgcaa cgaagctcct gtcgttccag 420

agcctccgtg atgaacagca gcatcgatct gaggaaatag ccaatcatgg ggcacgcttc 480

cagcattata tatttcaggt ggaagcacca cctcaatttc ggtcttcgtt cccagacgat 540

ctgaccaccc tttattcaga atgcacctga catcggcctc aagaacagcg tccacaaccg 600

cttgggtgag ttctgaaggc ttggaaacga cgatggaccc aaatccaatg taaaccacct 660

ttttcccgtc ttttctcgcc tgctcgatga acttagtcag aacctcgggt ggctggtacg 720

tctcgctttc atccaaaaac cagtaaccgg taactttgac ccactcagca aaatccacag 780

aaggaggaaa gacggttggc gaaacgttat aaaggaaagg aacgttattc tgtttcatct 840

ctgctagaga cgttttaggc agccttaacg tttcaacacg ccatttattc acctgatgag 900

cggttcctcg ccagtatcca ttttcgaaag ccacatgggt catatagttg tatgcgccgc 960

ccagtttctg atcgggaacc atgaaggcgt gaggatacgc tctcgtacgt gtccacggca 1020

tggtaaaagc acggaagtaa ggaatttgca gcttctcagc aatgtgaata ccacatattg 1080

acgacggaga ctcgatcaga atatctgtgt cctgacaggc tttccatgat gtgaccaaca 1140

ggtcatcgat ccagctccgg aactttgact tggcctcctt tataaagttg taatttatgg 1200

ttggatgggt gaccatcaat gccatgagtt ctgatggatc tcccgctatc gatgcaaacc 1260

taataccatg tttcttgatc caaggctcga actcggcatg cgtgacaata cgaacctggt 1320

ggccctcttt catcaaggcc tttcccaatg caatataagg ctgaacgtct cctctggatc 1380

caatcgtcaa cagcgtgaat ctgtaagatt tcaacggcct aactttggtt ttggtcaatg 1440

gatgctcttc tatgatgatc ggcacgtcca ggccaattgc atcatggatt cgattttcga 1500

acatcctcaa tctggcagat gctaaa 1526

<210> 2

<211> 1501

<212> DNA

<213> 汉逊酵母(Hansenula polymorpha)

<400> 2

gctccagggg cactcagctt agcggaggac agaaacagag gatagcactt gcaagaacgc 60

tgcttttggg ccatcgcacc gacaagaaag tgtcggttcc tgaggcttac agttcgcgtg 120

gagagctgct tcttgggcca agcatcttga ttctggacga ggccacgtct gcactggatg 180

ccaagtcgga ggaggccatc aagcgcacgc tcaagctgag acaggaggct ggtctgacca 240

ccatcagcat cgctcaccgg ttaagcacca tcaagaccag cgacaaaatt gtggttttca 300

accataaggg tgtgattgtg gagtacgaca atttcgacaa gttgtatgcg gaccccaaga 360

gcgagctcaa cagactgctt tccaagagcg agagcggcga agagacggaa gaaaaggatg 420

agtgaataga ataataatgt acatatatca acgcgattga tgccacagag caaatgcgtc 480

gccgtttttc agcaatgcct ggacgtttgg ccctggcatg tgttccgacc tgccaaaacc 540

cacgttggag tcttgcacgc catattttag catggctacc cagcttgcgt cgaacagttg 600

caggagctgc tctgccgttg acgtggacac cagaccgctc aaggacaccc tataaatttc 660

ctcctcgttg tgtagctcca cggtttcgcg gtaggtcgag acgttggcgt ccgttttgtc 720

gaacggcgag agctgcgggc cgttgatgga cgcatatgct agccattcta gcgtcgtgga 780

cagccactcc tcgtcgtcca gcggaaccag gctgggcatg caaagacggc ccagtctact 840

aacagtgggc tggaaagtaa ccttgcgcac tccctccagc tgcaagtctc caaccactgc 900

gaatcggagc ggtttctggt atttttccgc aaaccagaag agtcgaagcg agtttctgtc 960

ttccgtcgcc agctggctca gatcgagctg caccacaaac agctgctgtc tgatgtttgt 1020

atttccctgt gaaagagccg aacggacgcc cttgagtcca gatttgtaga aggattctgc 1080

ggtcaggcga agcgtcagaa tgcctcgtat cagagaaaca gtgtcttcat gctcagcatg 1140

ctgggcaaca gaaaccacct ggatacttcc aatgtcaatt tgcgacgcca gtttcacaca 1200

gctctgcagt attttgtgca gcgagcagtc tacaataccg tagctgtatt cgagatcggc 1260

gagtctggcc tcgatgttct tgctcacaaa cacgtttttc ggcaccaaaa aatcaatcct 1320

gttggggaag ttctgtttct cgatctgtct ggccacctcc tcgccacatt cggtccagga 1380

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tccacgccaa cacagcacga gccagcgcaa ccgtcgccgg cagtttctga aaataaatgg 720

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ggctccacgt tgcaggagtc ctttgacagg tctccagatt tcaaaatata cgggaaaccg 960

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gaggggattt tccgactgaa cggaatgatg tcagaagtca acaagatcca ggagatcttc 1080

aacgagaaga acgactgcga cttctcaacg ctgtcgacgc cgcctgatgt gcactcaatt 1140

gcaacccttt tcaaaagata cctgcgaaca ctgaaagtga cggtgatccc ggaggaagag 1200

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ctgaccaatt acaagtacta cttcgaggac ggcgaaatgg tggtgcgcta gtgctaccat 1500

atctgaggtt acgtaatatg cactatttca tagataataa tatccaagtc agcaaaatat 1560

catatattaa tttaatttaa tttacatgga ctcaaaggtc gttggaattt tgggcggcgg 1620

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aaaagacgaa cagtatcaca tggaacgcga ctttttcgta gacctcaatg aacgtgtcaa 4260

attatatgac gaagaccaaa gatatcatga gctcatggat gacgtgtttc ccatccaagg 4320

cattgatttt gcagagccaa ccaaagagcc gattctcgtt ctaaaagggg gtcggggagg 4380

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ggtcggactg ccaaatgcgg gaaagtccac gctattgcgc gccatttcta acgctcggcc 4560

acgtgtgggt cactgggagt tcaccacact gcaacctaca attggaacga tacagctgcg 4620

aattgatcag ccgtctttca cagtggccga tattcctgga gtggtcaagg gtgccagcga 4680

gaatagaggc atgggtctga ctttcttgcg acacgtggag agatcgggcg gcttagtttt 4740

cgtgatatct ctgggtagcg agaatcctgt ggaagatttg aaagtcctgc ttcaggaaat 4800

gggacctcaa cgaatggaag c 4821

<210> 14

<211> 4560

<212> DNA

<213> 汉逊酵母(Hansenula polymorpha)

<400> 14

cttcatcaac aacttcccag acaaactgga gactgtggtc ggctccaggg gcactcagct 60

tagcggagga cagaaacaga ggatagcact tgcaagaacg ctgcttttgg gccatcgcac 120

cgacaagaaa gtgtcggttc ctgaggctta cagttcgcgt ggagagctgc ttcttgggcc 180

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caagcgcacg ctcaagctga gacaggaggc tggtctgacc accatcagca tcgctcaccg 300

gttaagcacc atcaagacca gcgacaaaat tgtggttttc aaccataagg gtgtgattgt 360

ggagtacgac aatttcgaca agttgtatgc ggaccccaag agcgagctca acagactgct 420

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tacatatatc aacgcgattg atgccacaga gcaaatgcgt cgccgttttt cagcaatgcc 540

tggacgtttg gccctggcat gtgttccgac ctgccaaaac ccacgttgga gtcttgcacg 600

ccatatttta gcatggctac ccagcttgcg tcgaacagtt gcaggagctg ctctgccgtt 660

gacgtggaca ccagaccgct caaggacacc ctataaattt cctcctcgtt gtgtagctcc 720

acggtttcgc ggtaggtcga gacgttggcg tccgttttgt cgaacggcga gagctgcggg 780

ccgttgatgg acgcatatgc tagccattct agcgtcgtgg acagccactc ctcgtcgtcc 840

agcggaacca ggctgggcat gcaaagacgg cccagtctac taacagtggg ctggaaagta 900

accttgcgca ctccctccag ctgcaagtct ccaaccactg cgaatcggag cggtttctgg 960

tatttttccg caaaccagaa gagtcgaagc gagtttctgt cttccgtcgc cagctggctc 1020

agatcgagct gcaccacaaa cagctgctgt ctgatgtttg tatttccctg tgaaagagcc 1080

gaacggacgc ccttgagtcc agatttgtag aaggattctg cggtcaggcg aagcgtcaga 1140

atgcctcgta tcagagaaac agtgtcttca tgctcagcat gctgggcaac agaaaccacc 1200

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tcgatctgtc tggccacctc ctcgccacat tcggtccagg agccggtccg tactctgatt 1440

ttaggtggtt ttttcattga gaatgagagg cagtgcaacc acaaaaaaaa aaactacaaa 1500

atacatttaa aaaaagagtc agagttcaac tcgcacaccg acatggggta caagatcgtc 1560

aaagaacagc ccgaaaaccc attttcgaag ctcgtgagtg gccagacaat tgtagagatc 1620

ccagagttcg agctcgaatc gggtgacgtg ctgtacaaag tgccggtggc gtacaagaca 1680

tggggaaagc tcaacgacaa aggagacaac tgcatgctta tagcacacgc cctgaccggc 1740

tctgcggatg taaaggactg gtggggacca ttgataggac gcgaccgtgc gttcgaccct 1800

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ggacggtttg tgaaaaacct tgttgcgctg gcaaccagtg cgagacactc ggcatggtgc 2100

atctcgtggg gagaggccca gagacagtgc atatattccg accccaaata cgacgacggc 2160

tactatagtc tggaagaccc tcctgtgaat gggcttggag ctgcgcggat ggcagcttta 2220

ctcacataca ggtcgcgaaa ttcgtttgag agcagatttg gtcgtggaca gccaacagaa 2280

cagcagaaga ataagagcca acagagcact ccgggccccg acgaggctaa tgcgatcgag 2340

gactctcctt cggcaaagga agagcattgg caaatccaca accacggtgc ctctgtgcac 2400

aggagatcgt ttgagtcgag acacgctagt cgctcaaact caatggactc atcagtttcc 2460

tcggcagaca cagaaagcct aagctctgcc acatcggcta gaaccagacc aaaacgcaga 2520

ccgcaacact acttctcagc acagagctat ctcaggtacc aagcacaaaa gttccaccat 2580

cgatttgacg ccaactgcta catatccatc acgaggaagc tcgacacgca cgacgtcggc 2640

cgcgaccgcc cagaattcga caatgacgcc gcaaaagcac tgcagagcct gaagcagccg 2700

tccctgatta ttggaatcga ctcggacgcg ctgttcacgc tcagtgagca gatcttcatt 2760

gccaaaaaca tgccaaactc aacgctcaag aaaatcaact ctccagaagg acatgatgcg 2820

ttcctgctag aattcaagga aatcaatgac ttgatattaa atttcgaaaa agcccatatc 2880

aaggagatta tggaccacga gggcaataat ccagattggc aggacgacga cacagaacac 2940

aaggaaagcg ttttcggtga ggctgaggac gttgcaaatt ggtgatagag tgtataacaa 3000

aggatattat taattgacaa gtatttcaaa ccagtaacca cgagccttca acttcctcgt 3060

ctttatcgtc atcaaactcc tcgtcgctct ttacaacaga aactggtttc accttgctga 3120

ttgataaact ccgagcgtac tccatttcgt tgtaaattgt ttcaatggca gtttgaacgc 3180

ctgtttcgga ccggattctc gctcccacaa gtttagcctt ttcgataatc cttgtgttgg 3240

tggtcacctc cttgagagcc ctcgccagac tcttatagtt caaatctttc agactaacac 3300

cacatccaag gtcttcgact cttcctgcat aaaacttctg gtctccaaaa aacggcttga 3360

tgattgtcgg caccccgaac cgcaacgaag ctcctgtcgt tccagagcct ccgtgatgaa 3420

cagcagcatc gatctgagga aatagccaat catggggcac gcttccagca ttatatattt 3480

caggtggaag caccacctca atttcggtct tcgttcccag acgatctgac caccctttat 3540

tcagaatgca cctgacatcg gcctcaagaa cagcgtccac aaccgcttgg gtgagttctg 3600

aaggcttgga aacgacgatg gacccaaatc caatgtaaac cacctttttc ccgtcttttc 3660

tcgcctgctc gatgaactta gtcagaacct cgggtggctg gtacgtctcg ctttcatcca 3720

aaaaccagta accggtaact ttgacccact cagcaaaatc cacagaagga ggaaagacgg 3780

ttggcgaaac gttataaagg aaaggaacgt tattctgttt catctctgct agagacgttt 3840

taggcagcct taacgtttca acacgccatt tattcacctg atgagcggtt cctcgccagt 3900

atccattttc gaaagccaca tgggtcatat agttgtatgc gccgcccagt ttctgatcgg 3960

gaaccatgaa ggcgtgagga tacgctctcg tacgtgtcca cggcatggta aaagcacgga 4020

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tcagaatatc tgtgtcctga caggctttcc atgatgtgac caacaggtca tcgatccagc 4140

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tcaatgccat gagttctgat ggatctcccg ctatcgatgc aaacctaata ccatgtttct 4260

tgatccaagg ctcgaactcg gcatgcgtga caatacgaac ctggtggccc tctttcatca 4320

aggcctttcc caatgcaata taaggctgaa cgtctcctct ggatccaatc gtcaacagcg 4380

tgaatctgta agatttcaac ggcctaactt tggttttggt caatggatgc tcttctatga 4440

tgatcggcac gtccaggcca attgcatcat ggattcgatt ttcgaacatc ctcaatctgg 4500

cagatgctaa acttgtattg gactctgcta aattgcaact ctcatcgctc gaaccttcgc 4560

<210> 15

<211> 440

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 15

ccttcgagat tatatctagg aacccatcag gttggtggaa gattacccgt tctaagactt 60

ttcagcttcc tctattgatg ttacacctgg acaccccttt tctggcatcc agtttttaat 120

cttcagtggc atgtgagatt ctccgaaatt aattaaagca atcacacaat tctctcggat 180

accacctcgg ttgaaactga caggtggttt gttacgcatg ctaatgcaaa ggagcctata 240

tacctttggc tcggctgctg taacagggaa tataaagggc agcataattt aggagtttag 300

tgaacttgca acatttacta ttttcccttc ttacgtaaat atttttcttt ttaattctaa 360

atcaatcttt ttcaattttt tgtttgtatt cttttcttgc ttaaatctat aactacaaaa 420

aacacataca taaactaaaa 440

<210> 16

<211> 671

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 16

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tgctggtgta tttaccaata atgtttaatg tatatatata tatatatata tggggccgta 120

tacttacata tagtagatgt caagcgtagg cgcttcccct gccggctgtg agggcgccat 180

aaccaaggta tctatagacc gccaatcagc aaactacctc cgtacattca tgttgcaccc 240

acacatttat acacccagac cgcgacaaat tacccataag gttgtttgtg acggcgtcgt 300

acaagagaac gtgggaactt tttaggctca ccaaaaaaga aagaaaaaat acgagttgct 360

gacagaagcc tcaagaaaaa aaaaattctt cttcgactat gctggaggca gagatgatcg 420

agccggtagt taactatata tagctaaatt ggttccatca ccttcttttc tggtgtcgct 480

ccttctagtg ctatttctgg cttttcctat tttttttttt ccatttttct ttctctcttt 540

ctaatatata aattctcttg cattttctat ttttctctct atctattcta cttgtttatt 600

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<210> 17

<211> 1659

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

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aacaacgcta tctggtatca taagactggt gctggtaagt tgttgccatt cactgatgtt 300

agagctgcaa tgttgttgag agctaattca catatgagag gtgcctctgg tattagattg 360

gaaatcatcc aaagaatggt caccttcttg aacgctaatg ttactccaca tgttagagaa 420

ttcggttcta ttggtgcttc tggtgatttg gttccattga tttctattac cggtgctttg 480

ttgggtactg atcaagcttt tatggttgac ttcaacggtg aaaccttgga ttgcatttct 540

gctttggaaa gattgggttt gccaagattg agattgcaac ctaaagaagg tttagctatg 600

atgaacggta cttctgttat gactggtatt gctgctaact gtgttcatga tgccagaatt 660

ttgttggctt tggctttaga agctcatgcc ttgatgattc aaggtttaca aggtactaat 720

caatccttcc atccattcat ccatagacat aagccacata ctggtcaagt ttgggctgct 780

gatcatatgt tggaattatt gcaaggttcc caattgtcca gaaacgaatt ggatggttct 840

cacgattata gagatggtga cttgattcaa gacagatact ctttgagatg cttgccacaa 900

tttttgggtc caattattga tggtatggcc ttcatctctc atcacttgag agttgaaatc 960

aattccgcta acgataaccc tttgattgat actgcttctg ctgcttctta tcacggtggt 1020

aatttcttgg gtcaatatat cggtgttggt atggaccaat tgagatatta catgggtttg 1080

atggctaagc acttggatgt tcaaattgcc ttgttggttt ctccacaatt caacaatggt 1140

ttgccagctt ctttggttgg taacattcaa agaaaggtta atatgggttt aaagggttta 1200

caattgaccg ccaactccat tatgccaatt ttgacttttt tgggtaactc cttggctgat 1260

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<210> 18

<211> 1686

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1686)

<400> 18

atggctccac aagaacaagc tgtttctcaa gttatggaaa agcaatctaa caacaacaac 60

tctgacgtta tcttcagatc taagttgcca gacatctaca tcccaaacca cttgtctttg 120

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ccagacgacg ttgttgcttt gccatactct tctggtacta ctggtttgcc aaagggtgtt 660

atgttgactc acaagggttt ggttacttct gttgctcaac aagttgacgg tgaaaaccca 720

aacttgtact tccactctga cgacgttatc ttgtgtgttt tgccaatgtt ccacatctac 780

gctttgaact ctatcatgtt gtgtggtttg agagttggtg ctgctatctt gatcatgcca 840

aagttcgaaa tcaacttgtt gttggaattg atccaaagat gtaaggttac tgttgctcca 900

atggttccac caatcgtttt ggctatcgct aagtcttctg aaactgaaaa gtacgacttg 960

tcttctatca gagttgttaa gtctggtgct gctccattgg gtaaggaatt ggaagacgct 1020

gttaacgcta agttcccaaa cgctaagttg ggtcaaggtt acggtatgac tgaagctggt 1080

ccagttttgg ctatgtcttt gggtttcgct aaggaaccat tcccagttaa gtctggtgct 1140

tgtggtactg ttgttagaaa cgctgaaatg aagatcgttg acccagacac tggtgactct 1200

ttgtctagaa accaaccagg tgaaatctgt atcagaggtc accaaatcat gaagggttac 1260

ttgaacaacc cagctgctac tgctgaaact atcgacaagg acggttggtt gcacactggt 1320

gacatcggtt tgatcgacga cgacgacgaa ttgttcatcg ttgacagatt gaaggaattg 1380

atcaagtaca agggtttcca agttgctcca gctgaattgg aagctttgtt gatcggtcac 1440

ccagacatca ctgacgttgc tgttgttgct atgaaggaag aagctgctgg tgaagttcca 1500

gttgctttcg ttgttaagtc taaggactct gaattgtctg aagacgacgt taagcaattc 1560

gtttctaagc aagttgtttt ctacaagaga atcaacaagg ttttcttcac tgaatctatc 1620

ccaaaggctc catctggtaa gatcttgaga aaggacttga gagctaagtt ggctaacggt 1680

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<210> 19

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1179)

<400> 19

atggcttctg ttgaagaaat cagaaacgct caaagagcta agggtccagc tactatcttg 60

gctatcggta ctgctactcc agaccactgt gtttaccaat ctgactacgc tgacttctac 120

ttcagagtta ctaagtctga acacatgact gctttgaaga agaagttcaa cagaatctgt 180

gacaagtcta tgatcaagaa gagatacatc cacttgactg aagaaatgtt ggaagaacac 240

ccaaacatcg gtgcttacat ggctccatct ttgaacatca gacaagaaat catcactgct 300

gaagttccaa agttgggtaa ggaagctgct ttgaaggctt tgaaggaatg gggtcaacca 360

aagtctaaga tcactcactt ggttttctgt actacttctg gtgttgaaat gccaggtgct 420

gactacaagt tggctaactt gttgggtttg gaaccatctg ttagaagagt tatgttgtac 480

caccaaggtt gttacgctgg tggtactgtt ttgagaactg ctaaggactt ggctgaaaac 540

aacgctggtg ctagagtttt ggttgtttgt tctgaaatca ctgttgttac tttcagaggt 600

ccatctgaag acgctttgga ctctttggtt ggtcaagctt tgttcggtga cggttctgct 660

gctgttatcg ttggttctga cccagacatc tctatcgaaa gaccattgtt ccaattggtt 720

tctgctgctc aaactttcat cccaaactct gctggtgcta tcgctggtaa cttgagagaa 780

gttggtttga ctttccactt gtggccaaac gttccaactt tgatctctga aaacatcgaa 840

aagtgtttga ctcaagcttt cgacccattg ggtatctctg actggaactc tttgttctgg 900

atcgctcacc caggtggtcc agctatcttg gacgctgttg aagctaagtt gaacttggac 960

aagaagaagt tggaagctac tagacacgtt ttgtctgaat acggtaacat gtcttctgct 1020

tgtgttttgt tcatcttgga cgaaatgaga aagaagtctt tgaagggtga aagagctact 1080

actggtgaag gtttggactg gggtgttttg ttcggtttcg gtccaggttt gactatcgaa 1140

actgttgttt tgcactctat cccaatggtt actaactaa 1179

<210> 20

<211> 1830

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1830)

<400> 20

atgaagtggg ttactttcat ctctttgttg ttcttgttct cttctgctta ctctagaggt 60

gttttcagaa gagacgctca caagtctgaa gttgctcaca gattcaagga cttgggtgaa 120

gaaaacttca aggctttggt tttgatcgct ttcgctcaat acttgcaaca atgtccattc 180

gaagaccacg ttaagttggt taacgaagtt actgaattcg ctaagacttg tgttgctgac 240

gaatctgctg aaaactgtga caagtctttg cacactttgt tcggtgacaa gttgtgtact 300

gttgctactt tgagagaaac ttacggtgaa atggctgact gttgtgctaa gcaagaacca 360

gaaagaaacg aatgtttctt gcaacacaag gacgacaacc caaacttgcc aagattggtt 420

agaccagaag ttgacgttat gtgtactgct ttccacgaca acgaagaaac tttcttgaag 480

aagtacttgt acgaaatcgc tagaagacac ccatacttct acgctccaga attgttgttc 540

ttcgctaaga gatacaaggc tgctttcact gaatgttgtc aagctgctga caaggctgct 600

tgtttgttgc caaagttgga cgaattgaga gacgaaggta aggcttcttc tgctaagcaa 660

agattgaagt gtgcttcttt gcaaaagttc ggtgaaagag ctttcaaggc ttgggctgtt 720

gctagattgt ctcaaagatt cccaaaggct gaattcgctg aagtttctaa gttggttact 780

gacttgacta aggttcacac tgaatgttgt cacggtgact tgttggaatg tgctgacgac 840

agagctgact tggctaagta catctgtgaa aaccaagact ctatctcttc taagttgaag 900

gaatgttgtg aaaagccatt gttggaaaag tctcactgta tcgctgaagt tgaaaacgac 960

gaaatgccag ctgacttgcc atctttggct gctgacttcg ttgaatctaa ggacgtttgt 1020

aagaactacg ctgaagctaa ggacgttttc ttgggtatgt tcttgtacga atacgctaga 1080

agacacccag actactctgt tgttttgttg ttgagattgg ctaagactta cgaaactact 1140

ttggaaaagt gttgtgctgc tgctgaccca cacgaatgtt acgctaaggt tttcgacgaa 1200

ttcaagccat tggttgaaga accacaaaac ttgatcaagc aaaactgtga attgttcgaa 1260

caattgggtg aatacaagtt ccaaaacgct ttgttggtta gatacactaa gaaggttcca 1320

caagtttcta ctccaacttt ggttgaagtt tctagaaact tgggtaaggt tggttctaag 1380

tgttgtaagc acccagaagc taagagaatg ccatgtgctg aagactactt gtctgttgtt 1440

ttgaaccaat tgtgtgtttt gcacgaaaag actccagttt ctgacagagt tactaagtgt 1500

tgtactgaat ctttggttaa cagaagacca tgtttctctg ctttggaagt tgacgaaact 1560

tacgttccaa aggaattcaa cgctgaaact ttcactttcc acgctgacat ctgtactttg 1620

tctgaaaagg aaagacaaat caagaagcaa actgctttgg ttgaattggt taagcacaag 1680

ccaaaggcta ctaaggaaca attgaaggct gttatggacg acttcgctgc tttcgttgaa 1740

aagtgttgta aggctgacga caaggaaact tgtttcgctg aagaaggtaa gaagttggtt 1800

gctgcttctc aagctgcttt gggtttgtaa 1830

<210> 21

<211> 1078

<212> DNA

<213> 汉逊酵母(Hansenula polymorpha)

<400> 21

acctaccgac caactttcat gttctgtttc gacctacctc ttgtaaatga caaatcacct 60

ttttcatcgt atgcacctta ttctccacat cacaatgcac tattgctttt gctttttcac 120

ctgtcatatc ctattgctat tagatgaaat ataataaaaa ttgtcctcca cccataacac 180

ctctcactcc cacctactga acatgtctgg accctgccct catatcacct gcgtttccgt 240

taaactatcg gttgcggcca tatctaccag aaagcaccgt ttcccgtccg atcaactgta 300

gttaagctgg taagagcctg accgagtagt gtagtgggtg accatacgcg aaactcaggt 360

gctgcaatct ttatttcttt tttttttttt tttttttttt ttttttctag tttcttggct 420

tcctatgcta aatcccataa ctaacctacc attcgattca gaaaaattcg cactatccag 480

ctgcactctt cttctgaaga gttaagcact ccattatgct cattgggttg ctactacttg 540

atatgtacaa acaatattct cctccgatat tcctacaaaa aaaaaaaaaa aaacactccg 600

gttttgttct cttccctcca tttccctctc ttctacggtt aatactttcc tcttcgtctt 660

tttctacacc ctcgtttagt tgcttcttat tccttcccgc tttcctgcac taacattttg 720

ccgcattaca ctatatgatc gtagtacatc ttacaactcc gcataccgcg tcgccgcgtc 780

gccgcgtcgc caaaaattta cttcgccaac cattccatat ctgttaagta tacatgtata 840

tattgcactg gctattcatc ttgcactttt cctctttctt cttcccagta gcctcatcct 900

tttacgctgc ctctctggaa cttgccatca tcattcccta gaaactgcca tttacttaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaat gtccccactg ttcactgttc actgttcact tgtctcttac 1020

atctttcttg gtaaaatcgt agttcgtagt attttttttc atatcaaagg catgtcct 1078

<210> 22

<211> 1044

<212> DNA

<213> 汉逊酵母(Hansenula polymorpha)

<400> 22

acaaatcaga caacaaaggc ttaatctcag cagatcgtaa caacaaggct actctactgc 60

ttacaatacc ccgttgtaca tctaagtcgt atacaaatga tttatcccca cgcaaaatga 120

cattgcaatt cgccagcaag cacccaaggc ctttccgcca agtgcaccgt tgctagcctg 180

ctatggttca gcgacgccac aaggacgcct tattcgtatc catctatatt gtgtggagca 240

aagaaatcac cgcgttctag catggattct gacttagagg cgttcagcca taatccagcg 300

gatggtagct tcgcggcaat gcctgatcag acagccgcaa aaaccaatta tccgaatgaa 360

ctgttcctct cgtactaagt tcaattacta ttgcggtaac attcatcagt agggtaaaac 420

taacctgtct cacgacggtc taaacccagc tcacgttccc tattagtggg tgaacaatcc 480

aacgcttacc gaattctgct tcggtatgat aggaagagcc gacatcgaag aatcaaaaag 540

caatgtcgct atgaacgctt gactgccaca agccagttat ccctgtggta acttttctgg 600

cacctctagc ctcaaattcc gagggactaa aggatcgata ggccacactt tcatggtttg 660

tattcacact gaaaatcaaa atcaaggggg cttttaccct tttgttctac tggagatttc 720

tgttctccat gagcccccct taggacatct gcgttatcgt ttaacagatg tgccgcccca 780

gccaaactcc ccacctgaca atgtcttcaa cccggatcag ccccgaatgg gaccttgaat 840

gctagaacgt ggaaaatgaa ttccagctcc gcttcattga ataagtaaag aaactataaa 900

ggtagtggta tttcactggc gccgaagctc ccacttattc tacaccctct atgtctcttc 960

acaatgtcaa actagagtca agctcaacag ggtcttcttt ccccgctgat tctgccaagc 1020

ccgttccctt ggctgtggtt tcgc 1044

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<400> 23

atagacgttt ggatagacaa 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<400> 24

atctattata atatacgatg 20

Claims

1.一种介导目的基因在酵母中多拷贝整合的方法，其特征在于，包括：

（A）构建表达Cas9核酸酶的酵母菌株，所述构建表达Cas9核酸酶的酵母菌株为将携带Cas9表达盒的表达载体导入所述酵母菌株，或将Cas9表达盒整合至所述酵母菌株的染色体上；

（B）向所述酵母菌株导入转录gRNA的载体，所述gRNA中的向导序列与所述酵母菌株的rDNA单元序列的片段互补；

（C）向所述酵母菌株导入携带目的基因的修复模板，所述目的基因为编码人血清白蛋白基因HSA，所述HSA如序列表中序列20所示；

（D）通过将所述酵母菌株在无筛选压力的培养基中培养进行载体的消除，或通过同源重组将整合至染色体上的所述表达盒替换为染色体上整合位点的原始DNA片段；

（E）筛选酵母菌株，所述筛选为筛选表达Cas9核酸酶的酵母菌株，筛选转录gRNA的酵母菌株，筛选目的基因整合成功的酵母菌株，和/或筛选至少整合目的基因两个拷贝的酵母菌株；

所述酵母为汉逊酵母Hansenula polymorpha、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、毕赤酵母Pichia pastoris、念珠菌属酵母Candida species、裂殖酵母Schizosaccharomyces Pombe或克鲁维亚酵母Kluyveromyces。

2.根据权利要求1方法构建的重组菌，所述重组菌的rDNA单元包含所述目的基因的至少两个拷贝，且不包含外源遗传标记基因，所述目的基因为HSA基因，所述HSA基因如序列表中序列20所示。

3.一种重组人血清白蛋白的制备方法，其特征在于，包括发酵权利要求2所述的重组菌。