CN109652388B - 一段可用于编码番茄红素脱氢酶的基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一段可用于编码番茄红素脱氢酶的基因，属于基因工程技术领域。本发明基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；将此基因整合至共表达了编码番茄红素环化酶和番茄红素合成酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)的热带假丝酵母中，可使热带假丝酵母能够高效表达β‑胡萝卜素；将此热带假丝酵母发酵96h，可使β‑胡萝卜素的产量高达4.24g·L^‑1。

Description

一段可用于编码番茄红素脱氢酶的基因

技术领域

本发明涉及一段可用于编码番茄红素脱氢酶的基因，属于基因工程技术领域。

背景技术

β-胡萝卜素是人体合成维生素A的前体物质，也是联合国粮农组织和世界卫生组织一致认定的A类营养色素，具有较强的抗氧化、抗衰老和抗肿瘤功能，因此，其被广泛应用于食品、药品、化妆品和保健品等的制备。

目前，β-胡萝卜素主要通过化学合成法生产，但是，化学合成法生产的β-胡萝卜素不易被人体完全吸收，会对人体产生一定的毒副作用，长期服用会对人体造成不可逆病变，并且，化学合成法得到的β-胡萝卜素生物活性十分低下，这无疑大大限制了β-胡萝卜素在食品、药品、化妆品和保健品等领域的应用，而天然β-胡萝卜素的产量却远远无法满足市场需求。

因此，提高β-胡萝卜素的产量，同时，降低β-胡萝卜素的生产成本具有重要的科研意义和广泛的应用前景。

目前，已经有研究通过CRISPR-Cas9基因编辑技术对E.coli中的各基因进行改造以提高β-胡萝卜素的产量，但是，该方法具有产量低的缺陷(目前文献报道最高为3.2g·L^-1)；也有研究通过尝试从红法夫酵母获取CrtE，CrtYB和CrtI三个基因，然后转入酿酒酵母细胞构建重组菌用来发酵生产β-胡萝卜素，但是，此方法构建的菌株具有遗传稳定性差的缺陷。

因此，如何在提高β-胡萝卜素产量的同时降低β-胡萝卜素的生产成本仍需进一步研究。

发明内容

热带假丝酵母是一种二倍体非常规酵母，其细胞内具有高活性合成β-胡萝卜素前体物的代谢途径，是极具潜力的可用于生产β-胡萝卜素的菌株，但是，热带假丝酵母本身不具有可用于合成β-胡萝卜素的基因。为解决上述问题，发明人首先尝试了将编码番茄红素环化酶和番茄红素合成酶的基因以及编码番茄红素脱氢酶的基因同时在热带假丝酵母中共表达，以期望能够使得热带假丝酵母可以产β-胡萝卜素，但是，此共表达了番茄红素环化酶、番茄红素合成酶以及番茄红素脱氢酶的热带假丝酵母并未获得产β-胡萝卜素的能力。这可能是由于热带假丝酵母具有明显的密码子偏好性，并且其通常将CTG密码子翻译成丝氨酸(常规的被翻译成亮氨酸)，易导致异源蛋白在热带假丝酵母中发生突变；同时，除了特殊的使用CTG密码子的方式，与其他酵母相比，热带假丝酵母对其他密码子的使用频率也存在显著的差异，这无疑对异源基因在热带假丝酵母中的表达造成了严重的限制。

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是对编码番茄红素脱氢酶的基因进行密码子优化，进一步地，使得表达经过密码子优化的基因的热带假丝酵母能够高效合成β-胡萝卜素。

[技术方案]

本发明提供了一段通过密码子优化得到的可用于编码番茄红素脱氢酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，将此基因整合至共表达了编码番茄红素环化酶和番茄红素合成酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)的热带假丝酵母中，可使热带假丝酵母能够高效表达β-胡萝卜素；将此热带假丝酵母发酵96h，可使β-胡萝卜素的产量高达4.24g·L^-1。

本发明还提供了携带上述基因的基因表达盒。

在本发明的一种实施方式中，所述基因表达盒为含有FBA1启动子和FBA1终止子的基因表达盒。

本发明还提供了携带上述基因或上述基因表达盒的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pMD19-T载体、pUC18-T载体、pGEM-T载体或pET-28a(+)载体。

本发明还提供了携带上述基因或上述基因表达盒或上述重组质粒的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为热带假丝酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述热带假丝酵母为共表达了番茄红素环化酶和番茄红素合成酶的热带假丝酵母。

在本发明的一种实施方式中，编码所述番茄红素环化酶和番茄红素合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明提还供了一种生产β-胡萝卜素的方法，所述方法为将上述宿主细胞在培养基中进行发酵，从发酵液中分离得到β-胡萝卜素。

本发明提供了上述基因或上述基因表达盒或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述方法在生产β-胡萝卜素方面的应用。

[有益效果]

本发明提供了一段可用于编码番茄红素脱氢酶的基因(核苷酸序列如SEQ IDNO.24所示)，将此基因整合至共表达了编码番茄红素环化酶和番茄红素合成酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)的热带假丝酵母中，可使热带假丝酵母能够高效合成β-胡萝卜素；将此热带假丝酵母发酵96h，可使β-胡萝卜素的产量高达4.24g·L^-1。

附图说明

图1：质粒Ts-CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB-T_FBA1的物理图谱；

其中，CAT1：同源重组用同源臂；URA3：标记基因；P_FBA1：果糖1,6-二磷酸醛缩酶基因的启动子；carB：根据热带假丝酵母密码子偏好性优化的番茄红素脱氢酶基因；T_FBA1：果糖1,6-二磷酸醛缩酶基因的终止子；

图2：表达盒CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB1-T_FBA1-CAT1转化热带假丝酵母ZZ-RPT菌株后的转化子生长情况；

图3：表达盒CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB2-T_FBA1-CAT1转化热带假丝酵母ZZ-RPT菌株后的转化子生长情况；

图4：表达盒CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB3-T_FBA1-CAT1转化热带假丝酵母ZZ-RPT菌株后的转化子生长情况；

图5：不同表达盒转化热带假丝酵母ZZ-RPT菌株后的不同转化子的PCR鉴定结果；

其中，泳道ck1为表达盒CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB1-T_FBA1-CAT1的空白对照(无carB1基因)；泳道1-7为表达盒CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB1-T_FBA1-CAT1的不同转化子的PCR鉴定结果；泳道ck2为表达盒CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB2-T_FBA1-CAT1的空白对照(无carB2基因)；泳道8-14为表达盒CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB2-T_FBA1-CAT1的不同转化子的PCR鉴定结果；泳道ck3为表达盒CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB3-T_FBA1-CAT1的空白对照(无carB3基因)；泳道15-21为表达盒CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB3-T_FBA1-CAT1的不同转化子的PCR鉴定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的热带假丝酵母ATCC 20336购自美国典型菌株保藏中心(ATCC)；pMD19-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒Ts-POX4-gda324-URA3及其构建方法记载于文献“张利华.热带假丝酵母遗传操作系统的建立及在二元酸合成中的应用:硕士学位论文.江苏:江南大学,2016”中；质粒Ts-CAT1-gda324-URA3及其构建方法记载于文献“Lihua Zhang,et al.2016,Development of an efficient genetic manipulationstrategy for sequential gene disruption and expression of differentheterologous GFP genes in Candida tropicalis.Appl Microbiol Biot,100(22):9567-9580”中。

下述实施例中涉及的培养基如下：

基本培养基(MM培养基)：YNB 6.7g·L^-1，硫酸铵10g·L^-1，葡萄糖20g·L^-1。

补充培养基(SM培养基)：YNB 6.7g·L^-1，硫酸铵10g·L^-1，葡萄糖20g·L^-1，尿嘧啶0.06g·L^-1。

FOA平板：YNB 6.7g·L^-1，硫酸铵10g·L^-1，葡萄糖20g·L^-1，尿嘧啶0.06g·L^-1，5-氟乳清酸0.2g·L^-1。

种子培养基(YPD20)：20g·L^-1葡萄糖，10g·L^-1蛋白胨，5g·L^-1酵母粉。

发酵培养基(YPD30)：30g·L^-1葡萄糖，10g·L^-1蛋白胨，5g·L^-1酵母粉。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

DNA质量的测定：

DNA质量浓度通过NanoDrop 2000超微量分光光度(赛默飞世尔科技公司)测定。

黄色转化子数目的测定：

将菌株在FOA平板上培养后对黄色菌落进行计数。

转化效率的测定：

转化效率的计算公式为：转化效率＝(黄色转化子数目/DNA质量)。

β-胡萝卜素产量的测定：

1、提取

取10mL发酵液，8000rpm·min^-1离心10min后弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤2次，随后将菌体于60℃烘箱干燥24h；然后用5mL浓度为3mol·L^-1的盐酸重悬干燥的酵母菌体，室温振荡1h后沸水浴3min，迅速冷却；8000rpm·min^-1离心10min后弃上清，沉淀用蒸馏水洗涤一次，溶于5ml丙酮(含5％的BHT)，于室温振荡30min，然后8000rpm·min^-1离心10min，上清即为β-胡萝卜素提取液；

2、检测

取1mLβ-胡萝卜素提取液用0.22μm有机滤膜过滤，用高效液相色谱仪进行分析，流动相为35％甲醇、35％乙腈和30％乙酸乙酯。色谱柱为安捷伦TC-C18，β-胡萝卜素检测波长450nm，进样量10μL，流速1mL·min^-1，柱温25℃，保留时间为15min。

实施例1：尿嘧啶营养缺陷型热带假丝酵母菌株(ZZ)的构建

具体步骤如下：

(1)根据NCBI中热带假丝酵母的URA3基因序列(SEQ ID NO.1)设计引物URA3-F1：5’-TACTCTAACGACGGGTACAAC-3’(SEQ ID NO.2)和URA3-R1：5’-ACATCGGTACCAGTCAGAATTGTGCTAACCATTGCGAAT-3’(SEQ ID NO.3)，URA3-F2：5’-ATTCGCAATGGTTAGCACAATTCTGACTGGTACCGATGT-3’(SEQ ID NO.4)和URA3-R2：5’-ACCCGATTTCAAAAGTGCAGA-3’(SEQ ID NO.5)；然后分别以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，通过PCR扩增URA3基因的5’端片段(1URA3，长度为436bp)和3’端片段(2URA3，长度488bp)；

(2)以URA3-F1和URA3-R2为引物，1URA3和2URA3为模板，通过融合PCR扩增URA3基因删除盒1URA3-2URA3；

(3)将上述URA3基因删除盒通过氯化锂转化法(氯化锂转化法记载于文献“LihuaZhang,et al.2016,Development of an efficient genetic manipulation strategyfor sequential gene disruption and expression of different heterologous GFPgenes in Candida tropicalis.Appl Microbiol Biot,100(22):9567-9580”中)转化热带假丝酵母ATCC 20336菌株，然后通过FOA平板筛选URA3基因缺失突变菌株，阳性转化子命名为ZZ。

实施例2：基因表达盒的构建

具体步骤如下：

1、carRP基因整合表达盒的构建：

(1)根据NCBI中热带假丝酵母的GAPDH基因序列(SEQ ID NO.6)设计引物PGAP-F：5’-GCTCTAGAAACGTGGTATGGTTGTAAGAAAC-3’(SEQ ID NO.7)和TGAP-R：5’-GCTCTAGATCTGGTTTAGAAGTAGGGACTGTATG-3’(SEQ ID NO.8)；以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，通过PCR扩增GAPDH基因，然后插入到pMD19-T Simple商业化载体中，获得重组质粒Ts-GAPDH；然后以PGAP-R：5’-CCCAAGCTTTGTTTAAATTCTTTAATTG-3’(SEQ ID NO.9)和TGAP-F：5’-GCGTCGACGCTATCCAACAAACTCTAG-3’(SEQ ID NO.10)为引物，以质粒Ts-GAPDH为模板，通过PCR获得携带GAPDH启动子和GAPDH终止子的线性化DNA片段(GAPDH启动子-pMD19-TSimple载体-GAPDH终止子，简记为P_GAPDH-Ts-T_GAPDH)；

(2)根据热带假丝酵母的密码子偏好性对来源于卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)的carRP基因(SEQ ID NO.11)进行全序列密码子优化，然后化学合成得到优化后的carRP基因(SEQ ID NO.12)，将优化后的carRP基因与线性化DNA片段P_GAPDH-Ts-T_GAPDH连接，获得重组质粒Ts-P_GAPDH-carRP-T_GAPDH；

(3)用Xba I酶切质粒Ts-P_GAPDH-carRP-T_GAPDH，回收carRP基因表达盒P_GAPDH-carRP-T_GAPDH。

(4)在质粒Ts-POX4-gda324-URA3同源臂外侧添加两个MluI酶切位点，然后将P_GAPDH-carRP-T_GAPDH表达盒插入到重组质粒的Xba I酶切位点处，获得重组质粒Ts-POX4-gda324-URA3-P_GAPDH-carRP-T_GAPDH；用Mlu I酶切质粒Ts-POX4-gda324-URA3-P_GAPDH-carRP-T_GAPDH，获得线性化的carRP基因整合表达盒POX4-gda324-URA3-P_GAPDH-carRP-T_GAPDH-POX4。

2、carB基因整合表达盒的构建：

(1)根据热带假丝酵母ATCC 20336菌株的基因组测序结果，设计引物PPFA-F：5’-GCGTCGACTACGATAACCCATTGATTTCT-3’(SEQ ID NO.13)和TFBA-R：5’-GCGTCGACGCCGAGATCCAGTTCCAAGCC-3’(SEQ ID NO.14)；以热带假丝酵母ATCC20336染色体DNA为模板，通过PCR扩增FBA1基因(SEQ ID NO.15)，然后插入到pMD19-T Simple商业化载体中，获得重组质粒Ts-FBA1；以PFBA-R：5’-TGTTGGATGATTTGTAGATAAGGTAGTAAA-3’(SEQ IDNO.16)和TFBA-F：5’-GCTTCCATGGAACAACATTTAAAAAAT-3’(SEQ ID NO.17)为引物，以质粒Ts-FBA1为模板，通过PCR获得携带FBA1基因启动子和终止子的线性化DNA片段(FBA1启动子-pMD19-T Simple载体-FBA1终止子，简记为P_FBA1-Ts-T_FBA1)；

(2)根据NCBI中卷枝毛霉的carB基因序列(SEQ ID NO.18)设计引物carB-F：5’-CTACAAATCATCCAACAGCCACCATGTCCAAGAAACACATTGTCAT-3’(SEQ ID NO.19)和carB-R：5’-TGTTGTTCCATGGAAGCTTAAATGACATTAGAGTTATGAACG-3’(SEQ ID NO.20)，然后以卷枝毛霉基因组DNA为模板PCR扩增carB基因编码区片段；将获得的carB基因片段通过诺唯赞公司的一步克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)插入到线性化DNA片段P_FBA1-Ts-T_FBA1中，获得重组质粒Ts-P_FBA1-carB-T_FBA1；

(3)用Sal I酶切质粒Ts-P_FBA1-carB-T_FBA1，回收carB表达盒P_FBA1-carB-T_FBA1，然后通过pfu DNApolymerase对各片段中的粘性末端进行补平；

(4)在质粒Ts-CAT1-gda324-URA3的同源臂外侧引入两个MluI酶切位点构建重组质粒，然后用XbaI酶切上述重组质粒并通过pfu DNApolymerase对酶切的粘性末端进行补平；

(5)用T4DNA连接酶对(3)和(4)中获得的两段DNA片段进行连接，获得重组质粒Ts-CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB-T_FBA1；

(6)用MluI酶切重组质粒Ts-CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB-T_FBA1，通过琼脂糖凝胶电泳回收获得线性化的carB基因整合表达盒CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB-T_FBA1-CAT1。

实施例3：重组菌株的构建

具体步骤如下：

(1)将实施例2得到的carRP基因整合表达盒通过氯化锂转化法(氯化锂转化法记载于文献“Lihua Zhang,et al.2016,Development of an efficient geneticmanipulation strategy for sequential gene disruption and expression ofdifferent heterologous GFP genes in Candida tropicalis.Appl Microbiol Biot,100(22):9567-9580”中)转化实施例1得到的尿嘧啶营养缺陷型热带假丝酵母菌株ZZ，然后通过基本培养基平板筛选转化子，阳性转化子命名为ZZ-RP；将ZZ-RP菌株接种于液体SM培养基中30℃，200r·min^-1培养，染色体中的同向重复序列(即，carRP表达盒POX4-gda324-URA3-P_GAPDH-carRP-T_GAPDH-POX4中的gda324片段和URA3基因的3`端序列)会在酵母细胞染色体复制过程中发生随机的同源重组，从而环化弹出标记基因(URA3)，进而通过FOA平板筛选获得尿嘧啶营养缺陷型突变株ZZ-RPT；

(2)将实施例2得到的carB基因整合表达盒同样通过氯化锂转化法转化热带假丝酵母ZZ-RPT，然后通过基本培养基平板筛选转化子。

阳性转化子菌落为黄色，假阳性转化子菌落为白色，此次并未筛选得到任何阳性转化子，推测可能是carB基因未进行优化，不适应热带假丝酵母的表达环境。

实施例4：carB基因的初步优化

具体步骤如下：

根据热带假丝酵母的密码子偏好性对来源于卷枝毛霉的carB基因(SEQ IDNO.18)中CTG密码子进行优化，然后化学合成，得到carB1(SEQ ID NO.21)，经比对，该基因与初始carB基因(SEQ ID NO.18)的相似性为98.85％。

参照实施例2中的方法，获得针对carB1基因的基因整合表达盒CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB1-T_FBA1-CAT1。

参照实施例3中的方法，将基因整合表达盒CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB1-T_FBA1-CAT1转化热带假丝酵母ZZ-RPT，然后通过基本培养基平板筛选转化子。

阳性转化子菌落为黄色，假阳性转化子菌落为白色，经多次转化后筛选获得了CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB1-T_FBA1-CAT1表达盒正确整合的突变菌株，但是未筛选到黄色转化子，推测可能是因为优化后的carB1基因依旧不能在热带假丝酵母中表达或表达水平过低。

实施例5：carB基因的进一步优化

具体步骤如下：

根据热带假丝酵母的密码子偏好性对来源于卷枝毛霉的carB基因(SEQ IDNO.18)进行进一步的全序列密码子优化，然后化学合成，得到三条carB基因，即carB2、carB3和carB4(SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24)，经比对，此三条基因与初始carB基因(SEQ ID NO.18)的相似性分别为77.76％、78.45％和79.20％。

参照实施例2中的方法，通过carB2、carB3和carB4获得基因整合表达盒CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB2-T_FBA1-CAT1、CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB3-T_FBA1-CAT1和CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB4-T_FBA1-CAT1。

参照实施例3中的方法，将基因整合表达盒CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB2-T_FBA1-CAT1、CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB3-T_FBA1-CAT1和CAT1-gda324-URA3-P_FBA1-carB4-T_FBA1-CAT1转化热带假丝酵母ZZ-RPT，然后通过基本培养基平板筛选转化子。

阳性转化子菌落为黄色，假阳性转化子菌落为白色，对转化子进行筛选并对筛选出的阳性转化子和假阳性转化子提取染色体DNA进行PCR鉴定，得到分别含有carB2、carB3和carB4的ZZ-RPB菌株；

其中，鉴定引物分别为：DcarB2-F：5’-CACATCCACTATGAATCCGGTA-3’(SEQ IDNO.25)和DcarB2-R：5’-TTTTCCTAGCTTTATCGACCA-3’(SEQ ID NO.26)、DcarB3-F：5’-TCTGGTACTCTTATCGCCCTC-3’(SEQ ID NO.27)和DcarB3-R：5’-CCAAGACCATTTTACGTGCCTT-3’(SEQ ID NO.28)、DcarB4-F:5’-ACTCCGATACTTTCCACGAC-3’(SEQ ID NO.29)和DcarB4-R:5’-AAACGTTACAAGCGGCTCT-3’(SEQ ID NO.30)(此次筛选结果见图2-4、PCR结果见图5)。

从图5可知，carB2的阳性转化子PCR产物大小与理论之相一致(理论大小为830bp，泳道5)、carB3的阳性转化子PCR产物大小与理论之相一致(理论大小为910bp，泳道10、12和14)、carB4的阳性转化子PCR产物大小与理论之相一致(理论大小为850bp，泳道15、16、17、18和21)。

根据筛选到的阳性转化子菌落数目，计算carB基因整合表达盒的转化效率(结果如表1)。

统计结果表明：carB4基因构建的表达框转化宿主菌株时转化效率比carB2提高了约470％，比carB3提高了大约130％。

表1各carB基因整合表达盒重组效率比较

注：DNA质量和黄色转化子数目列3个数字表示3次重复实验的结果。

实施例6：carB4基因的验证

具体步骤如下：

将实施例5得到的含carB4的ZZ-RPB菌株单菌落在液体补充培养基中于30℃，200r·min^-1摇瓶培养，待菌体OD₆₀₀达到8-9后涂布FOA平板，于30℃培养，然后筛选弹出标记基因的突变株ZZ-RPBT。

挑取筛选得到的突变株ZZ-RPBT接种于YPD20培养基(20g·L^-1葡萄糖，10g·L^-1蛋白胨和5g·L^-1酵母粉)中于30℃，200r·min^-1的条件下培养，得到种子液；将种子液以5％的接种量接种至YPD30培养基(30g·L^-1葡萄糖，10g·L^-1蛋白胨和5g·L^-1酵母粉)中于30℃，200r·min^-1的条件下发酵96小时(在发酵的48小时和72小时分别补加3％的葡萄糖)，得到发酵液。

检测发酵液中β-胡萝卜素的产量。

检测结果为：β-胡萝卜素产量4.24g·L^-1，可见，此ZZ-RPB菌株确实能够高产β-胡萝卜素。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一段可用于编码番茄红素脱氢酶的基因

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1692

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatctggttt ggattgttgg agaatttcaa gaatctcaag atttactcta acgacgggta 60

caacgagaat tgtattgaat tgatcaagaa catgatcttg gtgttacaga acatcaagtt 120

cttggaccag actgagaatg cacagatata caaggcgtca tgtgataaaa tggatgagat 180

ttatccacaa ttgaagaaag agtttatgga aagtggtcaa ccagaagcta aacaggaaga 240

agcaaacgaa gaggtgaaac aagaagaaga aggtaaataa gtattttgta ttatataaca 300

aacaaagtaa ggaatacaga tttatacaat aaattgccat actagtcacg tgagatatct 360

catccattcc ccaactccca agaaaaaaaa aaagtgaaaa aaaaaatcaa acccaaagat 420

caacctcccc atcatcatcg tcatcaaacc cccagctcaa ttcgcaatgg ttagcacaaa 480

aacatacaca gaaagggcat cagcacaccc ctccaaggtt gcccaacgtt tattccgctt 540

aatggagtcc aaaaagacca acctctgcgc ctcgatcgac gtgaccacaa ccgccgagtt 600

cctttcgctc atcgacaagc tcggtcccca catctgtctc gtgaagacgc acatcgatat 660

catctcagac ttcagctacg agggcacgat tgagccgttg cttgtgcttg cagagcgcca 720

cgggttcttg atattcgagg acaggaagtt tgctgatatc ggaaacaccg tgatgttgca 780

gtacacctcg ggggtatacc ggatcgcggc gtggagtgac atcacgaacg cgcacggagt 840

gactgggaag ggcgtcgttg aagggttgaa acgcggtgcg gagggggtag aaaaggaaag 900

gggcgtgttg atgttggcgg agttgtcgag taaaggctcg ttggcgcatg gtgaatatac 960

ccgtgagacg atcgagattg cgaagagtga tcgggagttc gtgattgggt tcatcgcgca 1020

gcgggacatg gggggtagag aagaagggtt tgattggatc atcatgacgc ctggtgtggg 1080

gttggatgat aaaggcgatg cgttgggcca gcagtatagg actgttgatg aggtggttct 1140

gactggtacc gatgtgatta ttgtcgggag agggttgttt ggaaaaggaa gagaccctga 1200

ggtggaggga aagagataca gggatgctgg atggaaggca tacttgaaga gaactggtca 1260

gttagaataa atattgtaat aaataggtct atatacatac actaagcttc taggacgtca 1320

ttgtagtctt cgaagttgtc tgctagttta gttctcatga tttcgaaaac caataacgca 1380

atggatgtag cagggatggt ggttagtgcg ttcctgacaa acccagagta cgccgcctca 1440

aaccacgtca cattcgccct ttgcttcatc cgcatcactt gcttgaaggt atccacgtac 1500

gagttgtaat acaccttgaa gaacggcttc gtctgaccct tgagcttcgc ctcgttgtaa 1560

tgattataca catccaacgc ttccaacctc gataaatgga tcttctgcac ttttgaaatc 1620

gggtactgga tcgcaagcaa cgagaacgcc gccgatgctc cggcaagcaa cacaaacgag 1680

gacttcaaga tc 1692

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tactctaacg acgggtacaa c 21

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acatcggtac cagtcagaat tgtgctaacc attgcgaat 39

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attcgcaatg gttagcacaa ttctgactgg taccgatgt 39

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acccgatttc aaaagtgcag a 21

<210> 6

<211> 2781

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aacgtggtat ggttgtaaga aacatattgc aactggagat agcgatcgtt caatttattc 60

cgattttgtg ggggaagtcg cccgctggtg ggcgtgcgcg aatggcaaaa gaaactcgac 120

catgcttttc atcatccctt aacagagcaa tcatatttta aacgttcaag caaaaagaaa 180

cgttggtttc ggctaatgat cacctgaaag gcaaaatcct tccatgtatg aacatgtagg 240

ttattccttt tttttgcaac accctcgggc agttgttcat attcccggaa aacaccacca 300

ctcggggcta agtggaagtt ctacaatccc ggggaaataa ggagccccgg tgagcacgcg 360

cacacaccac cttcacttca ttttgtccga gggaagcagc acgtgaagtc ggaacacgag 420

aggagcattt cttctatttt tttcttctct actgtgagtg catgattata tatgtaatca 480

aaagcgatca acttatggta gggtcgtgca cggcgcaccg ggttccaaaa tgatctgtga 540

gggacaaaat tctttttttt ttccagcatg ccgctggtgg caaataccgt ggtggtatga 600

tgcaccctat gccattgatt cacaccacca ccattaatca acaattgaga gaggacaaaa 660

gtgaactatt ggtggtcgtc aggttatact cgtcagcttc ggaatattac gtcccttcag 720

tttgtgaaat gtcatcctgg cgatgttcga gagagatcag tccgagagcg cgtggtagga 780

gaaacggagc actgcagcaa caaaaaaaaa atccaaaccc aggggggagg aagaagaaca 840

gccagggaaa ttgttcaccg acctgaccgt aaatttgctg ctgaaagaaa cgtgtcaaac 900

aagaccaatt ggctcaattg accctgaggg agtactttgt ctgccaccaa tgcttccacc 960

aaaacgctac ttttgttttg caatcggatg gtgtgggtct ggggtccacc tgttttgtta 1020

agctacagaa ggtggcatat tcctctgatc aggtgctttt tttcggctgc tgctgctcgt 1080

ggtggtgtag tggtagtggt gtgtgtgcgt gtgcgtgagg gaggccgctt tttgctctct 1140

gactcctccc aatcagaagt tgctgtagca gtgaaacaac acaatggatg ataatgcccc 1200

gggcggtgcg tgtccgacac aaaccactac attttttagc tgggagcata ctgccactac 1260

gacccaccca cccatggtca acaaaaaaat tctgacaaat tataaaataa cccttggatt 1320

cccccttgga aaaatttttg gtatttctct ctttcttttc cttttccttt ccctcttctt 1380

tttccctcca tcaatcaatt gacgttcagt aactcaatta attacatcac atccctcaat 1440

taaagaattt aaacaatggc tgctattaaa gttggtatca acggtttcgg tagaatcggt 1500

agattggtct tgagaattgc cttgaccaga aaggacattg aagttgtcgc cgtcaacgac 1560

ccattcattg gcgctgaata cgctgcttac atgttcaagt acgactccac ccacagaacc 1620

ttcaagggtg aagttaaggc tgaaggtgac tccttgatca ttgacggtca caagatccac 1680

gtcttccaag aaagagaccc aatcaacatc ccatgggcca agtacggtgt cgaatacgtc 1740

attgactcca ctggtgtctt caccaagatt gaaggtgccc aaaagcacat tgacgctggt 1800

gccaagaagg ttatcatcac cgccccatct gctgatgccc caatgttcgt tgtcggtgtc 1860

aacgaagaca aatacacccc agacttgaag attatctcca acgcttcttg taccaccaac 1920

tgtttggccc cattggccaa ggttatcaac gacaccttcg gtattgccga cggtttgatg 1980

accaccgtcc actccatcac cgccacccaa aagaccgttg acggtccatc ccacaaggac 2040

tggagaggtg gtagaaccgc ttctggtaac attatcccat cctctaccgg tgctgccaag 2100

gccgtcggta aggttatccc agaattgaac ggtaagttga ctggtatgtc tttgagagtc 2160

ccaaccaccg atgtttccgt tgttgacttg actgtcaact tgaagaagcc agctacctat 2220

gaagaaatct gtgatgctat caagaaggct tctgaaggtc cattgaaggg agttttgggt 2280

tacaccgaag acgctgttgt ctcctccgac ttcttgacca ccaacttgtc ttctgtcttt 2340

gacgccaagg ccggtatctt gttgacccca accttcgtca agttgatctc ctggtacgat 2400

aacgaatacg gttactccac cagagttgtt gacttgttgg aacacgttgc caaggtctct 2460

ggttccgctt aactatccaa caaactctag gggttgtgct ttttgaaaaa aacatatagg 2520

ttttattgaa atagccacaa tgtctgttga gaggacattt gatttgtttt atattatcgt 2580

atatgtaccc tggaatatat tgcgtttttt aacaaaagac aaacaacggt ctttagtttt 2640

tttttcaatc aatcaatgtt cgtgatcgta gagagaagga gaaaaaaaga gtaaacataa 2700

acaaacatct ttctttttac aaacgagtac aagcaacagc catgtcacaa gatgccatac 2760

agtccctact tctaaaccag a 2781

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gctctagaaa cgtggtatgg ttgtaagaaa c 31

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctctagatc tggtttagaa gtagggactg tatg 34

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cccaagcttt gtttaaattc tttaattg 28

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcgtcgacgc tatccaacaa actctag 27

<210> 11

<211> 1845

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgctgctca cctacatgga agtccacctc tactacacgc tgcctgtgct gggcgtcctg 60

tcctggctgt cgcggccgta ctacacagcc accgatgcgc tcaaattcaa atttctgaca 120

ctggttgcct tcacgaccgc ctccgcctgg gacaactaca ttgtctacca caaggcgtgg 180

tcctactgcc ccacctgcgt caccgctgtc attggctacg tgcccttgga ggagtacatg 240

ttcttcatca tcatgactct gttgaccgtg gcattcacca atctggtgat gcgctggcac 300

ctgcacagct tctttatcag gcctgaaacg cccgtcatgc agtccgtcct ggtccgtctt 360

gtccccataa cagccttatt aatcactgca tacaaggctt ggcatttggc ggtccctgga 420

aagccactgt tctacggatc atgcattttg tggtacgcct gtccggtttt ggccttattg 480

tggtttggtg ctggcgagta catgatgcgt cgtccgctgg cggtgctcgt ctccattgcg 540

ctgcccacgc tgtttctctg ctgggtcgat gtcgtcgcta ttggcgccgg cacatgggac 600

atttcgctgg ccacaagcac cggcaagttc gtcgtgcccc acctgcccgt ggaggaattc 660

atgttctttg cgctaattaa taccgttttg gtatttggta cgtgtgcgat cgatcgcacg 720

atggcgatcc tccacctgtt caaaaacaag agtccttatc agcgcccata ccagcacagc 780

aagtcgttcc tccaccagat cctcgagatg acctgggcct tctgtttacc cgaccaagtg 840

ctgcattcag acacattcca cgacctgtcc gtcagctggg acatcctgcg caaggcctcc 900

aagtcctttt acacggcctc tgctgtcttt cccggcgacg tgcgccaaga gctcggtgtg 960

ctatacgcct tttgcagagc cacggacgat ctctgcgaca acgagcaggt ccctgtgcag 1020

acgcgaaagg agcagctgat actgacacat cagttcgtca gcgatctgtt tggccaaaag 1080

acaagcgcgc cgactgccat tgactgggac ttttacaacg accaactgcc tgcctcgtgc 1140

atctctgcct tcaagtcgtt cacccgtttg cgccatgtgc tggaagctgg agccatcaag 1200

gaactgctcg acgggtacaa gtgggatttg gagcgtcgct ccatcaggga tcaggaggat 1260

ctcagatatt actcagcttg tgtcgccagc agtgttggtg aaatgtgcac tcgcatcata 1320

ctggcccacg ccgacaagcc cgcctcccgc cagcaaacac agtggatcat tcagcgtgcg 1380

cgtgaaatgg gtctggtact ccaatataca aacattgcaa gagacattgt caccgacagc 1440

gaggaactgg gcagatgcta cctgcctcag gattggctta ccgagaagga ggtggcgctg 1500

attcaaggcg gccttgcccg agaaattggc gaggagcgat tgctctcact gtcgcatcgc 1560

ctcatctacc aggcagacga gctcatggtg gttgccaaca agggcatcga caagctgccc 1620

agccattgtc aaggcggcgt gcgtgcggcc tgcaacgtct atgcttccat tggcaccaag 1680

ctcaagtctt acaagcacca ctatcccagc agagcacatg tcggcaattc gaaacgagtg 1740

gaaattgctc ttcttagcgt atacaacctt tacaccgcgc caattgcgac tagtagtacc 1800

acacattgca gacagggaaa aatgagaaat ctaaatacca tttaa 1845

<210> 12

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gccaccatgt tgttgaccta catggaagtc cacttgtact acaccttgcc agtcttgggt 60

gtcttgtctt ggttgtccag accatactac accgctaccg acgccttgaa gttcaagttc 120

ttgaccttgg tcgctttcac taccgcttca gcttgggaca actacatcgt ctaccacaag 180

gcttggtcct attgtccaac ttgtgtcacc gccgttatcg gttacgtccc attggaagaa 240

tacatgttct tcatcatcat gaccttgttg accgtcgctt tcaccaactt ggtcatgaga 300

tggcacttgc actccttctt catcagacca gaaaccccag tcatgcaatc cgtcttggtc 360

agattggtcc caatcaccgc tttgttgatc accgcttaca aggcttggca tttggccgtt 420

ccaggtaagc cattgttcta cggttcttgt atcttgtggt acgcttgtcc agtcttggct 480

ttgttgtggt tcggtgccgg tgaatacatg atgagaagac cattggccgt tttggtctcc 540

atcgctttgc caaccttgtt cttgtgttgg gttgacgttg ttgctattgg tgccggtact 600

tgggatatct ccttggctac ttccaccggt aagttcgttg tcccacactt gccagtcgaa 660

gaattcatgt tcttcgcctt gatcaacacc gtcttggtct tcggtacttg tgctatcgac 720

agaaccatgg ccatcttgca cttgttcaag aacaagtccc cataccaaag accataccaa 780

cactccaagt ccttcttgca ccaaatcttg gaaatgactt gggccttttg tttgccagac 840

caagtcttgc actccgatac tttccacgac ttgtccgtca gttgggacat cttgagaaag 900

gcttccaagt ccttctacac cgcttcagcc gttttcccag gtgacgtcag acaagaattg 960

ggtgtcttgt acgccttttg tagagctacc gacgacttgt gtgacaacga acaagtccca 1020

gtccaaacca gaaaggaaca attgatcttg acccaccaat tcgtctccga cttgttcggt 1080

caaaagacct cagctccaac cgctattgat tgggacttct acaacgacca attgccagcc 1140

tcttgtatct ccgccttcaa gtccttcacc agattgagac acgtcttgga agccggtgct 1200

atcaaggaat tgttggacgg ttacaagtgg gacttggaaa gaagatccat cagagaccaa 1260

gaagacttga gatactactc cgcttgtgtc gcttcctccg ttggtgaaat gtgtaccaga 1320

atcatcttgg ctcacgccga taagccagct tccagacaac aaacccaatg gatcatccaa 1380

agagccagag aaatgggttt ggtcttgcaa tacaccaaca tcgctagaga catcgttacc 1440

gactccgaag aattgggtag atgttacttg ccacaagatt ggttgaccga aaaggaagtc 1500

gccttgatcc aaggtggttt ggccagagaa atcggtgaag aaagattgtt gtccttgtcc 1560

cacagattga tctaccaagc cgacgaattg atggtcgtcg ctaacaaggg tatcgacaag 1620

ttgccatccc attgtcaagg tggtgttaga gccgcttgta acgtttacgc ctccatcggt 1680

accaagttga agtcctacaa gcaccactac ccatccagag ctcacgttgg taactccaag 1740

agagtcgaaa tcgccttgtt gtccgtctac aacttgtaca ccgctccaat cgctacctct 1800

tctactaccc attgtagaca aggtaagatg agaaacttga acaccatcta a 1851

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcgtcgacta cgataaccca ttgatttct 29

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcgtcgacgc cgagatccag ttccaagcc 29

<210> 15

<211> 2858

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tacgataacc cattgatttc tcttattaga ctcatgaaag tgaaacgtgt gtgtgtgtgt 60

gtgtgtgtgt gtgtatgtgt gtattgaata tttagaaaga aagtctccac tcgcgtgata 120

tgaatagaaa gattacgatt gtgtaaaaac tcgttggctg tgaaacttct tccgatttgt 180

tgggggagtt tattagggtg tgtcagtctg gtgatgaaac gaataaattt ttctgtgtgt 240

gtaggctcgt gacttcccaa actcctggac tgccacctcc actcgtcctg aataattggt 300

aaggacacga ttcttggagg agtttcaagt ccgacacaaa cctcctcagg tctttttttt 360

ttgttgtacg gcatagagag cggacagctt aagcaaggga ggaaggtcac gttccttaag 420

gaagagggtt agtagccagt agccaataag gagattcggt attactcata gactactaag 480

gtaaccgact tgtcaattgg gagagtgtgg gattgcgttt ttcttgtgtg tgggtgaagt 540

gttggtatac ccccggggtt ctacgggttc ggagcagatc gccatggagt tagagggcaa 600

tatagccaga gagagaaaag gagggacaca tgggtggaga gaaacaaaga acaaagagta 660

tgattttttt tttttgttta ccccgagctt tggaatgagt tccgaagagt ctggaattat 720

ccgccttttg gatccaccac caccagtcaa ttgatctgaa gggcattaca tcagaggtgt 780

aatgggagca gcgtagcatg acgtaaattt ttttctctct tctcttggtg gtgtcttgtt 840

gctctggtgt atctcggggc aaagagttcc agctgatttg aaaaattttt catcacgagt 900

acaaccctga gttgatttgt ctggcaccgg ctgccatcag ctggtgggag ggagacagag 960

ggagagagca aaaaaaaaga tctggcggtg cgtggtgcgt ggtgcgtggt ggtgggaggg 1020

agagagggag agatgtgtgg tgtggtgtgc gccggagaac agccaactcc aggcaacgta 1080

atattttaat tacttttgtg tcacggtgca cgcactgcca tttccagaca gcaataacaa 1140

caacccaccc actttctttt tttcacggtg ctcaactcaa taaaataata tataaatacg 1200

tttacaaccc cccagtcccg tcgtaccagt tttttttttt acaacccttc tcttggtttt 1260

ttaatatttt tacaaccaac aattaattgg ctttttaatt aatttactac cttatctaca 1320

aatcatccaa caatggctcc tccagcagtt ttaaagaaat ccggtgttat ctacggtcaa 1380

gatgtcgttg acttgtttga ctacgcccag gaaaagggtt tcgccatccc agctatcaat 1440

gtcacctcct cttccaccgt cgttgccgct ttggaagccg ccagagacaa caagtcccca 1500

atcatcttgc aaacctccca aggtggtgcc gcttactttg ccggtaaggg tgtcgacaac 1560

aaggaccaag ctgcttctat tgctggtgcc attgctgctg cccactacat cagagcaatt 1620

gctccaacct acggcatccc agttgtcttg cacaccgacc actgtgctaa gaagttgttg 1680

ccatggttcg acggtatgtt ggaagccgac gaagaattct ttgctaagac cggtactcca 1740

ttgttctcct cccacatgtt ggacttgtct gaagaaaccg acgacgaaaa cattgccacc 1800

tgtgccaagt actttgaaag aatggccaag atgaaccaat ggttggaaat ggaaatcggt 1860

atcactggtg gtgaagaaga tggtgtcaac aacgaacacg ttgaaaagga ctccttgtac 1920

acttccccag aaaccgtctt tgccgtctac aaggctttgc acccaattgc tccaaacttc 1980

tccattgctg ccgctttcgg taacgtccac ggtgtctaca agccaggtaa cgttcaattg 2040

agaccatcca tcttgggtga ccaccaagcc tacgctgcca aggaactcgg caccgacaac 2100

aagcacccat tgtacttggt cttccacggt ggttccggtt cttcccaaga agaattcaac 2160

accgccatca agaacggtgt tgtcaagatc aacttggaca ctgactgtca attcgcctac 2220

ttgtccggta tccgtgacta cattgtcaag aacattgact acttgaagac cccagtcggt 2280

aacccagagg gtgctgacaa gccaaacaag aagaagtttg acccaagagt ctgggtcaga 2340

gaaggtgaaa agaccatgtc tgccagaatt gctgaagctt tggacgtctt ccacaccaag 2400

aacgctttgg cttaagcttc catggaacaa catttaaaaa atcggtgatg tataatgtat 2460

agatatttaa actttttaat aaagaggtat taaaagaaac ccccaacctg cttgtaaaac 2520

ccgtgtctag aatgaccata cattatgatt cgtatatata catgcaaaaa aggtttggat 2580

aacatgtctg gttattgttc cctctcacta ttgatcaaca tctcctggac tttcttgtat 2640

tcaggcatgg agttatacgg actgaatctg aagttggttt gtaggaagtt tccaatgaca 2700

acgtttgcct tgacgtattt cagcacacaa cggtctatac attccagctc acctttcgtc 2760

aactcgcctt caccatactc gtgcaccaag cacttggctt cacagcgggc caatagcttg 2820

ttgaatgtga aggacatggc ttggaactgg atctcggc 2858

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgttggatga tttgtagata aggtagtaaa 30

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gcttccatgg aacaacattt aaaaaat 27

<210> 18

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atgtccaaga aacacattgt cattatcggt gctggcgtgg gtggcacggc tacagctgct 60

cgtttggccc gcgaaggctt caaggtcact gtggtggaga aaaacgactt tggtggcggc 120

cgctgctcct tgatccatca ccagggccat cgctttgatc agggcccgtc gctctacctg 180

atgcccaagt actttgagga cgcctttgcc gatctggacg agcgcattca agaccacctg 240

gagctgctgc gatgcgacaa caactacaag gtgcactttg acgacggtga gtcgatccag 300

ctgtcgtctg acttgacacg catgaaggct gaattggacc gcgtggaggg cccccttggt 360

tttggccgat tcctggattt catgaaagag acacacatcc actacgaaag cggcaccctg 420

attgcgctca agaagaattt cgaatccatc tgggacctga ttcgcatcaa gtacgctcca 480

gagatctttc gcttgcacct gtttggcaag atctacgacc gcgcttccaa gtacttcaag 540

accaagaaga tgcgcatggc attcacgttt cagaccatgt atatgggcat gtcgccctac 600

gatgcgcctg ctgtctacag cctgttgcag tacaccgagt tcgctgaagg catctggtat 660

ccccgtggcg gcttcaacat ggtggttcag aagctagagg cgattgcaaa gcaaaagtac 720

gatgccgagt ttatctacaa tgcgcctgtt gccaagatta acaccgatga tgccaccaaa 780

caagtgacag gtgtaacctt ggaaaatggc cacatcatcg atgccgatgc ggttgtgtgt 840

aacgcagatc tggtctatgc ttatcacaat ctgttgcctc cctgccgatg gacgcaaaac 900

acactggctt ccaagaaatt gacgtcttct tccatttcct tctactggtc catgtccacc 960

aaggtgcctc aattggacgt gcacaacatc tttttggccg aggcttatca ggagagcttt 1020

gacgaaatct tcaaggactt tggcctgcct tctgaagcct ccttctacgt caatgtgccc 1080

tctcgcatcg atccttctgc tgctcccgac ggcaaggact ctgtcattgt cttggtgcct 1140

attggtcata tgaagagcaa gacgggcgat gcttccaccg agaactaccc ggccatggtg 1200

gacaaggcac gcaagatggt gctggctgtg attgagcgtc gtctgggcat gtcgaatttc 1260

gccgacttga ttgagcatga gcaagtcaat gatcccgctg tatggcagag caagttcaat 1320

ctgtggagag gctcaattct gggtttgtct catgatgtgc ttcaggtgct gtggttccgt 1380

cccagcacaa aggattctac cggtcgttat gataacctat tctttgtggg tgcaagcacg 1440

catcccggaa ctggtgttcc cattgtcctt gcaggaagca agctcacctc tgaccaagtt 1500

gtcaagagct ttggaaagac gcccaagcca agaaagatcg agatggagaa cacgcaagca 1560

cctttggagg agcctgatgc tgaatcgaca ttccctgtgt ggttctggtt gcgcgctgcc 1620

ttttgggtca tgtttatgtt cttttacttc ttccctcaat ccaatggcca aacgcccgca 1680

tcttttatca ataatttgtt acctgaagta ttccgcgttc ataactctaa tgtcatttaa 1740

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ctacaaatca tccaacagcc accatgtcca agaaacacat tgtcat 46

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tgttgttcca tggaagctta aatgacatta gagttatgaa cg 42

<210> 21

<211> 1746

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gccaccatgt ccaagaaaca cattgtcatt atcggtgctg gcgtgggtgg cacggctaca 60

gctgctcgtt tggcccgcga aggcttcaag gtcactgtgg tggagaaaaa cgactttggt 120

ggcggccgct gctccttgat ccatcaccag ggccatcgct ttgatcaggg cccgtcgctc 180

tacttgatgc ccaagtactt tgaggacgcc tttgccgatt tggacgagcg cattcaagac 240

cacttggagt tgttgcgatg cgacaacaac tacaaggtgc actttgacga cggtgagtcg 300

atccagttgt cgtctgactt gacacgcatg aaggctgaat tggaccgcgt ggagggcccc 360

cttggttttg gccgattctt ggatttcatg aaagagacac acatccacta cgaaagcggc 420

accttgattg cgctcaagaa gaatttcgaa tccatctggg acttgattcg catcaagtac 480

gctccagaga tctttcgctt gcacttgttt ggcaagatct acgaccgcgc ttccaagtac 540

ttcaagacca agaagatgcg catggcattc acgtttcaga ccatgtatat gggcatgtcg 600

ccctacgatg cgcctgctgt ctacagcttg ttgcagtaca ccgagttcgc tgaaggcatc 660

tggtatcccc gtggcggctt caacatggtg gttcagaagc tagaggcgat tgcaaagcaa 720

aagtacgatg ccgagtttat ctacaatgcg cctgttgcca agattaacac cgatgatgcc 780

accaaacaag tgacaggtgt aaccttggaa aatggccaca tcatcgatgc cgatgcggtt 840

gtgtgtaacg cagatttggt ctatgcttat cacaatttgt tgcctccctg ccgatggacg 900

caaaacacat tggcttccaa gaaattgacg tcttcttcca tttccttcta ctggtccatg 960

tccaccaagg tgcctcaatt ggacgtgcac aacatctttt tggccgaggc ttatcaggag 1020

agctttgacg aaatcttcaa ggactttggc ttgccttctg aagcctcctt ctacgtcaat 1080

gtgccctctc gcatcgatcc ttctgctgct cccgacggca aggactctgt cattgtcttg 1140

gtgcctattg gtcatatgaa gagcaagacg ggcgatgctt ccaccgagaa ctacccggcc 1200

atggtggaca aggcacgcaa gatggtgctg gttgtgattg agcgtcgttt gggcatgtcg 1260

aatttcgccg acttgattga gcatgagcaa gtcaatgatc ccgctgtatg gcagagcaag 1320

ttcaatttgt ggagaggctc aattttgggt ttgtctcatg atgtgcttca ggtgttgtgg 1380

ttccgtccca gcacaaagga ttctaccggt cgttatgata acctattctt tgtgggtgca 1440

agcacgcatc ccggaactgg tgttcccatt gtccttgcag gaagcaagct cacctctgac 1500

caagttgtca agagctttgg aaagacgccc aagccaagaa agatcgagat ggagaacacg 1560

caagcacctt tggaggagcc tgatgctgaa tcgacattcc ctgtgtggtt ctggttgcgc 1620

gctgcctttt gggtcatgtt tatgttcttt tacttcttcc ctcaatccaa tggccaaacg 1680

cccgcatctt ttatcaataa tttgttacct gaagtattcc gcgttcataa ctctaatgtc 1740

atttaa 1746

<210> 22

<211> 1746

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gccaccatgt caaagaaaca catcgttatt atcggtgctg gcgttggtgg tactgctacc 60

gctgccagat tggctagaga aggtttcaag gtcactgtcg tcgaaaagaa tgacttcggt 120

ggtggtcgtt gttctttgat ccatcaccaa ggtcacagat tcgaccaagg tccatccttg 180

tacttgatgc caaaatattt cgaagatgcc tttgccgatt tggacgaaag aatccaagac 240

cacttggaat tgttgagatg tgataacaat tacaaagttc actttgacga tggtgaatcc 300

attcaattga gttctgattt gactagaatg aaggccgaat tggatcgtgt tgaaggtcca 360

ttaggtttcg gtagattctt ggacttcatg aaagaaactc acatccacta tgaatccggt 420

actttgattg ccttgaagaa gaacttcgaa tccatctggg acttgattag aattaaatac 480

gccccagaaa tctttagatt acacttattc ggtaagattt acgatagagc ttcaaaatac 540

ttcaaaacca agaagatgag aatggccttt actttccaaa ctatgtacat gggtatgtcc 600

ccatatgacg ctccagctgt ttactcttta ttgcaatata ctgaattcgc cgaaggtatt 660

tggtatccaa gaggtggttt taacatggtt gttcaaaagt tggaagccat tgctaaacaa 720

aagtatgatg ctgaattcat ctataacgca ccagttgcta agatcaacac cgatgacgct 780

accaaacaag ttactggtgt tactttggaa aatggtcaca tcatcgatgc tgatgctgtt 840

gtttgtaatg ccgatttagt ctacgcttat cacaacttat tgccaccatg tagatggact 900

caaaacactt tggcttctaa gaaattgacc tcatcttcaa tttcctttta ctggtctatg 960

tccactaaag tcccacaatt ggatgttcac aacatcttct tggctgaagc ttaccaagaa 1020

tccttcgatg aaatcttcaa ggacttcggt ttgccttccg aagcctcctt ctacgtcaac 1080

gttccatcta gaatcgatcc atctgctgct ccagatggta aagactccgt tatcgtttta 1140

gttccaattg gtcacatgaa atccaaaacc ggtgacgctt ctactgaaaa ctacccagct 1200

atggtcgata aagctaggaa aatggttttg gctgttatcg aaagaagatt gggtatgtct 1260

aactttgctg atttgattga acacgaacaa gtcaacgacc cagccgtctg gcaatccaag 1320

ttcaacttgt ggagaggttc tatattgggt ttgtcccacg atgttttgca agttttatgg 1380

tttagaccat ccactaaaga ttccactggt agatatgaca acttgttctt cgttggtgcc 1440

agtactcatc caggtacagg tgttccaatc gttttagctg gttctaaatt gacttctgac 1500

caagttgtta aatcttttgg taaaacccca aagccaagaa agattgaaat ggaaaacacc 1560

caagccccat tggaagaacc tgatgctgaa tcaactttcc cagtttggtt ctggttgaga 1620

gctgctttct gggtcatgtt tatgttcttc tatttcttcc cacaatccaa cggtcaaacc 1680

ccagcttcct tcattaacaa cttgttgcca gaagttttca gagtccacaa ttctaacgtc 1740

atttaa 1746

<210> 23

<211> 1746

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gccaccatgt cgaagaagca cattgtcatc atcggcgccg gtgttggtgg caccgccacc 60

gctgctaggt tggccagaga aggtttcaag gttaccgttg tcgaaaagaa cgacttcggt 120

ggtggtagat gttccttgat tcaccaccaa ggtcacagat tcgaccaggg tccatctttg 180

tacttgatgc caaaatactt cgaagacgct ttcgccgatc ttgacgaaag aattcaagac 240

cacttggaat tgttgagatg tgacaataat tataaggtcc actttgatga cggtgaatcc 300

atccagttgt cttctgatct gactagaatg aaagccgaat tagacagagt tgaaggtccg 360

ttaggtttcg gtagattctt ggacttcatg aaggaaaccc acatccacta tgagtctggt 420

actcttatcg ccctcaagaa gaattttgaa tccatctggg acttgattag aatcaagtac 480

gccccagaaa tcttcagatt gcacttgttc ggtaagatct acgatagagc ttccaagtac 540

ttcaagacca agaaaatgcg tatggctttc acctttcaaa ccatgtacat gggtatgtct 600

ccgtacgacg ctccggccgt ctactctttg ttgcaataca ctgaatttgc cgagggtatt 660

tggtacccac gaggtggttt taatatggtt gtccaaaagt tggaagctat cgccaagcaa 720

aagtacgacg ctgaatttat atacaacgct ccggtggcta aaattaacac cgatgacgcc 780

actaagcagg tcacgggtgt caccctggaa aacgggcaca taattgatgc tgatgccgtt 840

gtttgtaatg ctgacctcgt ttacgcctac cacaacttgt tgccaccttg tagatggaca 900

caaaacacgt tagcctcaaa gaagttgact tcttcttcta tttcattcta ctggagcatg 960

tctaccaaag tgccacaatt ggacgtccac aatatcttct tggccgaagc ttaccaagaa 1020

tccttcgatg aaatcttcaa agattttggt ttgccttctg aagcttcgtt ttacgtcaac 1080

gtcccatccc gcattgaccc atccgcagct ccagatggta aggactccgt tattgttttg 1140

gttccaatcg gtcacatgaa gtctaaaact ggtgatgcct ccaccgagaa ctaccctgct 1200

atggttgaca aggcacgtaa aatggtcttg gctgtgatcg agcgtcgtct cggtatgtcc 1260

aactttgccg acttgattga acatgaacaa gtcaacgacc cagctgtatg gcaaagtaag 1320

tttaacttgt ggagaggttc tatcttgggc ttgtcccatg acgttttgca agttttgtgg 1380

ttccggccaa gtaccaaaga ttccaccggt agatacgata acttgttctt cgttggtgct 1440

tccacccatc cgggtactgg tgttccaatc gtcttggctg gttctaagtt gactagtgat 1500

caggtcgtca agtcctttgg taagactcca aagcccagaa agattgaaat ggaaaacacc 1560

caagctccat tggaagagcc agacgctgaa tctacttttc ctgtttggtt ctggctgaga 1620

gctgccttct gggttatgtt tatgttcttc tacttctttc ctcaaagcaa cggtcaaacg 1680

cctgcgtcct tcataaataa cctattgcca gaagttttca gagtccacaa ctccaacgtc 1740

atttga 1746

<210> 24

<211> 1746

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gccaccatgt ccaagaagca catcgtcatt attggcgctg gcgttggcgg taccgctact 60

gctgctagat tggctagaga aggcttcaag gtcaccgtcg ttgaaaagaa cgactttggc 120

ggcggtagat gttccttgat ccaccaccaa ggtcacagat tcgaccaagg tccatccttg 180

tacttgatgc caaagtactt cgaagacgct ttcgccgact tggacgaaag aatccaagac 240

cacttggaat tgttgagatg tgacaacaac tacaaggtcc acttcgacga cggcgaatct 300

atccaattgt cctccgactt gaccagaatg aaggccgaat tggacagagt cgaaggtcca 360

ttgggtttcg gcagattctt ggacttcatg aaggaaaccc acatccacta cgaatccggt 420

accttgatcg ccttgaagaa gaacttcgaa tccatttggg acttgatcag aatcaagtac 480

gccccagaaa tcttcagatt gcacttgttc ggcaagatct acgacagagc ctccaagtac 540

ttcaagacca agaagatgag aatggccttc accttccaaa ccatgtacat gggtatgtcc 600

ccatacgacg ctccagccgt ttactccttg ttgcaataca ccgaattcgc cgaaggcatt 660

tggtacccaa gaggcggttt caacatggtc gtccaaaagt tggaagccat cgccaagcaa 720

aagtacgacg ccgaattcat ctacaacgcc ccagttgcta agatcaacac cgacgacgct 780

actaagcaag ttaccggcgt taccttggaa aacggtcaca tcattgacgc cgacgccgtt 840

gtttgtaacg ccgacttggt ttacgcctac cacaacttgt tgccaccatg tagatggacc 900

caaaacacct tggcttccaa gaaattgacc tcctcctcca tctccttcta ttggtccatg 960

tccaccaagg tcccacaatt ggacgtccac aacatcttct tggccgaagc ctaccaagaa 1020

tccttcgacg aaatcttcaa ggacttcggc ttgccatccg aagcttcttt ctacgtcaac 1080

gtcccatcca gaattgatcc atcagccgct ccagacggta aggattccgt cattgtcttg 1140

gtcccaatcg gtcacatgaa gtctaaaacc ggcgacgctt ctaccgaaaa ctacccagct 1200

atggttgaca aagccagaaa gatggtcttg gccgtcatcg aaagaagatt gggcatgtcc 1260

aacttcgccg acttgatcga acacgaacaa gtcaacgatc cagccgtttg gcaatccaag 1320

ttcaacttgt ggagaggctc catcttgggt ttgtctcacg acgtcttgca agtcttgtgg 1380

ttcagaccat ccaccaagga ttctaccggt agatacgaca acttgttctt cgtcggcgct 1440

tctactcatc caggtaccgg cgttccaatt gttttggccg gttctaagtt gacttccgac 1500

caagttgtca agtccttcgg taagacccca aagccaagaa agatcgaaat ggaaaacacc 1560

caagccccat tggaagaacc agacgccgaa tctaccttcc cagtttggtt ttggttgaga 1620

gccgctttct gggtcatgtt catgttcttc tacttcttcc cacaatccaa cggtcaaacc 1680

ccagcttcct tcatcaacaa cttgttgcca gaagtcttca gagtccacaa ctccaacgtc 1740

atctaa 1746

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cacatccact atgaatccgg ta 22

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ttttcctagc tttatcgacc a 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tctggtactc ttatcgccct c 21

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ccaagaccat tttacgtgcc tt 22

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

actccgatac tttccacgac 20

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

aaacgttaca agcggctct 19

Claims (9)

1.一种重组热带假丝酵母，其特征在于，表达SEQ ID NO.24所示的编码番茄红素脱氢酶的基因，并共表达了番茄红素环化酶和番茄红素合成酶；所述番茄红素环化酶和番茄红素合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

2.一段可用于编码番茄红素脱氢酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.24所示。

3.携带权利要求2所述基因的基因表达盒。

4.如权利要求3所述的基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒为含有FBA1启动子和FBA1终止子的基因表达盒。

5.携带权利要求2所述基因或权利要求3或4所述基因表达盒的重组质粒。

6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，用于构建所述重组质粒的载体为pMD19-T载体、pUC18-T载体、pGEM-T载体或pET-28a（+）载体。

7.携带权利要求2所述基因，或权利要求3或4所述基因表达盒，或权利要求5或6所述重组质粒的宿主细胞。

8.一种生产β-胡萝卜素的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1所述重组热带假丝酵母在培养基中进行发酵，从发酵液中分离得到β-胡萝卜素。

9.权利要求2所述基因，或权利要求3或4所述基因表达盒，或权利要求5或6所述重组质粒或权利要求7所述宿主细胞，或权利要求8所述方法在生产β-胡萝卜素方面的应用。

Images