CN114277040B - 一种高效合成β-胡萝卜素菌株的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效合成β‑胡萝卜素菌株的构建方法及其应用，属于代谢工程领域。所述构建方法为将β‑胡萝卜素合成途径中从乙酰辅酶A到甲羟戊酸合成相关基因在酵母细胞质中表达，从IPP和DMAPP到β‑胡萝卜素合成相关基因在酵母过氧化物酶体中过表达，从甲羟戊酸到IPP和DMAPP合成相关基因在细胞质或过氧化物酶体中过表达。利用该方法构建的工程菌株β‑胡萝卜素产量显著提高。本发明构建的基因工程菌株经过9天发酵后发酵液中菌体干重可达213g/L，β‑胡萝卜素产量可达6.5g·L^‑1。本发明构建的工程菌株可以高效合成β‑胡萝卜素，具有良好的应用前景。

Description

一种高效合成β-胡萝卜素菌株的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种高效合成β-胡萝卜素菌株的构建方法及其应用，属于代谢工程领域。

背景技术

β-胡萝卜素是人体合成维生素A的前体物质，也是联合国粮农组织和世界卫生组织一致认定的A类营养色素，具有较强的抗氧化、抗衰老和抗肿瘤功能，因此，其被广泛应用于食品、药品、化妆品和保健品等的制备。

目前，β-胡萝卜素主要通过化学合成法生产，但是，化学合成法生产的β-胡萝卜素不易被人体完全吸收，会对人体产生一定的毒副作用，长期服用会对人体造成不可逆病变，并且，化学合成法得到的β-胡萝卜素生物活性十分低下，这无疑大大限制了β-胡萝卜素在食品、药品、化妆品和保健品等领域的应用，而天然β-胡萝卜素的产量却远远无法满足市场需求。因此，提高β-胡萝卜素的产量，同时，降低β-胡萝卜素的生产成本具有重要的科研意义和广泛的应用前景。

目前，已经有研究通过CRISPR-Cas9基因编辑技术对E.coli中的各基因进行改造以提高β-胡萝卜素的产量，但是，该方法具有产量低的缺陷(目前文献报道最高为3.2g·L^-1)；也有研究通过尝试从红法夫酵母获取CrtE，CrtYB和CrtI三个基因，然后转入酿酒酵母细胞构建重组菌用来发酵生产β-胡萝卜素，但是，此方法构建的菌株具有遗传稳定性差的缺陷。此外，目前利用代谢工程手段构建萜类合成酵母工程菌株仍然局限在将全部代谢途径定位到细胞质或定位到特定的亚细胞器，所构建的工程菌株的目的产物合成能力提高有限。

因此，如何构建高产β-胡萝卜素的工程菌株，在提高β-胡萝卜素产量的同时降低β-胡萝卜素的生产成本仍需进一步研究。

发明内容

热带假丝酵母是一种二倍体非常规酵母，其细胞内具有合成β-胡萝卜素前体物的高活性代谢途径，是极具潜力的可用于生产β-胡萝卜素的菌株，但是，热带假丝酵母本身不具有可用于合成β-胡萝卜素的基因。通过将外源的β-胡萝卜素合成途径相关基因(编码番茄红素环化酶和番茄红素合成酶的基因以及编码番茄红素脱氢酶的基因)引入到热带假丝酵母细胞质中可以实现β-胡萝卜素的合成，但是产量仍然无法满足工业化需求。因此，为解决上述问题，本发明通过基因工程手段系统构建高效生产β-胡萝卜素的工程菌株，显著增加β-胡萝卜素的产量，提高其合成效率，促进其在食品和医药等领域中的应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了重组热带假丝酵母，所述重组热带假丝酵母以热带假丝酵母ATCC20336或热带假丝酵母CU-206为宿主细胞。

热带假丝酵母CU-206来源于热带假丝酵母ATCC20336，其构建方法记载于文献“Lihua Zhang,et al.2020,A CRISPR–Cas9 system for multiple genome editing andpathway assembly in Candida tropicalis.Biotechnol Bioeng,117:531-542”中。

所述重组热带假丝酵母的基因组上整合了β-胡萝卜素合成途径基因：

所述β-胡萝卜素合成途径中从乙酰辅酶A到甲羟戊酸合成相关基因(包括乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、HMG-CoA合成酶基因ERG13和HMG-CoA还原酶基因tHMGR或NADH-HMGR)在酵母细胞质中表达；所述基因ERG10的genebank登录号为：D13470.1，所述基因ERG13的genebank登录号为：RCK66100.1，所述基因tHMGR的genebank登录号为：RCK56388.1，HMG-CoA还原酶(NADH-HMGR)的核苷酸序列如SEQ ID NO.6。

从IPP和DMAPP到β-胡萝卜素合成相关基因(包括香叶基/法尼基焦磷酸合酶基因ERG20、GGPP合成酶基因BTS1、番茄红素脱氢酶基因carB和茄红素环化酶与番茄红素合成酶carRP)在酵母过氧化物酶体中过表达；所述基因ERG20的genebank登录号为：RCK67668.1，所述基因BTS1的genebank登录号为：RCK64891.1；所述基因carB的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述基因carRP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

从甲羟戊酸到IPP和DMAPP合成相关基因(包括甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、二磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG19和异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1)在细胞质或过氧化物酶体中过表达；所述基因ERG12的genebank登录号为：RCK63831.1，所述基因ERG8的genebank登录号为：RCK59297.1，所述基因ERG19的genebank登录号为：RCK60630.1，所述基因IDI1的genebank登录号为：RCK59267.1。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达的基因通过同源重组整合到酵母染色体DNA上稳定表达，所述基因在酵母染色体上整合的拷贝数为2-6。

本发明提供了一种合成β-胡萝卜素的基因表达盒，所述基因表达盒自上游至下游依次包括一个或多个“启动子-目的基因-转录终止子”结构单位；

其中，所述目的基因包括：

从乙酰辅酶A到甲羟戊酸合成的相关基因：ERG10基因、ERG13基因、tHMGR基因或NADH-HMGR基因；或，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ePTS分别连接至各基因的3’端的ERG10-ePTS基因、ERG13-ePTS基因、tHMGR-ePTS基因或NADH-HMGR-ePTS基因；

从甲羟戊酸到IPP和DMAPP合成的相关基因：ERG12基因、ERG8基因、ERG19基因和IDI1基因；或，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ePTS分别连接至各基因的3’端的ERG12-ePTS基因、ERG8-ePTS基因、ERG19-ePTS基因和IDI1-ePTS基因；

从IPP和DMAPP到β-胡萝卜素合成的相关基因：carB基因、carRP基因、ERG20基因和BTS1基因；或，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ePTS分别连接至各基因的3’端的carB-ePTS基因、carRP-ePTS基因、ERG20-ePTS基因和BTS1-ePTS基因。

在本发明的一种实施方式中，所述表达盒包括：

所述表达盒1C为：采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达ERG10基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达tHMGR基因或NADH-HMGR基因，及采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达ERG13基因；

所述表达盒1P为：将ePTS分别连接至ERG10、ERG13、tHMGR基因的3’端后，采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达ERG10-ePTS基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达tHMGR-ePTS基因，及采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达ERG13-ePTS基因；

所述表达盒2C为：采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达IDI1基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达ERG19基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG8基因，及采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达ERG12基因；

所述表达盒2P为：将ePTS分别连接至ERG12、ERG8、ERG19、IDI1基因的3’端后，采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达IDI1-ePTS基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达ERG19-ePTS基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG8-ePTS基因，及采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达ERG12-ePTS基因；

所述表达盒3C为：采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达carB基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG20基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达BTS1基因，及采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达carRP基因；

所述表达盒3P为：将ePTS分别连接至carB、carRP、ERG20、BTS1基因的3’端后，采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达carB-ePTS基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG20-ePTS基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达BTS1-ePTS基因，及采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达carRP-ePTS基因。

本发明的一种实施方式中，所述基因ERG10的genebank登录号为：D13470.1，所述基因ERG13的genebank登录号为：RCK66100.1，所述基因tHMGR的genebank登录号为：RCK56388.1，HMG-CoA还原酶(NADH-HMGR)的核苷酸序列如SEQ ID NO.6；

所述基因ERG20的genebank登录号为：RCK67668.1，所述基因BTS1的genebank登录号为：RCK64891.1；所述基因carB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述基因carRP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述基因ERG12的genebank登录号为：RCK63831.1，所述基因ERG8的genebank登录号为：RCK59297.1，所述基因ERG19的genebank登录号为：RCK60630.1，所述基因IDI1的genebank登录号为：RCK59267.1。

所述P_GAP1启动子的genebank登录号为：HQ171163.1；P_FBA1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了一种重组热带假丝酵母，所述重组热带假丝酵母为，将上述细胞质表达盒1C或过氧化物酶表达盒1P，及将上述细胞质表达盒2C或过氧化物酶表达盒2P，同时将上述细胞质表达盒3C或过氧化物酶表达盒3P整合至热带假丝酵母基因组上不影响其生长的任一位点得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述重组热带假丝酵母为，

将细胞质表达盒1C，并将细胞质表达盒2C，同时将过氧化物酶体表达盒3P整合至热带假丝酵母基因组上不影响其生长的任一位点得到的；

或将细胞质表达盒1C，并将过氧化物酶体表达盒2P，同时将过氧化物酶体表达盒3P整合至热带假丝酵母基因组上不影响其生长的任一位点得到的。

在本发明的一种实施方式中，优选热带假丝酵母CU-206、热带假丝酵母ATCC20336为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，整合至热带假丝酵母基因组上的位点包括但不限于FAO1位点，ALD1位点，POX5位点，DLD1-1位点和DLD1-2。

在本发明的一种实施方式中，所述重组热带假丝酵母将表达carB、carRP、ERG20和BTS1的表达盒3C，或将含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ePTS的表达carB、carRP、ERG20和BTS1的表达盒3P整合至热带假丝酵母基因组的POX5位点；

同时，将表达ERG12、ERG8、ERG19和IDI1的表达盒2C，或将含有核苷酸序列如SEQID NO.1所示的ePTS的表达ERG12、ERG8、ERG19和IDI1的表达盒2P整合至热带假丝酵母基因组的ALD1位点；

同时，将表达ERG10、ERG13和tHMGR的表达盒1C，或将含有核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的ePTS的表达ERG10、ERG13和tHMGR的表达盒1P整合至热带假丝酵母基因组的FAO1位点。

在本发明的一种实施方式中，所述表达盒3C为：POX5-gda324-URA3-T_PGK1-carB-P_FBA1-P_GAP1-ERG20-T_7syn-T_ADH2-BTS1-P_FBA1-P_GAP1-carRP-T_ENO1-POX5；所述表达盒3P为：POX5-gda324-URA3-T_PGK1-ePTS-carB-P_FBA1-P_GAP1-ERG20-ePTS-T_7syn-T_ADH2-ePTS-BTS1-P_FBA1-P_GAP1-carRP-ePTS-T_ENO1-POX5；

在本发明的一种实施方式中，所述表达盒2C为：ALD1-gda324-URA3-T_ENO1-IDI1-P_GAP1-P_FBA1-ERG19-T_ADH2-T_7syn-ERG8-P_GAP1-P_FBA1-ERG12-T_PGK1-ALD1；所述表达盒2P为：ALD1-gda324-URA3-T_ENO1-ePTS-IDI1-P_GAP1-P_FBA1-ERG19-ePTS-T_ADH2-T_7syn-ePTS-ERG8-P_GAP1-P_FBA1-ERG12-ePTS-T_PGK1-ALD1；

在本发明的一种实施方式中，所述表达盒1C为：FAO1-gda324-URA3-T_ENO1-ERG10-P_GAP1-T_7syn-tHMGR-P_GAP1-P_FBA1-ERG13-T_PGK1-FAO1；所述表达盒1P为：FAO1-gda324-URA3-T_ENO1-ePTS-ERG10-P_GAP1-T_7syn-ePTS-tHMGR-P_GAP1-P_FBA1-ERG13-ePTS-T_PGK1-FAO1。

在本发明的一种实施方式中，将表达盒3P整合至热带假丝酵母基因组的POX5位点；同时，将表达盒2C整合至热带假丝酵母基因组的ALD1位点，同时，将表达盒1C整合至热带假丝酵母基因组的FAO1位点；

或将表达盒3P整合至热带假丝酵母基因组的POX5位点；同时，将表达盒2P整合至热带假丝酵母基因组的ALD1位点，同时，将表达盒1C整合至热带假丝酵母基因组的FAO1位点。

在本发明的一种实施方式中，所述重组热带假丝酵母为：将所述表达盒2P整合至热带假丝酵母基因组的ALD1位点；同时，将所述表达盒3P整合至热带假丝酵母基因组的POX5位点；同时，将表达盒1C整合至热带假丝酵母基因组的FAO1位点后得到重组热带假丝酵母1；

将整合位点POX5替换为DLD1-1的3P表达盒整合至重组热带假丝酵母1的DLD1-1位点后得到的。

在本发明的一种实施方式中，β-胡萝卜素合成途径中ERG10、ERG13和tHMGR在酵母细胞质中表达，ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、ERG20、BTS1、carB和carRP在酵母过氧化物酶体中过表达。

在本发明的一种实施方式中，β-胡萝卜素合成途径中ERG10、ERG13、tHMGR、ERG12、ERG8、ERG19和IDI1在酵母细胞质中表达，ERG20、BTS1、carB和carRP在酵母过氧化物酶体中过表达。

在本发明的一种实施方式中，所述基因ERG10、ERG13和tHMGR整合在FAO1位点表达，所述基因ERG12、ERG8、ERG19和IDI1整合在ALD1位点表达，所述基因ERG20、BTS1、carB和carRP整合为POX5位点表达。

在本发明的一种实施方式中，在DLD1-2位点过表达ERG10和NADH-HMGR，在DLD1-1位点过表达ERG20、BTS1、carB和carRP进一步强化菌株的β-胡萝卜素生产能力。

在本发明的一种实施方式中，将过表达ERG10和NADH-HMGR的表达盒整合在上述重组热带假丝酵母(将整合位点POX5替换为DLD1-1的3P表达盒整合至重组热带假丝酵母1的DLD1-1位点后得到的重组热带假丝酵母)的DLD1-2位点。

本发明提供了一种提高热带假丝酵母合成β-胡萝卜素的产量的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)在热带假丝酵母的细胞质中过表达从乙酰辅酶A到甲羟戊酸合成的相关基因，得到工程菌1；

(2)在工程菌1的细胞质中过表达从甲羟戊酸到IPP和DMAPP合成的相关基因，得到工程菌2-1；

(3)在工程菌1的过氧化物酶体中过表达从甲羟戊酸到IPP和DMAPP合成的相关基因，得到工程菌2-2；

(4)在工程菌2-1或2-2的过氧化物酶体中过表达从IPP和DMAPP到β-胡萝卜素合成的相关基。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)在热带假丝酵母基因组上不影响其生长的任一位点中，采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达ERG10基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达tHMGR基因或NADH-HMGR基因，及采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达ERG13基因，得到工程菌1；

(2)在工程菌1基因组上不影响其生长的任一位点中，采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达IDI1基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达ERG19基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG8基因，及采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达ERG12基因，得到工程菌2-1；

(3)在工程菌1基因组上不影响其生长的任一位点中，将核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的ePTS分别连接至ERG12、ERG8、ERG19、IDI1基因的3’端后，在在工程菌1基因组上不影响其生长的任一位点中，采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达IDI1-ePTS基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达ERG19-ePTS基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG8-ePTS基因，及采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达ERG12-ePTS基因，得到工程菌2-2；

(4)在工程菌2-1或2-2基因组上不影响其生长的任一位点中，采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达carB基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG20基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达BTS1基因，及采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达carRP基因；

或，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的将ePTS分别连接至carB、carRP、ERG20、BTS1基因的3’端后，在工程菌2-1或2-2基因组上不影响其生长的任一位点中，采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达carB-ePTS基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG20-ePTS基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达BTS1-ePTS基因，及采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达carRP-ePTS基因。

在本发明的一种实施方式中，以热带假丝酵母为宿主，较优的宿主为热带假丝酵母ATCC20336和CU-206。

本发明的一种实施方式中，所述基因ERG10的genebank登录号为：D13470.1，所述基因ERG13的genebank登录号为：RCK66100.1，所述基因tHMGR的genebank登录号为：RCK56388.1，HMG-CoA还原酶(NADH-HMGR)的核苷酸序列如SEQ ID NO.6；

所述基因ERG20的genebank登录号为：RCK67668.1，所述基因BTS1的genebank登录号为：RCK64891.1；所述基因carB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述基因carRP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述基因ERG12的genebank登录号为：RCK63831.1，所述基因ERG8的genebank登录号为：RCK59297.1，所述基因ERG19的genebank登录号为：RCK60630.1，所述基因IDI1的genebank登录号为：RCK59267.1。

在本发明的一种实施方式中，整合至热带假丝酵母基因组上的位点包括但不限于FAO1位点，ALD1位点，POX5位点，DLD1-1位点和DLD1-2位点。

本发明还提供了一种合成β-胡萝卜素的方法，所述方法为采用上述重组热带假丝酵母发酵制备得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为YPD60培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将酵母工程菌株在YPD中培养种子，当OD600到达12～16后，制备得到种子液，将制备得到的种子液按照5％～12％(v/v)的比例转接到发酵培养基，然后在25～40℃发酵至少48h。

在本发明的一种实施方式中，将重组热带假丝酵母在种子培养基中进行培养，当OD600到达12～16后，制备得到种子液，将制备得到的种子液按照5％～12％(v/v)的比例转接到发酵培养基，在30℃进行补料发酵，发酵时间至少72h。

本发明还提供了上述基因表达盒，或上述重组热带假丝酵母，或上述方法在在制备β-胡萝卜素或含有β-胡萝卜素的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、药品或保健品。

有益效果

(1)本发明从工业生产菌株出发，利用合成生物学技术构建高效合成β-胡萝卜素的酵母工程菌株，最终β-胡萝卜素的产量高达6.5g·L^-1，菌体干重可达213g/L。

(2)本发明首次发现并证明将β-胡萝卜素合成途径中ERG10、ERG13和tHMGR(对应代谢途径中从乙酰辅酶A到甲羟戊酸合成基因)在酵母细胞质中表达，ERG20、BTS1、carB和carRP(对应代谢途径中从IPP和DMAPP到β-胡萝卜素合成基因)在酵母过氧化物酶体中过表达，而ERG12、ERG8、ERG19和IDI1(对应代谢途径中从甲羟戊酸到IPP和DMAPP合成基因)在细胞质或过氧化物酶体中过表达是最有效的萜类合成菌株构建方式。本发明报道的β-胡萝卜素合成方式也将适用于其他四萜类化合物的生物合成。

附图说明

图1：代谢改造热带假丝酵母工程菌株β-胡萝卜素摇瓶发酵产量图。

图2：工程菌株1C2P3P-05 β-胡萝卜素摇瓶发酵产量图。

图3：工程菌株1C2P3P-05 β-胡萝卜素5L发酵罐发酵产量图。

图4：代谢改造产朊圆酵母工程菌株β-胡萝卜素摇瓶发酵产量图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的热带假丝酵母CU-206菌株(来源于热带假丝酵母ATCC20336)和CRISPR-Cas9基因编辑载体及其构建方法均记载于文献“Lihua Zhang,et al.2020,ACRISPR–Cas9 system for multiple genome editing and pathway assembly inCandida tropicalis.Biotechnol Bioeng,117:531-542”中；质粒Ts-P_GAP1DH-carRP-T_GAP1DH和Ts-PFBA1-carB-TFBA1及其构建方法以及β-胡萝卜素的提取与检测方法记载于专利“一段可用于编码番茄红素脱氢酶的基因，专利公开号为CN109652388B”中；质粒Ts-POX5-gda324-URA3及其构建方法记载于文献“张利华，2016江南大学硕士学位论文，热带假丝酵母遗传操作系统的建立及在二元酸合成中的应用”；质粒Tm-gda324-URA3及其构建方法记载于文献“Lihua Zhang,et al.2016,Development of an efficient geneticmanipulation strategy for sequential gene disruption and expression ofdifferent heterologous GFP genes in Candida tropicalis.Appl Microbiol Biot,100(22):9567-9580”中；pMD19-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

基本培养基(MM培养基)：YNB 6.7g·L^-1，硫酸铵10g·L^-1，葡萄糖20g·L^-1。

补充培养基(SM培养基)：YNB 6.7g·L^-1，硫酸铵10g·L^-1，葡萄糖20g·L^-1，尿嘧啶0.06g·L^-1。

FOA平板：YNB 6.7g·L^-1，硫酸铵10g·L^-1，葡萄糖20g·L^-1，尿嘧啶0.06g·L^-1，5-氟乳清酸0.2g·L^-1。

YPD培养基：20g·L^-1葡萄糖，10g·L^-1蛋白胨，5g·L^-1酵母粉。

YPD60培养基：60g·L^-1葡萄糖，10g·L^-1蛋白胨，5g·L^-1酵母粉。

下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示。

表1引物序列

下述实施例中所涉及的终止子序列如表2所示：

表2：终止子序列

以下实例中未具体注明的实验方法均可按照常规方法或按照所用产品生产厂商的使用说明完成，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例1：细胞质中表达基因的表达盒的构建及其应用

具体步骤如下：

1、同时表达carB、carRP、ERG20和BTS1整合表达盒的构建：

(1)以重组质粒Ts-PGAPDH-carRP-TGAPDH(构建方法记载于公开号为CN109652388B的中国发明专利文本中)为模板，引物CarRP-F和CarRP-R通过PCR扩增，得到carRP基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，然后将carRP基因插入到pMD19-T Simple商业化载体中，获得重组质粒Ts-carRP；

(2)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，P_GAP1-F和P_GAP1-R为引物，通过PCR扩增GAPDH基因启动子(所述P_GAP1启动子的genebank登录号为：HQ171163.1)，然后插入到质粒Ts-carRP中XbaI和SalI酶切位点处，获得重组质粒Ts-P_GAP1-carRP；

(3)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，TENO1A-F和TENO-R为引物，通过PCR扩增ENO1基因终止子，然后插入到质粒Ts-P_GAP1-carRP中NheI和MluI酶切位点处，获得重组质粒Ts-P_GAP1-carRP-TENO1；

(4)以重组质粒Ts-PFBA1-carB-TFBA1(构建方法记载于公开号为CN109652388B的中国发明专利文本中)为模板，以CarB-F和CarB-R为引物，通过PCR扩增，得到carB基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，然后将carB基因插入到pMD19-T Simple商业化载体中，获得重组质粒Ts-carB；

(5)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，PFBA1-F和PFBA1-R为引物，通过PCR扩增FBA1基因启动子(P_FBA1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，然后插入到质粒Ts-carB中NotI和SpeI酶切位点处，获得重组质粒Ts-PFBA1-carB；

(6)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，TPGK1-F和TPGK1-R为引物，通过PCR扩增PGK1基因终止子，然后插入到质粒Ts-PFBA1-carB中XhoI和XbaI酶切位点处，获得重组质粒Ts-PFBA1-carB-TPGK1；

(7)用NotI和XbaI酶切步骤(6)制备得到的重组质粒Ts-PFBA1-carB-TPGK1，回收carB基因表达盒PFBA1-carB-TPGK1，然后然入到步骤(3)得到的重组质粒Ts-P_GAP1-carRP-TENO1中，获得可表达carB、carRP基因的重组质粒Ts-TPGK1-carB-PFBA1-P_GAP1-carRP-TENO1(简记为PBRP01)；

(8)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，BTS1-F和BTS1-R为引物，通过PCR扩增，获得BTS1基因(所述基因BTS1的genebank登录号为：RCK64891.1)；

(9)用SpeI和XbaI酶切步骤(6)制备得到的重组质粒Ts-PFBA1-carB-TPGK1，回收带有PFBA1启动子的载体片段，然后与步骤8中的BTS1基因通过一步克隆试剂盒C112(诺唯赞)进行连接，获得重组质粒Ts-PFBA1-BTS1；

(10)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，T7TA2-F和T7TA2-R为引物，通过PCR扩增携带T_7syn终止子的ADH2终止子(TADH2)片段，然后插入到pMD19-T Simple商业化载体中，获得重组质粒Ts-T7syn-TADH2；

(11)用SacI和NotI酶切质粒步骤(9)制备得到的重组质粒Ts-PFBA1-BTS1回收PFBA1-BTS1，然后插入到重组质粒Ts-T7syn-TADH2中，获得重组质粒Ts-T7syn-TADH2-BTS1-PFBA1；

(12)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，ERG20-F和ERG20-R为引物，通过PCR扩增ERG20基因(所述基因ERG20的genebank登录号为：RCK67668.1)；

(13)用SalI和MluI酶切步骤(3)得到的重组质粒Ts-P_GAP1-carRP-TENO1，回收带有P_GAP1启动子的载体片段，然后与ERG20基因通过一步克隆试剂盒C112进行连接，获得重组质粒Ts-P_GAP1-ERG20；

(14)用SpeI和XbaI酶切质粒Ts-P_GAP1-ERG20回收P_GAP1-ERG20片段，然后插入到质粒Ts-T_7syn-T_ADH2-BTS1-P_FBA1中，获得重组质粒Ts-P_GAP1-ERG20-T_7syn-T_ADH2-BTS1-P_FBA1(简记为PBE01)

(15)用NotI酶切质粒Ts-P_GAP1-ERG20-T_7syn-T_ADH2-BTS1-P_FBA1回收ERG20和BTS1基因表达盒P_GAP1-ERG20-T_7syn-T_ADH2-BTS1-P_FBA1，然后插入到质粒PBRP01中的NotI酶切位点处，获得重组质粒Ts-TPGK1-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-T7syn-TADH2-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-TENO1(简记为PBRPBE-01)

(16)用MluI酶切重组质粒PBRPBE-01回收carB、carRP、ERG20和BTS1基因表达盒TPGK1-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-T7syn-TADH2-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-TENO1，然后插入到重组质粒Ts-POX5-gda324-URA3(构建方法记载于文献“张利华，2016江南大学硕士学位论文，热带假丝酵母遗传操作系统的建立及在二元酸合成中的应用”中)的EcoRI酶切位点处，获得重组质粒Ts-POX5-gda324-URA3-TPGK1-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-T7syn-TADH2-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-TENO1(简记为POX5-PBRPBE-01)；

(17)用Mlu I酶切质粒POX5-PBRPBE-01，获得线性化的carB、carRP、ERG20和BTS1整合表达盒POX5-gda324-URA3-TPGK1-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-T7syn-TADH2-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-TENO1-POX5；命名为3C。

2、细胞质中同时表达ERG12、ERG8、ERG19和IDI1整合表达盒的构建

(1)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，ERG19-F和ERG19-R为引物，通过PCR扩增ERG19基因(所述基因ERG19的genebank登录号为：RCK60630.1)，然后插入到质粒PBE01(Ts-P_GAP1-ERG20-T7syn-TADH2-BTS1-PFBA1)中的SacI和EcoRI酶切位点处，获得重组质粒PEE819-01-1；

(2)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，ERG8-F和ERG8-R为引物，通过PCR扩增ERG8基因(所述基因ERG8的genebank登录号为：RCK59297.1)，然后插入到质粒PEE819-01-1中的SpeI和KpnI酶切位点处，获得重组质粒PEE819-01-2；

(3)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，IDI-F和IDI-R为引物，通过PCR扩增IDI1基因(所述基因IDI1的genebank登录号为：RCK59267.1)，然后插入到质粒PBRP01中的SalI和NheI酶切位点处，获得重组质粒PIE12-01-1；

(4)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，ERG12-F和ERG12-R为引物，通过PCR扩增ERG12基因(所述基因ERG12的genebank登录号为：RCK63831.1)，然后插入到步骤(3)制备得到的重组质粒PIE12-01-1中的SpeI和XhoI酶切位点处，获得重组质粒PIE12-01-2；

(5)从质粒PEE819-01-2中回收ERG8和ERG19基因表达盒，然后插入到重组质粒质粒PIE12-01-2的Not I酶切位点处，获得重组质粒PIEEE81912-01；

(6)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，ALD-F1和ALD-R1为引物，通过PCR扩增ALD1基因(所述基因ALD1核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)，然后插入到pMD19-TSimple商业化载体中，获得重组质粒Ts-ALD1；设计引物rALD-F1和rALD-R1，以质粒Ts-ALD1为模板，通过反向PCR对质粒进行线性化；然后将线性化的DNA片段与gda-URA3片段(其序列公开于“张利华，2016江南大学硕士学位论文，热带假丝酵母遗传操作系统的建立及在二元酸合成中的应用”或文献“Lihua Zhang,et al.2016,Development of an efficientgenetic manipulation strategy for sequential gene disruption and expressionof different heterologous GFP genes in Candida tropicalis.Appl MicrobiolBiot,100(22):9567-9580”)连接，获得重组质粒Ts-ALD1-gda324-URA3；

(7)从质粒PIEEE81912-01中回收ERG8、ERG19、ERG12和IDI1基因表达盒，然后插入到重组质粒质粒Ts-ALD1-gda324-URA3的EcoRI酶切位点处，获得重组质粒ALD1-PIEEE81912-01；用MluI酶切质粒ALD1-PIEEE81912-01，获得线性化的ERG8、ERG19、ERG12和IDI1基因整合表达盒ALD1-gda324-URA3-TENO1-IDI1-P_GAP1-PFBA1-ERG19-TADH2-T7syn-ERG8-P_GAP1-PFBA1-ERG12-TPGK1-ALD1；命名为2C。

3、细胞质中同时表达ERG10、ERG13和tHMGR整合表达盒的构建

(1)用SacI和BamHI酶切PBE01(质粒Ts-P_GAP1-ERG20-T7syn-TADH2-BTS1-PFBA1)，然后将载体片段补成平末端后环化获得重组质粒Ts-P_GAP1-ERG20-TADH2-P；

(2)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，tHMG-F1和tHMG-R1为引物，通过PCR扩增tHMGR基因(所述基因tHMGR的genebank登录号为：RCK56388.1)，然后插入到步骤(1)制备得到的重组质粒Ts-P_GAP1-ERG20-TADH2-P中的SpeI和KpnI酶切位点处，获得重组质粒PtHMG-01；

(3)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，ERG10-F和ERG10-R为引物，通过PCR扩增ERG10基因(所述基因ERG10的genebank登录号为：D13470.1)，然后插入到质粒PBRP-01(重组质粒Ts-TPGK1-carB-PFBA1-P_GAP1-carRP-TENO1)中的SalI和NheI酶切位点处，获得重组质粒PEE1013-01-1；

(4)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，ERG13-F和ERG13-R为引物，通过PCR扩增ERG13基因(所述基因ERG13的genebank登录号为：RCK66100.1)，然后插入到步骤(3)制备得到的重组质粒PEE1013-01-1中的SpeI和XhoI酶切位点处，获得重组质粒PEE1013-01-2；

(5)从步骤(2)制备得到的重组质粒PtHMG-01中回收tHMGR基因表达盒，然后插入到步骤(4)制备得到的重组质粒PEE1013-01-2的Not I酶切位点处，获得重组质粒PEET10131-01；

(6)以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，FAO1-F1和FAO1-R1为引物，通过PCR扩增FAO1基因序列(所述基因FAO1的genebank登录号为：GU056288.1)，然后插入到pMD19-T Simple商业化载体中，获得重组质粒Ts-FAO1；设计引物rFAO1-F1和rFAO1-R1，以质粒Ts-FAO1为模板，通过反向PCR对质粒进行线性化；然后将线性化的DNA片段与gda-URA3片段连接，获得重组质粒Ts-FAO1-gda324-URA3；

(7)从步骤(5)制备得到的重组质粒PEET10131-01中回收ERG10、ERG13和tHMGR基因表达盒，然后插入到步骤(6)制备得到的重组质粒Ts-FAO1-gda324-URA3的EcoR I酶切位点处，获得重组质粒FAO1-PEET10131-01；用Mlu I酶切质粒FAO1-PEET10131-01获得线性化的ERG10、ERG13和tHMGR基因整合表达盒FAO1-gda324-URA3-T_ENO1-ERG10-P_GAP1-T_7syn-tHMGR-P_GAP1-P_FBA1-ERG13-T_PGK1-FAO1；命名为1C。

4.产β-胡萝卜素工程菌株1C2C3C的构建

(1)利用CRISPR-Cas9技术将线性化的上述步骤3制备得到的ERG10、ERG13和tHMGR整合表达盒(1C)FAO1-gda324-URA3-T_ENO1-ERG10-P_GAP1-T_7syn-tHMGR-P_GAP1-P_FBA1-ERG13-T_PGK1-FAO1转化进入热带假丝酵母CU-206(来源于热带假丝酵母ATCC20336，构建方法记载于文献“Lihua Zhang,et al.2020,A CRISPR–Cas9 system for multiple genome editing andpathway assembly in Candida tropicalis.Biotechnol Bioeng,117:531-542”)，在FAO1位点整合两个拷贝的ERG10、ERG13和tHMGR基因，获得菌株DC-01。

(2)DC-01丢失URA3基因(具体方法可以参考文献“Lihua Zhang,et al.2016,Development of an efficient genetic manipulation strategy for sequential genedisruption and expression of different heterologous GFP genes in Candidatropicalis.Appl Microbiol Biot,100(22):9567-9580”)后获得突变菌株DC-02；

(3)再利用CRISPR-Cas9技术将线性化的上述步骤2制备得到的ERG8、ERG19、ERG12和IDI1基因整合表达盒(2C)ALD1-gda324-URA3-TENO1-IDI1-P_GAP1-PFBA1-ERG19-TADH2-T7syn-ERG8-P_GAP1-PFBA1-ERG12-TPGK1-ALD1整合至热带假丝酵母DC-02的ALD1位点，获得菌株DC-03。

(4)DC-03丢失URA3基因后获得突变菌株DC-04；

(5)再次利用CRISPR-Cas9技术将上述步骤1制备得到的线性化的carB、carRP、ERG20和BTS1基因整合表达盒(3C)POX5-gda324-URA3-TPGK1-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-T7syn-TADH2-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-TENO1-POX5整合至热带假丝酵母DC-04的POX5，获得菌株1C2C3C。

5、利用基因工程菌制备β-胡萝卜素

(1)挑取步骤4制备得到的热带假丝酵母基因工程菌1C2C3C单菌落接种至20mL新鲜的YPD培养基中，并在30℃，200rpm条件下培养作为种子液；

(2)当种子液OD₆₀₀到达12～15后按照5％(v/v)的比例转接到装有15mL YPD培养基的摇瓶中，在30℃，200rpm条件下发酵3d。

发酵结束后提取β-胡萝卜素并进行检测，菌株1C2C3C的β-胡萝卜素产量为55.2mg·L^-1(如图1所示)。

实施例2：线粒体中表达基因的表达盒的构建及其应用

实施例中所涉及的线粒体定位信号肽编码序列MLS的核苷酸序列如表2所示。

1、线粒体中同时表达carB、carRP、ERG20和BTS1整合表达盒的构建

(1)通过一步克隆试剂盒C113(诺唯赞)在重组质粒PBRP01中carB和carRP基因的5’端添加线粒体定位信号肽编码序列MLS，构建重组质粒PBRP02；

(2)通过一步克隆试剂盒C113在重组质粒PBE01中ERG20和BTS1基因的5`端添加线粒体定位信号肽编码序列MLS，构建重组质粒PBE02；

(3)用NotI酶切质粒PBE02回收ERG20和BTS1基因表达盒P_GAP1-MLS-ERG20-T7syn-TADH2-BTS1-MLS-PFBA1，然后插入到质粒PBRP02中的NotI酶切位点处，获得重组质粒PBRPBE-02。

(4)用MluI酶切重组质粒PBRPBE-02回收carB、carRP、ERG20和BTS1基因表达盒TPGK1-carB-MLS-PFBA1-P_GAP1-MLS-ERG20-T7syn-TADH2-BTS1-MLS-PFBA1-P_GAP1-MLS-carRP-TENO1，然后插入到重组质粒Ts-POX5-gda324-URA3(构建方法记载于文献“张利华，2016江南大学硕士学位论文，热带假丝酵母遗传操作系统的建立及在二元酸合成中的应用”中)的EcoRI酶切位点处，获得重组质粒POX5-PBRPBE-02；

(5)用Mlu I酶切质粒POX5-PBRPBE-02，获得线性化的carB、carRP、ERG20和BTS1整合表达盒POX5-gda324-URA3-TPGK1-carB-MLS-PFBA1-P_GAP1-MLS-ERG20-T7syn-TADH2-BTS1-MLS-PFBA1-P_GAP1-MLS-carRP-TENO1-POX5；命名为3M。

2、线粒体中同时表达ERG12、ERG8、ERG19和IDI1整合表达盒的构建

(1)通过一步克隆试剂盒C113在重组质粒PEE819-01-2中ERG8和ERG19基因的5`端添加线粒体定位信号肽编码序列MLS，构建重组质粒PEE819-02-2；

(2)通过一步克隆试剂盒C113在重组质粒PIE12-01-2中ERG12和IDI1基因的5`端添加线粒体定位信号肽编码序列MLS，构建重组质粒PIE12-02-2；

(3)用NotI酶切质粒PEE819-02-2回收ERG8和ERG19基因表达盒P_GAP1-MLS-ERG8-T7syn-TADH2-ERG19-MLS-PFBA1，然后插入到质粒PIE12-02-2中的NotI酶切位点处，获得重组质粒PIEEE81912-02；

(4)用MluI酶切重组质粒PIEEE81912-02回收ERG12、ERG8、ERG19和IDI基因表达盒TENO1-IDI1-MLS-P_GAP1-PFBA1-MLS-ERG19-TADH2-T7syn-ERG8-MLS-P_GAP1-PFBA1-MLS-ERG12-TPGK1，然后插入到重组质粒Ts-ALD1-gda324-URA3的EcoRI酶切位点处，获得重组质粒ALD1-PIEEE81912-02；

(5)用Mlu I酶切质粒ALD1-PIEEE81912-02，获得线性化的ERG8、ERG19、ERG12和IDI1基因整合表达盒ALD1-gda324-URA3-TENO1-IDI1-MLS-P_GAP1-PFBA1-MLS-ERG19-TADH2-T7syn-ERG8-MLS-P_GAP1-PFBA1-MLS-ERG12-TPGK1-ALD1；命名为2M。

3、线粒体中同时表达ERG10、ERG13和tHMGR整合表达盒的构建

(1)通过一步克隆试剂盒C113在重组质粒PtHMG-01中tHMGR基因的5`端添加线粒体定位信号肽编码序列MLS，构建重组质粒PtHMG-02；

(2)通过一步克隆试剂盒C113在重组质粒PEE1013-01-2中ERG10和ERG13基因的5`端添加线粒体定位信号肽编码序列MLS，构建重组质粒PEE1013-02-2；

(3)用NotI酶切质粒PtHMG-02回收tHMGR基因表达盒T7syn-tHMGR-MLS-P_GAP1，然后插入到质粒PEE1013-02-2中的NotI酶切位点处，获得重组质粒PEET10131-02；

(4)用MluI酶切重组质粒PEET10131-02回收ERG10、ERG13和tHMGR基因表达盒T_ENO1-ERG10-MLS-P_GAP1-T_7syn-tHMGR-MLS-P_GAP1-P_FBA1-MLS-ERG13-T_PGK1，然后插入到重组质粒Ts-FAO1-gda324-URA3的EcoRI酶切位点处，获得重组质粒FAO1-PEET10131-02；

(5)用Mlu I酶切质粒FAO1-PEET10131-02获得线性化的ERG10、ERG13和tHMGR基因整合表达盒FAO1-gda324-URA3-T_ENO1-ERG10-MLS-P_GAP1-T_7syn-tHMGR-MLS-P_GAP1-P_FBA1-MLS-ERG13-T_PGK1-FAO1；命名为1M。

4.产β-胡萝卜素工程菌株1M2M3M的构建

(1)按着菌株1C2C3C的构建流程(实施例1的步骤4的方法)，利用CRISPR-Cas9技术依次将步骤1～步骤3制备得到的表达盒(1M～3M)FAO1-gda324-URA3-T_ENO1-ERG10-MLS-P_GAP1-T_7syn-tHMGR-MLS-P_GAP1-P_FBA1-MLS-ERG13-T_PGK1-FAO1、ALD1-gda324-URA3-TENO1-IDI1-MLS-P_GAP1-PFBA1-MLS-ERG19-TADH2-T7syn-ERG8-MLS-P_GAP1-PFBA1-MLS-ERG12-TPGK1-ALD1和POX5-gda324-URA3-TPGK1-carB-MLS-PFBA1-P_GAP1-MLS-ERG20-T7syn-TADH2-BTS1-MLS-PFBA1-P_GAP1-MLS-carRP-TENO1-POX5转化进入热带假丝酵母CU-206获得工程菌株1M2M3M。

挑取1M2M3M单菌落接种至20mL新鲜的YPD培养基中，并在30℃，200rpm条件下培养作为种子液；

当种子液OD₆₀₀到达12～15后按照5％(v/v)的比例转接到装有15mL YPD培养基的摇瓶中，在30℃，200rpm条件下发酵3d。

发酵结束后提取β-胡萝卜素并进行检测，菌株1M2M3M的β-胡萝卜素产量为1.5mg·L^-1(如图1所示)。

实施例3：过氧化物酶体中表达基因的表达盒的构建及其应用

实施例中所涉及的过氧化物酶体定位信号肽编码序列ePTS的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

1、过氧化物酶体中同时表达carB、carRP、ERG20和BTS1整合表达盒的构建

(1)通过一步克隆试剂盒C113在重组质粒PBRP01中carB和carRP基因的3’端添加过氧化物酶体定位信号肽编码序列ePTS，构建重组质粒PBRP03；

(2)通过一步克隆试剂盒C113在重组质粒PBE01中ERG20和BTS1基因的3’端添加过氧化物酶体定位信号肽编码序列ePTS，构建重组质粒PBE03；

(3)用NotI酶切质粒PBE03回收ERG20和BTS1基因表达盒P_GAP1-ERG20-ePTS-T7syn-TADH2-ePTS-BTS1-PFBA1，然后插入到质粒PBRP03中的NotI酶切位点处，获得重组质粒PBRPBE-03；

(4)用MluI酶切重组质粒PBRPBE-03回收carB、carRP、ERG20和BTS1基因表达盒TPGK1-ePTS-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-ePTS-T7syn-TADH2-ePTS-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-ePTS-TENO1，然后插入到重组质粒Ts-POX5-gda324-URA3的EcoRI酶切位点处，获得重组质粒POX5-PBRPBE-03；

(5)用Mlu I酶切质粒POX5-PBRPBE-03，获得线性化的carB、carRP、ERG20和BTS1整合表达盒POX5-gda324-URA3-TPGK1-ePTS-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-ePTS-T7syn-TADH2-ePTS-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-ePTS-TENO1-POX5；命名为3P。

2、过氧化物酶体中同时表达ERG12、ERG8、ERG19和IDI整合表达盒的构建

(1)通过一步克隆试剂盒C113在重组质粒PEE819-01-2中ERG8和ERG19基因的3’端添加过氧化物酶体定位信号肽编码序列ePTS，构建重组质粒PEE819-03-2；

(2)通过一步克隆试剂盒C113在重组质粒PIE12-01-2中ERG12和IDI1基因的3’端添加过氧化物酶体定位信号肽编码序列ePTS，构建重组质粒PIE12-03-2；

(3)用NotI酶切质粒PEE819-03-2回收ERG8和ERG19基因表达盒P_GAP1-ERG8-ePTS-T7syn-TADH2-ePTS-ERG19-PFBA1，然后插入到质粒PIE12-03-2中的NotI酶切位点处，获得重组质粒PIEEE81912-03；

(4)用MluI酶切重组质粒PIEEE81912-03回收ERG12、ERG8、ERG19和IDI基因表达盒TENO1-ePTS-IDI1-P_GAP1-PFBA1-ERG19-ePTS-TADH2-T7syn-ePTS-ERG8-P_GAP1-PFBA1-ERG12-ePTS-TPGK1，然后插入到重组质粒Ts-ALD1-gda324-URA3的EcoRI酶切位点处，获得重组质粒ALD1-PIEEE81912-03；

(5)用Mlu I酶切质粒ALD1-PIEEE81912-03，获得线性化的ERG8、ERG19、ERG12和IDI1基因整合表达盒ALD1-gda324-URA3-TENO1-ePTS-IDI1-P_GAP1-PFBA1-ERG19-ePTS-TADH2-T7syn-ePTS-ERG8-P_GAP1-PFBA1-ERG12-ePTS-TPGK1-ALD1；命名为2P。

3、过氧化物酶体中同时表达ERG10、ERG13和tHMGR整合表达盒的构建

(1)通过一步克隆试剂盒C113在重组质粒PtHMG-01中tHMGR基因的3`端添加过氧化物酶体定位信号肽编码序列ePTS，构建重组质粒PtHMG-03；

(2)通过一步克隆试剂盒C113在重组质粒PEE1013-01-2中ERG10和ERG13基因的3`端添加过氧化物酶体定位信号肽编码序列ePTS，构建重组质粒PEE1013-03-2；

(3)用NotI酶切质粒PtHMG-03回收tHMGR基因表达盒T7syn-ePTS-tHMGR-P_GAP1，然后插入到质粒PEE1013-03-2中的NotI酶切位点处，获得重组质粒PEET10131-03；

(4)用MluI酶切重组质粒PEET10131-03回收ERG10、ERG13和tHMGR基因表达盒T_ENO1-ePTS-ERG10-P_GAP1-T_7syn-ePTS-tHMGR-P_GAP1-P_FBA1-ERG13-ePTS-T_PGK1，然后插入到重组质粒Ts-FAO1-gda324-URA3的EcoRI酶切位点处，获得重组质粒FAO1-PEET10131-03；

(5)用Mlu I酶切质粒FAO1-PEET10131-03获得线性化的ERG10、ERG13和tHMGR基因整合表达盒FAO1-gda324-URA3-T_ENO1-ePTS-ERG10-P_GAP1-T_7syn-ePTS-tHMGR-P_GAP1-P_FBA1-ERG13-ePTS-T_PGK1-FAO1；命名为1P。

4、产β-胡萝卜素工程菌株1P2P3P的构建

按着菌株1C2C3C的构建流程(实施例1的步骤4的方法)，利用CRISPR-Cas9技术依次将步骤1～步骤3制备得到的表达盒(1P～3P)FAO1-gda324-URA3-T_ENO1-ePTS-ERG10-P_GAP1-T_7syn-ePTS-tHMGR-P_GAP1-P_FBA1-ERG13-ePTS-T_PGK1-FAO1(1P)、ALD1-gda324-URA3-TENO1-ePTS-IDI1-P_GAP1-PFBA1-ERG19-ePTS-TADH2-T7syn-ePTS-ERG8-P_GAP1-PFBA1-ERG12-ePTS-TPGK1-ALD1(2P)和POX5-gda324-URA3-TPGK1-ePTS-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-ePTS-T7syn-TADH2-ePTS-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-ePTS-TENO1-POX5(3P)转化进入热带假丝酵母CU-206获得工程菌株；即：将1P表达盒整合至热带假丝酵母CU-206的FAO1位点中，得到DP-01(丢失URA3基因获得DP-02)，将2P表达盒整合至DP-02菌株的ALD1位点中，得到DP-03(丢失URA3基因获得DP-04)，将3P表达盒整合至DP-04菌株的POX5位点中，得到1P2P3P。

5、利用基因工程菌制备β-胡萝卜素

挑取1P2P3P单菌落接种至20mL新鲜的YPD培养基中，并在30℃，200rpm条件下培养作为种子液；

当种子液OD₆₀₀到达12～15后按照5％(v/v)的比例转接到装有15mL YPD培养基的摇瓶中，在30℃，200rpm条件下发酵3d。

发酵结束后提取β-胡萝卜素并进行检测，菌株1P2P3P的β-胡萝卜素产量为126.9mg·L^-1(如图1所示)。

实施例4：产β-胡萝卜素工程菌株的构建

1.产β-胡萝卜素工程菌株1C2C3P的构建

利用CRISPR-Cas9技术将线性化的carB、carRP、ERG20和BTS1整合表达盒POX5-gda324-URA3-TPGK1-ePTS-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-ePTS-T7syn-TADH2-ePTS-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-ePTS-TENO1-POX5(3P表达盒)转化进入热带假丝酵母DC-04(含有1C，2C表达盒)获得菌株1C2C3P。

2.产β-胡萝卜素工程菌株1C2P3P的构建

利用CRISPR-Cas9技术将线性化的ERG8、ERG19、ERG12和IDI1基因整合表达盒ALD1-gda324-URA3-TENO1-ePTS-IDI1-P_GAP1-PFBA1-ERG19-ePTS-TADH2-T7syn-ePTS-ERG8-P_GAP1-PFBA1-ERG12-ePTS-TPGK1-ALD1(2P表达盒)和线性化的carB、carRP、ERG20和BTS1整合表达盒POX5-gda324-URA3-TPGK1-ePTS-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-ePTS-T7syn-TADH2-ePTS-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-ePTS-TENO1-POX5(3P表达盒)依次转化进入热带假丝酵母DC-02(含有1C表达盒)获得菌株1C2P3P。菌株1C2P3P丢失URA3基因后获得突变菌株1C2P3P-02。

3.产β-胡萝卜素工程菌株1P2P3C的构建

利用CRISPR-Cas9技术将线性化的carB、carRP、ERG20和BTS1整合表达盒POX5-gda324-URA3-TPGK1-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-T7syn-TADH2-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-TENO1-POX5(3C表达盒)转化进入热带假丝酵母DP-04(含有1P，2P表达盒)获得菌株1P2P3C。

4.产β-胡萝卜素工程菌株1P2C3P的构建

利用CRISPR-Cas9技术将线性化的ERG8、ERG19、ERG12和IDI1基因整合表达盒ALD1-gda324-URA3-TENO1-IDI1-P_GAP1-PFBA1-ERG19-TADH2-T7syn-ERG8-P_GAP1-PFBA1-ERG12-TPGK1-ALD1(2C表达盒)和线性化的carB、carRP、ERG20和BTS1整合表达盒POX5-gda324-URA3-TPGK1-ePTS-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-ePTS-T7syn-TADH2-ePTS-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-ePTS-TENO1-POX5(3P表达盒)依次转化进入热带假丝酵母DP-02(含有1P表达盒)获得菌株1P2C3P。

5.产β-胡萝卜素工程菌株的发酵

分别挑取1C2C3P、1C2P3P、1P2P3C和1P2C3P单菌落到在20mL新鲜的YPD培养基中，并在30℃，200rpm条件下培养作为种子液；

当种子液OD₆₀₀到达12～15后按照5％(v/v)的比例转接到装有15mL YPD培养基的摇瓶中，在30℃，200rpm条件下发酵3d。

发酵结束后提取β-胡萝卜素并进行检测，工程菌株1C2C3P、1C2P3P、1P2P3C和1P2C3P的β-胡萝卜素产量分别为198.5、203.7、25.2和75.3mg·L^-1(如图1所示)。

其中菌株1C2P3P的产量显著最高，是菌株1C2C3C的3.7倍，是菌株1M2M3M的135.8倍，是菌株1P2P3P的1.6倍。

实施例5：产β-胡萝卜素工程菌株1C2P3P-03的构建及其应用

1、表达盒的构建：

以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，DLD1-F1和DLD1-R1为引物(序列如表3所示)，通过PCR扩增DLD1-1基因序列(genebank登录号为：RCK67597.1)，然后插入到pMD19-T Simple商业化载体中，获得重组质粒Ts-DLD1-1；设计引物rDLD1-F1和rDLD1-R1，以质粒Ts-DLD1-1为模板，通过反向PCR对质粒进行线性化；然后将线性化的DNA片段与gda-URA3片段连接，获得重组质粒Ts-DLD1-1-gda324-URA3；

表3引物序列

用MluI酶切重组质粒PBRPBE-03回收carB、carRP、ERG20和BTS1基因表达盒TPGK1-ePTS-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-ePTS-T7syn-TADH2-ePTS-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-ePTS-TENO1，然后插入到重组质粒Ts-DLD1-1-gda324-URA3的EcoRI酶切位点处，获得重组质粒DLD1-1-PBRPBE-03；

用Mlu I酶切质粒DLD1-1-PBRPBE-03，获得线性化的carB、carRP、ERG20和BTS1整合表达盒DLD1-1-gda324-URA3-TPGK1-ePTS-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-ePTS-T7syn-TADH2-ePTS-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-ePTS-TENO1-DLD1-1(将整合位点POX5替换为DLD1-1的3P表达盒)。

2.产β-胡萝卜素工程菌株1C2P3P-03的构建与发酵

利用CRISPR-Cas9技术将表达盒DLD1-1-gda324-URA3-TPGK1-ePTS-carB-PFBA1-P_GAP1-ERG20-ePTS-T7syn-TADH2-ePTS-BTS1-PFBA1-P_GAP1-carRP-ePTS-TENO1-DLD1-1(将整合位点POX5替换为DLD1-1的3P表达盒)转化进入热带假丝酵母1C2P3P-02(实施例4步骤2制备得到的)获得工程菌株1C2P3P-03(丢失URA3基因获得1C2P3P-04)。

挑取1C2P3P-03单菌落到在20mL新鲜的YPD培养基中，并在30℃，200rpm条件下培养作为种子液，当种子液OD₆₀₀到达12～15后按照5％(v/v)的比例转接到装有15mL YPD培养基的摇瓶中，在30℃，200rpm条件下发酵3d。

发酵结束后提取β-胡萝卜素并进行检测，菌株1C2P3P-03的β-胡萝卜素产量为223.3mg·L^-1(如图1所示)。

实施例6：产β-胡萝卜素工程菌株1C2P3P-05的构建与应用

1、表达盒的构建：

根据热带假丝酵母的密码子偏好性对来源于Silicibacter pomeroyi的HMG-CoA还原酶(NADH-HMGR)进行全序列密码子优化，然后化学合成得到优化后的NADH-HMGR基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，将优化后的NADH-HMGR基因插入到质粒PEE1013-01-1(实施例1的步骤3的(3)制备得到的)的SpeI和XhoI酶切位点处，获得携带在细胞质中表达ERG10和NADH-HMGR基因的重组质粒PEH10R-01-2；

以热带假丝酵母ATCC 20336染色体DNA为模板，DLD1-F2和DLD1-R2为引物(如表4所示)，通过PCR扩增DLD1-2基因序列(genebank登录号为：RCK60940.1)，然后插入到pMD19-T Simple商业化载体中，获得重组质粒Ts-DLD1-2；设计引物rDLD1-F2和rDLD1-R2，以质粒Ts-DLD1-2为模板，通过反向PCR对质粒进行线性化；然后将线性化的DNA片段与gda-URA3片段连接，获得重组质粒Ts-DLD1-2-gda324-URA3；

表4引物序列

从质粒PEH10R-01-2中回收ERG10和NADH-HMGR基因表达盒，然后插入到重组质粒质粒Ts-DLD1-2-gda324-URA3的EcoRI酶切位点处，获得重组质粒Ts-DLD1-2-gda324-URA3-T_ENO1-ERG10-P_GAP1-P_FBA1-NADH-HMGR-T_PGK1(简记为DLD2-PEH10R-01-2)；用Mlu I酶切质粒DLD2-PEH10R-01-2获得线性化的ERG10和NADH-HMGR基因整合表达盒DLD1-2-gda324-URA3-T_ENO1-ERG10-P_GAP1-P_FBA1-NADH-HMGR-T_PGK1-DLD1-2。

2.产β-胡萝卜素工程菌株1C2P3P-05的构建与发酵

利用CRISPR-Cas9技术将表达盒DLD1-2-gda324-URA3-T_ENO1-ERG10-P_GAP1-P_FBA1-NADH-HMGR-T_PGK1-DLD1-2转化进入热带假丝酵母1C2P3P-04(实施例5的步骤2制备得到的)获得工程菌株1C2P3P-05。

挑取1C2P3P-05单菌落到在20mL新鲜的YPD培养基中，并在30℃，200rpm条件下培养作为种子液，当种子液OD₆₀₀到达12～15后按照5％(v/v)的比例转接到装有15mL YPD培养基的摇瓶中，在30℃，200rpm条件下发酵3d。发酵结束后提取β-胡萝卜素并进行检测，菌株1C2P3P-05的β-胡萝卜素产量为245.0mg·L^-1(如图1所示)。

实施例7：产β-胡萝卜素工程菌株1C2P3P-05的发酵优化

具体步骤如下：

挑取1C2P3P-05单菌落到在20mL新鲜的YPD培养基中，并在30℃，200rpm条件下培养作为种子液，当种子液OD₆₀₀到达12～15后按照5％(v/v)的比例转接到装有15mL YPD 60培养基的摇瓶中，在30℃，200rpm条件下发酵4d；

其中，在发酵进行到24h时补加20g/L的葡萄糖，1g/L的酵母粉和2g/L的蛋白胨。

发酵结束后提取β-胡萝卜素并进行检测，菌株1C2P3P-05的β-胡萝卜素产量为886.0mg·L^-1，较YPD培养基中β-胡萝卜素产量提高了2.6倍(如图2所示)。

实施例8：产β-胡萝卜素工程菌株1C2P3P-05的发酵罐培养

具体步骤如下：

(1)挑取1C2P3P-05单菌落到在20mL新鲜的YPD培养基中，并在30℃，200rpm条件下培养作为一级种子液；

(2)将一级种子液按照1％(v/v)的接种量转接到50mL新鲜的YPD培养基中，并在30℃，200rpm条件下培养作为二级种子液；

(3)当二级种子液OD₆₀₀到达12～15后按照10％(v/v)的比例转接到装有2.5LYPD60培养基的5L发酵罐中进行发酵；

发酵过程通气量为2-4vvm，转速为400-800rpm，溶氧控制在20％以上，发酵过程pH控制在5.5，通过流加浓度为800g/L的葡萄糖控制发酵液中葡萄糖浓度，发酵温度为30℃，发酵周期为9d。

发酵结束后提取β-胡萝卜素并进行检测，在5L发酵罐中菌株1C2P3P-05的最终菌体干重为213g/L，β-胡萝卜素产量为6.5g·L^-1，是摇瓶水平的7.3倍(如图3所示)。

对比例1：

具体实施方式同实施例1和实施例3～4，区别在于，调整宿主细胞为产朊圆酵母ATCC 9226。

分别制备得到所有基因在细胞质中表达的工程菌株CU-1C2C3C菌株，所有基因在过氧化物酶体中表达的工程菌株CU-1P2P3P菌株。

将实施例1中ERG10、ERG13和tHMGR基因表达盒，实施例3中ERG8、ERG19、ERG12和IDI1基因表达盒以及carB、carRP、ERG20和BTS1表达盒转化产朊圆酵母，构建乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因、HMG-CoA合成酶基因和HMG-CoA还原酶基因在酵母细胞质中表达，其它基因在酵母过氧化物酶体中表达的工程菌株CU-1C2P3P。

分别挑取CU-1C2C3C、CU-1P2P3P和CU-1C2P3P单菌落到在20mL新鲜的YPD培养基中，并在30℃，200rpm条件下培养作为种子液；

当种子液OD₆₀₀到达8～12后按照5％(v/v)的比例转接到装有15mL YPD培养基的摇瓶中，在30℃，200rpm条件下发酵3d。发酵结束后提取β-胡萝卜素并进行检测。

结果显示，菌株CU-1C2C3C、CU-1P2P3P和CU-1C2P3P的β-胡萝卜素产量分别为3.3mg·L^-1、9.2mg·L^-1和19.7mg·L^-1(如图4所示)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种高效合成β-胡萝卜素菌株的构建方法及其应用

<130> BAA211518A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgggtagag gtagaagatc caagttg 27

<210> 2

<211> 1845

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgttgttga cctacatgga agtccacttg tactacacct tgccagtctt gggtgtcttg 60

tcttggttgt ccagaccata ctacaccgct accgacgcct tgaagttcaa gttcttgacc 120

ttggtcgctt tcactaccgc ttcagcttgg gacaactaca tcgtctacca caaggcttgg 180

tcctattgtc caacttgtgt caccgccgtt atcggttacg tcccattgga agaatacatg 240

ttcttcatca tcatgacctt gttgaccgtc gctttcacca acttggtcat gagatggcac 300

ttgcactcct tcttcatcag accagaaacc ccagtcatgc aatccgtctt ggtcagattg 360

gtcccaatca ccgctttgtt gatcaccgct tacaaggctt ggcatttggc cgttccaggt 420

aagccattgt tctacggttc ttgtatcttg tggtacgctt gtccagtctt ggctttgttg 480

tggttcggtg ccggtgaata catgatgaga agaccattgg ccgttttggt ctccatcgct 540

ttgccaacct tgttcttgtg ttgggttgac gttgttgcta ttggtgccgg tacttgggat 600

atctccttgg ctacttccac cggtaagttc gttgtcccac acttgccagt cgaagaattc 660

atgttcttcg ccttgatcaa caccgtcttg gtcttcggta cttgtgctat cgacagaacc 720

atggccatct tgcacttgtt caagaacaag tccccatacc aaagaccata ccaacactcc 780

aagtccttct tgcaccaaat cttggaaatg acttgggcct tttgtttgcc agaccaagtc 840

ttgcactccg atactttcca cgacttgtcc gtcagttggg acatcttgag aaaggcttcc 900

aagtccttct acaccgcttc agccgttttc ccaggtgacg tcagacaaga attgggtgtc 960

ttgtacgcct tttgtagagc taccgacgac ttgtgtgaca acgaacaagt cccagtccaa 1020

accagaaagg aacaattgat cttgacccac caattcgtct ccgacttgtt cggtcaaaag 1080

acctcagctc caaccgctat tgattgggac ttctacaacg accaattgcc agcctcttgt 1140

atctccgcct tcaagtcctt caccagattg agacacgtct tggaagccgg tgctatcaag 1200

gaattgttgg acggttacaa gtgggacttg gaaagaagat ccatcagaga ccaagaagac 1260

ttgagatact actccgcttg tgtcgcttcc tccgttggtg aaatgtgtac cagaatcatc 1320

ttggctcacg ccgataagcc agcttccaga caacaaaccc aatggatcat ccaaagagcc 1380

agagaaatgg gtttggtctt gcaatacacc aacatcgcta gagacatcgt taccgactcc 1440

gaagaattgg gtagatgtta cttgccacaa gattggttga ccgaaaagga agtcgccttg 1500

atccaaggtg gtttggccag agaaatcggt gaagaaagat tgttgtcctt gtcccacaga 1560

ttgatctacc aagccgacga attgatggtc gtcgctaaca agggtatcga caagttgcca 1620

tcccattgtc aaggtggtgt tagagccgct tgtaacgttt acgcctccat cggtaccaag 1680

ttgaagtcct acaagcacca ctacccatcc agagctcacg ttggtaactc caagagagtc 1740

gaaatcgcct tgttgtccgt ctacaacttg tacaccgctc caatcgctac ctcttctact 1800

acccattgta gacaaggtaa gatgagaaac ttgaacacca tctaa 1845

<210> 3

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtccaaga aacacattgt cattatcggt gctggcgtgg gtggcacggc tacagctgct 60

cgtttggccc gcgaaggctt caaggtcact gtggtggaga aaaacgactt tggtggcggc 120

cgctgctcct tgatccatca ccagggccat cgctttgatc agggcccgtc gctctacttg 180

atgcccaagt actttgagga cgcctttgcc gatttggacg agcgcattca agaccacttg 240

gagttgttgc gatgcgacaa caactacaag gtgcactttg acgacggtga gtcgatccag 300

ttgtcgtctg acttgacacg catgaaggct gaattggacc gcgtggaggg cccccttggt 360

tttggccgat tcttggattt catgaaagag acacacatcc actacgaaag cggcaccttg 420

attgcgctca agaagaattt cgaatccatc tgggacttga ttcgcatcaa gtacgctcca 480

gagatctttc gcttgcactt gtttggcaag atctacgacc gcgcttccaa gtacttcaag 540

accaagaaga tgcgcatggc attcacgttt cagaccatgt atatgggcat gtcgccctac 600

gatgcgcctg ctgtctacag cttgttgcag tacaccgagt tcgctgaagg catctggtat 660

ccccgtggcg gcttcaacat ggtggttcag aagctagagg cgattgcaaa gcaaaagtac 720

gatgccgagt ttatctacaa tgcgcctgtt gccaagatta acaccgatga tgccaccaaa 780

caagtgacag gtgtaacctt ggaaaatggc cacatcatcg atgccgatgc ggttgtgtgt 840

aacgcagatt tggtctatgc ttatcacaat ttgttgcctc cctgccgatg gacgcaaaac 900

acattggctt ccaagaaatt gacgtcttct tccatttcct tctactggtc catgtccacc 960

aaggtgcctc aattggacgt gcacaacatc tttttggccg aggcttatca ggagagcttt 1020

gacgaaatct tcaaggactt tggcttgcct tctgaagcct ccttctacgt caatgtgccc 1080

tctcgcatcg atccttctgc tgctcccgac ggcaaggact ctgtcattgt cttggtgcct 1140

attggtcata tgaagagcaa gacgggcgat gcttccaccg agaactaccc ggccatggtg 1200

gacaaggcac gcaagatggt gctggttgtg attgagcgtc gtttgggcat gtcgaatttc 1260

gccgacttga ttgagcatga gcaagtcaat gatcccgctg tatggcagag caagttcaat 1320

ttgtggagag gctcaatttt gggtttgtct catgatgtgc ttcaggtgtt gtggttccgt 1380

cccagcacaa aggattctac cggtcgttat gataacctat tctttgtggg tgcaagcacg 1440

catcccggaa ctggtgttcc cattgtcctt gcaggaagca agctcacctc tgaccaagtt 1500

gtcaagagct ttggaaagac gcccaagcca agaaagatcg agatggagaa cacgcaagca 1560

cctttggagg agcctgatgc tgaatcgaca ttccctgtgt ggttctggtt gcgcgctgcc 1620

ttttgggtca tgtttatgtt cttttacttc ttccctcaat ccaatggcca aacgcccgca 1680

tcttttatca ataatttgtt acctgaagta ttccgcgttc ataactctaa tgtcatttaa 1740

<210> 4

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgttggatga tttgtagata aggtagtaaa ttaattaaaa agccaattaa ttgttggttg 60

taaaaatatt aaaaaaccaa gagaagggtt gtaaaaaaaa aaactggtac gacgggactg 120

gggggttgta aacgtattta tatattattt tattgagttg agcaccgtga aaaaaagaaa 180

gtgggtgggt tgttgttatt gctgtctgga aatggcagtg cgtgcaccgt gacacaaaag 240

taattaaaat attacgttgc ctggagttgg ctgttctccg gcgcacacca caccacacat 300

ctctccctct ctccctccca ccaccacgca ccacgcacca cgcaccgcca gatctttttt 360

tttgctctct ccctctgtct ccctcccacc agctgatggc agccggtgcc agacaaatca 420

actcagggtt gtactcgtga tgaaaaattt ttcaaatcag ctggaactct ttgccccgag 480

atacaccaga gcaacaagac accaccaaga gaagagagaa aaaaatttac gtcatgctac 540

gctgctccca ttacacctct gatgtaatgc ccttcagatc aattgactgg tggtggtgga 600

tccaaaaggc ggataattcc agactcttcg gaactcattc caaagctcgg ggtaaacaaa 660

aaaaaaaaat catactcttt gttctttgtt tctctccacc catgtgtccc tccttttctc 720

tctctggcta tattgccctc taactccatg gcgatctgct ccgaacccgt agaaccccgg 780

gggtatacca acacttcacc cacacacaag aaaaacgcaa tcccacactc tcccaattga 840

caagtcggtt accttagtag tctatgagta ataccgaatc tccttattgg ctactggcta 900

ctaaccctct tccttaagga acgtgacctt cctcccttgc ttaagctgtc cgctctctat 960

gccgtacaac aaaaaaaaaa gacctgagga ggtttgtgtc ggacttgaaa ctcctccaag 1020

aatcgtgtcc ttaccaatta ttcaggacga gtggaggtgg cagtccagga gtttgggaag 1080

tcacgagcct acacacacag aaaaatttat tcgtttcatc accagactga cacaccctaa 1140

taaactcccc caacaaatcg gaagaagttt cacagccaac gagtttttac acaatcgtaa 1200

tctttctatt catatcacgc gagtggagac tttctttcta aatattcaat acacacatac 1260

acacacacac acacacacac acacacgttt cactttcatg agtctaataa gagaaatcaa 1320

tgggttatcg ta 1332

<210> 5

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgggatccc caccaacatc agccaggatt gctgcgcctg aattggaacc cgtcgaacca 60

acatctgaca gcgagctccc aactaccaaa gtggccgttc gcagaagcag cagcacttcg 120

tcaaagtcaa ccaacggatc cgcggctgcc actgctgctg gtgctgccaa agctgctgcc 180

ccacaaaaga acccagttga agcaaagcca actcctaagc cagagccagt tcagtccaag 240

gctaacgaca acgactcaga tggctccaac ttggacaccg ctgaatcata tgtcgacgtg 300

aagaaagaaa ccgaagctct agttgagtca aagtcgcttg cttcaacagt cgatacttcg 360

gtcttgcagt acaccccgtt atctgagatc cctggcggag tcaagagggt tgtcgatggg 420

ttccacagcg gtaagaccca cccattggag tttaggttga agcaattgag aaacttgtat 480

tttgcggtga aggataacca ggaagccatc tgtgacgcct tgagcaaaga tttccaccgt 540

gtgtcatccg aaactagaaa ctatgaaata gtcactgggt tgaatgagtt gttgtacacg 600

atgtcgcaat tgcacaagtg gagcaagcca ttgccagtgg atgagttgcc attgaacttg 660

atgattaacc ctacgtatgt tgaaagaatc ccagttggta cggttttggt cattgccgct 720

ttcaactatc cattgttcgt ttctatctcc cctattgcgg gtgcgattgc tgctggtaac 780

actgtcgtgt tcaagccatc tgaattgact ccacactttt ccaagttgtt cactgacttg 840

atggctaaag cattagatcc ggatgtgttt tatgccgtga acggttccgt gcctgaaact 900

accgagttgt tgaaccagaa attcgacaag atcatttaca ccggtagcga aactgttggt 960

aagatcattg ccaagaaggc agccgagacg ttgactccag cgattttgga acttggaggc 1020

aaatcgccag ctttcgtttt ggacgacgtt gccgacaaag acttgccaat tgttgctcgc 1080

cgtattgctt gggggagata tgctaatgct ggacagacct gtattggtgt tgattatgtg 1140

ttggttgcaa agtccaagca cgacaagttc atcaaagctt tgagggacgt tatcgagaaa 1200

gagttcttcc ccaatgttga cgttaacagc aactttacgc acttgatcca tgacagggca 1260

<210> 6

<211> 1302

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaccggta agaccggtca cattgatggt ttgaactcta gaattgaaaa gatgagagat 60

ttggatcctg ctcaaagatt ggtccgtgtt gctgaagctg ctggtttgga acctgaagct 120

atttccgctt tggctggtaa cggtgctttg ccattgtcct tggctaacgg tatgattgaa 180

aacgttattg gtaagttcga attgccatta ggtgttgcta ccaacttcac cgttaacggt 240

agagattact tgattccaat ggctgttgaa gaaccatccg ttgttgctgc cgcttcctac 300

atggctagaa ttgctagaga aaacggtggt ttcaccgctc acggcaccgc tccattgatg 360

cgtgctcaaa ttcaagttgt tggtttgggt gaccctgaag gtgctagaca aagattgttg 420

gctcacaagg ctgctttcat ggaagctgct gatgctgttg atcctgtttt ggttggttta 480

ggcggtggtt gtagagatat tgaagtccac gttttcagag atacccctgt tggtgctatg 540

gttgttttgc acttgattgt tgatgttaga gatgctatgg gtgctaacac cgttaacacc 600

atggctgaaa gattggctcc tgaagttgaa agaattgctg gtggcaccgt tagattgaga 660

attttgtcca acttggctga tttgcgtttg gttagagcta gagttgaatt agctcctgaa 720

accttaacca cccaaggtta cgatggtgct gatgttgcta gaggtatggt tgaagcttgt 780

gctttggcta ttgttgatcc atacagagct gctacccaca acaagggtat tatgaacggt 840

attgatcctg ttgtcgttgc taccggtaac gattggagag ctatcgaggc tggtgctcac 900

gcttacgctg ctagaaccgg tcactacact tccttgacta gatgggaatt ggctaacgat 960

ggtagattgg ttggcaccat tgaattgcca ttggctttgg gtttggttgg tggcgctacc 1020

aagacccacc caaccgctag agctgctttg gctttgatgc aagttgaaac cgctaccgaa 1080

ttggctcaag ttaccgctgc tgttggtttg gctcaaaaca tggctgctat tagagctttg 1140

gctaccgaag gtattcaaag aggtcacatg accttgcacg ctagaaacat tgctattatg 1200

gctggtgcta ccggtgctga tattgataga gttactagag ttattgttga ggccggcgat 1260

gtttccgttg ctagagctaa gcaagttttg gaaaacacct ag 1302

Claims (6)

1.一种重组热带假丝酵母，其特征在于，所述重组热带假丝酵母为，

将细胞质表达盒1C，并将细胞质表达盒2C，同时将过氧化物酶体表达盒3P整合至热带假丝酵母基因组上不影响其生长的任一位点得到的；

或将细胞质表达盒1C，并将过氧化物酶体表达盒2P，同时将过氧化物酶体表达盒3P整合至热带假丝酵母基因组上不影响其生长的任一位点得到的；

所述细胞质表达盒1C为：采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达ERG10基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达tHMGR基因或NADH-HMGR基因，及采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达ERG13基因；

所述细胞质表达盒2C为：采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达IDI1基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达ERG19基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG8基因，及采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达ERG12基因；

所述过氧化物酶体表达盒2P为：将ePTS分别连接至ERG12、ERG8、ERG19、IDI1基因的3’端后，采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达IDI1-ePTS基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达ERG19-ePTS基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG8-ePTS基因，及采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达ERG12-ePTS基因；将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ePTS分别连接至各基因的3’端，分别得到ERG12-ePTS基因、ERG8-ePTS基因、ERG19-ePTS基因和IDI1-ePTS基因；

所述过氧化物酶体表达盒3P为：将ePTS分别连接至carB、carRP、ERG20、BTS1基因的3’端后，采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达carB-ePTS基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG20-ePTS基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达BTS1-ePTS基因，及采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达carRP-ePTS基因；将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ePTS分别连接至各基因的3’端，分别得到carB-ePTS基因、carRP-ePTS基因、ERG20-ePTS基因和BTS1-ePTS基因。

2.如权利要求1所述的重组热带假丝酵母，其特征在于，以热带假丝酵母CU-206或热带假丝酵母ATCC20336为宿主细胞。

3.一种提高热带假丝酵母合成β-胡萝卜素的产量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）在热带假丝酵母的细胞质中过表达从乙酰辅酶A到甲羟戊酸合成的相关基因，具体为，在热带假丝酵母基因组上不影响其生长的任一位点中，采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达ERG10基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达tHMGR基因或NADH-HMGR基因，及采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达ERG13基因，得到工程菌1；

（2）在工程菌1的细胞质中过表达从甲羟戊酸到IPP和DMAPP合成的相关基因，具体为，在工程菌1基因组上不影响其生长的任一位点中，采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达IDI1基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达ERG19基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG8基因，及采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达ERG12基因，得到工程菌2-1；

（3）在工程菌1的过氧化物酶体中过表达从甲羟戊酸到IPP和DMAPP合成的相关基因，具体为，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ePTS分别连接至ERG12、ERG8、ERG19、IDI1基因的3’端后，在工程菌1基因组上不影响其生长的任一位点中，采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达IDI1-ePTS基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达ERG19-ePTS基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG8-ePTS基因，及采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达ERG12-ePTS基因，得到工程菌2-2；

（4）在工程菌2-1或2-2的过氧化物酶体中过表达从IPP和DMAPP到β-胡萝卜素合成的相关基因；具体为，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ePTS分别连接至carB、carRP、ERG20、BTS1基因的3’端后，在工程菌2-1或者2-2基因组上不影响其生长的任一位点中，采用P_FBA1启动子和T_PGK1终止子过表达carB-ePTS基因，采用P_GAP1启动子和T_7syn终止子过表达ERG20- ePTS基因，采用P_FBA1启动子和T_ADH2终止子过表达BTS1-ePTS基因，及采用P_GAP1启动子和T_ENO1终止子过表达carRP-ePTS基因。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，以热带假丝酵母CU-206或热带假丝酵母ATCC20336为宿主细胞。

5.一种合成β-胡萝卜素的方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的重组热带假丝酵母发酵制备得到的。

6.权利要求1或2所述的重组热带假丝酵母，或权利要求3或4所述的方法在制备β-胡萝卜素或含有β-胡萝卜素的产品中的应用。