CN104937098B - 改进过表达碱性磷酸酶的酿酒酵母重组菌株中乙醇产率并减少生物质积累 - Google Patents

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Abstract

在此描述了一种方法，该方法在酒精发酵过程中通过表达编码液泡或细胞溶质形式的碱性磷酸酶的截短形式的酿酒酵母PHO8基因增加乙醇产率，其表达降低了生物质积累同时将较大的碳转移给乙醇生产。还描述了用于表达该PHO8基因的核酸序列和载体以及运载它们的菌株。包含编码液泡形式的碱性磷酸酶的完整PHO8基因的菌株已经轻微地降低细胞内的ATP水平，其中生物质积累改变不显著并且乙醇生产增加高达13％。

Description

改进过表达碱性磷酸酶的酿酒酵母重组菌株中乙醇产率并减 少生物质积累
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年12月20日提交的美国临时专利申请号61/739,904的优先权。
技术领域
本发明涉及通过发酵生产乙醇的领域，并且更具体地说涉及在酿酒酵母中表达碱性磷酸酶e基因以改进乙醇的生产同时减少生物质积累。
发明背景
酒精发酵表示了在工业生物技术的领域中的酿酒酵母的最大应用，其中在2011年超过800亿升的燃料、工业和饮料乙醇的生产。在过去的十年并且由于经济和环境原因，世界范围内的燃料乙醇的生产已经经历了指数式增长(Schubert，2006)。虽然木质纤维素被认为是用于生产燃料乙醇最有希望的原料之一，但是目前燃料乙醇的工业生产严重依赖于传统原料(如，蔗糖(主要衍生自甘蔗或甜糖用甜菜)和从含淀粉材料获得的葡萄糖(玉米、小麦、大麦、马铃薯等))的发酵。目前用于生物乙醇生产的最常见的生物是面包酵母、酿酒酵母。这种酵母菌通过糖酵解恩布顿-迈耶霍夫途径(EMP)途径分解代谢葡萄糖产生2摩尔ATP/摩尔消耗的葡萄糖。这种途径在酵母菌中的效率是低的，其中最大的生物质产率约7％并且乙醇产率在理论值的90％与93％的范围内(Ingledew，1999)。然而，转化为细胞物质的7％的糖的工业规模代表巨大量的副产品，虽然这些副产品作为动物饲料是有价值的但是显著地降低目标产品乙醇的总产率。即使通过酿酒酵母在乙醇产率上的轻微的改进，每年乙醇生产的全球产量可以增加几百万l升乙醇。
与酿酒酵母相对比，细菌运动发酵单胞菌通过恩特纳-道德洛夫(ED)途径发酵葡萄糖。这个途径给出了仅仅1摩尔ATP/摩尔葡萄糖，并且将仅仅3％的葡萄糖引导至细胞生物质中实现了高达97％的可能的理论值的乙醇产率(Sprenger，1996)。这表明了在酒精发酵过程中降低ATP产率水平增加了乙醇产率，其中底物向细胞物质的转化降低。此外，运动发酵单胞菌(Z.mobilis)具有超过酿酒酵母的另一个重要的优点：将葡萄糖更快的发酵成乙醇(Sprenger，1996，Panesar等人，2006)，运动发酵单胞菌的较高的繁殖力(productivity)通常归因于较快的糖摄取速率以及随后的分解代谢而不是低ATP产率。以用于生产工业乙醇的运动发酵单胞菌取代酿酒酵母的尝试被认为增加了3％-4％的乙醇产率，由此全世界每年增加了几亿升。然而，运动发酵单胞菌具有几个妨碍其工业用途的严重的缺点，并且这些缺点由以下各项组成：(i)非常狭窄的底物范围(蔗糖几乎不发酵，具有低的产率)，(ii)赖氨酸、蛋氨酸和一些维生素的天然营养缺陷体，(iii)非GRAS的状态，其阻止了作为饲料添加剂的生物质的使用，(iv)用于生长的较高的pH的需要(Jeffries，2005；Bai等人，2008；阿巴斯，未公开出版的发现)。此外，用于酒精发酵的酵母菌细胞的技术很好地发展，然而用于乙醇生产的细菌细胞的使用是很不常见的。因此，一种增加乙醇产率并且减少细胞物质生产的更好的方法是构建在酒精发酵过程中产生更少的ATP(例如，一摩尔ATP，如运动发酵单胞菌在ED途径中产生的)的酵母菌菌株。这些新的酵母菌菌株将酵母菌的所有的可能的优点与运动发酵单胞菌的高的乙醇产率结合。存在几种可以用于实现这个目标的方法，例如：由来自拥有该途径的基因的运动发酵单胞菌或其他细菌的ED途径取代酵母菌中的EMP途径；增加在无效循环的产生中所涉及的酶的活性；构建具有提高的ATP酶活性的重组菌株；并且引入编码质膜同向转运体的异源基因。
尝试的第一种方法是在酿酒酵母的果糖磷酸激酶缺陷型突变体中表达ED脱水酶和ED醛缩酶基因edd和eda(Lancashire等人，1998)。所获得的酵母菌转化体成长并且将葡萄糖发酵为乙醇，尽管没有测量ED脱水酶和ED醛缩酶的活性。在这项获得专利的工作中描述的工作没有进一步发展，因为在科学文献中没有另外的报道。通常原核生物的酶在酿酒酵母宿主中展示了低的活性或没有活性(Hahn-Hagerdal等人，2007)。这是可能的，在某种程度上归因于在酵母菌中的所表达的细菌蛋白产物的不当地折叠或不稳定性。此外，在酵母菌工程化的ED途径中的NADP再生上存在困难，因为在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应中产生的NADPH不能够通过醇脱氢酶反应再氧化。已经报道了在酿酒酵母中主要的醇脱氢酶利用NADH但是不利用NADPH的并且酵母菌不具有NADH/NADPH转氢酶(Lescovac等人，2002；Jeffries和Jin，2004)。为了在酵母菌酒精发酵过程中通过EMP途径维持低水平的ATP，没有必要将它替代成一个具有较低效率的途径。实现以上目标的一种更好的方法是保持EMP途径不变并且通过一种依赖于一些细胞溶质ATP酶的活化的更具体的方法或通过诱导或构建某种无效循环以消散ATP的细胞池来降低ATP水平。
在我们以前的工作中，我们通过过表达编码细胞溶质ATP酶结构域的酿酒酵母SSB1基因的5'部分并且通过过表达编码来自大肠杆菌的腺苷三磷酸双磷酸酶的异源基因apy进行了一个成功的尝试来减少细胞内ATP水平(Sibirny等人，2010)。一些所构建的菌株示出了在厌氧、需氧或半厌氧培养过程中在细胞ATP水平上的减少并且其特征在于在在厌氧、需氧或半厌氧条件下在葡萄糖利用过程中细胞生物质产率随着乙醇产率的相应增加减少。我们提出这种方法可能对于构建新一代酿酒酵母的工业菌株是有用的，该方法特征在于来自常规(葡萄糖、蔗糖)和非常规(木质纤维素)原料的改进的乙醇产率。
在本申请中，我们描述了通过过表达编码碱性磷酸酶的完整或截短形式的酿酒酵母PHO8基因来降低细胞ATP的另一种方法。
发明概述
在一个通用实施例中，本发明提供了一种酿酒酵母菌株，该菌株包括一个编码一种碱性磷酸酶的核酸序列，该核酸序列可操作地连接至一个启动子、在该细胞中表达该碱性磷酸酶。在某些更具体的实施例中，由该核酸序列表达的碱性磷酸酶的菌株包含一个液泡靶向序列并且该碱性磷酸酶存在于该细胞的液泡中。在其他独特实施例中，该碱性磷酸酶缺少一个液泡靶向序列并且碱性磷酸酶存在于该细胞的细胞质中。
在最有用的实施例中，该菌株相对于缺少该编码碱性磷酸酶的核酸序列的亲本细胞在细胞中过表达碱性磷酸酶。在某些过表达的实施例中，该细胞包含编码一种碱性磷酸酶的核酸序列的多个拷贝，该核酸序列可操作地连接至一个启动子、在该细胞中表达该碱性磷酸酶。在一些具体的实施例中，编码一种碱性磷酸酶、可操作地连接至一个启动子、在该细胞中表达该碱性磷酸酶的核酸序列被整合到该细胞的基因组中。
在特别有用的实施例中，用于过表达该碱性磷酸酶活性的启动子是一个来自酿酒酵母的乙醇诱导型启动子。在示例性实施例中，该诱导型启动子是一个醇脱氢酶启动子。
最有用的实施例的菌株的特征为在厌氧发酵期间的过程中比一种缺少编码该碱性磷酸酶、可操作地连接至一个启动子、表达该碱性磷酸酶的核酸序列的亲本菌株产生更高效价的乙醇。再者，最有用的菌株进一步地其特征为在厌氧发酵期间的过程中比一种缺少编码该碱性磷酸酶、可操作地连接至一个启动子、表达该碱性磷酸酶的核酸序列的亲本菌株具有减少的生物质积累速率。
在一个相关的方面中，提供了一种生产乙醇的方法，该方法包括在厌氧生长条件下生长上述菌株的至少一种持续足够产生乙醇的一段时间。
附图简要说明
图1质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-CYCt-kanMX(A)、pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8-CYCt-kanMX(B)的线性方案。δ1、δ2–δ元件–酵母菌逆转录转座子Ty1的长末端重复序列；ADH1 pr-编码醇脱氢酶的基因的启动子；CYC1 term-细胞色素C基因的终止子；kanMX4-对抗生素遗传霉素提供抗性的基因；PHO8–编码碱性磷酸酶的完整的ORF。
图2质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8_trunc-CYCt-kanMX(A)、pUC57-δ1_2-ADHpr-MATαsign.-PHO8_trunc-CYCt-kanMX(B)、pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO5sign.-PHO8_trunc-CYCt-kanMX(C)的线性方案。PHO8_trunc-编码截短形式的碱性磷酸酶的基因，该基因缺少负责跨膜蛋白递送的60个初始氨基酸以及由通常从在细胞液泡中的蛋白质裂解的C末端前肽组成的22个末端氨基酸；MATαsign.-PHO8_trunc-编码截短形式的碱性磷酸酶的基因，该基因具有代替它的自然递送信号的来自交配信息素a因子(MF1α)的细胞外输出信号；PHO5sign.-PHO8_trunc–编码截短形式的碱性磷酸酶的基因，该基因具有来自酸性磷酸酶(PHO5)的细胞外输出信号。
图3携带质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8-CYCt-kanMX.BY4742–受体菌株的菌株的无细胞提取物的特异性碱性磷酸酶活性(以纳摩尔的产物/mg的蛋白*分钟计)。
图4由斑点杂交估计整合的表达盒的拷贝数。顶行示出了野生型菌株、BY4742、PHO8的1个拷贝，剩余的行示出了包含载体pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8-CYCt-kanMX的重组菌株。该基因组中的PHO8基因的从2至8-10个拷贝。
图5表达盒整合模式的分析。A)DNA杂交使用PHO8基因作为探针。HindIII被用于基因组DNA限制B)载体整合的“头接尾(head-to-tale)”构象。
图6携带质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8-CYCt-kanMX.BY4742–受体菌株的菌株的生长动力学。
图7携带载体pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8-CYCt-kanMX.AS400–受体菌株的重组菌株的特异性碱性磷酸酶活性(以纳摩尔的产物/mg的蛋白*分钟计)。
图8携带载体pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8-CYCt-kanMX.AS400–受体菌株的菌株的在细胞中的ATP水平(以微摩尔的ATP/mg的干细胞重量计)。
图9以纳摩尔的产物/mg的蛋白*分钟计的特异性碱性磷酸酶活性。BY4742–WT，受体菌株。BY+PHO8 2；5–包含载体pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8-CYCt-kanMX的菌株。BY+PHO8trunc1；5；9–包含载体pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8_trunc-CYCt-kanMX的菌株。具有MATa 1；2；3的BY+PHO8 trunc–包含载体pUC57-δ1_2-ADHpr-MATαsign.-PHO8_trunc-CYCt-kanMX的菌株。具有PHO5 1；2；3的BY+PHO8 trunc–包含载体pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO5sign.-PHO8_trunc-CYCt-kanMX的菌株。A-培养1天；B-培养2天。
图10野生型菌株BY4742及其衍生物的生长动力学，这些衍生物包含用于完整的(BY+PHO82；5)或改性的(BY+PHO8 trunc1；5；9；具有MATa 1；2；3的BY+PHO8 trunc；具有PHO5 1；2；3的BY+PHO8 trunc)形式的PHO8基因的表达盒。
图11在酒精发酵过程中通过野生型菌株BY4742及其衍生物的乙醇产率(以g乙醇/g生物质计)，这些衍生物包含用于完整的(BY+PHO8 2；5)或改性的(BY+PHO8 trunc1；5；9；具有MATa 1；2；3的BY+PHO8 trunc；具有PHO5 1；2；3的BY+PHO8 trunc)形式的PHO8基因的表达盒。
发明详细说明
菌株、质粒以及生长条件
该酿酒酵母菌株BY4742(MATα，his3Δ1，leu2Δ0，lys2Δ0，ura3Δ0；(Giaever等人，2002))和一种指定为AS400的工业菌株被用于表达编码该碱性磷酸酶的完整或截短形式的PHO8 ORF。大肠杆菌DH5α(Φ80dlacZΔM15，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17(rK -，mK +)，supE44，relA1，deoR，Δ(lacZYA-argF)U169)被用于通用目的和常规亚克隆。
为了分离质粒DNA，如描述的将大肠杆菌菌株在LB培养基中在37℃下生长18小时(Sambrook和Rusell 2001)。在30℃下孵育酿酒酵母菌株。对于常规应用，将酵母菌菌株保持在一种丰富的YPD培养基(1％酵母提取物、1％蛋白胨和2％葡萄糖)中或一种YNB(0.67％，不含氨基酸的酵母氮源、DIFCO、0.5％硫酸铵、2％葡萄糖)培养基的基本培养基中。对于乙醇发酵，使用补充有10％的葡萄糖的YNB培养基或补充有水解的玉米麦芽糖糊精的玉米浆(Corn Steep Liqour)(CSL)培养基。当需要抗生素选择时，将菌株与氨苄西林(100μg ml-1)或遗传霉素(200mgL-1)一起孵育。当需要时，添加组氨酸(20mg L-1)、亮氨酸(60mg L-1)、赖氨酸(20mg L-1)、或尿嘧啶(20mg L-1)。根据制造商的说明书使用显色底物半乳糖苷(X-gal)和IPTG(立陶宛维尔纽斯的Fermentas公司(Fermentas,Vilnius,Lithuania))。
DNA操作。
使用
Figure BDA0000763817620000071
Genomic DNA纯化试剂盒(美国威斯康辛州麦迪逊普洛麦格公司(Promega,Madison,WI,USA))从酿酒酵母菌株分离基因组DNA。使用
Figure BDA0000763817620000072
Plus SVMinipreps DNA纯化系统(普洛麦格公司)分离来自大肠杆菌的质粒DNA。根据供应商(Fermentas)的建议使用Taq和高保真度的聚合酶混合物、T4DNA连接酶、T4DNA聚合酶和限制性内切酶。通过标准实验方案(Sambrook和Russell 2001)进行酿酒酵母转化。
质粒的构建。
表达盒制备。使用引物SM16(CCG GAA TTC GAG GGG CAG TCT GTT GGA ATA GAAATC AAC TAT C)和SM17(CAT CAT TTT ATA TGT TTA TAT TCA TCT AGA CCC GGG GTC GACTTG ATC CTA TTA CAT TAT CAA TCC)对来自酿酒酵母菌株BY4742的基因组DNA的酿酒酵母YJRWδ12序列的154bp部分进行扩增，并且使用引物SM18(GGA TTG ATA ATG TAA TAG GATCAA GTC GAC CCC GGG TCT AGA TGA ATA TAA ACA TAT AAA ATG ATG)和SM19(CCC AAG CTT GAC GGG CAG TCT GAG AAA TAT GTG AAT GTT GAG)对来自相同模板的这个序列的其他180bp部分进行扩增。然后，使用引物SM16和SM19经由重叠PCR融合这两个包含δ序列的部分，将其用EcoRI和HindIII消化并且克隆进EcoRI/HindIII-线性化质粒pUC57中。所产生的质粒被称为pUC57-δ1_2。使用引物Ко419(CGC GTC GAC TTA ATT AAA GTC CAA TGC TAG)和Ко420(GAT ATC GAC AAA GGA AAA GGG GCG GCC GCG GAT CCC TCG AGT GTA TAT GAGATA GTT GAT TG)对来自酿酒酵母菌株BY4742的基因组DNA的对应于ADH1基因(编码醇脱氢酶)启动子的807bp DNA片段进行扩增。使用引物Ко453(CAA TCA ACT ATC TCA TAT ACACTC GAG GGA TCC GCG GCC GCC CCT TTT CCT TTG TCG ATA TC)和Ко454(CCC CCC GGGGCA AAT TAA AGC CTT CGA GC)对来自BY4742菌株的基因组DNA的对应于CYC1基因(编码细胞色素C)终止子的269bp DNA片段进行扩增。然后使用引物Ко419和Ко454经由重叠PCR融合启动子和终止子。将所获得的DNA片段用SalI和XmaI核酸内切酶消化并且将其克隆进对应的质粒pUC57-δ1_2的位点中，给出质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-CYCt。用限制性内切核酸酶SacI和SmaI从质粒pRS303K中切出对应于提供对遗传霉素抗性的选择标记kanMX的1470bpDNA片段，将其平端化并且克隆进XbaI消化的并且平端化的DNA质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-CYCt中，产生质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-CYCt-kanMX(图1A)。
用于PHO8表达的质粒。使用引物Ko508(CGC GGA TCC ATG ATG ACT CAC ACA TTACCA AGC)和Ko509(TTT GCG GCC GCT CAG TTG GTC AAC TCA TGG TAG TAT TC)对来自酿酒酵母菌株BY4742的基因组DNA的携带编码非特异性碱性磷酸酶的PHO8基因的ORF的1701bpDNA片段进行扩增。将这个片段用BamHI和NotI消化并且将其亚克隆至BamHI/NotI消化的质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-CYCt-kanMX中。所产生的质粒被指定为pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8-CYCt-kanMX(图1B)。
用于截短形式的PHO8基因表达的质粒。决定产生几种截短形式的碱性磷酸酶。第一种形式缺少负责跨膜蛋白递送的60个初始氨基酸以及构成通常从液泡中的蛋白质裂解的C末端前肽的22个末端氨基酸。使用引物SM28(CGC GGA TCC ATG TCT GCA TCA CAC AAGAAG AAG AAT GTC)和SM29(TTT GCG GCC GCT CAA TCT GAT GTG TGT TTG GTG TCC CTAATC)对来自BY4742菌株的基因组DNA的对应于这个截短形式的1452bp DNA片段进行扩增，用核酸内切酶BamHI和NotI将其消化并且将其克隆进BamHI/NotI消化的质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8-CYCt-kanMX中。所获得的质粒被指定为pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8_trunc-CYCt-kanMX(图2A)。构建第二种形式的碱性磷酸酶，该碱性磷酸酶具有代替它的自然递送信号的来自交配信息素a因子(MF1α)的细胞外输出信号。为了构建这样一种形式，使用引物SM31(CGC GGA TCC ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA G)和SM32(GAC ATT CTT CTT CTTGTG TGA TGC AGA CTC TCT TTT ATC CAA AGA TAC CCC)对来自BY4742菌株的基因组DNA的对应于MF1α输出信号的258bp DNA片段进行扩增，并且使用引物SM33(GGG GTA TCT TTGGAT AAA AGA GAG TCT GCA TCA CAC AAG AAG AAG AAT GTC)和SM29对来自相同模板的对应于PHO8截短形式的1452bpDNA片段进行扩增。然后，使用引物SM31/SM29经由重叠PCR融合这两个片段，用核酸内切酶BamHI和NotI对其消化并且将其克隆进BamHI/NotI消化的质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8-CYCt-kanMX中。所构建的质粒被指定为pUC57-δ1_2-ADHpr-MATαsign.-PHO8_trunc-CYCt-kanMX(图2B)。该第三种形式的碱性磷酸酶具有来自酸性磷酸酶(PHO5)的细胞外输出信号。为了构建这样一种形式，用PHO5递送信号融合对应于PHO8截短形式的1503bp DNA片段，并且使用引物SM30(CGC GGATCC ATG TTT AAA TCT GTT GTT TATTCA ATT TTA GCC GCT TCT TTG GCC AAT GCA TCT GCA TCA CAC AAG AAG AAG AAT GTC)和SM29(TTT GCG GCC GCT CAA TCT GAT GTG TGT TTG GTG TCC CTA ATC)对来自BY4742菌株的基因组DNA的对应于PHO8截短形式的1503bp DNA片段进行扩增，用核酸内切酶BamHI和NotI对其消化并且将其克隆进BamHI/NotI消化的质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8-CYCt-kanMX中。所构建的质粒被指定为pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO5sign.-PHO8_trunc-CYCt-kanMX(图2C)。
酿酒酵母转化体的选择。
将包含完整或截短形式的PHO8基因的载体用AhdI限制性内切核酸酶消化。在这之后，将包含表达盒和选择标记(侧接两个δ序列部分)的DNA片段从琼脂糖凝胶中洗脱并且用于转化酿酒酵母菌株BY4742和AS400。在一种补充有200mg/L遗传霉素的固体YPD培养基上选择转化体。通过在非选择性和选择性的培养基中交替培养稳定化所选择的转化体并且使用一种对于ADH1启动子具有特异性的正向引物(Ko419)以及一种对于PHO8基因具有特异性的反向引物(Ko509)通过诊断PCR检查所选择的转化体。
在酵母菌细胞中的碱性磷酸酶和ATP的测定。
通过使用磷酸对硝基苯酯作为底物并且使用细胞提取物作为酶源，如在别处描述的(Kaneko等人，1982)测定碱性磷酸酶活性。一单位的碱性磷酸酶活性被定义为在测定的条件下每分钟释放1μmol的对硝基酚的酶量。
使用用沸腾的乙醇提取代谢物并且随后蒸发的方法进行从酿酒酵母细胞中提取ATP(Entian等人1983)。为了优化经乙醇提取的ATP测定，测试从2至15mg广泛范围的酵母菌生物质。在使用1ml沸腾的乙醇用8-10mg酿酒酵母细胞进行ATP提取的过程中获得了可复制的结果。使用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的混合物确定了提取的ATP水平的测量值(Ano Y.等人2005)。
乙醇生产和生长分析。
将菌株在YPD培养基中生长过夜接着是用无菌水洗涤细胞并且等量的每一次培养被用于接种试验培养基。对于酿酒酵母BY4742菌株和它的PHO8表达的衍生物，使用补充有10％葡萄糖的YNB。在半厌氧条件下在30℃下使用一个旋转振荡器Inkubator1000Heidolph(德国施瓦巴赫)(120转/分钟)生长菌株并且每24小时进行取样。对于酿酒酵母AS400菌株和它的PHO8表达的衍生物，使用补充有水解的麦芽糖糊精的玉米浆(CSL)培养基。在半厌氧条件下在34℃下孵育这些菌株2天并且每24小时进行取样。通过在别处描述的方案(Gonchar等人，2001，Gonchar，1998)测量乙醇和葡萄糖浓度。
CSL培养基制备。
为了制备溶液1，将200-280g麦芽糖糊精与800ml水混合并且将pH调节到6.0。添加α淀粉酶(在0.1单元的液化酶(Liquizyme)SCDS/克麦芽糖糊精的速率下)用于与该混合物液化，将其加热至80℃并且将样品保持30分钟。
为了制备溶液2，将63ml的CSL浓缩物(包含约50％的干固体)与137ml去离子水混合。接着将溶液1和2高压灭菌、冷却、合并并且混合。将葡糖淀粉酶的一个等分部分(在0.2单元葡糖淀粉酶/克麦芽糖糊精的速率下)添加至无菌烧瓶中并且在28℃下孵育这些烧瓶。在酵母菌接种之前确定葡萄糖浓度。
结果
完整形式的碱性磷酸酶的克隆和过表达。由基因PHO8编码的酿酒酵母非特异性碱性磷酸酶在不同的包括ATP的化合物中催化二磷酸键的水解(Kaneko等人，1982)。因此这种酶可作为其他ATP酶起作用。为了在细胞中进行二磷酸键的水解，这种酶的活性需要是相当高的。这种克隆的酶在酿酒酵母细胞中的活性取决于很多因素，在它们之中，所选择的启动子的强度、所产生的mRNA的稳定性、缺少翻译后的酶抑制、以及整合至宿主基因组的该基因的拷贝数。我们已经证明了编码醇脱氢酶的基因的ADH1启动子在酒精发酵的条件下提供了靶基因的诱导型表达(Sibirny等人，2011)。我们决定使用这种启动子用于PHO8基因表达。为了得到整合至该酵母菌基因组中的PHO8基因的更高拷贝数，构建一种包含δ序列的整合质粒。该酿酒酵母δ序列是逆转录转座子Ty1和Ty2的长末端重复序列。总数为约425的δ序列典型地分散遍及酵母菌基因组。示出了使用基于δ序列的载体通过同源重组可以提供整合至酵母菌基因组DNA的一个或几个位点中的串联多拷贝(Lee和Da Silva，1997)。如在材料与方法中描述的构建在ADH启动子的控制下的携带PHO8基因的基于δ序列的质粒并且随后将其转化为酿酒酵母实验室菌株BY4742。
测定所选择的重组菌株的特异性碱性磷酸酶的活性。在11个所测试的转化体之中，六个菌株的特征为相当高的特异性磷酸酶活性(图3，菌株1-5和11)。在这些菌株中，当与初始的宿主菌株BY4742相比时，碱性磷酸酶的特异性活性是高30-40倍。因此，这种构建的表达载体可被用于有效多拷贝整合至酵母属宿主的基因组中。
将从这些重组菌株分离的基因组DNA制品经受斑点杂交以估计携带整合至该基因组中的靶基因的质粒拷贝数。使用基因PHO8作为探针(图4)。揭示了包含从1至7-9个另外的PHO8基因拷贝的重组菌株。观察到在PHO8基因的拷贝数目与特异性碱性磷酸酶的活性之间的良好的相关性。
进行DNA杂交以分析所测试菌株的载体整合模式(图5，A)。来自WT和重组菌株的总基因组DNA被HindIII消化并且用一个标记的PHO8基因杂交。示出了所构建的基于δ序列的载体提供了在所谓的“头接尾”构象中整合至酵母菌基因组DNA的高达三个位点中的串联多拷贝(图5，B)，这与公布的结果(Lee和Da Silva，1997)一致。
出人意料地，几种所选择的重组菌株揭示了受损的生物质积累，这与增加的碱性磷酸酶活性水平不相关(图6)。
质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8-CYCt-kanMX被用于转化工业菌株AS400。与亲本菌株AS400相比，所选择的转化体具有至多5.5倍的碱性磷酸酶特异性活性的增加(图7)。将具有最高碱性磷酸酶特异性活性的重组菌株在一种补充有水解的玉米粗粉的CSL培养基上经受针对酒精发酵效率的测试。与亲本菌株(79.1g/L)相比，菌株AS400+PHO8-6、AS400+PHO8-8、AS400+PHO8-3B、AS400+PHO8-12产生了增加的乙醇量(84.4、86.5、84.4、90.1g/L)(表1)。一些所分析的重组菌株比野生型菌株AS400具有轻微降低的细胞内ATP水平(图8)。
表1
具有脱阻抑的PHO8(碱性磷酸酶)的酿酒酵母重组菌株和初始菌株AS400在补充有水解的玉米面的CSL培养基上在酒精发酵的第一天的乙醇合成。
Figure BDA0000763817620000131
截短形式的碱性磷酸酶的克隆和过表达。如在此描述的，一些携带质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8-CYCt-kanMX的重组菌株具有高达30倍的碱性磷酸酶活性增加，但是它们的生长水平实质上与WT菌株的生长水平没有不同。这个结果可以通过能够阻碍ATP水解的碱性磷酸酶的液泡定位解释。为了测试，我们决定构建包含编码截短形式的碱性磷酸酶的基因的菌株，该碱性磷酸酶将保持在细胞质中而不是被递送至液泡中。然而，存在阻止阻塞活性细胞溶质形式的碱性磷酸酶的产生的几个缺点。首先，示出了碱性磷酸酶作为一种包含C末端前肽的无活性前体被合成，该C末端前肽然后以一种PEP4依赖的方式从在液泡中的蛋白质裂解(Klionsky D.和Emr S.D.1989)。在液泡的递送(其与分泌途径具有相同的早期阶段)过程中，前体形式的这种酶在内质网中被糖基化。还已经示出了活性形式的碱性磷酸酶在液泡中而不是在分泌途径的较早的区室中接受它的金属辅因子锌(Qiao W.等人1985)。为了估计这些因素如何影响这种酶的活性，我们决定生产几种截短形式的碱性磷酸酶。该第一种形式缺少负责跨膜蛋白递送的60个初始氨基酸以及合成通常从液泡中的蛋白质裂解的C末端前肽的22个末端氨基酸。该第二种形式具有一个代替它的自然递送信号的来自交配信息素a因子(MF1α)的细胞外输出信号，并且，最终，所构建的第三种形式具有一个来自酸性磷酸酶(基因PHO5)的细胞外输出信号。
包含三种提及的PHO8改性形式(部分具有选择标记(侧接δ序列))的表达盒的DNA片段被用于转化酿酒酵母菌株BY4742。在通过PCR转化之后确认了这些表达盒的存在。
测定所获得的重组菌株的特异性碱性磷酸酶的活性并且与具有完整形式的PHO8的转化体的活性进行比较。在包含质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO8_trunc-CYCt-kanMX的菌株中的细胞内碱性磷酸酶活性与在具有完整形式PHO8的菌株中的处于相同的水平。在包含质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-MATαsign.-PHO8_trunc-CYCt-kanMX的菌株中的细胞内碱性磷酸酶活性是非常低的，几乎与在WT菌株中的处于相同的水平。最可能，这种形式的碱性磷酸酶从细胞中分泌。包含质粒pUC57-δ1_2-ADHpr-PHO5sign.-PHO8_trunc-CYCt-kanMX的菌株的细胞内碱性磷酸酶活性在培养的第一天是高的。这个活性在培养的第二天降低并且这可以通过分泌形式的碱性磷酸酶输出的延迟进行解释。(图9A，B)。
测试所构建的重组体的生长动力学。具有不同截短PHO8形式的几乎所有菌株在培养的第一天生长已经受损并且到培养的第二天生长受损降低至较小的程度(图10)。这些重组菌株尤其是具有截短形式的碱性磷酸酶的那些，它们保持在细胞的细胞质中，还显著地生产更少的乙醇(图11)。这表明了细胞溶质形式的碱性磷酸酶还有力地影响其他细胞磷酸化的化合物的水平，这些化合物影响所有代谢途径，尤其负责酒精发酵的反应。
总之并且在这项工作的基础上，完整的液泡形式的碱性磷酸酶适合于在酿酒酵母细胞中获得更高的乙醇。
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Claims (7)

1.一种酿酒酵母菌株，该菌株包括一个编码碱性磷酸酶的基因PHO8的核酸序列，该核酸序列可操作地连接至一个启动子、提供该碱性磷酸酶在细胞中的过表达，使得所述细胞具有较低的细胞内ATP水平存在，较低的生物质积累并以比未修饰的酿酒酵母菌株高的水平表达更高的乙醇产量，其中由该核酸序列表达的该碱性磷酸酶包含一个液泡靶向序列并且该碱性磷酸酶存在于该细胞的液泡中，并且其中该启动子是一种来自酿酒酵母的乙醇诱导型启动子。
2.如权利要求1所述的菌株，其中该细胞包含编码一种碱性磷酸酶的核酸序列的多拷贝，该核酸序列可操作地连接至一个启动子、在该细胞中表达该碱性磷酸酶。
3.如权利要求1所述的菌株，其中编码一种碱性磷酸酶、可操作地连接至一个启动子、在该细胞中表达该碱性磷酸酶的核酸序列被整合到该细胞的基因组中。
4.如权利要求1所述的菌株，其中该诱导型启动子是一种醇脱氢酶启动子。
5.如权利要求1所述的菌株，进一步地其特征为在厌氧发酵期间的过程中比一种缺少编码该碱性磷酸酶、可操作地连接至一个启动子、表达该碱性磷酸酶的核酸序列的亲本菌株产生更高效价的乙醇。
6.如权利要求1所述的菌株，进一步地其特征为在厌氧发酵期间的过程中比一种缺少编码该碱性磷酸酶、可操作地连接至一个启动子、表达该碱性磷酸酶的核酸序列的亲本菌株具有减少的生物质积累速率。
7.一种生产乙醇的方法，该方法包括在厌氧生长条件下生长根据权利要求1所述的酿酒酵母菌株持续足够产生乙醇的一段时间。
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