CA2553435A1 - Procede de surproduction d'une proteine recombinante determinee par des souches monocaryotiques de p. cinnabarinus - Google Patents
Procede de surproduction d'une proteine recombinante determinee par des souches monocaryotiques de p. cinnabarinus Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne l'utilisation de souches monocaryotiques de champignons filamenteux de l'espèce Pycnoporus du groupe basidiomycète, pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation d'une protéine recombinante déterminée, ledit procédé étant effectué par surexpression du gène codant po ur cette protéine dans la souche monocaryotique susmentionnée de Pycnoporus</SD OAB>
Description
DEMANDES OU BREVETS VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE I)E CETTE DEMANDE OU CE BREVETS
COMPRI~:ND PLUS D'UN TOME.
CECI EST ~.E TOME 1 DE 2 NOTE: Pour les tomes additionels, veillez contacter le Bureau Canadien des Brevets.
JUMBO APPLICATIONS / PATENTS
THIS SECTION OF THE APPLICATION / PATENT CONTAINS MORE
THAN ONE VOLUME.
NOTE: For additional vohxmes please contact the Canadian Patent Oi~ice.
PROCEDE DE SURPRODUCTION D'UNE PROTEINE RECOMBINANTE
DETERMINEE PAR DES SOUCHES MONOCARYOTIQUES DE P.
CINNABARINUS
La présente invention concerne l'utilisation de souches monocaryotiques de champignons filamenteux de (espèce Pycnoporus du groupe basidiomycète, pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation d'une protéine recombinante déterminée, ledit procédé étant effectué par surexpression du gène codant pour cette protéine dans la souche monocaryotique susmentionnée de Pycnoporus. , A (heure actuelle, deux modèles fongiques sont utilisés préférentiellement par les grands groupes industriels dans le cadre dë la production d'enzymes intervenant dans les biotransformations végétales, telles que les métalloenzymes. Il s'agit d'Aspef gillus, et de Tf~ichodef~ma, qui appartiennent au groupe des deutéromycètes. Toutefois, les rendements de production à l'aide de ces modèles, notamment en production de laccases, n'excèdent pas les 150 mg/l.
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs du fait que la transformation de souches monocaryotiques de P. cinnabarinus déficientes pour l'activité laccase à l'aide de vecteurs contenant le gène codant pour cette laccase et dont l' expression est sous le contrôle d'un promoteur identique au promoteur pLac endogène de la laccase de P. cinrzabarinus, conduit à une production équivalente de laccase que lors de la mise en oruvre d'un procédé de surproduction de laccase par induction du promoteur endogène de cette laccase par action de l'éthanol sur des souches rnonocaryotiques de P. cinnabarinus non déficientes pour (activité laccase, et qui égale le gll.
Des résultats similaires ont été obtenus par les Inventeurs en utilisant le promoteur ~gpd, et le promoteur sc3 de Sclaizophyllum commune, en lieu et place du promoteur pLac susmentionné.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une protéine recombinante déterminée, ledit procédé étant effectué par surexpression du gène codant pour cette protéine déterminée dans une souche monocaryotique de champignons filamenteux de (espèce Pycnopof~us du groupe basidiomycète, et comprend - une étape de mise en culture de la souche monocaryotique de Pycnopof~us susmentionnée, ladite souche étant iransformée à (aide d'un vecteur d'expression
LA PRÉSENTE PARTIE I)E CETTE DEMANDE OU CE BREVETS
COMPRI~:ND PLUS D'UN TOME.
CECI EST ~.E TOME 1 DE 2 NOTE: Pour les tomes additionels, veillez contacter le Bureau Canadien des Brevets.
JUMBO APPLICATIONS / PATENTS
THIS SECTION OF THE APPLICATION / PATENT CONTAINS MORE
THAN ONE VOLUME.
NOTE: For additional vohxmes please contact the Canadian Patent Oi~ice.
PROCEDE DE SURPRODUCTION D'UNE PROTEINE RECOMBINANTE
DETERMINEE PAR DES SOUCHES MONOCARYOTIQUES DE P.
CINNABARINUS
La présente invention concerne l'utilisation de souches monocaryotiques de champignons filamenteux de (espèce Pycnoporus du groupe basidiomycète, pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation d'une protéine recombinante déterminée, ledit procédé étant effectué par surexpression du gène codant pour cette protéine dans la souche monocaryotique susmentionnée de Pycnoporus. , A (heure actuelle, deux modèles fongiques sont utilisés préférentiellement par les grands groupes industriels dans le cadre dë la production d'enzymes intervenant dans les biotransformations végétales, telles que les métalloenzymes. Il s'agit d'Aspef gillus, et de Tf~ichodef~ma, qui appartiennent au groupe des deutéromycètes. Toutefois, les rendements de production à l'aide de ces modèles, notamment en production de laccases, n'excèdent pas les 150 mg/l.
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs du fait que la transformation de souches monocaryotiques de P. cinnabarinus déficientes pour l'activité laccase à l'aide de vecteurs contenant le gène codant pour cette laccase et dont l' expression est sous le contrôle d'un promoteur identique au promoteur pLac endogène de la laccase de P. cinrzabarinus, conduit à une production équivalente de laccase que lors de la mise en oruvre d'un procédé de surproduction de laccase par induction du promoteur endogène de cette laccase par action de l'éthanol sur des souches rnonocaryotiques de P. cinnabarinus non déficientes pour (activité laccase, et qui égale le gll.
Des résultats similaires ont été obtenus par les Inventeurs en utilisant le promoteur ~gpd, et le promoteur sc3 de Sclaizophyllum commune, en lieu et place du promoteur pLac susmentionné.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une protéine recombinante déterminée, ledit procédé étant effectué par surexpression du gène codant pour cette protéine déterminée dans une souche monocaryotique de champignons filamenteux de (espèce Pycnopof~us du groupe basidiomycète, et comprend - une étape de mise en culture de la souche monocaryotique de Pycnopof~us susmentionnée, ladite souche étant iransformée à (aide d'un vecteur d'expression
2 contenant le gène codant pour la protéine recombinante déterminée, dont (expression est placée sous le contrôle d'un promoteur correspondant à un promoteur endogène des champignons susmentionnés, ou d'un promoteur différent (encore désigné
promoteur exogène), ledit promoteur étant constitutif ou inductible, - le cas échéant une étape d'induction du promoteur susmentionné, lorsque celui-ci est inductible, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la protéine recombinante déterminée, produite dans le milieu de culture.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce que la souche monocaryotique de Pyc~aopor~us utilisée pour la surexpression du gène codant pour la protéine recombinante déterminée, est telle qu'obtenue par mise en culiure de la souche dicaryotique d'origine à
30°C dans le noir pendant 15 jours, suivie d'une étape d'exposition au jour 2 à 3 semaines à
température ambiante jusqu'à la formation d'organes de fructification correspondant à des hyphes différenciées appelées basides, au sein desquels a alors lieu la caryogamie (fusion des noyaux), suivie de la méiose qui conduit à la formation de quatre spores sexuées, ou basidiospores haploïdes génétiquement différentes, qui, après germination, engendre un mycélium monocaryotique.
Avantageusement, la souche monocaryotique de Pycnoporus utilisée dans le procédé susmentionné de (invention, est une souche de Pycnoporus cinf2abarinus.
Les protéines recombinantes déterminées surexprimées dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé selon (invention, correspondent soit à des protéines endogènes de Pycnoporus, soit à des protéines exogènes différentes des protéines endogènes de la souche de Pychoporus utilisée pour la production desdites protéines. Notamment ces protéines exogènes correspondent à des protéines endogènes de basidiomycètes autres que Pycnoporus, telles que les enzymes basidiomycètes intervenant dans les biotransformations végétales, ou correspondent à des protéines endogènes de souches de Pycnopor-us différentes de la souche de Pycnopor-us utilisée pour la production desdites protéines.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce que les protéines recombinantes déterminées correspondent - aux protéines endogènes de Pychopof-us suivantes * les métalloenzymes, telles que la laccase, ou la tyrosinase,
promoteur exogène), ledit promoteur étant constitutif ou inductible, - le cas échéant une étape d'induction du promoteur susmentionné, lorsque celui-ci est inductible, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la protéine recombinante déterminée, produite dans le milieu de culture.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce que la souche monocaryotique de Pyc~aopor~us utilisée pour la surexpression du gène codant pour la protéine recombinante déterminée, est telle qu'obtenue par mise en culiure de la souche dicaryotique d'origine à
30°C dans le noir pendant 15 jours, suivie d'une étape d'exposition au jour 2 à 3 semaines à
température ambiante jusqu'à la formation d'organes de fructification correspondant à des hyphes différenciées appelées basides, au sein desquels a alors lieu la caryogamie (fusion des noyaux), suivie de la méiose qui conduit à la formation de quatre spores sexuées, ou basidiospores haploïdes génétiquement différentes, qui, après germination, engendre un mycélium monocaryotique.
Avantageusement, la souche monocaryotique de Pycnoporus utilisée dans le procédé susmentionné de (invention, est une souche de Pycnoporus cinf2abarinus.
Les protéines recombinantes déterminées surexprimées dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé selon (invention, correspondent soit à des protéines endogènes de Pycnoporus, soit à des protéines exogènes différentes des protéines endogènes de la souche de Pychoporus utilisée pour la production desdites protéines. Notamment ces protéines exogènes correspondent à des protéines endogènes de basidiomycètes autres que Pycnoporus, telles que les enzymes basidiomycètes intervenant dans les biotransformations végétales, ou correspondent à des protéines endogènes de souches de Pycnopor-us différentes de la souche de Pycnopor-us utilisée pour la production desdites protéines.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce que les protéines recombinantes déterminées correspondent - aux protéines endogènes de Pychopof-us suivantes * les métalloenzymes, telles que la laccase, ou la tyrosinase,
3 * ou la cellobiose déshydrogénase, la xylanase, la (3-glycosidase, finvertase, ou l'a-amylase, - aux protéines exogènes choisies parmi les suivantes * les ïyrosinases de souches de Pychoporus différentes de la souche de Pyc~aoporus utilisée pour la production desdites protéines, telle que la tyrosinase de Pycf2opor-us sangr~ineus lorsque la souche de PychopoYUS utilisée pour la production de cette tyrosinase est différente de Pycnoporus safaguiheus, * les laccases de basidiomycètes autres que Pycnopo~us, telle que la laccase d'halocyphina villosa (basidiomycète halophile), * les cinnamoyl estérases A (numéro EMBL Y09330) et B (numéro EMBL
ANI309~07) d'Aspergillus nigef°.
Avantageusement, notamment dans le cas de la préparation de protéines recombinantes déterminées correspondant aux protéines endogènes de ~Pyc~copof~us, la souche monocaryotique de Pychoporus utilisée est déficiente pour le gène codant pour la protéine endogène à laquelle correspond la protéine recombinante déterminée, afin de ne pas avoir à séparer la protéine recombinante déterminée de la protéine endogène à
laquelle elle correspond lors de la purification de ladite protéine recombinante.
En variante, notamment dans le cas de la préparation de protéines recombinantes déterminées correspondant aux protéines endogènes de Pycnopo~us, la souche monocaryotique de Pycfaoporus utilisée peut ne pas être déficiente pour le gène codant pour la protéine endogène à laquelle correspond la protéine recombinante déterminée, ladite souche étant alors transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine recombinante déterminée marquée afin de la distinguer de la protéine endogène lors de (étape de purification. A titre d'illustration, la protéine recornbinante déterminée peut être marquée par une étiquette histidine (His-tag).
A ce titre, (invention a plus particulièrement pour objet un procédé de préparation de laccases recombinantes correspondant aux laccases endogènes de Pycnoporus, caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycuopof~us, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de ~Pycnoporus, transformée à (aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour une laccase de Pycnopof~us, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur correspondant au promoteur endogène de cette laccase,
ANI309~07) d'Aspergillus nigef°.
Avantageusement, notamment dans le cas de la préparation de protéines recombinantes déterminées correspondant aux protéines endogènes de ~Pyc~copof~us, la souche monocaryotique de Pychoporus utilisée est déficiente pour le gène codant pour la protéine endogène à laquelle correspond la protéine recombinante déterminée, afin de ne pas avoir à séparer la protéine recombinante déterminée de la protéine endogène à
laquelle elle correspond lors de la purification de ladite protéine recombinante.
En variante, notamment dans le cas de la préparation de protéines recombinantes déterminées correspondant aux protéines endogènes de Pycnopo~us, la souche monocaryotique de Pycfaoporus utilisée peut ne pas être déficiente pour le gène codant pour la protéine endogène à laquelle correspond la protéine recombinante déterminée, ladite souche étant alors transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine recombinante déterminée marquée afin de la distinguer de la protéine endogène lors de (étape de purification. A titre d'illustration, la protéine recornbinante déterminée peut être marquée par une étiquette histidine (His-tag).
A ce titre, (invention a plus particulièrement pour objet un procédé de préparation de laccases recombinantes correspondant aux laccases endogènes de Pycnoporus, caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycuopof~us, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de ~Pycnoporus, transformée à (aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour une laccase de Pycnopof~us, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur correspondant au promoteur endogène de cette laccase,
4 - une étape d'induction du promoteur susmentionné, notamment par addition d'éthanol, ou de sous-produits agricoles contenant de la lignocellulose comme la paille de blé, les sons de maïs et la pulpe de betterave, ou des composés à cycle aromatique .
comme la 2,5-xylidine, l'acide vératrylique, le guaïcol, l'alcool vératrylique, la syringaldazine, l'acide férulique, l'acide caféique et les lignosulfonates, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus susmentionnée produite dans le milieu de culture, notamment selon la méthode décrite dans Sigoillot J.C., Herpoel L, Frasse P., Moukha S., Lesage-Meessen L., Asther M.
1999 ; Laccase production by a monokaxyotic strain Pycnoporus cinnaba~°inus derived from a dikaryotic strain ; World Journal of Microbiology and Biotechnology 15, 484.
L'invention concerne plus parïiculièrement un procédé tel que défini ci-dessus, de préparation de la laccase recombinante correspondant à la laccase endogène de PycnopoYUS cinnabar~inus représentée par SEQ ID NO : 2, caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnopof~us cinnabarinus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnopor-us cinnabaf~inus, transformée à (aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique (ou acide nucléique) SEQ ID NO : 1 codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ D~ NO : 2, le cas échéant marquée, notamment par une étiquette His-tag, et dont (expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase susmentionnée, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ ID NO : 3, - une étape d'induction par féthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recornbinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ ID NO : 2 produite dans le milieu de culture, notamment selon la méthode décrite dans Sigoillot J.C., et al. (1999) susmentionné.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de préparation de laccases recombinantes correspondant aux laccases endogènes de Pycnoporus, caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycn~po~~us, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour une laccase de Pycnoporus dont (expression est placée sous le contrôle d'un promoteur exogène choisi parmi * le promoteur gpd de (expression du gène codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate déhydrogénase de Schizophyllum commune, dont la séquence nucléotidique est représentée par SEQ ID NO : 4, * ou le promoteur sc3 de (expression du gène codant pour fhydrophobine de Schizophyllum commune, dont la séquence nucléotidique est représentée pax SEQ m NO : 5, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus susmentionnée produite dans le milieu de culture, notamment selon la méthode, décrite dans Sigoillot J.C., et al. (1999) susmentionné.
L'invention concerne plus particulièrement un procédé tel que défini ci-dessus, de préparation de la laccase correspondant à la laccase endogène de Pycnopos°us cinnabarinus représentée par SEQ m NO : 2, caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de mise en culture d'une souche monocaxyotique de Pycnopo~°us cinnabaninus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus, transformée à (aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique SEQ m NO : 1 codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ m NO : 2, le cas échéant marqùée, notamment par une étiquette His-tag, dont (expression est placée sous le contrôle du promoteur exogène gpd ou sc3, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant maxquée, représentée par SEQ m NO : 2 produite dans le milieu de culture, notamment selon la méthode décrite dans Sigoillot J.C., et al. (1999) susmentionné.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, de préparation de tyrosinase recombinante correspondant à la tyrosinase de Pycnoporus sanguineus représentée par SEQ m NO : 16, caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarinus transformée à (aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidiqûe SEQ m NO : 15 codant pour la tyrosinase recombinante représentée par SEQ lD NO : 16, le cas échéant marquée, la séquence SEQ ID NO : 15 étant avantageusement précédée pax la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides süués aux positions 128 et 190 de SEQ m NO : 1 codant pour le peptide signal de Pycnopof~us cinnabarinus délimité par les 21 premiers aminoacides de SEQ m NO
:.2, et dont (expression est placée sous le conirôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase de Pycnopo3°us cinnabaf~inus, la séquénce dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ m NO : 3, - une étape d'induction par féthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la tyrosinase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ m NO : 16 produite dans le milieu de culture.
L'invention concerne plus particulièrement un procédé tel que défini ci-dessus, de préparation de laccase recombinante correspondant à la laccase d'halocyplaina villosci représentée sur la figure 12 (SEQ m NO : 18), caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarinus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnopo~us cinnabaf-inus, transformée à (aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique représentée sur la figure 12 (SEQ m NO : 17) codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ m NO : 18, le cas échéant marquée, et dont (expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase de Pycnopof~us cinnabaf°inus, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ m NO : 3, - une étape d'induction par l'éthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ m NO : 18 produite dans le milieu de culture.
L'invention a également pour objet la séquence nucléotidique codant pour le promoteur pLac de la laccase endogène de Pycnopof-us cinnabaf°inus, et correspondant à
la séquence SEQ ID NO : 3, ou toute séquence dérivée de ce promoteur par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides et conservant la propriété d'éire un promoteur de l'expression de séquences.
L'invention concerne également tout vecteur d'expression, tel que le plasmide pELP, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ m NO : 3 du promoteur pLac susmentionné, ou une séquence dérivée telle que définie ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet tout vecteur d'expression tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour une protéine recombinante déterminée, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac susmentionné, ou d'une séquence dérivée telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne plus particulièrement tout vecteur d'expression tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la protéine recombinante déterminée est une protéine correspondant:
- aux protéines endogènes de Pycnoporus suivantes * les métalloenzymes, telles que la laccase, ou la tyrosinase, * ou la cellobiose déshydrogénase, la xylanase, la (3-glycosidase, finvertase, ou fa,-amylase, - aux protéines exogènes choisies parmi les suivantes * les tyrosinases de souches de Pychoporus différentes de la souche de Pycnoporus utilisée pour la production desdites protéines, telle que la tyrosinase de Pychoporus sahguineus lorsque la souche de Pycnoporus utilisée pour la production de cette tyrosinase est différente de Pychopor us sanguineus, * les laccases de basidiomycètes autres que Pychoporus, telle que la laccase d'halocyphina villosa (basidiomycète halophile), * les cinnamoyl estérases A et B d'Aspergillus piger.
L'invention concerne également. toute cellule hôte transformée à (aide d'un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet toute cellule hôte susmentionnée, correspondant à des cellules monocaryotiques de souches de Pycnoporus, telles que les souches de Pycnoporus cinhabarinus.
L'invention a également pour objet (utilisation de vecteurs d'expression tels que définis ci-dessus, ou de cellules hôtes susmentionnées, pour la mise en oeuvre d'un procédé de surproduction d'une protéine recornbinante déterminée telle que définie ci-dessus.
L'invention sera davantage illustrée à (aide de la description détaillée qui suit du SEPC : Système d'Expression Pycnoporus cinnabarinus, à savoir du développement d'un modèle d'expression fongique performant permettant de s'affranchir des modèles industriels utilisés actuellement par les grands groupes européens (Aspergillus et Trichoderma).
En résumé, il s'agit d'un système d'expression eucaryote et plus spécifiquement de champignon filamenteux du groupe basidiomycète, Pycnoporus cinraabarinus, qui a' été développé par les Inventeurs pour la surexpression de protéines d'intérêt industriel.
Ce Travail a été fait dans le cadre de l'étude de métalloenzymes, telles que les laccases, et en particulier a permis de cloner les gènes impliqués pour leur surexpression, et de surproduction des laccases en grande quantité à l'aide de fermenteurs, ceci afin de les utiliser dans des applications industrielles à usage alimentaire (panification, préparation de boissons afin de moduler la couleur du thé, aider à la clarification des jus de fruits et des boissons alcoolisées, formation d'agropolymères) et non alimentaire (traitement des « j eans », dégradation de polluants aromatiques dans les sols, bioblanchiment des fibres lignocellulosiques dans le domaine des pâtes à papier).
n Obtention de lignées monocaryotiques de Pycuoporus ciufzabariuus pour la transformation du champignon et la surproduction de gènes d'intérêt.
Cette étape a pour but d'isoler puis de sélectionner des lignées cellulaires haploïdes issues des spores sexuées d'un champignon filamenteux, Pycnoporus cinnabarinus, qui seront utilisées en temps qu'hôte pour l'expression des gènes d'intérêt. P. cinnabaYinus est un champignon hétérothallique qui se trouve à
l'état sauvage sous forme dicaryotique (deux noyaux non appariés par cellule) à
partir duquel des lignées monocaryotiques sont sélectionnées (un noyau par cellule), potentiellement plus stable et donc utilisable pour la transformation génétique. Dans le cadre de cette étude les Inventeurs se sont attachés à sélectionner de lignées monocaryotiques déficientes pour l'activité laccase (lac ). A l'état dicaryotique, le champignon peut se multiplier par voie végétative (Fig. 1). Mais, sous l'influence de conditions environnementales particulières, on peut induire, en laboratoire, la formation d'organes de fructification. Au sein d'hyphes différenciées appelées basides, a alors lieu la caryogamie (fusion des noyaux), suivie de la méiose qui conduit à la formation de quatre spores sexuées, ou basidiospores haploïdes génétiquement différentes.
Après germination, chaque basidiospore engendre un mycélium monocaryotique. Un simple test colorimétrique permet ensuite de ne sélectionner que les souches dépourvues d'activité laccase.
1) Isolement des souches monocaYyotiques Le milieu de fructification est composé d'extrait de malt 2% (P/V) et de l'agar (1,6% P/V). Les cultures sont ensemencées dans des boites de Pétri et gardées à 30°C
dans le noir pendant 15 jours avant de les exposer au jour 2 à 3 semaines à
température ambiante. Le corps de fructification apparaît orange-rouge. Les monospores sont alors récoltées avec de l'eau stérile sur le couvercle de la boite de Pétri. La suspension est diluée et mise en culture dans des boites de Pétri contenant un milieu MA2 (malt 2%
P/V et agar 2% P/V) dans le but d'isoler des colonies. Des cultures pures isolées sont piquées et gardées dans du milieu MA2 à 30°C pendant 5 jours et stockées à 4°C.
Dans ces conditions, une souche monocaryotique déficiente pour l'activité
laccase a été sélectionnée pour la transformation avec le vecteur d'expression dans le but de surexprimer le gène de la laccase. Une étude en Southern blot a été effectuée et a permis de démontrer que cette souche est déficiente pour le gène codant pour la laccase chez P . cinnaba~inus.
2) Test rapide de détection de l'activité laccase des colonies monospores Un morceau de mycélium est déposé dans une boite de Petri et recouvert d'une goutte de syringaldazine 0,1 % (P/~ en solution éthanolique ; Après 15 minutes, un changement de couleur est observé. Le 2,2-azino-bis-[3-ethylthiazoline-6-sulfonate]
(ABTS) peut-ètre utilisé également comme substrat pour révéler une activité
laccase.
3) Conditions de cultuf-es pouf° pf°~duif°e la laccase Un inoculum est prélevé des précultures qui ont poussé 10 jours à 30°C
dans des fioles de Roux contenant 200 mL d'un milieu synthétique avec la composition suivante poux 1L : maltose (20 g), tartrate de diammonium (1,84 g), tartrate de disodium (2,3 g), KHZP04 (1,33 g), CaCl2, H20 (0,1 g), MgS04, 7H20 (0,5 g), FeS04,7H2O (0,07 g), ZnSOa,7H20 (0,046 g), MnS04,H20 (0,035 g), CuS04,5H20 (0,1 g), extrait de levure (1 g), solution de vitamines (1 mL/L) selon Tatum et al. (Biochemical mutant strains of Neurospo~a produced by physical and chemical treatment. Arnerican Journal of Botany, 37 : 38-46, 1950). Le mycélium de deux fioles est collecté, mélangé à 100 mL
d'eau stérile et broyés au mixeur Ultraturax 60 sec. Pour produire de la laccase, le milieu synthétique est inoculé par 1 mL de la suspension de mycélium. Le milieu (100 mL) est ensuite incubé à 30°C dans des fioles erlenmeyer bafflées de 250 mL
sous agitation (120 rpm).°
II) Clonage du gène codant pour la laccase de .Pycnoporus cinnabariuus et de son promoteur en vue de la construction d'un vecteur d'expression Il s'agit d'un système d'expression eucaryote et plus particulièrement de champignon filamenteux, Pycnoporus cinnabar~i~aus, du groupe basidiomycète pour la surproduction de protéines recombinantes déterminées. Le modèle d'étude sélectionné
est celui de la laccase de P. cinnabarinus. A l'heure actuelle, deux modèles fongiques sont utilisés préférentiellement par les grands groupes industriels. Il s'agit d'Aspergillus et de Trichoderma qui appartiennent au groupe des Deutéromycètes. Ce système d'expression est donc tout à fait original et devrait combler la lacune concernant le développement de système d'expression basidiomycète compatible avec les exigences des industriels (possibilité de production à grande échelle de protéines sécrétées dans le milieu extra-cellulaire et culture du champignon producteur en fermenteur).
1) Clonage de gène de la laccase de Pycnoporus cinnabarinus et de son promoteur Dans une première étape, les Inventeurs ont amplifié un fragment du gène codant pour la laccase à l'aide d'amorces nucléotidiques dégénérées (Fig. 2). Les amorces dégénérées amont F2 (SEQ ID NO : 6 ; CAYTGGCAYGGRTTCTTCC) et aval R8 (SEQ ID NO : 7 ; GAGRTGGAAGTCRATGTGRC) ont été déduites, respectivement , des régions de liaison au cuivre I et IV des laccases d'organismes voisins et utilisées dans une réaction de PCR (Polymerase Chain Reaction) en utilisant l'ADN
génomique de P. cinnabarinus I-937. A 10 ~1 de mélange réactionnel sont ajoutés : 100 ng d'ADN
génomique; 0.2 mM de dATP, dCTP, dTTP, and dGTP; 25 pmol de chaque amorce nucléotidique; 0.1 volume de tampon lOX Pfu polymerase (100 mM Tris=HCI, lSmM
MgCl2, 500 mM KCl, pH 8,3) and 1 U de polymerase Pfu. Le mélange est chauffé à
94°C pendant 5 min avant d'ajouter la polymérase. Les conditions de la réaction sont les suivantes : 5 cycles de 94 °C, 5 min; 55 °C, 30 s; et 72 °C, 4 min; puis 25 cycles of 94 °C, 30 s; 55 °C, 30 s, et 72 °C, 3 min. Une étape de 10 min à 72°C est effectuée afin de finir la réaction. Une bande de 1,64 kpb a été obtenue correspondant à la partie centrale du gène de la laccase. La séquence ADN a été clonée dans pGEM-T afin de séquencer cette partie du gène.
Par une technique de Southern blot (Fig. 3), . nous avons défini les sites de restriction appropriés afin d'obtenir un fragment d'ADN minimum, pouvant contenir l'intégralité de gène de la laccase, et qui sont susceptibles de servir à
amplifier les extrémités 5' et 3' manquantes. Un Southern blot a été effectué avec l'ADN
génomique de P. cinnabaf°inus avec les enzymes, BamHI, EcoRI, Pstl, PvuII, SacI, SmaI and Xba I
et a permis de sélectionner Pstl qui donne une bande de 3.5 kpb par digestion de l'ADN
génomiqué. Afin d'amplifier les parties manquantes du gène, une technique de PCR
inverse a été utilisée avec un mélange de PCR contenant des amorces nucléotidiques spécifiques de la partie centrale précédemment isolée et de l'ADN génomique de P.
cinnabaYinus. La réaction de PCR est effectuée avec 150 ng d'ADN coupé par Pstl et recircularisé sur lui-même par ligation et les amorces nucléotidiques Fex (SEQ ID NO : ~ ; GGATAACTACTGGATCCGCG) et Rex (SEQ ID NO : 9 ;
CGCAGTATTGCGTGGAGAG). Les conditions de la réaction sont les suivantes : 5 cycles de 94 °C, 5 min; 55 °C, 30 s; et 72 °C, 5 min;
puis 25 cycles of 94 °C, 30 s;
55 °C, 30 s, et 72 °C, 4 min avec une étape finale de 10 min à
72 °C. Le fragment d'ADN amplifié correspond à une bande de 2,7 kpb qui a été cloné dans pGEM-T
et séquencé.
L'intégralité du gène codant pour la laccase a été ensuite définie en combinant la partie centrale et les parties 5' et 3' amplifiées. Afin de ~ vérifier cette séquence, l'intégralité du gène a été amplifié (3,331 kpb, Fig. 4) avec les amorces nucléotidiques Fin (SEQ D~ NO : 10 ; GACATCTGGAGCGCCTGTC) et Rin (SEQ ID NO : 11 ;
ATCGAAGGTTCCGATGACTGACATGAC) à partir de l'ADN génomique de P. cir~nabarinus. Ce gène a été également cloné à partir de l'ADN génomique de P. cinnaba~°inus ss3 et s'est avéré être identique à celui isolé chez P. cinnabarinus I-937.
~') Construction du vecteu3° d'expression utilisant le promoteur du gène de la laccase A partir de la séquence du gène de la laccase, les Inventeurs ont cloné le promoteur de ce gène en utilisant la même stratégie employée précédemment pour l'isolement du gène, c'est-à-dire avec une technique de PCR inverse sur un fragment d'ADN génomique (3,5 kpb) coupé cette fois-ci par l'enzyme de restriction BgIII (Fig.
comme la 2,5-xylidine, l'acide vératrylique, le guaïcol, l'alcool vératrylique, la syringaldazine, l'acide férulique, l'acide caféique et les lignosulfonates, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus susmentionnée produite dans le milieu de culture, notamment selon la méthode décrite dans Sigoillot J.C., Herpoel L, Frasse P., Moukha S., Lesage-Meessen L., Asther M.
1999 ; Laccase production by a monokaxyotic strain Pycnoporus cinnaba~°inus derived from a dikaryotic strain ; World Journal of Microbiology and Biotechnology 15, 484.
L'invention concerne plus parïiculièrement un procédé tel que défini ci-dessus, de préparation de la laccase recombinante correspondant à la laccase endogène de PycnopoYUS cinnabar~inus représentée par SEQ ID NO : 2, caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnopof~us cinnabarinus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnopor-us cinnabaf~inus, transformée à (aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique (ou acide nucléique) SEQ ID NO : 1 codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ D~ NO : 2, le cas échéant marquée, notamment par une étiquette His-tag, et dont (expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase susmentionnée, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ ID NO : 3, - une étape d'induction par féthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recornbinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ ID NO : 2 produite dans le milieu de culture, notamment selon la méthode décrite dans Sigoillot J.C., et al. (1999) susmentionné.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de préparation de laccases recombinantes correspondant aux laccases endogènes de Pycnoporus, caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycn~po~~us, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour une laccase de Pycnoporus dont (expression est placée sous le contrôle d'un promoteur exogène choisi parmi * le promoteur gpd de (expression du gène codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate déhydrogénase de Schizophyllum commune, dont la séquence nucléotidique est représentée par SEQ ID NO : 4, * ou le promoteur sc3 de (expression du gène codant pour fhydrophobine de Schizophyllum commune, dont la séquence nucléotidique est représentée pax SEQ m NO : 5, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus susmentionnée produite dans le milieu de culture, notamment selon la méthode, décrite dans Sigoillot J.C., et al. (1999) susmentionné.
L'invention concerne plus particulièrement un procédé tel que défini ci-dessus, de préparation de la laccase correspondant à la laccase endogène de Pycnopos°us cinnabarinus représentée par SEQ m NO : 2, caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de mise en culture d'une souche monocaxyotique de Pycnopo~°us cinnabaninus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus, transformée à (aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique SEQ m NO : 1 codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ m NO : 2, le cas échéant marqùée, notamment par une étiquette His-tag, dont (expression est placée sous le contrôle du promoteur exogène gpd ou sc3, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant maxquée, représentée par SEQ m NO : 2 produite dans le milieu de culture, notamment selon la méthode décrite dans Sigoillot J.C., et al. (1999) susmentionné.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, de préparation de tyrosinase recombinante correspondant à la tyrosinase de Pycnoporus sanguineus représentée par SEQ m NO : 16, caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarinus transformée à (aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidiqûe SEQ m NO : 15 codant pour la tyrosinase recombinante représentée par SEQ lD NO : 16, le cas échéant marquée, la séquence SEQ ID NO : 15 étant avantageusement précédée pax la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides süués aux positions 128 et 190 de SEQ m NO : 1 codant pour le peptide signal de Pycnopof~us cinnabarinus délimité par les 21 premiers aminoacides de SEQ m NO
:.2, et dont (expression est placée sous le conirôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase de Pycnopo3°us cinnabaf~inus, la séquénce dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ m NO : 3, - une étape d'induction par féthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la tyrosinase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ m NO : 16 produite dans le milieu de culture.
L'invention concerne plus particulièrement un procédé tel que défini ci-dessus, de préparation de laccase recombinante correspondant à la laccase d'halocyplaina villosci représentée sur la figure 12 (SEQ m NO : 18), caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarinus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnopo~us cinnabaf-inus, transformée à (aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique représentée sur la figure 12 (SEQ m NO : 17) codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ m NO : 18, le cas échéant marquée, et dont (expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase de Pycnopof~us cinnabaf°inus, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ m NO : 3, - une étape d'induction par l'éthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ m NO : 18 produite dans le milieu de culture.
L'invention a également pour objet la séquence nucléotidique codant pour le promoteur pLac de la laccase endogène de Pycnopof-us cinnabaf°inus, et correspondant à
la séquence SEQ ID NO : 3, ou toute séquence dérivée de ce promoteur par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides et conservant la propriété d'éire un promoteur de l'expression de séquences.
L'invention concerne également tout vecteur d'expression, tel que le plasmide pELP, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ m NO : 3 du promoteur pLac susmentionné, ou une séquence dérivée telle que définie ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet tout vecteur d'expression tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour une protéine recombinante déterminée, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac susmentionné, ou d'une séquence dérivée telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne plus particulièrement tout vecteur d'expression tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la protéine recombinante déterminée est une protéine correspondant:
- aux protéines endogènes de Pycnoporus suivantes * les métalloenzymes, telles que la laccase, ou la tyrosinase, * ou la cellobiose déshydrogénase, la xylanase, la (3-glycosidase, finvertase, ou fa,-amylase, - aux protéines exogènes choisies parmi les suivantes * les tyrosinases de souches de Pychoporus différentes de la souche de Pycnoporus utilisée pour la production desdites protéines, telle que la tyrosinase de Pychoporus sahguineus lorsque la souche de Pycnoporus utilisée pour la production de cette tyrosinase est différente de Pychopor us sanguineus, * les laccases de basidiomycètes autres que Pychoporus, telle que la laccase d'halocyphina villosa (basidiomycète halophile), * les cinnamoyl estérases A et B d'Aspergillus piger.
L'invention concerne également. toute cellule hôte transformée à (aide d'un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet toute cellule hôte susmentionnée, correspondant à des cellules monocaryotiques de souches de Pycnoporus, telles que les souches de Pycnoporus cinhabarinus.
L'invention a également pour objet (utilisation de vecteurs d'expression tels que définis ci-dessus, ou de cellules hôtes susmentionnées, pour la mise en oeuvre d'un procédé de surproduction d'une protéine recornbinante déterminée telle que définie ci-dessus.
L'invention sera davantage illustrée à (aide de la description détaillée qui suit du SEPC : Système d'Expression Pycnoporus cinnabarinus, à savoir du développement d'un modèle d'expression fongique performant permettant de s'affranchir des modèles industriels utilisés actuellement par les grands groupes européens (Aspergillus et Trichoderma).
En résumé, il s'agit d'un système d'expression eucaryote et plus spécifiquement de champignon filamenteux du groupe basidiomycète, Pycnoporus cinraabarinus, qui a' été développé par les Inventeurs pour la surexpression de protéines d'intérêt industriel.
Ce Travail a été fait dans le cadre de l'étude de métalloenzymes, telles que les laccases, et en particulier a permis de cloner les gènes impliqués pour leur surexpression, et de surproduction des laccases en grande quantité à l'aide de fermenteurs, ceci afin de les utiliser dans des applications industrielles à usage alimentaire (panification, préparation de boissons afin de moduler la couleur du thé, aider à la clarification des jus de fruits et des boissons alcoolisées, formation d'agropolymères) et non alimentaire (traitement des « j eans », dégradation de polluants aromatiques dans les sols, bioblanchiment des fibres lignocellulosiques dans le domaine des pâtes à papier).
n Obtention de lignées monocaryotiques de Pycuoporus ciufzabariuus pour la transformation du champignon et la surproduction de gènes d'intérêt.
Cette étape a pour but d'isoler puis de sélectionner des lignées cellulaires haploïdes issues des spores sexuées d'un champignon filamenteux, Pycnoporus cinnabarinus, qui seront utilisées en temps qu'hôte pour l'expression des gènes d'intérêt. P. cinnabaYinus est un champignon hétérothallique qui se trouve à
l'état sauvage sous forme dicaryotique (deux noyaux non appariés par cellule) à
partir duquel des lignées monocaryotiques sont sélectionnées (un noyau par cellule), potentiellement plus stable et donc utilisable pour la transformation génétique. Dans le cadre de cette étude les Inventeurs se sont attachés à sélectionner de lignées monocaryotiques déficientes pour l'activité laccase (lac ). A l'état dicaryotique, le champignon peut se multiplier par voie végétative (Fig. 1). Mais, sous l'influence de conditions environnementales particulières, on peut induire, en laboratoire, la formation d'organes de fructification. Au sein d'hyphes différenciées appelées basides, a alors lieu la caryogamie (fusion des noyaux), suivie de la méiose qui conduit à la formation de quatre spores sexuées, ou basidiospores haploïdes génétiquement différentes.
Après germination, chaque basidiospore engendre un mycélium monocaryotique. Un simple test colorimétrique permet ensuite de ne sélectionner que les souches dépourvues d'activité laccase.
1) Isolement des souches monocaYyotiques Le milieu de fructification est composé d'extrait de malt 2% (P/V) et de l'agar (1,6% P/V). Les cultures sont ensemencées dans des boites de Pétri et gardées à 30°C
dans le noir pendant 15 jours avant de les exposer au jour 2 à 3 semaines à
température ambiante. Le corps de fructification apparaît orange-rouge. Les monospores sont alors récoltées avec de l'eau stérile sur le couvercle de la boite de Pétri. La suspension est diluée et mise en culture dans des boites de Pétri contenant un milieu MA2 (malt 2%
P/V et agar 2% P/V) dans le but d'isoler des colonies. Des cultures pures isolées sont piquées et gardées dans du milieu MA2 à 30°C pendant 5 jours et stockées à 4°C.
Dans ces conditions, une souche monocaryotique déficiente pour l'activité
laccase a été sélectionnée pour la transformation avec le vecteur d'expression dans le but de surexprimer le gène de la laccase. Une étude en Southern blot a été effectuée et a permis de démontrer que cette souche est déficiente pour le gène codant pour la laccase chez P . cinnaba~inus.
2) Test rapide de détection de l'activité laccase des colonies monospores Un morceau de mycélium est déposé dans une boite de Petri et recouvert d'une goutte de syringaldazine 0,1 % (P/~ en solution éthanolique ; Après 15 minutes, un changement de couleur est observé. Le 2,2-azino-bis-[3-ethylthiazoline-6-sulfonate]
(ABTS) peut-ètre utilisé également comme substrat pour révéler une activité
laccase.
3) Conditions de cultuf-es pouf° pf°~duif°e la laccase Un inoculum est prélevé des précultures qui ont poussé 10 jours à 30°C
dans des fioles de Roux contenant 200 mL d'un milieu synthétique avec la composition suivante poux 1L : maltose (20 g), tartrate de diammonium (1,84 g), tartrate de disodium (2,3 g), KHZP04 (1,33 g), CaCl2, H20 (0,1 g), MgS04, 7H20 (0,5 g), FeS04,7H2O (0,07 g), ZnSOa,7H20 (0,046 g), MnS04,H20 (0,035 g), CuS04,5H20 (0,1 g), extrait de levure (1 g), solution de vitamines (1 mL/L) selon Tatum et al. (Biochemical mutant strains of Neurospo~a produced by physical and chemical treatment. Arnerican Journal of Botany, 37 : 38-46, 1950). Le mycélium de deux fioles est collecté, mélangé à 100 mL
d'eau stérile et broyés au mixeur Ultraturax 60 sec. Pour produire de la laccase, le milieu synthétique est inoculé par 1 mL de la suspension de mycélium. Le milieu (100 mL) est ensuite incubé à 30°C dans des fioles erlenmeyer bafflées de 250 mL
sous agitation (120 rpm).°
II) Clonage du gène codant pour la laccase de .Pycnoporus cinnabariuus et de son promoteur en vue de la construction d'un vecteur d'expression Il s'agit d'un système d'expression eucaryote et plus particulièrement de champignon filamenteux, Pycnoporus cinnabar~i~aus, du groupe basidiomycète pour la surproduction de protéines recombinantes déterminées. Le modèle d'étude sélectionné
est celui de la laccase de P. cinnabarinus. A l'heure actuelle, deux modèles fongiques sont utilisés préférentiellement par les grands groupes industriels. Il s'agit d'Aspergillus et de Trichoderma qui appartiennent au groupe des Deutéromycètes. Ce système d'expression est donc tout à fait original et devrait combler la lacune concernant le développement de système d'expression basidiomycète compatible avec les exigences des industriels (possibilité de production à grande échelle de protéines sécrétées dans le milieu extra-cellulaire et culture du champignon producteur en fermenteur).
1) Clonage de gène de la laccase de Pycnoporus cinnabarinus et de son promoteur Dans une première étape, les Inventeurs ont amplifié un fragment du gène codant pour la laccase à l'aide d'amorces nucléotidiques dégénérées (Fig. 2). Les amorces dégénérées amont F2 (SEQ ID NO : 6 ; CAYTGGCAYGGRTTCTTCC) et aval R8 (SEQ ID NO : 7 ; GAGRTGGAAGTCRATGTGRC) ont été déduites, respectivement , des régions de liaison au cuivre I et IV des laccases d'organismes voisins et utilisées dans une réaction de PCR (Polymerase Chain Reaction) en utilisant l'ADN
génomique de P. cinnabarinus I-937. A 10 ~1 de mélange réactionnel sont ajoutés : 100 ng d'ADN
génomique; 0.2 mM de dATP, dCTP, dTTP, and dGTP; 25 pmol de chaque amorce nucléotidique; 0.1 volume de tampon lOX Pfu polymerase (100 mM Tris=HCI, lSmM
MgCl2, 500 mM KCl, pH 8,3) and 1 U de polymerase Pfu. Le mélange est chauffé à
94°C pendant 5 min avant d'ajouter la polymérase. Les conditions de la réaction sont les suivantes : 5 cycles de 94 °C, 5 min; 55 °C, 30 s; et 72 °C, 4 min; puis 25 cycles of 94 °C, 30 s; 55 °C, 30 s, et 72 °C, 3 min. Une étape de 10 min à 72°C est effectuée afin de finir la réaction. Une bande de 1,64 kpb a été obtenue correspondant à la partie centrale du gène de la laccase. La séquence ADN a été clonée dans pGEM-T afin de séquencer cette partie du gène.
Par une technique de Southern blot (Fig. 3), . nous avons défini les sites de restriction appropriés afin d'obtenir un fragment d'ADN minimum, pouvant contenir l'intégralité de gène de la laccase, et qui sont susceptibles de servir à
amplifier les extrémités 5' et 3' manquantes. Un Southern blot a été effectué avec l'ADN
génomique de P. cinnabaf°inus avec les enzymes, BamHI, EcoRI, Pstl, PvuII, SacI, SmaI and Xba I
et a permis de sélectionner Pstl qui donne une bande de 3.5 kpb par digestion de l'ADN
génomiqué. Afin d'amplifier les parties manquantes du gène, une technique de PCR
inverse a été utilisée avec un mélange de PCR contenant des amorces nucléotidiques spécifiques de la partie centrale précédemment isolée et de l'ADN génomique de P.
cinnabaYinus. La réaction de PCR est effectuée avec 150 ng d'ADN coupé par Pstl et recircularisé sur lui-même par ligation et les amorces nucléotidiques Fex (SEQ ID NO : ~ ; GGATAACTACTGGATCCGCG) et Rex (SEQ ID NO : 9 ;
CGCAGTATTGCGTGGAGAG). Les conditions de la réaction sont les suivantes : 5 cycles de 94 °C, 5 min; 55 °C, 30 s; et 72 °C, 5 min;
puis 25 cycles of 94 °C, 30 s;
55 °C, 30 s, et 72 °C, 4 min avec une étape finale de 10 min à
72 °C. Le fragment d'ADN amplifié correspond à une bande de 2,7 kpb qui a été cloné dans pGEM-T
et séquencé.
L'intégralité du gène codant pour la laccase a été ensuite définie en combinant la partie centrale et les parties 5' et 3' amplifiées. Afin de ~ vérifier cette séquence, l'intégralité du gène a été amplifié (3,331 kpb, Fig. 4) avec les amorces nucléotidiques Fin (SEQ D~ NO : 10 ; GACATCTGGAGCGCCTGTC) et Rin (SEQ ID NO : 11 ;
ATCGAAGGTTCCGATGACTGACATGAC) à partir de l'ADN génomique de P. cir~nabarinus. Ce gène a été également cloné à partir de l'ADN génomique de P. cinnaba~°inus ss3 et s'est avéré être identique à celui isolé chez P. cinnabarinus I-937.
~') Construction du vecteu3° d'expression utilisant le promoteur du gène de la laccase A partir de la séquence du gène de la laccase, les Inventeurs ont cloné le promoteur de ce gène en utilisant la même stratégie employée précédemment pour l'isolement du gène, c'est-à-dire avec une technique de PCR inverse sur un fragment d'ADN génomique (3,5 kpb) coupé cette fois-ci par l'enzyme de restriction BgIII (Fig.
5). Deux mille cinq cent vingt sept kpb en avant du gène de la laccase ont été
ainsi cloné
par PCR inverse et séquencé. Ce promoteur a été placé dans un vecteur une résistance à
l'ampicilline pour son sous-clonage dans la bactérie et une résistance à la phléomycine utilisé comme marqueur de sélection dans le champignon. Un terminateur du gène codant pour l'hydrophobine sc3 de Sc7aizophyllum commune a été placé en aval afm de terminer l'étape de transcription. Ce vecteur appelé pELP sera utilisé pour l'expression homologue de la laccase (Fig. 6). Deux autres promoteurs hétérologues ont été
utilisés dans cette étude. Ce sont les promoteurs des gènes codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (gpd) et l'hydrophobine (sc3) de Schizophyllum commune (Fig. 6), constituant respectivement les vecteurs d'expression pEGT et pESC.
L'intégralité des séquences nucléotidiques de vecteurs pEGT (SEQ ID NO : 12), pESC
(SEQ ID NO : 13), et pELP (SEQ ID NO : 14), se trouvent dans les figures 7, ~
et 9 avec les positions du promoteur, du marqueur de sélection et du terminateur.
III) Transformation de la souche monocaryotique avec les vecteurs d'expression (modèle d'étude : la laccase de.Pycnoporus cinnabarinus) 1) Préparation du mycélium pour l'obtention de protoplastes Un quart d'une colonie cultivée en milieu solide (10 jours) est homogénéisé
avec un mixeur (type Ultraturax, vitesse lente) pendant une minute dans 50 ml de milieu YM
(par litre : glucose 10 g, peptone 5 g, extrait de levure 3 g, extrait de malt 3 g). Le broyat est transféré dans un erlenmeyer de 250 ml stérile où l'on rajoute50 ml de milieu YM, puis incubé à 30°C et sous agitation (225 rpm) pendant 20 heures.
La culture est une nouvelle fois homogénéisée pendant 1 min (vitesse lente) et on rajoute 100 ml de milieu YM. Le broyat est transféré dans un erlenmeyer de 500 ml et mis en culture pendant une nuit à 30°C.
2) Préparation des protoplastes La culture de champignon est centrifugée pendant 10 min à 2000 rpm dans un rotor oscillant (tube de 50 ml). Seize g (poids humide) sont lavés dans 40 ml d'une solution de MgS04 0,5 M ou de saccharose 0,5 M. Dans le cas de l'utilïsation du saccharose, l'enzyme lytique utilisée pour digérer les parois est diluée dans le saccharose. Le mycélium est ensuite centrifugé 10 min à 2000 rpm et le surnageant éliminé. Concernant la lyse des parois fongiques, on ajoute au mycéliurn provenant de 50 ml de culture, 10 ml d'enzyme lytique (Glucanex, Sigma) dilué à 1 mg/ml dans une solution de MgS04 0,5 M . La digestion se fait dans un erlenmeyer de 500 ml à
30°C
sous faible agitation pendant 3 à 4 heures. Pendant cette incubation, l'apparition des protoplastes est contrôlée au microscope. Dix ml d'eau stérile sont rajoutés, puis mélangés délicatement. Les protoplastes sont laissés 10 min, le temps que l'équilibre avec l'eau se fasse (les protoplastes vont flotter à la surface). Ils sont ensuite centrifugés min à 2000 rpm dans un rotor oscillant. Le surnageant contenant les protoplastes est transféré délicatement dans un nouveau de 50 ml. Le culot restant peut-être re-incubé
avec 25 ml d'une solution de MgS04 O,SM pour récûpérer le maximum de protoplastes (on répéte alors l'étape de centrifugation). Un volume de sorbitol 1 M, égal à
celui de la préparation des protoplastes, lui est rajouté. Pendant 10 min, on laisse les protoplastes relarguer l'eau. Cette préparation est ensuite centrifugée 10 min à 2000 rpm.
Le surnageant est éliminé, tout en laissant un peu de sorbitol. Les protoplastes sont transférés dans un nouveau tube. Le précédent tube est rincé avec la solution de sorbitol 1M et les protoplastes récupérés, ajoutés dans le nouveau tube. Les protoplastes sont comptés et centrifugés 10 min à 2000 rpm. Ils sont ensuite dilués à une concentration de 2. I07 protoplastes par ml dans la solution de sorbitol 1M. Une solution de CaCl2 à 0,5 M (1/10) est rajoutée aux protoplastes.
3) Trarasforrrzation des protoplastes Pour la transformation, 100 ~l de protoplastes sont transformés avec 5 à 10 ~,g de vecteur (volume maximum de 10 ~.1) dans un tube stérile de 10 rnl. Ils sont alors incubés 10 à 15 min dans la glace. Un volume d'une solution de PEG 4000 à 40%
est ajouté, puis mélangé et les protoplastes sont incubés 5 min à température ambiante.
Deux et demi ml de milieu de régénération (pour 100 ml : glucose 2 g, MgS04,7HZO
12,5 g, KH2PO4 0,046 g, K2HPO4 0,1 g, bacto peptone 0,2 g, extrait de levure 0,2 g) sont rajoutés aux protoplastes qui sont incubés une nuit à 30°C. Des boites de sélection (milieu YM contenant de la phléomycine à 7 ~g/rnl , boites carrées) sont préchauffées à
37°C. Sept et demi ml d'un mélange de top agar (Low Melting Point agarose 1% dilué
dans un milieu YM contenant de la phléomycine 7 à 10 ~,g/ml) sont ajoutés au milieu de régénération contenant les protoplastes et sont versés sur les boites de sélection préchauffées. Quand la solution de top agar s'est solidifiée, les boites sont incubées à
30°C pendant 4 jours. Les transformants sont alors transférés sur de nouvelles boites de sélection.
4) Ciblage des transforrraarits A partir de 16 g de mycélium, on obtient généralement de l'ordre de 1 à 2.107 protoplastes. Le pourcentage de régénération est de IO %. Concernant le vecteur pESC, les monokaryons ont été transformés avec le vecteur contenant le cDNA (BRFM
472, 473 et 474) ou le gène codant pour la laccase de P. cirzriabar~i~us (BRFM 470 et 471) (Fig. 10). En parallèle, d'autres monokaryons ont été transformés avec les promoteurs pEGT (GPDl 1, 12 et I3) ou avec le vecteur pELP (12.3, 12.7 et 12.x) contenant le gène codant pour la laccase (Fig. 10). Au vu des résultats deux transformants se dégagent du lot avec des activités équivalentes, les transformants 12.7 et GPD 14. L' activité au cours du temps a été suivie pour les transformants GPD14 et12.7 (Fig. 11).
L'activité est détectable à partir de 3-4 jours et augmentent jusqu'à 12 jours pour atteindre approximativement 1200 nkatal/ml soit 72000 U/1 avec ajout d'éthanol dans le milieu de culture.
Légende des figures Figure 1 : Isolement de souche monocaryotique déficiente pour l' activité
laccase.
Figure 2 : Isolement du gène codant pour la laccase de Pycnopof~us ci~anabarinus laccase.
Figure 3 : Etude en Southern blot du gène codant pour la laccase de Pycnoporus cinhaba~°inus.
Figure 4 : Séquence du gène codant pour la laccase de Pycnoporus cifzuabarinus.
Figure 5 : Séquence de la séquence promotrice pLac du gène codant pour la laccase de Pychopof~us cifanabaf~ifzus (jusqu'à l'ATG codant pour la méthionine de la laccase).
Figure 6 : Carte physique des trois vecteurs d'expression pEGT, pESC, pELP, utilisés pour la production de la laccase chez Pycnoporus cinnabarinus.
Figure 7 : Séquence nucléotidique du vecteur pEGT, contenant le promoteur du gène gpd (4480-5112), un marqueur de résistance à la phléomycine (507-1822) et le terminateur du gène ~sc3 (71-507).
Figure 8 : Séquence nucléotidique du vecteur pESC, contenant le promoteur du gène sc3 (1-1033), un marqueur de résistance à la phléomycine (1540-2855) et le terminateur du gène sc3 (1104-1540).
Figure 9 : Séquence nucléotidique du vecteur pELP, contenant le promoteur du gène laccase (4457-6983), un marqueur de résistance à la phléomycine (507-1822) et le terminateur du gène sc3 (71-507) Figure 10 : Résultats de production des transformants présentant les activités les plus importantes. La culture a été effectuée avec ou sans (témoin) éthanol.
Figure 11 : Suivi des activités laccase des transformants GPD 14 et 12.7 en fonction du temps avec ou (témoin) sans éthanol.
Figure 12 : Séquence du gène codant pour la laccase d'halocyphina villosa.
DEMANDES OU BREVETS VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVETS
COMPRI~:ND PLUS D'UN TOME.
CECI EST L,E TOME 1 DE 2 NOTE: Pour les tomes additionels, veillez contacter le Bureau Canadien des Brevets.
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THAN ONE VOLUME.
NOTE: For additional valumes please contact the Canadian Patent Office.
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par PCR inverse et séquencé. Ce promoteur a été placé dans un vecteur une résistance à
l'ampicilline pour son sous-clonage dans la bactérie et une résistance à la phléomycine utilisé comme marqueur de sélection dans le champignon. Un terminateur du gène codant pour l'hydrophobine sc3 de Sc7aizophyllum commune a été placé en aval afm de terminer l'étape de transcription. Ce vecteur appelé pELP sera utilisé pour l'expression homologue de la laccase (Fig. 6). Deux autres promoteurs hétérologues ont été
utilisés dans cette étude. Ce sont les promoteurs des gènes codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (gpd) et l'hydrophobine (sc3) de Schizophyllum commune (Fig. 6), constituant respectivement les vecteurs d'expression pEGT et pESC.
L'intégralité des séquences nucléotidiques de vecteurs pEGT (SEQ ID NO : 12), pESC
(SEQ ID NO : 13), et pELP (SEQ ID NO : 14), se trouvent dans les figures 7, ~
et 9 avec les positions du promoteur, du marqueur de sélection et du terminateur.
III) Transformation de la souche monocaryotique avec les vecteurs d'expression (modèle d'étude : la laccase de.Pycnoporus cinnabarinus) 1) Préparation du mycélium pour l'obtention de protoplastes Un quart d'une colonie cultivée en milieu solide (10 jours) est homogénéisé
avec un mixeur (type Ultraturax, vitesse lente) pendant une minute dans 50 ml de milieu YM
(par litre : glucose 10 g, peptone 5 g, extrait de levure 3 g, extrait de malt 3 g). Le broyat est transféré dans un erlenmeyer de 250 ml stérile où l'on rajoute50 ml de milieu YM, puis incubé à 30°C et sous agitation (225 rpm) pendant 20 heures.
La culture est une nouvelle fois homogénéisée pendant 1 min (vitesse lente) et on rajoute 100 ml de milieu YM. Le broyat est transféré dans un erlenmeyer de 500 ml et mis en culture pendant une nuit à 30°C.
2) Préparation des protoplastes La culture de champignon est centrifugée pendant 10 min à 2000 rpm dans un rotor oscillant (tube de 50 ml). Seize g (poids humide) sont lavés dans 40 ml d'une solution de MgS04 0,5 M ou de saccharose 0,5 M. Dans le cas de l'utilïsation du saccharose, l'enzyme lytique utilisée pour digérer les parois est diluée dans le saccharose. Le mycélium est ensuite centrifugé 10 min à 2000 rpm et le surnageant éliminé. Concernant la lyse des parois fongiques, on ajoute au mycéliurn provenant de 50 ml de culture, 10 ml d'enzyme lytique (Glucanex, Sigma) dilué à 1 mg/ml dans une solution de MgS04 0,5 M . La digestion se fait dans un erlenmeyer de 500 ml à
30°C
sous faible agitation pendant 3 à 4 heures. Pendant cette incubation, l'apparition des protoplastes est contrôlée au microscope. Dix ml d'eau stérile sont rajoutés, puis mélangés délicatement. Les protoplastes sont laissés 10 min, le temps que l'équilibre avec l'eau se fasse (les protoplastes vont flotter à la surface). Ils sont ensuite centrifugés min à 2000 rpm dans un rotor oscillant. Le surnageant contenant les protoplastes est transféré délicatement dans un nouveau de 50 ml. Le culot restant peut-être re-incubé
avec 25 ml d'une solution de MgS04 O,SM pour récûpérer le maximum de protoplastes (on répéte alors l'étape de centrifugation). Un volume de sorbitol 1 M, égal à
celui de la préparation des protoplastes, lui est rajouté. Pendant 10 min, on laisse les protoplastes relarguer l'eau. Cette préparation est ensuite centrifugée 10 min à 2000 rpm.
Le surnageant est éliminé, tout en laissant un peu de sorbitol. Les protoplastes sont transférés dans un nouveau tube. Le précédent tube est rincé avec la solution de sorbitol 1M et les protoplastes récupérés, ajoutés dans le nouveau tube. Les protoplastes sont comptés et centrifugés 10 min à 2000 rpm. Ils sont ensuite dilués à une concentration de 2. I07 protoplastes par ml dans la solution de sorbitol 1M. Une solution de CaCl2 à 0,5 M (1/10) est rajoutée aux protoplastes.
3) Trarasforrrzation des protoplastes Pour la transformation, 100 ~l de protoplastes sont transformés avec 5 à 10 ~,g de vecteur (volume maximum de 10 ~.1) dans un tube stérile de 10 rnl. Ils sont alors incubés 10 à 15 min dans la glace. Un volume d'une solution de PEG 4000 à 40%
est ajouté, puis mélangé et les protoplastes sont incubés 5 min à température ambiante.
Deux et demi ml de milieu de régénération (pour 100 ml : glucose 2 g, MgS04,7HZO
12,5 g, KH2PO4 0,046 g, K2HPO4 0,1 g, bacto peptone 0,2 g, extrait de levure 0,2 g) sont rajoutés aux protoplastes qui sont incubés une nuit à 30°C. Des boites de sélection (milieu YM contenant de la phléomycine à 7 ~g/rnl , boites carrées) sont préchauffées à
37°C. Sept et demi ml d'un mélange de top agar (Low Melting Point agarose 1% dilué
dans un milieu YM contenant de la phléomycine 7 à 10 ~,g/ml) sont ajoutés au milieu de régénération contenant les protoplastes et sont versés sur les boites de sélection préchauffées. Quand la solution de top agar s'est solidifiée, les boites sont incubées à
30°C pendant 4 jours. Les transformants sont alors transférés sur de nouvelles boites de sélection.
4) Ciblage des transforrraarits A partir de 16 g de mycélium, on obtient généralement de l'ordre de 1 à 2.107 protoplastes. Le pourcentage de régénération est de IO %. Concernant le vecteur pESC, les monokaryons ont été transformés avec le vecteur contenant le cDNA (BRFM
472, 473 et 474) ou le gène codant pour la laccase de P. cirzriabar~i~us (BRFM 470 et 471) (Fig. 10). En parallèle, d'autres monokaryons ont été transformés avec les promoteurs pEGT (GPDl 1, 12 et I3) ou avec le vecteur pELP (12.3, 12.7 et 12.x) contenant le gène codant pour la laccase (Fig. 10). Au vu des résultats deux transformants se dégagent du lot avec des activités équivalentes, les transformants 12.7 et GPD 14. L' activité au cours du temps a été suivie pour les transformants GPD14 et12.7 (Fig. 11).
L'activité est détectable à partir de 3-4 jours et augmentent jusqu'à 12 jours pour atteindre approximativement 1200 nkatal/ml soit 72000 U/1 avec ajout d'éthanol dans le milieu de culture.
Légende des figures Figure 1 : Isolement de souche monocaryotique déficiente pour l' activité
laccase.
Figure 2 : Isolement du gène codant pour la laccase de Pycnopof~us ci~anabarinus laccase.
Figure 3 : Etude en Southern blot du gène codant pour la laccase de Pycnoporus cinhaba~°inus.
Figure 4 : Séquence du gène codant pour la laccase de Pycnoporus cifzuabarinus.
Figure 5 : Séquence de la séquence promotrice pLac du gène codant pour la laccase de Pychopof~us cifanabaf~ifzus (jusqu'à l'ATG codant pour la méthionine de la laccase).
Figure 6 : Carte physique des trois vecteurs d'expression pEGT, pESC, pELP, utilisés pour la production de la laccase chez Pycnoporus cinnabarinus.
Figure 7 : Séquence nucléotidique du vecteur pEGT, contenant le promoteur du gène gpd (4480-5112), un marqueur de résistance à la phléomycine (507-1822) et le terminateur du gène ~sc3 (71-507).
Figure 8 : Séquence nucléotidique du vecteur pESC, contenant le promoteur du gène sc3 (1-1033), un marqueur de résistance à la phléomycine (1540-2855) et le terminateur du gène sc3 (1104-1540).
Figure 9 : Séquence nucléotidique du vecteur pELP, contenant le promoteur du gène laccase (4457-6983), un marqueur de résistance à la phléomycine (507-1822) et le terminateur du gène sc3 (71-507) Figure 10 : Résultats de production des transformants présentant les activités les plus importantes. La culture a été effectuée avec ou sans (témoin) éthanol.
Figure 11 : Suivi des activités laccase des transformants GPD 14 et 12.7 en fonction du temps avec ou (témoin) sans éthanol.
Figure 12 : Séquence du gène codant pour la laccase d'halocyphina villosa.
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Claims (20)
1. Procédé de préparation d'une protéine recombinante déterminée, ledit procédé
étant effectué par surexpression du gène codant pour cette protéine déterminée dans une souche monocaryotique de champignons filamenteux de l'espèce Pychoporus du groupe basidiomycète, et comprend:
- une étape de mise en culture de la souche monocaryotique de Pycrzoporus susmentionnée, ladite souche étant transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine recombinante déterminée, dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur correspondant à un promoteur endogène des champignons susmentionnés, ou d'un promoteur différent (encore désigné
promoteur exogène), ledit promoteur étant constitutif ou inductible, - le cas échéant une étape d'induction du promoteur susmentionné, lorsque celui-ci est inductible, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la protéine recombinante déterminée, produite dans le milieu de culture.
étant effectué par surexpression du gène codant pour cette protéine déterminée dans une souche monocaryotique de champignons filamenteux de l'espèce Pychoporus du groupe basidiomycète, et comprend:
- une étape de mise en culture de la souche monocaryotique de Pycrzoporus susmentionnée, ladite souche étant transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine recombinante déterminée, dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur correspondant à un promoteur endogène des champignons susmentionnés, ou d'un promoteur différent (encore désigné
promoteur exogène), ledit promoteur étant constitutif ou inductible, - le cas échéant une étape d'induction du promoteur susmentionné, lorsque celui-ci est inductible, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la protéine recombinante déterminée, produite dans le milieu de culture.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche monocaryotique de Pycnoporus utilisée pour la surexpression du gène codant pour la protéine recombinante déterminée est telle qu'obtenue par mise en culture de la souche dicaryotique d'origine à 30°C dans le noir pendant 15 jours, suivie d'une étape d'exposition au jour 2 à 3 semaines à température ambiante jusqu'à la formation d'organes de fructification correspondant à des hyphes différenciées appelées basides, au sein desquels a alors lieu la caryogamie, suivie de la méiose qui conduit à
la formation de quaire spores sexuées, ou basidiospores haploïdes génétiquement différentes, qui, après germination, engendre un mycélium monocaryotique.
la formation de quaire spores sexuées, ou basidiospores haploïdes génétiquement différentes, qui, après germination, engendre un mycélium monocaryotique.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la souche monocaryotique de Pycnoporus utilisée est une souche de Pycnoporus cinnabarinus.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les protéines recombinantes déterminées suréxprimées correspondent à des protéines endogènes de Pycnoporus, ou à des protéines exogènes, notamment à des protéines exogènes correspondant à des protéinés endogènes de basidiomycètes autres que Pycnoporus, telles que les enzymes basidiomycètes intervenant dans les biotransformations végétales, ou correspondant à des protéines endogènes de souches de Pycnoporus différentes de la souche de Pycnoporus utilisée pour la production desdites protéines.
5. Procédé selon fane des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les protéines recombinantes déterminées correspondent:
- aux protéines endogènes de Pycnoporus suivantes:
* les métalloenzymes, telles que la laccase, ou la tyrosinase, * ou la cellobiose déshydrogénase, la xylanase, la .beta.-glycosidase, l'invertase, ou l'.alpha.-amylase, - aux protéines exogènes choisies parmi les suivantes:
* les tyrosinases de souches de Pycnoporus différentes de la souche de Pycnoporus utilisée pour la production desdites protéines, telle que la tyrosinase de Pycnoporus sanguineus lorsque la souche de Pycnoporus utilisée pour la production de cette tyrosinase est différente de Pycnoporus sanguiraeus, * les laccases de basidiomycètes autres que Pycnoporus, telle que la laccase d'halocyphina villosa (basidiomycète halophile), * les cinnamoyl estérases A et B d'Aspergillus piger.
- aux protéines endogènes de Pycnoporus suivantes:
* les métalloenzymes, telles que la laccase, ou la tyrosinase, * ou la cellobiose déshydrogénase, la xylanase, la .beta.-glycosidase, l'invertase, ou l'.alpha.-amylase, - aux protéines exogènes choisies parmi les suivantes:
* les tyrosinases de souches de Pycnoporus différentes de la souche de Pycnoporus utilisée pour la production desdites protéines, telle que la tyrosinase de Pycnoporus sanguineus lorsque la souche de Pycnoporus utilisée pour la production de cette tyrosinase est différente de Pycnoporus sanguiraeus, * les laccases de basidiomycètes autres que Pycnoporus, telle que la laccase d'halocyphina villosa (basidiomycète halophile), * les cinnamoyl estérases A et B d'Aspergillus piger.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, de préparation de protéines recombinantes déterminées correspondant aux protéines endogènes de Pycnoporus, caractérisé en ce que la souche monocaryotique de Pycnoporus utilisée est déficiente pour le gène codant pour la protéine endogène à laquelle correspond la protéine recombinante déterminée.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, de préparation de protéines recombinantes déterminées correspondant aux protéines endogènes de Pycnoporus, caractérisé en ce que la souche monocaryotique de Pycnoporus utilisée est transformée -à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour la protéine recombinante déterminée marquée, notamment par un marqueur histidine.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, de préparation de laccases recombinantes correspondant aux laccases endogènes de Pycnoporus, caractérisé
en ce qu'il comprend:
- une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pychoporus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour une laccase de Pycnoporus, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur correspondant au promoteur endogène de cette laccase, - une étape d'induction du promoteur susmentionné, notamment par addition d'éthanol, ou de sous-produits agricoles contenant de la lignocellulose comme la paille de blé, les sons de maïs et la pulpe de betterave, ou des composés à cycle aromatique comme la 2,5-xylidine, l'acide vératrylique, le guaïcol, l'alcool vératrylique, la syringaldazine, l'acide férulique, l'acide caféique et les lignosulfonates, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus susmentionnée produite dans le milieu de culture.
en ce qu'il comprend:
- une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pychoporus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour une laccase de Pycnoporus, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur correspondant au promoteur endogène de cette laccase, - une étape d'induction du promoteur susmentionné, notamment par addition d'éthanol, ou de sous-produits agricoles contenant de la lignocellulose comme la paille de blé, les sons de maïs et la pulpe de betterave, ou des composés à cycle aromatique comme la 2,5-xylidine, l'acide vératrylique, le guaïcol, l'alcool vératrylique, la syringaldazine, l'acide férulique, l'acide caféique et les lignosulfonates, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus susmentionnée produite dans le milieu de culture.
9. Procédé selon la revendication 8, de préparation de la laccase recombinante correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus représentée par SEQ
ID NO : 2, caractérisé en ce qu'il comprend:
- une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarimus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ ID NO : 2, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase susmentionnée, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ ID
NO : 3, - une étape d'induction par l'éthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ ID NO : 2 produite dans le milieu de culture.
ID NO : 2, caractérisé en ce qu'il comprend:
- une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarimus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ ID NO : 2, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase susmentionnée, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ ID
NO : 3, - une étape d'induction par l'éthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ ID NO : 2 produite dans le milieu de culture.
10. Procédé de préparation de laccases recombinantes correspondant aux laccases endogènes de Pycnoporus selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend:
- une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus, transformée à (aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour une laccase de Pycnoporus, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur exogène choisi parmi :
* le promoteur gpd de l'expression du gène codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate déhydrogénase de Schizophyllum commune, dont la séquence nucléotidique est représentée par SEQ ID NO : 4, * ou le promoteur sc3 de l'expression du gène codant pour l'hydrophobine de Schizophyllum commune, dont la séquence nucléotidique est représentée par SEQ ID NO : 5, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus susmentionnée produite dans le milieu de culture.
- une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus, transformée à (aide d'un vecteur d'expression contenant le gène codant pour une laccase de Pycnoporus, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle d'un promoteur exogène choisi parmi :
* le promoteur gpd de l'expression du gène codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate déhydrogénase de Schizophyllum commune, dont la séquence nucléotidique est représentée par SEQ ID NO : 4, * ou le promoteur sc3 de l'expression du gène codant pour l'hydrophobine de Schizophyllum commune, dont la séquence nucléotidique est représentée par SEQ ID NO : 5, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, correspondant à la laccase endogène de Pycnoporus susmentionnée produite dans le milieu de culture.
11. Procédé selon la revendication 10, de préparation de la laccase recombinante correspondant à la laccase endogène de Pycnoponus cinnabarinus représentée par SEQ
ID NO : 2, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pychoporus cinnabarinus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ
ID NO : 2 le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur exogène gpd ou sc3, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ ID NO : 2 produite dans le milieu de culture.
ID NO : 2, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pychoporus cinnabarinus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ
ID NO : 2 le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur exogène gpd ou sc3, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ ID NO : 2 produite dans le milieu de culture.
12. Procédé selon fane des revendications 1 à 5, de préparation de tyrosinase recombinante correspondant à la tyrosinase de Pychoporus sanguineus représentée par SEQ ID NO : 16, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarinus transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 15 codant pour la tyrosinase recombinante représentée par SEQ ID NO : 16, le cas échéant marquée, la séquence SEQ ID NO : 15 étant avantageusement précédée par la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 128 et 190 de SEQ ID NO : 1 codant pour le peptide signal de Pycnoporus cinnabarinus délimité par les 21 premiers aminoacides de SEQ ID NO
: 2, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase de Pycnoporus cinnabarinus, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ ID NO : 3, - une étape d'induction par l'éthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la tyrosinase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ ID NO : 16 produite dans le milieu de culture.
- une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pycnoporus cinnabarinus transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 15 codant pour la tyrosinase recombinante représentée par SEQ ID NO : 16, le cas échéant marquée, la séquence SEQ ID NO : 15 étant avantageusement précédée par la séquence nucléotidique délimitée par les nucléotides situés aux positions 128 et 190 de SEQ ID NO : 1 codant pour le peptide signal de Pycnoporus cinnabarinus délimité par les 21 premiers aminoacides de SEQ ID NO
: 2, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase de Pycnoporus cinnabarinus, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ ID NO : 3, - une étape d'induction par l'éthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la tyrosinase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ ID NO : 16 produite dans le milieu de culture.
13. Procédé selon fane des revendications 1 à 5, de préparation de laccase recombinante correspondant à la laccase d'halocyphirca villosa représentée sur la figure 12 (SEQ ID NO : 18), caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pychoporus cinraabariraus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique représentée sur la figure 12 (SEQ ID NO : 17) codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ ID NO : 18, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase de Pycnoporus cinnabarinus, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ ID NO : 3, - une étape d'induction par l'éthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ ID NO : 18 produite dans le milieu de culture.
- une étape de mise en culture d'une souche monocaryotique de Pychoporus cinraabariraus, le cas échéant déficiente pour le gène codant pour la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus, transformée à l'aide d'un vecteur d'expression contenant la séquence nucléotidique représentée sur la figure 12 (SEQ ID NO : 17) codant pour la laccase recombinante représentée par SEQ ID NO : 18, le cas échéant marquée, et dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac correspondant au promoteur endogène de la laccase de Pycnoporus cinnabarinus, la séquence dudit promoteur pLac étant représentée par SEQ ID NO : 3, - une étape d'induction par l'éthanol du promoteur pLac susmentionné, - la récupération, et, le cas échéant, la purification de la laccase recombinante, le cas échéant marquée, représentée par SEQ ID NO : 18 produite dans le milieu de culture.
14. Séquence nucléotidique codant pour le promoteur pLac de la laccase endogène de Pycnoporus cinnabarinus, et correspondant à la séquence SEQ ID NO : 3, ou toute séquence dérivée de ce promoteur par substitution, addition ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides et conservant la propriété d'être un promoteur de l'expression de séquences.
15. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID
NO: 3 du promoteur pLac selon la revendication 14.
NO: 3 du promoteur pLac selon la revendication 14.
16. Vecteur d'expression selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend un gène codant pour une protéine recombinante déterminée, et dont (expression est placée sous le contrôle du promoteur pLac selon la revendication 14.
17. Vecteur d'expression selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que la protéine recombinante déterminée est une protéine correspondant :
- aux protéines endogènes de Pycnoporus suivantes :
* les métalloenzymes, telles que la laccase, ou la tyrosinase, * ou la cellobiose déshydrogénase, la xylanase, la .beta.-glycosidase, l'invertase, ou l'alpha.-amylase, - aux protéines exogènes choisies parmi les suivantes :
* les tyrosinases de souches de Pycnoporus différentes de la souche de Pycnoporus utilisée pour la production desdites protéines, telle que la tyrosinase de Pycnoporus sanguineus lorsque la souche de Pycnoporus utilisée pour la production de cette tyrosinase est différente de Pycnoporus sanguineus, * les laccases de basidiomycètes autres que Pycnoporus, telle que la laccase d'halocyphina villosa (basidiomycète halophile), * les cinnamoyl estérases A et B d'Aspergillus piger.
- aux protéines endogènes de Pycnoporus suivantes :
* les métalloenzymes, telles que la laccase, ou la tyrosinase, * ou la cellobiose déshydrogénase, la xylanase, la .beta.-glycosidase, l'invertase, ou l'alpha.-amylase, - aux protéines exogènes choisies parmi les suivantes :
* les tyrosinases de souches de Pycnoporus différentes de la souche de Pycnoporus utilisée pour la production desdites protéines, telle que la tyrosinase de Pycnoporus sanguineus lorsque la souche de Pycnoporus utilisée pour la production de cette tyrosinase est différente de Pycnoporus sanguineus, * les laccases de basidiomycètes autres que Pycnoporus, telle que la laccase d'halocyphina villosa (basidiomycète halophile), * les cinnamoyl estérases A et B d'Aspergillus piger.
18. Cellule hôte transformée à l'aide d'un vecteur d'expression selon l'une des revendications 15 à 17.
19. Cellule hôte selon la revendication 18, correspondant à des cellules monocaryotiques de souches de Pycnoporus, telles que les souches de Pycnoporus cinnabarinus.
20. Utilisation de vecteurs d'expression selon l'une des revendications 15 à
17, ou de cellules hôtes selon la revendication 18 ou 19, pour la mise en oeuvre d'un procédé
de surproduction d'une protéine recombinante déterminée selon l'une des revendications 1 à 13.
17, ou de cellules hôtes selon la revendication 18 ou 19, pour la mise en oeuvre d'un procédé
de surproduction d'une protéine recombinante déterminée selon l'une des revendications 1 à 13.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EEER | Examination request | ||
| FZDE | Discontinued |
Effective date: 20150921 |