CN1321196A - 脂肪酸氢过氧化物裂合酶的核酸序列 - Google Patents

脂肪酸氢过氧化物裂合酶的核酸序列 Download PDF

Info

Publication number
CN1321196A
CN1321196A CN99801459A CN99801459A CN1321196A CN 1321196 A CN1321196 A CN 1321196A CN 99801459 A CN99801459 A CN 99801459A CN 99801459 A CN99801459 A CN 99801459A CN 1321196 A CN1321196 A CN 1321196A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
lyase
hpo lyase
plant
hpo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN99801459A
Other languages
English (en)
Inventor
松井健二
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monsanto Co
Original Assignee
Calgene LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Calgene LLC filed Critical Calgene LLC
Publication of CN1321196A publication Critical patent/CN1321196A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及植物氢过氧化物裂合酶或称HPO裂合酶多核苷酸和多肽。本文对在细胞中表达植物HPO裂合酶有用的DNA构建体进行了描述。此外,本文也对在细胞中反义表达植物HPO裂合酶有用的DNA构建体进行了描述。这样的构建体将包含在调节元件控制下编码目的植物HPO裂合酶的DNA序列,所说的调节元件在所说构建体在转基因植物中表达时,能够在植物组织中优先指导植物HPO裂合酶表达。本发明也涉及利用编码植物HPO裂合酶的DNA序列在植物组织中修饰挥发性醛类的方法,以及增加植物抗病性的方法。

Description

脂肪酸氢过氧化物裂合酶的核酸序列
概述
本申请要求美国临时申请60/090,924(1998年6月26日申请)，美国临时申请60/121,965(1999年2月26日申请)，美国临时申请60/121,968(1999年2月26日申请)的优先权。
技术领域
本发明涉及基因工程技术在植物中的应用，更具体地说，本发明涉及植物氢过氧化物裂合酶序列和利用这些序列的方法。
背景
随着基因工程技术的发展，现在把基因从各种各样有机体转移到大量不同植物品种的基因组是可能的。这一方法具有超过植物育种技术的许多优点，因为现在可以将基因从一种植物品种转移到另一种植物品种，而不只是简单地在相同的或虽不同但密切相关的品种之间进行转移。
多不饱和脂肪酸的降解由多不饱和脂肪酸顺-顺双键上的氧合开始。这一反应由植物，动物和微生物中存在的脂氧合酶(EC1.13.11.12)催化。氧合产物，称为脂肪酸氢过氧化物，是植物中许多重要激素(例如lipoxins，茉莉酮酸，愈伤酸)和香料/香味分子(例如3-己烯醇，L-辛烯-3-醇)的前体。
一些化合物(如茉莉酮酸)是由氢过氧化物(如13-氢过氧亚麻酸)经丙二烯氧化物合酶(被称作AOS)和丙二烯氧化物环化酶(被称作ACS)-依赖途径产生的。茉莉酮酸牵涉到经类硬脂酸(octadecanoid)途径的压力和抗病性信号反应。13-氢过氧亚麻酸也可以由过氧化酶催化形成角质单体。
此外，13-氢过氧亚麻酸可以由氢过氧化物裂合酶催化最终形成挥发性醛类和愈伤酸。
脂肪酸氢过氧化物裂合酶(HPO裂合酶)催化在多不饱和脂肪酸氢过氧化物中的碳-碳键的切割，产生短链醛类和ω-氧代酸(Vick等(1976)，植物生理，57:780-788)。脂肪酸氢过氧化物的裂解产物，如短链挥发性醛类普遍存在于植物品种中。短链挥发性醛类对多种植物叶，蔬菜和水果中的″绿色标记″有贡献。″绿色标记″是挥发性分子，其对可食用植物组织的味道和香味的感官质量有贡献。这些质量经常被称作绿色的或″绿色″特征。其它短链挥发性醛类，如(3Z,6Z)-壬二烯醛醇，经脂肪酸9-氢过氧化物裂合酶(9-HPO裂合酶或9-HPOL)由脂肪酸9-氢过氧化物裂解产生，对水果和蔬菜提供瓜芳香和/或瓜香味，或有时被称作″瓜″或″新鲜″特征。这样的特征对与香味和香料有关的工业是重要的。
此外，短链醛类也被认为涉及抗病性。例如，Croft等((1993)植物生理101:13-24)前不久报道，(3Z)-己烯醇和(2E)-依维派钠水平在超敏效应期间在个别大豆植物中增加。此外，他们也指出(2E)-依维派钠是一种有效的抗菌剂。
氢过氧化物(也被称作HPO裂合酶或HPOL)的特征对进一步研究植物脂肪酸代谢系统以开发具有增加的感官性质(包括香气和香味)的转基因植物是有用的。植物机制的研究还能提供提高，控制，修饰，或以其它方式改变可食用植物组织的感官质量的方法。此外，HPO裂合酶和其产物的生理角色的阐明对进一步研究抗病性反应(如HR反应)来说是有用的，特别有兴趣的是编码蛋白质的基因的核酸序列，这些蛋白质对用于基因工程而言可能是有用的。
发明概要
本发明涉及氢过氧化物裂合酶(本文称作HPO裂合酶和HPOL)，具体地说涉及HPO裂合酶多核苷酸。本发明的多核苷酸包括来源于植物源的那些。
本发明的一个方面提供了HPO裂合酶多肽的多核苷酸。尤其是，提供了编码13-HPO裂合酶多肽的多核苷酸，并提供了编码9-HPO裂合酶多肽的多核苷酸。
本发明的一个方面涉及包含部分或完整的HPO裂合酶编码序列的寡核苷酸。
本发明另一方面提供了重组DNA构建体，其可以用于HPO裂合酶的转录或转录与翻译(表达)。尤其是，提供了在宿主细胞中能够转录或转录与翻译的构建体。优选的构建体是能够在植物细胞中转录或转录与翻译的那些。
本发明另一方面提供了在宿主细胞或其子代中生产HPO裂合酶的方法。具体而言，用可以用于HPO裂合酶的转录或转录与翻译的DNA构建体转化或转染宿主细胞。包含HPO裂合酶的重组细胞也是本发明的一部分。优选的宿主细胞包括酵母，细菌，昆虫，以及植物细胞。
本发明另一方面涉及利用多核苷酸与多肽序列修饰宿主细胞挥发物含量的方法。本发明优选的宿主细胞包括细菌，酵母，昆虫和植物宿主细胞。具有这样的改进的挥发物含量的宿主细胞也被认为在本
发明的范围内。
本发明还一方面提供了利用本发明的多核苷酸和多肽序列来产生对疾病具有改变的反应的宿主植物。
由HPO裂合酶蛋白质的表达或抑制获得的改进的宿主细胞和油也被认为是本发明的一部分。
附图简要描述
图1显示拟南芥属HPO裂合酶的完整的核苷酸序列。
图2显示甜椒HPO裂合酶与类拟南芥属HPO裂合酶序列的氨基酸序列比较。
图3显示拟南芥属丙二烯氧化物合酶与类拟南芥属HPO裂合酶序列的氨基酸序列比较。
图4显示番茄HPO裂合酶的完整的核苷酸序列。
图5显示黄瓜丙二烯氧化物合酶的完整的核苷酸序列。
图6显示黄瓜9-氢过氧化物裂合酶的完整的核苷酸序列。
图7显示甜椒，香蕉，以及拟南芥属HPO裂合酶之间的氨基酸序列的对比，高度保守肽序列被突出表示。
图8提供了甜椒HPOL(CaHPOL)，番茄果实HPOL(LeHPOL)，黄瓜下胚轴HPOL(CsC17HPOL，假基因)，拟南芥属花序HPOL(AtHPOL)，香蕉叶片HPOL(MsHPOL)，黄瓜下胚轴9-HPOL(Cs15HPOL)，银胶菊AOS(GuAOS)，亚麻子AOS(LiAOS)，以及拟南芥属AOS(AtAOS)的核苷酸序列(图8A)与氨基酸序列(图8B)的相似性百分比(右上角)与差异性百分比(右下角)。
图9显示黄瓜9-HPO裂合酶的气相色谱(GC)分析，其中利用油酸13-氢过氧化物(图9A)和油酸9-氢过氧化物(图9B)底物。
图10提供了利用油酸13-氢过氧化物和油酸9-氢过氧化物底物从大肠杆菌表达的黄瓜9-HPO裂合酶分光光度分析测定的结果。
发明详述
本发明涉及氢过氧化物裂合酶(本文称作HPO裂合酶和HPOL)，特别是编码植物来源的HPO裂合酶蛋白质的分离的HPO裂合酶核酸序列。本发明的氢过氧化物裂合酶包括编码宿主细胞来源的氨基酸序列的任何核酸序列，如多肽，其可由细胞源获得，它显示在植物酶反应条件下由脂肪酸氢过氧化物形成短链醛类和氧代酸的能力。″酶反应条件″意指任何必要的条件(即，温度，pH，缺乏抑制物质这样的因素)在环境中是可得到的，其使酶起作用。
本文使用的术语HPO裂合酶编码序列指任何多核苷酸序列，这种序列编码氢过氧化物裂合酶多肽，能够由脂肪酸产生短链醛类和氧代酸氢过氧化物。HPO裂合酶编码序列可以编码一些多肽，它们对特定的脂肪酸氢过氧化物有优先活性。特定的脂肪酸氢过氧化物包括但不限于脂肪酸13-氢过氧化物，以及脂肪酸9-氢过氧化物。
如本文所使用的，术语13-HPO裂合酶或13-HPOL指从脂肪酸13-氢过氧化物裂合酶形成短的链醛类和氧代酸13-氢过氧化物的任何酶。短链醛类的例子包括但不限于顺式3-依维派钠，氧代酸的例子包括但不限于12-氧代-(9Z)十二碳烯酸。脂肪酸13-氢过氧化物的例子包括但不限于亚麻酸13-氢过氧化物。
如本文所使用的，术语9-HPO裂合酶或9-HPOL指从脂肪酸9-氢过氧化物裂合酶形成短的链醛类和氧代酸9-氢过氧化物的任何酶。短链醛类的例子包括但不限于(3Z,6Z)-壬二烯醛，氧代酸的例子包括但不限于9-氧代-壬酸。脂肪酸9-氢过氧化物的例子包括但不限于亚麻酸9-氢过氧化物或9-氢过氧-(10E,12Z,15Z)-十八碳二烯酸。分离的蛋白质，多肽和多核苷酸
本发明的第一方面涉及分离的HPO裂合酶多核苷酸和与这样的序列密切相关的多核苷酸序列及其变体。本发明的多核苷酸序列包括编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，所说的多肽具有选自序列表中所示的一组序列的推定的氨基酸序列，
本发明提供了其全长同源于序列表中所示的各编码序列的多核苷酸序列。本发明也提供了成熟多肽或其片段的编码序列，以及读框中的成熟多肽或其片段的编码序列，其具有其它编码序列，例如编码前导或分泌序列，前-，原-，或前原-蛋白质序列的那些。多核苷酸也可以包含非编码序列，例如包括但不限于5’和3’-非编码序列，如转录未翻译的序列，终止信号，核糖体固定位点，稳定mRNA的序列，内含子，聚腺苷酸化信号，以及编码附加的氨基酸的附加编码序列。例如，可以包含标记序列，以便有利于融合多肽的纯化。本发明的多核苷酸也包括包含结构基因和控制基因表达的天然连接的序列。
本发明也包括下式的多核苷酸：
    X-(R1)n-(R2)-(R3)n-Y
其中，在5’末端，X是氢，并且在3’末端，Y是氢或金属，R1和R3是任何核酸残基，n是在1和3000之间的整数，优选地是在1和1000之间的整数，R2是本发明的核酸序列，特别是选自序列表中所示的组的核酸序列。在式中，R2的取向是其5’末端残基在左，连接到R1上，其3’末端残基在右，连接到R3上。由R基团(这里R大于1)表示的任何残基的骨架可以是杂聚物或同聚物，优选的是杂聚物。
本发明也涉及本文所描述的多核苷酸的变体，其编码本发明的多肽变体。为本发明的多核苷酸的片段的变体可以用于合成本发明的全长多核苷酸。优选的实施方案是编码这样的多肽变体的多核苷酸，其中本发明的多肽序列的5至10个、1至5个、1至3个、2个、1个或没有氨基酸残基被以任意组合取代，添加或缺失。优选的是沉默取代，添加，以及缺失，这样它们不改变多核苷酸或多肽的性质或活性。
本发明进一步优选的具体例是其全长上至少50％,60％，或70％等同于编码本发明之多肽的多核苷酸的那些，以及互补于这些多核苷酸的多核苷酸。更优选的是包含其全长上至少80％等同于编码本发明之多肽的多核苷酸的区的多核苷酸以及互补于它们的多核苷酸。在这一点上，其全长上至少90％等同的多核苷酸是特别优选的，其全长上至少95％等同的是尤其优选的。进一步地，具有至少97％等同性的那些是特别优选的，具有至少98％和99％等同性的那些是更特别优选的，具有至少99％等同性的那些是最特别优选的。
优选的具体例是这样的多核苷酸，其编码实质上保留与由序列表中所示的多核苷酸编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性的多肽。
本发明进一步涉及与上述序列杂交的多核苷酸。尤其是，本发明涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所使用的，术语“严格条件”，“严格杂交条件”意指在序列之间存在至少95％，优选的是至少97％的等同性时，杂交一般会发生。严格杂交条件的例子是在包含50％甲酰胺，5x SSC(150mMNaCl,15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6),5x Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸盐，以及20微克/升变性剪切鲑精DNA的溶液中于42℃下温育过夜，其后在约65℃下用0.1x SSC洗涤杂交支持体。其它杂交和洗涤条件是公知的，在Sambrook等，分子克隆：实验室手册，再版，冷泉港，NY(1989)中有说明，特别是在第11章。
本发明也提供了实质上由可用以下方法获得的多核苷酸组成的多核苷酸：用具有所说的多核苷酸序列或其片段的探针在严格杂交条件下筛选合适的文库(含有序列表中所示的多核苷酸序列的完整的基因)，并分离所说的多核苷酸序列。对于获得这样的多核苷酸有用的片段包括，例如，本文所描述的探针和引物。
如本文所讨论的，有关本发明的多核苷酸测定，例如，本发明的多核苷酸可以用作RNA,cDNA，或基因组DNA的杂交探针，以分离编码多肽的全长cDNAs或基因组克隆，并分离与序列表所示的多核苷酸具有高序列类似性的其它基因的cDNA或基因组克隆。这样的探针一般地包含至少15个碱基。优选的这样的探针具有至少30个碱基，可以具有至少50个碱基。特别优选的探针具有30个碱基和50个碱基之间的碱基。
通过采用序列表中提供的DNA序列合成寡核苷酸探针可以分离各基因的编码区，所说的基因包含序列表中所示的多核苷酸序列或者由它们组成。然后将具有互补于本发明的基因之序列的序列的标记寡核苷酸用于筛选cDNA，基因组DNA或mRNA，以鉴别杂交到探针上的文库的成员。例如，制备相应于HPO裂合酶EST序列的合成寡核苷酸。将该寡核苷酸用作聚合酶连锁反应(PCR)技术的引物，以获得HPO裂合酶基因的5’和3’末端序列。此外，在低简并性的寡核苷酸可以特定HPO裂合酶肽制备，这样的探针能用来直接筛选HPO裂合酶基因序列的基因文库。尤其是，筛选嗜菌体中的cDNA文库在这样的方法中是有用的，因为背景杂交是低水平的。
典型地，可从使用核酸探针获得的HPO裂合酶序列在靶HPO裂合酶序列和用作探针的编码序列之间将显示60-70％的序列等同性。然而，具有低至50-60％序列等同性的长序列也可以获得。核酸探针可以是核酸序列的长片段，或者也可以更短的寡核苷酸探针。当较长的核酸片段(大于约100bp)用作探针时，人们可以在较低的严格性下筛选，以从靶样品获得序列，其与用作探针的序列具有20-50％的差异性(即，50-80％的序列同源性)。寡核苷酸探针可以比编码HPO裂合酶的整个核酸序列短些，但是应该是至少大约10个，优选的是至少大约15个，更优选的是至少大约20个核苷酸。当使用更短的区而不是更长的区时，高度序列等同性是所需的。鉴别高度保守氨基酸序列的区以设计检测和发现其它相关HPO裂合酶基因可能是合乎需要的。较短探针对聚合酶连锁反应(PCR)来说常常是特别有用，尤其是当可以鉴别高度保守的序列时(参见，Gould等，PNAS美国(1989)86:1934-1938)。
本发明的另一方面涉及HPO裂合酶多肽。这样的多肽包括序列表中所示的多肽，以及其片段，特别是显示HPO裂合酶活性那些多肽，和那些与选自序列表中所示的组的多肽序列具有至少50％,60％或70％的等同性，优选的是至少80％的等同性，更优选的是至少90％的等同性和最优选的是至少95％的等同性的多肽，也包括这些多肽的部分，其中这样的多肽部分优选地包含至少30个氨基酸，更优选地包含至少50个氨基酸。
如本领域非常清楚的“等同性”是两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系，是由比较确定的。在本领域，“等同性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度(当由这种序列串之间匹配测定时)。“等同性”易于由已知方法计算，这些方法包括但不限于在计算分子生物学，Lesk,A.M.编，牛津大学出版社，纽约(1988)；生物计算：信息和基因组方案，Smith,D.W.编，学院出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析，第一部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编，Hamana出版社，新泽西(1994)；分子生物学中的序列分析，von Heinje,G.，学院出版社(1987)；序列分析引物，Gribskov,M.和Devereux,J.编，Stockton出版社，纽约(1991)；和Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J Applied Math,48:1073(1988)。测定等同性的方法被设计成给出待试序列之间的最大匹配。此外，确定等同性的方法以公众可获得的程序编码。可以用于确定两个序列之间的计算机程序包括但不限于GCG(Devereux,J等，核酸研究12(1):387(1984)；五个BLAST程序组，三个设计用于核苷酸序列查询(BLASTN,BLASTX和TBLASTX)，两个设计用于蛋白质序列查询(BLASTP和TBLASTN)(Coulson，生物技术潮流，12:76-80(1994)；Birren等，基因组分析，1:543-559(1997))。BLAST X程序是公众可以从NCBI和其它来源得到的(BLAST手册，Altschul,S.，等，NCBINLMNIH,Bethesda,MD 20894；Altschul,S.等，分子生物学杂志，215:403-410(1990))。公知的Simith Waterman算法也可以用于确定等同性。
用于多肽序列比较的参数典型地包括下列：
算法：Needleman和Wunsch，分子生物学杂志48:443-453(1970)
比较基准：BLOSSUM62，来自Hentikoff和Hentikoff，美国科学院院报89:10915-10919(1992)
间隔罚分：12
间隙长度罚分：4
可以与这些参数一起使用的程序是公众所获得的“gap”，其来源于遗传学计算机小组，Madison威斯康星。上述参数与末端间隙无罚分一起是肽比较的默认参数。
多核苷酸序列比较的参数包括下列：
算法：Needleman和Wunsch，分子生物学杂志48:443-453(1970)
比较基质：匹配=+10；不匹配=0
间隙罚分：50
间隙长度罚分：3
可以与这些参数一起使用的程序是公众所获得的“gap”，其来源于遗传学计算机小组，Madison威斯康星。上述参数是核酸比较的默认参数。
本发明也包括下式的多肽：
    X-(R1)n-(R2)-(R3)n-Y
其中，在氨基末端上，X是氢，在羧基末端上，Y是氢或金属，R1，和R3是任何氨基酸残基，n是在1和1000之间的整数，R2是本发明的氨基酸序列，特别是选自序列表中所示的一组序列中的氨基酸序列。在式中，R2的取向是其氨基端残基在左，连接到R1上，其羧基末端残基在右，连接到R3上。由R基团代表的氨基酸残基骨架(其中R大于1)可以是杂聚物或同聚物，优选的是杂聚物。
本发明的多肽可以是成熟蛋白质或可以是融合蛋白质的一部分。
所述多肽的片段和变体也被认为是本发明的一部分。片段是这样的变体多肽，其具有完全等同于以前描述的多肽的部分的氨基酸序列，但不是其全部的氨基酸序列。片段可以是自由存在的或包含在较大的多肽内，其中片段形成一个区域的一部分，更优选地是一个单一的连续区。优选的片段是生物学活性片段，其是调节本发明的多肽活性的哪些片段，包括具有类似的活性或改进的活性或者具有降低的活性的哪些片段。也包括在本发明中的是在动物中(特别是在人中)具有抗原性或免疫原性的哪些片段。
所述的多肽变体也包括从序列表中所示的序列改变所得到的多肽，所说的改变是通过保守氨基酸取代，用具有类似特征的另外的氨基酸取代氨基酸残基获得的。一般来说，这种取代在Ala,Leu和Ile中间；在Ser和Thr之间；在Asp和Glu之间；在Asn和Gln之间；在Lys和Arg之间；或在Phe和Tyr之间。特别优选的是其中5到10；1到5；1到3或1个氨基酸以任意组合被取代、缺失或添加的变体。
为本发明的多肽片段的变体可以用于通过肽合成产生相应的全长多肽。因此，这些变体可以用作产生本发明的全长多肽的中间体。
本发明的多核苷酸和多肽可以用于，例如，转化宿主细胞，例如植物宿主细胞，如本文进一步要讨论的。
本发明也提供了编码一种多肽的多核苷酸，所说的多肽是成熟蛋白质附加氨基或羧基末端氨基酸，或者在成熟多肽内的氨基酸(例如当成熟形式的蛋白质具有一个以上的多肽链时)。这样的序列可以，例如在从前体向成熟形式的蛋白质加工过程中起作用，使得蛋白质转运、缩短或延长蛋白质的半衰期，或者有利于在测定或生产中操作蛋白质。人们预期，细胞酶可以用于从成熟蛋白质除去任何附加氨基酸。
具有融合进一个或多个原序列的多肽成熟形式的前体蛋白质可以是失活形式的多肽。失活的前体一般在原序列被除去时活化。某些或所有的原序列可以在活化前除去，这样的前体蛋白质一般成为原蛋白。
在以下提供的例子中，拟南芥属的核酸序列是从与甜椒HPO裂合酶高度同源的Genbank鉴别的。以前已经报道拟南芥属序列编码丙二烯氧化物合酶。
甜椒HPO裂合酶、拟南芥属丙二烯氧化物合酶(Laudert等(1996)植物分子生物学31(2)323-335)和Genbank来源于的拟南芥属序列的核酸比较表明，拟南芥属序列更类似于甜椒HPO裂合酶，而与丙二烯氧化物合酶类似程度较低。
在以下例子中也提供了这样的核酸序列，其是从cDNA文库鉴别的黄瓜(Cucumis sativus)核酸序列，所说的cDNA文库是从黄瓜下胚轴分离的总RNA制备的。获得全长编码序列，由全长序列编码的产物说明针对底物亚麻酸9-氢过氧化物产生(3Z,6Z)-壬二烯醛和9-氧代-壬酸的活性。植物构建体和使用的方法
目的是用重组DNA构建体中的核苷酸序列在宿主细胞中指导本发明的HPO裂合酶编码序列的转录或转录与翻译(表达)。特定的目的是使用在重组DNA构建体中的本发明的多核苷酸序列在宿主植物细胞中指导本发明的HPO裂合酶编码序列的转录或转录与翻译(表达)。
表达构建体一般包含与编码本发明的HPO裂合酶的核酸序列有效连接的在宿主细胞中有功能的启动子和在宿主植物细胞中有功能的转录终止区。特定的目的是使用在植物宿主细胞中有功能的启动子(也被称作转录起始区)。
本领域技术人员将认识到，有许多在植物细胞中有功能的启动子在文献中有描述。也预见了叶绿体和质体特异性启动子，叶绿体和质体功能性启动子，以及叶绿体或质体可操作启动子。
在植物细胞中有功能的一套启动子是组成型启动子，如CaMV355或FMV3SS启动子，这些启动子在大多数植物器官中产生高水平的表达。增强的或复制的CaM V355与FMV3SS启动子形式在本发明的实践中有用(Odell等(1985)自然313:810812；Rogers，美国专利5,378,619)。此外，它也可以优先引起HPO裂合酶基因在植物的特定组织，如，茎，根，块茎，种子，果实等中表达，所选择的启动子应当具有所需的组织和发育特性。
特定的目的是从转录起始区(其优先在植物种子组织中表达)表达本发明的核酸序列。这样的种子优先转录起始序列的例子包括那些来源于编码植物贮藏蛋白基因的序列或来源于牵涉油料种子中脂肪酸生物合成的基因的序列。这样的启动子的例子包括作为napin的基因的5’调节区(Kridl等，种子科学研究。1:209:219(1991))，云扁豆蛋白，玉米醇溶蛋白，大豆胰蛋白酶抑制剂，ACP，硬脂酰-ACP脱饱和酶，大豆β-伴大豆球蛋白的α’亚基(大豆7s(Chen等，美国科学院院报，83:8560-8564(1986)))和油质蛋白。
指导有关HPO裂合酶的蛋白质定位到特定亚细胞区室，例如，线粒体，内质网状组织，液泡，叶绿体或其它质体区室是有利的。例如，本发明的目的基因将靶向质体(例如，叶绿粒)进行表达。构建体也将使用序列指导基因到质体。这样的序列本文称作叶绿体转运肽(CTP)或质体转运肽(PTP)。按这一方式，目的基因不是直接插入到质体中时，表达构建体将另外包含编码转运肽的基因，以指导目的基因至质体。叶绿体转运肽可以来源于目的基因，或可以来源于具有CTP的异源序列。这样的转运肽在本领域中是已知的。参见，例如，VonHeijne等(1991)植物分子生物学回顾9:104-126；Clark等(1989)生物化学杂志264:17544-17550；della-Cioppa等(1987)植物生理84:965968；罗马等(1993)生物化学生物物理通讯196:1414-1421；和Shah等(1986)科学233:478-481。
依据预定的用途，构建体可以包含编码整个HPO裂合酶蛋白质，或其部分的核酸序列。例如，当给定HPO裂合酶蛋白质的反义抑制作用是所需的时，则整个HPO裂合酶编码序列不是所需的。此外，在用于构建体的HPO裂合酶编码序列旨在用作探针时，制备仅包含HPO裂合酶编码序列特定部分的构建体可能是有用的，例如暴露以编码高度保守的HPO裂合酶的区的序列。
本领域技术人员将认识到有多种在宿主细胞中抑制内源性序列表达的方法。这样的方法包括但不限于反义抑制(Smith等(1988)自然334:724-726)，辅抑制(那波利等(1989)植物细胞2:279289)，核糖体酶(PCT出版物WO 97/10328)，和有意与反义的结合Waterhouse等(1998)美国科学院院报95:13959-13964。用于在宿主细胞中内源性序列抑制的方法典型地采用至少一部分被抑制序列的转录或转录与翻译。这样的序列可以同源于内源性序列的编码及非编码区。
在本发明的植物表达构建体中也可以提供调节转录物终止区。转录物终止区可以由编码HPO裂合酶或得自不同基因源的方便的转录终止区的DNA序列提供，例如与转录物起始区天然联系的转录物终止区。技术人员会认识到能够在植物细胞中终止转录的任何方便的转录物终止区都可以用于本发明的构建体。
此外，可以制备构建体以便直接从宿主植物细胞质体指导HPO裂合酶编码序列的表达。这样的构建体和方法在本领域中是已知的，在例如下列文献中有一般性描述，Svab等(1990)美国科学院院报87:8526-8530；Svab和Maliga(1993)美国科学院院报90:913-917以及美国专利5,693,507。
已经引入了包含表达构建体的重组DNA构建体的植物细胞，组织，器官，或植物被认为是转化的，转染的或转基因的。转基因的或转化的细胞或植物也包括细胞或植物的子代，和由在杂交中利用这样一种转基因植物作为亲本的育种方法产生的子代，其因为存在HPO裂合酶核酸序列表现出改变的表型。
植物表达或转录构建体(具有HPO裂合酶作为目的DNA序列，以增加或减少其表达)可以用于各种植物体，特别是可食用和具有工业用途产生植物油的植物体。最优选的是种子，水果，蔬菜和叶片作物。目的植物包括但不限于，油菜籽(Canola和高芥酸品种)，向日葵，红花，棉花，大豆，花生，椰子以及油棕榈，玉米，番茄，草莓，甜椒和瓜。依据用于引入重组构建体至宿主细胞的方法，可以需要其它DNA序列。重要地是，本发明以同样的方式适用于双子叶植物和单子叶植物品种和易于适用于新的和/或改进的转化和调节技术。
特定的目的是在植物中使用HPO裂合酶构建体，以产生具有改善的挥发物含量的植物或植物部分，包括但不限于叶子，茎干，根，生殖器，以及种子。
预期基因序列可以或是完整或是部分地被合成，尤其在不希望提供植物-优选序列时。这样，所有或所需结构基因的部分(编码HPO裂合酶蛋白质的基因的那一个部分)可由使用选择的宿主优选的密码子合成。可以确定宿主-优选的密码子，例如，从最经常地用于在所需宿主品种中表达的蛋白质的密码子。
本领域技术人员将容易认识到可以制备抗体制剂，核酸探针(DNA和RNA)等并用于从各种植物源筛选和回收″同源的″或″相关的″序列。当有序列等同性时，则发现同源序列，其可以基于序列信息核酸，以及氨基酸比较确定，或通过一个已知HPO裂合酶和候选源之间的杂交反应确定。保守变化，如Glu/Asp,Val/Ile,Ser/Thr,Arg/Lys以及Gln/Asn也可以在决定序列同源性中考虑。在两个完全成熟的蛋白质之间氨基酸序列至少25％的序列等同性被认为是同源的(一般地参见，Doolittle,R.F.,OF URES和ORFS矿石(大学教科书，CA,1986)。
这样，其它HPO裂合酶可以从这里提供的特异性序列获得。此外，明显的是，可以获得天然和合成序列，包括改进的氨基酸序列和合成蛋白质的起始物质，所说的蛋白质从例证性HPO裂合酶编码序列从通过使用这样的例证性序列获得的序列模拟的。修饰的氨基酸序列包括变异了，截短的，增长了的序列等，不论序列是否是部分地或完整地被合成。从植物制剂实际纯化的或等同的或或编码等同其蛋白质的序列(不论用于获得蛋白质或序列的方法)都被等同地认为是天然来源的。
对于免疫学筛选，可以通过向兔或小鼠注射纯化蛋白质或其部分制备针对蛋白质的抗体，这样的制备抗体的方法在本领域中是已知的。虽然典型的多克隆抗体对基因分离来说更有用，但单克隆抗体和多克隆抗体都可以产生。通过针对所编码的蛋白质的抗体的交叉反应测定时，可以实施Western分析以确定相关蛋白质在所需植物品种的粗的抽提物中的存在。当交叉-反应性被观察到时，通过筛选代表所需植物品种的表达文库分离到编码相关蛋白质的基因。表达文库可以以在各种市售的载体中构建，包括λgtll，象在Sambrook等(分子克隆：实验室手册，再版(1989)冷泉港实验室，冷泉港，纽约)中所描述的。
潜在的宿主细胞包括原核和真核细胞两种。宿主细胞可以是单细胞的或在多细胞分化的或未分化的有机体中发现的，取决于预期的用途。本发明的细胞可以通过区别于存在于其中的野生型细胞具有HPO裂合酶来辨别，例如，通过具有编码其中不是品种本身的HPO裂合酶的重组核酸构建体。优选的宿主细胞包括细菌，酵母，昆虫，哺乳动物，以及植物宿主细胞。优选的宿主细胞包括酵母和植物宿主细胞。
原核细胞包括革兰氏阴性以及革兰氏阳性细菌，例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌菌株。合适的例子对本领域技术人员是已知的。象在以下实施例中详细描述的，从黄瓜下胚轴分离的HPO裂合酶在大肠杆菌菌株M15中表达。从大肠杆菌表达的蛋白质能够从9-氢过氧化物产生醛3(Z)-壬烯醛和2(E)-壬烯醛。这样，从黄瓜下胚轴分离的HPO裂合酶编码9-HPO裂合酶。
真核宿主细胞包括真菌，包括酵母，昆虫细胞，以及植物细胞。用于在酵母细胞中表达目的DNA序列的方法在本领域中是已知的，在以下文献中有描述：″酵母遗传学和分子生物学″，Guthrie和Fink编，酶学方法，学院出版公司，Vol 194(1991)，和″基因表达技术″，Goeddel等，酶学方法，学院出版公司，Vol 185(1991)。此外，用于HPO裂合酶基因表达的方法在欧洲专利申请EP 0 801 133 A2中有描述，其全部内容本文一并参考。
真菌重组载体可以是可以方便地进行重组DNA过程的任何载体。载体的选择典型地取决于载体与其将要引入的真菌宿主细胞的相容性。载体可以是线型或关闭的环状质粒。载体系统可以是单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，共同包含将要被引入真菌宿主的基因组的整个DNA。
真菌载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如，质粒，染色体外因子，小型微型染色体，或人工染色体。载体可以包括任何用以保证自-复制的手段。此外，载体可以是这样一种，当被引入真菌细胞时，其整合进基因组和与其已整合进的染色体一道复制。对于整合，载体可以依赖于载体的核酸序列，通过同源的或非同源重组稳定载体对染色体的整合。此外，载体可以包含附加的核酸序列，其通过同源重组进真菌宿主的基因组指导整合。附加的核酸序列使得载体能够在染色体的精确位置整合进宿主细胞基因组。为了在精确的位置增加整合的可能性，应该优选两个核酸序列，它们分别包含足够数量的核酸，优选的是400bp到1500bp，更优选的是800bp的1000bp，其高度同源于增加同源重组概率的靶序列。这些核酸序列可以是同源于真菌宿主细胞的基因组中靶序列的任何序列，此外，可以是非编码或编码序列。
对于自我复制，载体可以进一步包含使载体在所说宿主细胞中自我复制的复制起点。用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的例子是2微米复制起点和CEN3和ARS的组合体。与选择的真菌宿主细胞可兼容的任何复制起点都可以加以使用。
本发明的真菌载体优选的包含一个或多个选择性标记，它们使得可以容易地选择转化的细胞。选择性标记是一种基因，其产物提供，例如抗微生物性或病毒抗性，对重金属的抗性，和矿质寄生物营养缺陷型等。选择性标记可以从下组中选择，该组包括但不限于amdS(乙酰胺酶)，argB(鸟氨酸甲氨酰转移酶)，bar(phosphinothricin乙酰转移酶)，hygB(潮霉素磷酸转移酶)，niaD(硝酸盐还原酶)，pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)和sC(硫酸盐腺嘌呤基转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶。优选的用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记以及吸水链霉菌的bar标记。此外，选择可以由共转化完成，例如，象在WO91/17243中所描述的，其全部内容本文一并参考。本发明的核酸序列可以是与合适的启动子序列有效连接的。启动子序列是为核酸的表达被真菌宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列包含调节蛋白质或其片段表达的转录与翻译控制序列。
启动子可以是在选择的真菌宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，并且可以从编码对对宿主细胞同源的或异源的动态的基因获得。用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主中转录的合适的启动子的例子是从基因米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA),Rhizomucor miehei脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶，构巢曲霉乙酰胺酶以及其混合物获得的启动子。在酵母宿主中，一个有用的启动子是酿酒酵母烯醇化酶(eno-1)启动子。特别优选的启动子是TAKA淀粉酶，NA2-tpi(编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂合体)和glaA启动子。
本发明的蛋白质或其片段的编码核酸分子也可以有效连接到在其3’末端的末端序列上。终止子序列可以是对编码蛋白质或其片段的核酸序列固有的或可以是从外源获得的。在选择的真菌宿主细胞中有功能的任何终止子可以用于本发明，但是特别优选的终止子是从编码米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶，黑曲霉α-葡糖苷酶，以及酿酒酵母烯醇化酶的基因获得的。
本发明的蛋白质或其片段的编码核酸分子也可以有效连接到前导序列上。前导序列是mRNA的非翻译区，这对真菌宿主的翻译来说重要的。前导序列是与编码蛋白质或其片段的核酸序列的5’末端有效连接的。前导序列可以是编码蛋白质或其片段的核酸序列固有的，或者可以是外源的。
在选择的真菌宿主细胞中有功能的任何前导序列可以用于本发明，但是特别优选的前导序列是从编码米曲霉TAKA淀粉酶与米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。
聚腺苷酸化序列也可以是有效连接到本发明的核酸序列的3’末端上。聚腺苷酸化序列是这样的序列，当转录时，其被真菌宿主识别，以添加多聚腺苷残基至所转录的mRNA上。聚腺苷酸化序列可以是编码蛋白质或其片段的核酸序列固有的，或者可以是外源的。在选择的真菌宿主中有功能的任何聚腺苷酸化序列都可以用于本发明，但是特别有效的聚腺苷酸化序列是从编码米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因获得的。
为了避免破坏细胞以获得蛋白质或其片段的必要性和最大限度地减少所表达的蛋白质或其片段在细胞内可能的降解，优选的是蛋白质或其片段的表达导致在胞外分泌产物。对于这一点而言，本发明的蛋白质或其片段可以连接到信号肽(其与蛋白质或其片段的氨基末端连接)上。信号肽是使得蛋白质或其片段能够从真菌宿主分泌到培养介质中的氨基酸序列。信号肽可以是本发明的蛋白质或其片段固有的或外源的。本发明的核酸序列的编码序列的5’末端可以本质上含有信号肽编码区，其天然连接翻译读框，具有编码分泌蛋白质或其片段的编码区的区段。此外，编码序列的5’末端可以包含信号肽编码区，其对编码分泌蛋白质或其片段的编码序列的部分是外源的。当编码序列不正常含有信号肽编码区时，外源信号肽可以是所需的。此外，外源信号肽可以只是代替天然信号肽，以获得所需蛋白质或其片段的增强的分泌。外源信号肽编码区可以从曲霉属物种的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因，Rhizomucor miehei脂肪酶或蛋白酶基因，酿酒酵母α-因子基因，或小牛原前凝乳酶基因获得。真菌宿主细胞的有效的信号肽是米曲霉TAKA淀粉酶信号，黑曲霉中性淀粉酶信号，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶信号，Humicola lanuginosus纤维素酶信号，或Rhizomucor miehei脂肪酶信号。然而，能够使在选择的真菌宿主中分泌蛋白质或其片段的任何信号肽都可以用于本发明。
本发明的蛋白质或其片段的编码核酸分子也可以与原肽编码区连接。原肽是原蛋白或酶原的氨基末端所发现的氨基酸序列。从原蛋白切割原肽产生成熟生物化学活性蛋白质。所形成的多肽被称作原肽或原酶(或在某些情况下为酶原)。原多肽一般是失活的，并且可以通过催化或从原多肽或原酶自我催化切割原肽转化为成熟活性多肽。原肽编码区对蛋白质或其片段可以是固有的或可以是从外源获得的。外源原肽编码区可以从酿酒酵母α-因子基因或Myceliophthorathermophila漆酶基因获得(WO95/33836，其全部内容本文一并参考)。
用于连接以上所描述的元件构建本发明的重组体表达载体的方法对本领域技术人员是已知的(参见，例如，Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港，N.Y.(1989))。
本发明也涉及重组真菌宿主细胞，其是用本发明的方法产生的，该方法有利地与本发明的重组载体一起使用。所说的细胞优选地是以包含本发明的核酸序列的载体转化，其后将载体整合至宿主染色体中的。对真菌宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码蛋白质或其片段的基因和它的来源。真菌宿主细胞可以，例如，是酵母细胞或丝状真菌细胞。
本文使用的“酵母”包括Ascosporogenous酵母(酵母目)，Basidiosporogenous酵母和属于不全菌纲(芽生菌)的酵母。Ascosporogenous酵母分成蚀精霉科和酵母科。后者包括四亚科，裂殖酵母亚科(例如，裂殖酵母属)，拿逊酵母亚科，油脂酵母亚科和类酵母亚科(例如，毕赤酵母属，克鲁维酵母属和酵母属)。Basidiosporogenous酵母包括白冬孢酵母属，红冬孢酵母属，锁掷酵母属，Filobasidium和Filobasidiella。属于不全菌纲的酵母划分成两个科，掷孢酵母科(例如，Sorobolomyces和布勒掷孢酵母属)和隐球酵母科(例如，假丝酵母属)。因为酵母的分类在将来可能变化，为本发明的目的，酵母被定义为酵母的生物学和活性中所描述的(Skinner等，Soc.App.Bacteriol.专题研讨系列9号(1980)，其全部内容本文一并参考)。酵母的生物学和酵母遗传学操作方法在本领域中是已知的(参见，例如，生物化学和酵母遗传学，Bacil等(编者)，第二版，1987；酵母，Rose和Harrison(编者)，第二版，(1987)；和酵母酵母属的分子生物学，Strathem等(编者)，(1981)，其全部内容本文一并参考)。
本发明的重组真菌宿主细胞还包含编码一个或多个因子的一个或多个序列，所说的因子在表达蛋白质或其片段中是有利的，例如，激活物(例如，反式作用因子)，陪伴分子以及加工蛋白酶。编码一个或多个这些因子的核酸优选地是与编码蛋白质或其片段的核酸有效连接。激活物是激活编码多肽的核酸序列转录的蛋白质(Kudla等，EMBO 9:1355-1364(1990)；Jarai和Buxton，当前的遗传学26:2238-244(1994)；Verdier，酵母6:271297(1990)，其全部内容本文一并参考)。编码激活物的核酸序列可以从编码以下物质的基因获得：酿酒酵母血红素激活物蛋白质1(hapl)，酿酒酵母半乳糖代谢蛋白质4(gal4)，以及构巢曲霉氨调节蛋白质(areA)。其他例子，参见Verdier，酵母6:271-277(1990)；MacKenzie等，遗传微生物学139:2295-2307(1993)，全部内容本文一并参考)。陪伴分子是辅助另一个蛋白质适当折叠的蛋白质(Hartl等，TIBS19:20-25(1994)；Bergeron等，TIBS19:124-128(1994)；Demolder等，生物技术杂志32:179-189(1994)；Craig，科学260:1902-1903(1993)；Gething和Sambrook，自然355:33-45(1992)；Puig和Gilbert，生物活性杂志269:7764-7771(1994)；Wang和Tsou，FASEB期刊7:1515-11157(1993)；Robinson等，生物/技术1:381-384(1994)，其全部内容本文一并参考)。编码陪伴分子的核酸序列可以从编码下列物质的基因获得：米曲霉蛋白质二硫化物异构酶，酿酒酵母钙联接蛋白，酿酒酵母BiP/GRP78和酿酒酵母Hsp70。对于其他例子，参见Gething和Sambrook，自然355:33-45(1992)；HartⅠ等，TIBS19:20-25(1994)。加工蛋白酶是切开原肽以产生成熟生物化学活性多肽的蛋白酶(Enderlin和Ogrydziak，酵母10:67-79(1994)；Fuller等，美国科学院院报86:1434-1438(1989)；Julius等，细胞37:1075-1089(1984)；Julius等，细胞32:839-852(1983)，其全部内容本文一并参考)。编码加工蛋白酶的核酸序列可以从编码下列物质的基因获得：黑曲霉Kex2，酿酒酵母二肽基氨基肽酶，酿酒酵母Kex2和Yarrowia lipolytica二价加工内切蛋白酶(xpr6)。在选择的真菌宿主细胞中有功能的任何因子都可以用于本发明。
真菌细胞可以由涉及原生质体形成，原生质体转化以及细胞壁再生的方法以本来已知的方式转化。关于曲霉属宿主细胞的转化的合适的过程在以下文献中有描述：EP238023和Yelton等，美国科学院院报81:1470-1474(1984)，其全部内容本文一并参考。转化镰刀菌属物种的合适的方法由Malardier等，基因78:147-156(1989)描述，其全部内容本文一并参考。酵母可以使用以下文献中描述的的方法转化：Becker和Guarente,Abelson和Simon(编者)，酵母遗传学和分子生物学指导，酶学方法，194卷，pp182-187，学院出版公司，纽约；Ito等，细菌学杂志153:163(1983)；Hinnen等，美国科学院院报75:1920(1978)，其全部内容本文一并参考。
本发明也涉及产生蛋白质或其片段的方法，该方法包括在有利于表达蛋白质或其片段的条件下培养重组真菌宿主细胞。本发明的真菌细胞在本领域已知的适于蛋白质或其片段的产生的营养介质中培养。例如，细胞可以通过摇瓶培养，小规模或大规模的发酵(包括连续，批量，分批，或固态发酵)，其是在实验室或工业发酵罐中在合适的介质中在使得蛋白质或其片段可以表达和/或被分离的条件下进行的。使用本领域已知的方法在合适的营养介质中进行培养，所说的介质包含碳和氮源和无机盐(参见，例如，Bennett和LaSure(编者)，真菌的多基因操作，学院出版社，CA,(1991)，其全部内容本文一并参考)。合适的介质是从供应商可获得的，或者可以按照文献记载的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中，Manassas,VA)。如果蛋白质或其片段分泌进营养介质，则蛋白质或其片段可以从介质直接回收。如果蛋白质或其片段不被分泌，则由细胞溶胞产物回收。
所表达的蛋白质或其片段可以使用本领域已知的方法检测，所说的方法对特定的蛋白质或其片段是特异性的。这些检测方法可以包括使用特异性抗体，形成酶产物，或除去酶底物。例如，如果蛋白质或其片段有酶促活性，则酶测定可以使用。此外，对蛋白质或其片段特异性的多克隆或单克隆抗体可供使用，则免疫测定可以使用(用蛋白质或其片段的抗体)。酶测定和免疫测定的技术对本领域技术人员是已知的。
所形成的蛋白质或其片段可以用本领域已知的方法回收。例如，蛋白质或其片段可以由常规方法从营养介质回收，包括但不限于离心，过滤，抽提，喷雾干燥，蒸发，或沉淀。所回收的蛋白质或其片段然后可以进一步地经各种色谱方法纯化，例如，离子交换色谱，凝胶过滤色谱，亲和性色谱等。
用于在昆虫宿主细胞中表达目的DNA序列的方法在本领域也是己知的，在以下文献中有综述：Lucow和Summer(1988)，生物/技术6:4755，其全部内容本文一并参考。
为了确认所鉴别的核酸序列编码的蛋白质作为HPO裂合酶的活性与特异性，体外测定可以在昆虫细胞培养中使用杆状病毒表达系统完成。这样的杆状病毒表达系统是本领域己知的，并且由Lee等，美国专利5,348,886描述，其全部内容本文一并参考。
此外，其它表达构建体也可以制备，以使用不同的表达系统测定蛋白质活性。将这样的表达构建体转化进酵母或原核宿主，测定HPO裂合酶活性。这样的表达系统是本领域已知的，通过商业的来源容易获得。
获得这样的转基因植物的转化方法对本发明不是关键性的，植物转化的各种方法当前都可使用。此外，当转化作物的较新的方法可以使用时，它们也可以直接在此使用。例如，对农杆菌属感染天然敏感的许多植物品种都可以经农杆菌属介导的转化的三元或二元载体方法成功地转化。在许多实例中，理想的是具有位于T-DNA一边或两边上的构建体，尤其是具有左与右边，特别是右边。虽然T-DNA边可以在其它转化方式中找到用途，但当构建体使用A.tumefaciens或A.rhizogenes行为转化模式时，这特别有用。此外，已经开发了微注射，DNA微粒轰击，以及电穿孔法技术，其使得可以转化各种单子叶和双子叶植物品种。
通常，包括DNA在内的构建体会是结构基因，其具有在宿主中表达必需的调节区，并有利于转化细胞的选择。所说基因可以提供对细胞毒性剂的抗性，例如抗生素，重金属，毒素等等，互补提供对营养缺陷型宿主的原养型，病毒免疫原性等。依据表达构建体或其组分引入的不同宿主物种数量，可以使用一个或多个标记，此时，不同的选择条件用于不同的宿主。
在农杆菌属用于植物细胞转化时，可以使用载体，该载体可以引入农杆菌属宿主与在农杆菌属宿主中存在的T-DNA或Ti-或Ri-质粒同源重组。含有用于重组的T-DNA的Ti-或Ri-质粒可以是装备的(能够造成gall形成)或非装备的(不能造成gall形成)，后者是容许的，只要vir基因存在于转化的农杆菌属宿主中。装备的质粒可以给出正常的植物细胞和gall的混合物。
在一些农杆菌用作转化宿主-植物细胞的载体的实例中，与T-DNA边区相连的表达或转录构建体将插入到宽宿主范围的载体中，所说的载体能够在大肠杆菌和农杆菌中复制，文献中描述了广泛宿主范围的载体。一般使用的是pRK2或其衍生物。参见，例如，Ditta等(美国科学院院报(1980:7347-7351)和EPA 0120515，本文一并参考。此外，人们可以将要在植物细胞中表达的序列插入到载体中，所说的载体包含不同的复制序列，其中之一在大肠杆菌中稳定载体，另一个在农杆菌中稳定载体。参见，例如，McBride和Summerfelt(植物分子生物学(1990)14:269 276)，这里使用pRiHRI(Jouanin等，Mol.Gen.Genet.(1985)201:370-374)复制起点，并且在宿主农杆菌属细胞中提供植物表达载体增加的稳定性。
包括表达构建体和T-DNA的将是一个或多个标记，其使得可以选择转化的农杆菌属和转化的植物细胞。已经开发了一些标记与植物细胞一起使用，如对氯霉素，卡那霉素，氨基糖苷G418，潮霉素等的抗性。所使用的特定的标记对本发明不是十分重要的，一个或另一个标记是优选的取决于特定的宿主和构建方式。
对于使用农杆菌属的植物细胞的转化，可以组合外植体，并与转化的农杆菌一起培养足够的时间以转化，在适当的选择性培养基中杀灭细菌，并培养植物细胞。一旦愈伤组织形成，可以通过依据已知方法使用适当的植物激素促进根形成，将根转移到生根培养基中以再生植物。然后植物可以培育成种子，种子用于进行重复生产和分离植物油。
这样，在本发明的另一方面是用于修饰宿主细胞挥发性组分的方法。一般来说，该方法包括在宿主细胞中增加或降低挥发性化合物水平。所说方法一般包括使用表达构建体在宿主细胞中指导本发明的多核苷酸的表达。
特定的目的是使用表达构建体在宿主植物细胞中修饰挥发性化合物的水平。更具体地说，该方法在改善挥发性化合物在植物若干部分中的水平和从植物种子获得种子油上找到了用途，所说的部分包括但不限于叶，根，茎，鲜花，块茎，果，豆荚，种子。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了一种表达构建体，其指导编码HPO裂合酶的核酸序列在细菌和植物组织中从拟南芥属表达。
本发明的一个特定的目的是使用这样的表达构建体产生转基因植物，其具有在植物果实和组织中增加的短链挥发性醛类水平。这样的易挥发醛类是水果，蔬菜以及绿色叶的特征性香味的重要成分(也被称作绿色标记)。这样，本发明的HPO裂合酶序列可以用于表达构建体以产生具有改善的绿色标记香料特征的转基因植物。
为了增加脂质过氧化作用，进而增加在植物组织中″绿色标记″和/或″瓜″香气/香味，植物或在植物组织中的其它9-HPO裂合酶和/或13-HPO裂合酶与涉及脂质过氧化作用的第二基因的共表达也可以在本发明中使用。例如，植物组织中13-HPO裂合酶和/或9-HPO裂合酶序列与编码脂质过氧化作用中涉及的另一种蛋白质(如脂氧合酶)的DNA序列的共表达可以增加脂质过氧化作用，并增加在植物组织中产生的总的短链醛类。在一种可食用的植物组织中，在短链醛类上的这样的增加可以增加″绿色标记″和/或″瓜″香气。
表达本发明的9-HPO裂合酶的宿主细胞为在各种应用中使用挥发性醛类(规因于″绿色″和/或″瓜″标记)提供了新来源。此外，宿主细胞也可以含有这样的构建体，其提供增加的脂质过氧化作用中涉及的酶(例如脂氧合酶)的产量。此外，宿主细胞也可以产生一种特定的脂肪酸增加的产量，或在脂肪酸上有总体的增加。使用传统的育种技术，包括的诱变，可以获得这样的宿主细胞，以及具有这样的改变的脂肪酸组成的遗传工程宿主。
此外，包含构建体(其提供本发明的HPO裂合酶序列的表达)的植物宿主细胞在产生用于香料和芳香产物中的醇类产生反应中作为醛类来源上找到了用途。这样的方法是本领域已知的，在美国专利5,695,973和PCT出版物WO95/26413中有描述，本文一并参考。一般地，醛类和醇类的混合物从这些方法获得。这些方法一般涉及包含至少一种不饱和脂肪酸的反应混合物，一种具有脂氧合酶和氢过氧化物裂合酶高酶活性的植物材料以及醇脱氢酶源。
不饱和脂肪酸可以变化，并且包括单一不饱和脂肪酸物种以及几种不饱和脂肪酸的混合物。脂肪酸以游离酸形式提供，例子包括但不限于油酸，亚油酸，亚麻酸(α和γ形式)，花生四烯酸，十二碳五烯酸，以及蓖麻油酸。
醇脱氢酶的来源包括酵母，以及非酵母霉菌。醇脱氢酶有将醛转化成为醇的能力。酵母与非酵母霉菌作为还原剂进一步提供了烟碱腺嘌呤二核苷酸(NADH)的来源。
本发明的核酸序列在用于产生对各种病原体具有增加的抗性的转基因植物的表达构建体上找到了用途。表达本发明的HPO裂合酶序列的转基因植物在响应病原体进攻时可以显示出增强的超敏-反应(HR反应)，这是因为增加产生HR反应中涉及的醛类，如(3Z)-依维派钠和(2E)-依维派钠(Croft等(1993)植物生理101:13-24)。醛类，如(2E)-依维派钠也已显示出为有效的抗菌剂，进一步对增强的抗病性作出贡献(Croft等(1993)，同上)。此外，这些化合物可以涉及到植物创伤中反应中。
本发明的还一个特定目的是使用构建体中的9-HPO裂合酶核酸序列，指导9-HPO裂合酶在原核和/或真核宿主细胞中表达，以产生香气和芳香。
本发明已被一般性地描述，参照下列实施例，本发明将更容易理解，这些实施例仅仅用于说明目的，无意于用来限制本发明。
实施例实施例1拟南芥属HPO裂合酶编码序列的鉴定
编码甜椒氢过氧化物裂合酶的核酸片段以前以已经克隆和测序(Matsui等(1996)FEBS通讯394:21-24)。该核苷酸序列用来检索Genbank，寻找HPO裂合酶相关序列。已报道从Genbank鉴别的含有拟南芥属基因组序列的一个登记号(登记号Z97339(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank/Index.html))编码丙二烯氧化物合酶(Laudert等(1996)植物分子生物学31:323-335)。
使用Genetyx Mac(软件发展有限公司)进行的来自Genbank甜椒HPO裂合酶，拟南芥属丙二烯氧化物合酶(Laudert等(1996)，同上)和类拟南芥属HPO裂合酶序列之间的序列比较表明类拟南芥属HPO裂合酶序列更类似于甜椒HPO裂合酶(57％的等同性)(参见图2)，而与丙二烯氧化物合酶序列类似程度较低(39％的等同性)(参见图3)。实施例2拟南芥属cDNA文库的构建
分离Arabidopsis thaliana的幼苗，花序和长壳组织的总RNA，用于构建互补(cDNA)文库。方法是Webb和Knapp的DNA分离方案的改进形式(D.M.Webb和S.J.Knapp,(1990)植物分子报道物，8,180-185)。下列描述假定使用1g重量的新鲜组织。冻结的种子组织在液氮下经研磨磨碎。将粉末加入到10ml REC缓冲液(50mMTris-HCl,pH9,0.8M NaCl,10mMEDTA,0.5％w/v CTAB(溴化鲸蜡基三甲基铵))以及0.2g不溶性聚乙烯吡咯烷酮中，在室温下研磨。在12,000xg下离心匀浆5分钟，沉淀不溶性物质。将所形成的上清液组分以氯仿提取，回收上面的相。
然后通过添加1体积的RecP(50mMTris-HCL pH9,10mMEDTA和0.5％(w/v)CTAB)沉淀RNA，经如前的简短离心收集。将RNA沉淀重新溶解到0.4ml 1M NaCl中。将RNA沉淀重新溶解在水中，以苯酚/氯仿提取。加入足量的3M乙酸钾(pH5)，获得0.3M乙酸盐混合物，接着加入2体积的乙醇以沉淀RNA。在乙醇洗涤之后，将这一最后的RNA沉淀在水中溶解并存储冻结。
此外，按照制造商的方案，使用TRIzol试剂(BRL LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)可以获得总RNA，
按照制造商的方案，使用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech,Palo Alto,CA)，可以从RNA获得互补DNA(cDNA)。实施例3 HPO裂合酶序列的克隆
为了确定由拟南芥属cDNA GenBank序列编码的蛋白质的特征，获得相当于类拟南芥属HPO裂合酶的cDNA的完整的编码区(图1)。设计合成寡核苷酸引物以从实施例2中获得的RNA的类HPO裂合酶序列扩增5′和3′末端。按照类拟南芥属HPO裂合酶序列设计设计，用于cDNA末端快速扩增(RACE)反应(Frohman等(1988)美国科学院院报85:8998-9002)。按照制造商的方案，采用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)扩增cDNA克隆的侧翼序列。
一对引物设计来扩增以上实施例2所描述的文库的类拟南芥属HPO裂合酶cDNA的5’和3’区。两个引物，HPOL28(用于3′RACE,5′-CGGTTCCTCTGCGCCTCTCTCGCCGGCG-3′)和HPOL21(用于5′RACE,5′-GCGGAACCGGAGGACTAAAACGCAGC-3′)与MarathoncDNA扩增试剂盒中提供的衔接头特异性引物(AP1 5′-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)一起用于PCR反应。对于类HPO裂合酶cDNA的5’的扩增，使用引物AP1与HPOL 21，对于3’的扩增，使用引物AP1与引物HPOL28反应。所使用的循环条件是：94℃1分，接着94℃5秒5轮，72℃4分，接着采用94℃5秒扩增5轮，70℃4分，最终94℃5秒，和68℃4分25个循环。
1100bp的一单一片段从与RNA的3’RACE反应获得，所说的RNA是从以上描述的长壳组织获得的。为了确认PCR产物包含与类HPO裂合酶序列对应的序列，用凝胶纯化的1100bp片段使用以上描述的相同的条件完成第二轮PCR反应。用引物HPOL 13(5′-CTTGGCGTAGTTCCTCAGCCTCTTG-3′)和AP2(5′-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3′)完成反应，以扩增大约1000bp片段，作为类HPO裂合酶序列的证实。对再扩增的1000bp片段进行纯化，并克隆进pCR2.1 TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)，以产生质粒pCGN8094。
5’RACE反应产生许多非特异性片段。将1000bp片段从凝胶上切除，并克隆进pCR2.1 TOPO(Invitrogen)，以产生质粒pCGN8091。
图1公开了拟南芥属HPO裂合酶的完整的核苷酸序列。cDNA具有1687bp的序列，以及分别具有47和137bp的5′-和3’非编码区。存在带有起始密码子的读框中的5’-非编码区的终止密码子。最长的ORF编码492个氨基酸的多肽，具有54851Da的计算分子量。
为了确定拟南芥属HPO裂合酶序列的表达模式，完成总RNA的Northern印迹分析，所说的RNA是从拟南芥属的各种器官，愈伤组织，甲基茉莉酸盐，和病原体侵染的叶分离的。
使用TRIzol试剂(生命技术，Gaithersburg,MD)从玫瑰花形叶，茎干上的叶，茎干，花，绿色蓓蕾，闭合的花，开放的花，长壳(5-10mm)，长壳(＜5mm)和发芽2,3,4,5和6天的幼苗分离总RNA。将分离的RNA样品(10-20μg)在甲醛琼脂糖凝胶上分离，并转移到Hybond-N(Amersham)上。在65℃在6x SSC,5x Denhardt’s溶液，0.2％SDS,20p.g/ml鲑精DNA,20mM磷酸钠缓冲液，pH7.0中，将转移的RNA与拟南芥属HPO裂合酶cDNA 5’的一半的探针杂交一夜。杂交过的膜在60℃以2x SSC,0.1％SDS洗涤20分钟一次，在60℃用0.25x SSG,0.1％SDS洗涤两次，每次20分钟。与HPO裂合酶基因对应的1.6kb转录物在从所有所检查的组织源分离的RNA中观察到。表达的最高水平在花中观察到。大约3.0和3.3kb的附加的带被观察到，可能是由于在转录期间阅读-通过内含子-外显子连接处。此外，Rojo等(1998)植物杂志13:153-165报告了使用HPO裂合酶的探针在Northern印迹上的不同大小的两个mRNA带杂交。
为了确定HPO裂合酶序列是否响应愈伤和甲基茉莉酸盐而表达，从愈伤的叶子和使用甲基茉莉酸盐(MJ)处理的叶子分离RNA。对真菌进攻的诱导也检测HPO裂合酶表达。
在22℃16小时光照和65％相对湿度下，使Arabidopsis thaliana生态型No-O在土壤中生长三周。为了愈伤，每一片叶片在带有midvein的线上用止血剂在上面第三叶片上使其受伤一次。在每一花结中，叶子的一半受伤，另一半不受伤。这些分别被称作局部和全身性叶。
为了以MJ处理，将植物封装在密闭的9.25L罐中。将纯净的MJ(10或50μl,Aldrich Co.Milwaukee,WI)用在四只棉签上，并置于罐子上，不直接触到植物。罐子打开后，每次用新鲜的MJ棉签处理。为了病原体诱导，以在1％葡萄糖中每ml 106个孢子的浓度将真菌灰葡萄孢的孢子喷射在3周龄植物花结叶子上，
如制造商的描述，使用TRIzol试剂(生命技术)从组织分离总RNA。并如上所述转移到膜上。
HPO裂合酶mRNA的表达在愈伤之后在6和24小时观察到。HPO裂合酶诱导的高水平在用止血剂弄伤的叶子上看到。诱导在处理6小时之后明显，至少直到24小时HPO裂合酶mRNA的量增加。在全身性叶子中，HPO裂合酶mRNA的诱导也明显。在处理6小时之后，HPO裂合酶mR.NA的水平几乎与局部叶子的完全相同，然而，后来和在处理后24小时，该量只稍微增加，水平比局部叶子有可见的降低。
用甲基茉莉酸盐处理的植物显示HPO裂合酶低表达在所有检测的时间点上在10μl和50μl处理中都观察到。
真菌病原体灰葡萄孢的感染没有引起HPO裂合酶表达。然而，坏死性损伤在接种后5至6天在处理的植物叶片表面上观察到。实施例4制备HPO裂合酶表达构建体
制备一组构建体，供转化进植物或细菌宿主，以进一步确定类拟南芥属HPO裂合酶序列的特征。采用引物Alex2(5′-CGGGATCCATGTTGTTGAGAACGATGGCGGCG-3′)和Alex4(5′-CAATCTCCGGCGTTCTCGTCG-3′)PCR扩增在pCGN8091中的5’RACE产物。Alex2引物含有限制性内切核酸酶位点BamHⅠ，其方便克隆PCR产物进入pQE30表达载体(Qiagen,Hilden，德国)读框中(具有载体的ATG起始密码子)。除寡核苷酸引物(各0.2μM)之外，PCR反应混合包含各0.2mM的dATP,dCTP,dGTP和dTTP,1.0％甘油，0.2mMTris-HCl(pH8.3),4.6mMKCl,1.5mMEDTA,15mM二硫苏糖醇，7.3μgm/ml BSA,1.1mMKOAc和0.1单位Pfu DNA聚合酶(BRIL生命技术，Gaithersburg,MD)。使用下列条件扩增混合物：在Perkin-Elmer 9800热循环仪中95℃10分钟的1个循环；94℃ 20秒，60℃30秒，以及72℃1.5分钟的30个循环；和72℃7分钟的1个循环。所形成的PCR产物以BamHⅠ和HindⅢ消化，并连接到载体pQE30上，以产生载体pCGN8099。将拟南芥属HPO裂合酶的3’末端克隆进pCGN8099(来源于pCGN8094)的HindⅢ位点以产生表达载体pCGN8100。
从pCGN1558(McBride和Summerfelt,(1990)植物分子生物学，14:269-276)构建用于植物转化的二元载体pCGN5138。将pCGN 1558的多接头以HindⅢ/EcoRⅠ片段置入到含有单一限制性内切酶位点HindⅢ,SseⅠ/PstⅠ,NotⅠ,BamHⅠ,SwaⅠ,XbaⅠ,PacⅠ,AscⅠ和Asp718的多接头上。
从转化的拟南芥属制备类拟南芥属HPO裂合酶核苷酸序列反义构建体。将编码pCGN809的5’1000bp核苷酸的核酸序列作为EcoRⅠ片段克隆进质粒pBluescriptⅡ SK(Stratagene,La,Jolla,CA)用以产生载体pCGN8093。将pCGN8090的3’RACE产物作为HindⅢ片段克隆进pCGN8093，以产生质粒pCGN8094中的全长HPO裂合酶序列。通过以KpnⅠ消化和在该位点以Klenow片段填补除去pCGN8094的KpnⅠ位点，将HPO裂合酶编码序列作为SmaⅠ片段从这一质粒克隆进pCGN8059的StuⅠ位点。这一过程产生质粒pCGN8101。质粒pCGN8059含有若干35S启动子与hsp70前导序列下游的克隆位点，使得可以从35S启动子序列表达克隆序列。这一载体也包含胭脂氨酸合酶转录终止(nos 3’)序列(Fraley等，美国科学院院报(1983)80:4803-4807和Depicker等，分子应用遗传学(1982)1:562-573)。将包含35S启动子/hsp70前导序列，反义拟南芥属HPO裂合酶序列和nos3’终止序列的片段作为NotⅠ片段从pCGN8101克隆进pCGN5138的相同位点，以产生反义表达构建体pCGN8102。
实施例5大肠杆菌表达
使用在Maniatis等((1989)分子克隆：实验室手册，再版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)中所描述的氯化钙方法将表达载体pCGN8100转化进大肠杆菌(菌株M15,Qiagen,Hilden,Germany)。按照Shibata等(1995)植物细胞生理97:1059-1072中的描述，采用对甜椒HPO裂合酶产生的抗体，就HPO裂合酶蛋白质的表达经Western免疫印迹分析筛选转化的菌落。
用Matsui等(1991)，植物化学，30:2109-2113描述的气相色谱(GC)法测定氢过氧化物裂合酶活性。表1样品        区域     nmole   nmole/10分钟/mg8100        24677    130     153对照        4089     28      24
GC分析的结果如表1所示，说明类拟南芥属HPO裂合酶序列编码HPO裂合酶。实施例6反义拟南芥属HPO裂合酶构建体的转化
研究了各种方法将目的DNA序列插入进植物宿主的基因组，获得影响表型变化的序列的转录或转录与翻译。
将植物二元构建体pCGN8101用于植物转化，以指导类拟南芥属HPO裂合酶序列的反义核酸序列从植物组织表达。
可以按照Valverkens等，(美国科学院院报(1988)85:5536-5540)的描述，或者按照Bent等((1994)，科学265:1856-1860)，或Bechtold等((1993),C.R.A cad.Sci，生命科学316:1194-1199)的描述，通过农杆菌属-介导的转化获得转基因Arabidopsis thaliana植物。实施例7转基因植物的分析
按照Shibata等(1995)植物细胞生理36:147-156的描述，经蛋白质提取物的高压液相色谱(HPLC)分析分析包含pCGN8101的转基因拟南芥属植物依维派钠产生的下降。
可以使用Shibata等(1995)，同上中描述的比色测定或HPLC测定筛选超量表达本发明的拟南芥属HPO裂合酶的转基因植物。实施例8附加HPO裂合酶序列的鉴别
从番茄和黄瓜组织获得附加类HPO裂合酶序列。按照制造商的方案，采用TRIzol试剂(Gibco-BRL生命技术，Gaithersburg,MD)从黄瓜下胚轴和番茄未成熟果组织分离总RNA。
按照制造商的方案，采用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clonrech,Palo Alto.CA)获得互补DNA(cDNA)。
采用ClustaiW(http://www.clustalw.genome.ad.jp/)，将甜椒(Matsui,等(1996)sup ra)，香蕉(欧洲专利申请，公开号EP 0 801133 A2)和拟南芥属的HPO裂合酶序列进行序列对比，鉴别了7种保守肽序列(位置参见图7，列表参见表2)。
表2
 肽序列        引物            核苷酸序列1    PGSYG         HPOLlS     5’-ATNCCNGGNWNSNTAYGG-3’2    QPLEEI        HPOL2S     5’-CARCCNYTNGARGARAT-3’
               HPOL2AS    5’-ATYTCYTCNARNGGYTG-3’3    GFNAYGG       HPOL3S     5’-GGNTTYAAYGCNTWYGGNGG-3’
               HPOL3AS    5’-CCNCCRSANGCRTrRAANCC-3’4    YQPLVM        HPOLAS     5’-TAYCARCCNYTNGTNATG-3’
               HPOL4AS    5’-CATNACNARNGGYTGRTA-3’5    VFDEPE        HPOL5S     5’-GTNTTYGAYGANCCNGA-3’
               HPOL5AS    5’-TCNGGNTCRTCRAANAC-3’6    NGPQTG        HPOL6AS    5’-CCNGTYTWNGGNCCRTT-3’7    NKQCAAKD      HPOL7AS    5’-CYTTNGCNGCRCAYTGYTTRTT-3’
合成一套合成寡核苷酸(表2)，用于使用愈伤获得的cDNAs的聚合酶连锁反应，以鉴别哪些同源于HPO裂合酶序列。使用根据制造商方案的反应条件，采用优质cDNA聚合酶混合物(Clonetech.PaloAlto,CA)进行PCR反应。在寡核苷酸名称中的字母“S”指用来扩增有义链的PCR引物，或正向反应引物。字母“AS”指用来扩增反义链的PCR引物，或逆反应引物。在寡核苷酸序列中。字母“N”代表A,C,G，或T。字母“S”代表在那一位置的C或G，字母“Y”代表在那一位置的C或T，字母“R”代表在那一位置A的或G。
大约475bp的一种单一PCR产物在包含引物4HPOL3S与11HPOL7AS以及从黄瓜和番茄所获得的cDNA(以上描述)的的反应中得到扩增。将番茄和黄瓜的475bpPCR产物克隆进质粒pCR2.1TOPO(invitrogen)，以分别产生质粒T15与C15。在6HPOL4S和11HPOL7AS的PCR反应中，大约200bp的一种单一产物从具有从黄瓜下胚轴组织获得的cDNA的扩增反应获得。将200bp产物克隆进pCR2.1TOPO(invitrogen)，以产生质粒C17。
各PCR产物的核苷酸序列通过自动测序确定。将所获得的序列与甜椒，拟南芥属，以及香蕉叶的HPO裂合酶序列的核酸和氨基酸序列，以及银胶菊((1995)生物化学杂志270(15):8487-8494)，亚麻子((1993)美国科学院院报90(18):8519-8523)和拟南芥属的编码丙二烯氧化物合酶的DNA和氨基酸序列比较。
结果显示T15核酸序列大约85％类似于甜椒HPO裂合酶DNA序列，大约88％类似于氨基酸序列。此外，T15序列也至少大约55％类似于其它HPO裂合酶核酸序列，至少大约57％类似于氨基酸序列。此外，序列T15氨基酸仅仅大约41％类似于丙二烯氧化物合酶序列。C17序列也遵从类似HPO裂合酶序列的类似模式。这样，T15和C17序列编码高度类似于HPO裂合酶的蛋白质。
然而，序列比较的结果(图8)显示C15核酸序列50％和54％之间类似于其它HPO裂合酶核酸序列，大约58％类似于丙二烯氧化物合酶DNA序列。此外，所推论的氨基酸C15的序列大约38％和42％之间类似于HPO裂合酶氨基酸序列，大约51％类似于AOS氨基酸序列。这样，C15序列编码这样的蛋白质，其不同于两种已知的HPO裂合酶序列，更类似于丙二烯氧化物合酶序列。
每一种PCR产物的核苷酸序列通过自动测序确定。所获得的序列用来检索Genbank。检索结果确定T15和C17序列类似于HPO裂合酶序列，而C15序列类似于丙二烯氧化物合酶序列。
为了获得T15,C15和C17的全长编码序列，根据制造商的方案，采用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)和表3中所显示的寡核苷酸，进行RACE PCR反应。
表31KMC10-1:5’-CGGTGGAGATCCTCGCCACCGGTGCCGACCC-3’2KMC10-2:5’-CTTCCTTCACGGTTGTCCTCACTTCCTCCGCCAG-3’3KMC17-1:5’-TCCAGCAGCGCTGCCCCTTTCTCTCCCCGG-3’4KMC17-2:5’-CACTGTTTGTTCTTCTCGCTCGGTGTCCCCG-3’5KMC10-3:5’-GGGTCGGCACCGGTGGCGAGGATCTCCACCG-3’6KMC10-4:5’-CTGGCGGAGGAAGTGAGGACAACCGTGAAGGAAG-3’7KMC17-3:5’-CCGGGGAGAGAAAGGGGCAGCGCTGCTGG-3’8KMC17-4:5’-CGGGGACACCGAGCGAGAAGAACAAACAGTG-3’9KMT15-1:5’-GACrTGGTACTGGTGGACTAAGCCTAAGTGTTTC-3’10KMT15-2:5’-GGCTGATAACCACAAAGAAGCTCCCCTITC-3’11KMT15-3:5’-GAAACACTTAGGCTTAGTCCACCAGTACCAAGTC-3’12KMT15-4:5’-GAAAGGGGAGCTTCTTTGTGGTTATCAGCC-3’
将用从番茄和黄瓜获得的DNA的扩增反应的PCR产物克隆进pCR2.1 TOPO。对番茄(pCGN8303(5′RACE)和pCGN8304(3′RACE))，黄瓜，C15(pCGN8302(5’RACE)和pCGN8306(3′RACE))和C17(pCGN8301(5′RACE)和pCGN8307(3′RACE))的5′和3′-RACE产物的序列测序，并与从pCGN8305,pCGN8309，和pCGN8308所获得的各自的序列比较，以获得与番茄类HPO裂合酶序列(图4)，黄瓜HPO裂合酶序列(图6)和黄瓜丙二烯氧化物合酶序列(图5)对应的初步全长序列。实施例9制备表达构建体
制备一套构建体供转化进植物或细菌宿主，以进一步确定黄瓜新序列的特征。为了产生黄瓜(C15)类丙二烯氧化物合酶序列的全长编码序列，PCR扩增5’RACE(pCGN8302)和3’RACE(pCGN8306)的序列，在一个单一的限制性内切核酸酶位点组合。
在以上描述的PCR扩增反应中，采用引物(4KMC15ES1 5′-CGGGATCCATGGCTTCTTCCTCCCCTGAACTTC-3′和5KMC15EAS2 5′-TGCCGACCCATTTCAGTATAGTGGG-3′)扩增5′C15序列。引物4KMC15EASl从5’区扩增并包含起始密码子(ATG)，以及BamHⅠ位点。采用Marathon试剂盒(BRL-生命科学，Gaithersburg,MD)中提供的引物APl和引物6KMC15ES3(5′-TTCACACCAYFCCCCTGCCTTTCTTCCC-3′)扩增3’C15序列。C15全长克隆的序列在图6中显示。A．细菌表达构建体
将5’RACE PCR扩增产物以BamHⅠ和XbaⅠ(C15序列的单一内源位点)消化，并与以XbaⅠ和SmaⅠ消化的3’RACE PCR反应的扩增产物一起克隆进表达载体pQE30(Invitrogen)。这一构建体提供了在大肠杆菌表达载体中的C15 cDNA的全长编码序列，产生载体pCGN8333的coli表达载体。将全长序列也克隆进质粒pUC119，产生载体pCGN8334。B．植物表达构建体
从pCGN1558(McBride和Summerfelt,(1990)植物分子生物学，14:269-276)构建植物转化二元载体pCGN5138。用含有唯一限制性内切核酸酶位点，HindⅢ,SseⅠ/PstⅠ,NotⅠ,BamHⅠ,SwaⅠ,XbaⅠ,PacⅠ,AscⅠ以及Asp718的多接头将pCGN1558的多接头替换为HindⅢ/EcoRⅠ片段。
克隆C15的全长编码序列，以便在植物中从供表达的植物组成型启动子35S表达。将表达盒克隆进二元载体pCGN5138，产生载体pCGN8337。实施例10黄瓜C15在大肠杆菌中表达
采用Maniatis，等((1989)分子克隆：实验室手册，再版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)中描述的氯化钙方法，将表达载体pCGN8333转化进大肠杆菌(菌株M15,Qiagen,Hilden，德国等((1989))。按照Shibata等(1995)植物细胞生理97:1059-1072中的描述，采用对甜椒HPO裂合酶产生的抗体，就HPO裂合酶蛋白质的表达经Western免疫印迹分析筛选转化的菌落。
采用亚麻酸13-氢过氧化物和亚麻酸9-氢过氧化物作为底物，经Matsui等(1991)，植物化学，30:2109-2113描述的分光光度法和气相色谱(GC)法测定氢过氧化物裂合酶活性。
气相色谱法的结果(图9)显示由黄瓜C15序列编码的蛋白质对亚麻酸9-氢过氧化物(图9B)底物比对亚麻酸13-氢过氧化物底物(图9A)具有更多的活性。分光光度测定的结果进一步显示由黄瓜HPO裂合酶核酸序列编码的蛋白质优先选择9-氢过氧化物底物。分光光度测定的结果在图10中显示。
这样，黄瓜C15序列代表编码9-氢过氧化物裂合酶的第一已知克隆核酸序列。
在本所描述中提及的所有出版物与专利申请用来只是发明所属技术领域技术人员的水平。所有出版物与专利申请与单个出版物与专利申请被指明本文一并参考一样，本文一并参考。
虽然为了清楚理解本发明的目的，已经通过说明和举例的方式以某种详细程度描述了本发明，但是应当清楚，在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。

Claims (29)

1．一种分离的拟南芥属HPO裂合酶的核苷酸序列。
2．权利要求1的核苷酸序列，其包含图1中所示的序列。
3．一种构建体，其包含连接到异源核苷酸序列上的权利要求1的核苷酸序列。
4．一种分离的番茄HPO裂合酶的核苷酸序列。
5．权利要求4的分离的核苷酸序列，其包含图4中所示的序列。
6．一种构建体，其包含连接到异源核苷酸序列上的权利要求4的核苷酸序列。
7．一种分离的黄瓜HPO裂合酶的核苷酸序列。
8．权利要求7的分离的核苷酸序列，其包含图5中所示的序列。
9．一种构建体，其包含连接到异源核苷酸序列上的权利要求7的核苷酸序列。
10．一种获得分离的包含HPO裂合酶的核苷酸序列的方法，该方法包括利用选自下组的寡核苷酸从PCR反应获得扩增产物：
        5’-ATNCCNGGNWSNTAYGG-3’；
        5’-CARCCNYTNGARGARAT-3’；
        5’-ATYTCYTCNARNGGYTG-3’；
        5’- GGNTTYAAYGCNTWYGGNGG-3’；
        5’-CCNCCRSANGCRTTRAANCC-3’；
        5’-TAYCARCCNYTNGTNATG-3’；
        5’-CATNACNARNGGYTGRTA-3’；
        5’-GTNTTYGAYGANCCNGA-3’；
        5’-TCNGGNTCRTCRAANAC-3’；
        5’-CCNGTYTWNGGNCCRTT-3’；
        5’ -CYTTNGCNGCRCAYTGYTTRTT-3’
11．一种PCR扩增产物，其包含选自下组的寡核苷酸：
   1KMC10-1:5’-CGGTGGAGATCCTCGCCACCGGTGCCGACCC-3’；
   2KMC10-2:5’-CTTCCTTCACGGTTGTCCTCACTTCCTCCGCCAG-3’；
   3KMC17-1:5’-TCCAGCAGCGCTGCCCCTTTCTCTCCCCGG-3’；
   4KMC17-2:5’-CACTGTTTGTTCTTCTCGCTCGGTGTCCCCG-3’；
   5KMC10-3:5’-GGGTCGGCACCGGTGGCGAGGATCTCCACCG-3’；
   6KMC10-4:5’-CTGGCGGAGGAAGTGAGGACAACCGTGAAGGAAG-3’；
   7KMC17-3:5’-CCGGGGAGAGAAAGGGGCAGCGCTGCTGG-3’；
   8KMC17-4:5’-CGGGGACACCGAGCGAGAAGAACAAACAGTG-3’；
   9KMT15-1:5’-GACTTGGTACTGGTGGACTAAGCCTAAGTGTTTC-3’；
   10KMT15-2:5’-GGCTGATAACCACAAAGAAGCTCCCCTTTC-3’；
   11KMT15-3:5’-GAAACACTTAGGCTTAGTCCACCAGTACCAAGTC-3’；
   12KMT15-4:5’-GAAAGGGGAGCTTCTTTGTGGTTATCAGCC-3’.
12．一种构建体，其包含连接到HPO裂合酶核苷酸序列上的能在宿主细胞中指导转录的DNA序列，其中所说的HPO裂合酶包含选自下组的氨基酸序列：
        HPOL1S(PGSYG)；
        HPOL2S(QPLEEI)；
        HPOL2AS；
        HPOL3S (GFNAYGG)；
        HPOL3AS；
        HPOLAS(YQPLVM)；
        HPOL4AS；
        HPOL5S(VFDEPE)；
        HPOL5AS；
        HPOL6AS(NGPQTG)；
        HPOL7AS(NKQCAAKD)；并且其中所说的HPO裂合酶不是香蕉或甜椒HPO裂合酶。
13．一种用于增加植物对植物病原体的抗性的方法，该方法包括从按照权利要求3,6,9或12之任一的构建体表达HPO裂合酶，其中所说的HPO裂合酶编码序列与能够在植物细胞中指导表达的DNA序列连接。
14．一种用于增加植物挥发性组分的方法，该方法包括从按照权利要求3,6,9或12之任一的构建体表达HPO裂合酶，其中所说的HPO裂合酶编码序列与能够在植物细胞中指导表达的DNA序列连接。
15．一种分离的核酸序列，其编码对脂肪酸9-氢过氧化物有活性的氢过氧化物裂合酶。
16．根据权利要求15的序列，其中所说的序列对亚麻酸9-氢过氧化物有活性。
17．根据权利要求15的序列，其中所说的序列是从植物源获得的。
18．根据权利要求15的序列，其中所说的序列是从黄瓜获得的。
19．根据权利要求15的序列，其中所说的序列是从黄瓜下胚轴获得的。
20．根据权利要求15的序列，其包含图6中所示的序列。
21．一种构建体，其包含在宿主细胞中有功能的启动子，9-氢过氧化物裂合酶编码序列，以及转录终止序列。
22．根据权利要求21的构建体，其中所说的9-氢过氧化物裂合酶序列是从植物分离的。
23．根据权利要求21的构建体，其中所说的9-氢过氧化物裂合酶序列是从黄瓜分离的。
24．一种用于增加植物对植物病原体的抗性的方法，该方法包括从按照权利要求21的构建体表达HPO裂合酶，其中所说的HPO裂合酶编码序列与能够在植物细胞中指导表达的DNA序列连接。
25．一种用于增加植物挥发性组分的方法，该方法包括从按照权利要求21的构建体表达HPO裂合酶，其中所说的HPO裂合酶编码序列与能够在宿主细胞中指导表达的DNA序列连接。
26．根据权利要求25的方法，其中所说的宿主细胞是植物细胞。
27．根据权利要求25的方法，其中所说的宿主细胞是微生物细胞。
28．根据权利要求27的方法，其中所说的微生物细胞是酵母细胞。
29．根据权利要求25的方法，其还包括从所说的宿主细胞收获物质，并且浓缩在所说的收获物质中的所说挥发性组分的步骤。
CN99801459A 1998-06-26 1999-06-25 脂肪酸氢过氧化物裂合酶的核酸序列 Pending CN1321196A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9092498P 1998-06-26 1998-06-26
US60/090,924 1998-06-26
US12196599P 1999-02-26 1999-02-26
US60/121,965 1999-02-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1321196A true CN1321196A (zh) 2001-11-07

Family

ID=26782789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN99801459A Pending CN1321196A (zh) 1998-06-26 1999-06-25 脂肪酸氢过氧化物裂合酶的核酸序列

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1032694A2 (zh)
KR (1) KR20010023362A (zh)
CN (1) CN1321196A (zh)
CA (1) CA2301856A1 (zh)
WO (1) WO2000000627A2 (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6592619B2 (en) 1996-01-02 2003-07-15 University Of Cincinnati Heart wall actuation device for the natural heart
US6200794B1 (en) 1998-05-13 2001-03-13 Fimenrich Sa Guava (Psidium guajava) 13-hydroperoxide lyase and uses thereof
AU1309000A (en) 1998-10-13 2000-05-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. A hydroperoxide lyase gene from maize and methods of use
WO2000050575A2 (en) * 1999-02-26 2000-08-31 Calgene Llc Nucleic acid sequence of a cucumber (cucumis sativus) fatty acid 9-hydroperoxide lyase
US6271018B1 (en) 2000-03-29 2001-08-07 Vanderbilt University Muskmelon (Cucumis melo) hydroperoxide lyase and uses thereof
US6780621B2 (en) 2000-05-24 2004-08-24 Firmenich Sa Guava (Psidium guajava) 13-hydroperoxide lyase and uses thereof
DE10028639C2 (de) * 2000-06-09 2003-11-06 Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden, C9-Alkoholen sowie deren Ester
WO2002036788A2 (fr) * 2000-11-06 2002-05-10 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Acides nucleiques et polypeptides exprimes specifiquement dans les cellules de la zone de transfert d'un grain de plante et leurs applications
CA2400585C (en) 2000-12-18 2008-10-28 Ulrike Schafer Hydroperoxide lyase regulatory region

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5844121A (en) * 1996-01-19 1998-12-01 The Texas A & M University System Method of inhibiting mycotoxin production in seed crops by modifying lipoxygenase pathway genes
EP0801133B1 (en) * 1996-04-15 2004-09-08 Givaudan SA Hydroperoxide lyases

Also Published As

Publication number Publication date
EP1032694A2 (en) 2000-09-06
WO2000000627A2 (en) 2000-01-06
KR20010023362A (ko) 2001-03-26
WO2000000627A3 (en) 2000-07-06
CA2301856A1 (en) 2000-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ando et al. Establishment of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of an oleaginous fungus, Mortierella alpina 1S-4, and its application for eicosapentaenoic acid producer breeding
CN107858204B (zh) 产生ω-3脂肪酸的酶和方法
CN101765658B (zh) 复合酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途
CN1270636A (zh) 编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的dna序列及其于植物中的超量生产
CN1126423A (zh) 控制昆虫的方法
CN1301304A (zh) 脂酰辅酶a∶脂肪醇酰基转移酶
CN1151762A (zh) 非毒性、非产毒性、非致病性镰孢属表达系统及所用启动子和终止子
JP2006503557A (ja) ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ核酸配列および関連生成物
TW201634695A (zh) 降低植物種子中飽和脂肪酸含量之技術（三）
WO2016099568A1 (en) Generation of transgenic canola with low or no saturated fatty acids
CN1914321A (zh) 来自甘薯的蔗糖诱导型启动子
CN1444656A (zh) 在绿色植物中高水平地生产对羟基苯甲酸
Nyilasi et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Mucor circinelloides
CN1321196A (zh) 脂肪酸氢过氧化物裂合酶的核酸序列
CN101056983A (zh) 用于植物的启动子分子
CN1309835C (zh) 植物可选择标记物和植物转化方法
CN1849390A (zh) 在绿色植物和微生物中高水平生产对苯二酚葡糖苷
EP1709180A2 (fr) Procede de surproduction d'une proteine recombinante determinee par des souches monocaryotiques de pycnoporus cinnabarinus
CN1379783A (zh) 通过功能性地抑制植物细胞周期蛋白抑制剂基因增加植物细胞增殖的方法
CN1668748A (zh) 改良植物的方法
US7056718B2 (en) Polypeptides having oxaloacetate hydrolase activity and nucleic acids encoding same
US8053633B1 (en) Fungal desaturases and related methods
WO2000050575A2 (en) Nucleic acid sequence of a cucumber (cucumis sativus) fatty acid 9-hydroperoxide lyase
CN1537861A (zh) 从大豆中分离到的种子特异性启动子序列及其应用
CN1615363A (zh) 重组芽孢杆菌植酸酶及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication