KR20010023362A - 지방산 히드로퍼옥시드 리아제 핵산 서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물의 히드로퍼옥시드 리아제 (또는 HPO 리아제) 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드에 관한 것이다. 식물의 HPO 리아제의 발현에 유용한 DNA 구성물이 기술된다. 더욱이, 식물 세포에서 식물 HPO 리아제의 안티센스 발현에 유용한 DNA 구성물이 기술된다. 구성물이 형질전환된 식물에서 발현될 때, 이러한 구성물은 식물 조직에서 식물 HPO 리아제의 발현을 우선적으로 유도할 수 있는 조절 요소의 조절하에 관심의 대상인 식물 HPO 리아제를 코드화하는 DNA 서열을 함유할 것이다. 본 발명은 식물에서 질병 내성을 증가시키는 방법 뿐만 아니라 식물 조직에서 휘발성 알데히드의 변형을 위한 식물 HPO 리아제를 코드화하는 DNA 서열을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

지방산 히드로퍼옥시드 리아제 핵산 서열 {FATTY ACID HYDROPEROXIDE LYASE NUCLEIC ACID SEQUENCES}

유전자 공학 기술이 발달함에 따라, 유전자를 다양한 유기체로부터 다수의 상이한 식물종의 게놈으로 전달하는 것이 현재 가능하다. 유전자가 현재 단순하게 하나의 식물로부터 동일 식물로, 또는 상이하지만 밀접하게 관련된 종으로 전달되기 보다 하나의 식물종으로부터 또 다른 식물종으로 전달될 수 있기 때문에, 이러한 방법은 식물의 품종 개량에 있어 매우 유리하다.

다중불포화 지방산의 분해는 다중불포화 지방산의 시스-시스 이중 결합에서 산소 첨가에 의해 시작된다. 이러한 반응은 식물, 동물 및 미생물에 존재하는 리폭시게나아제(EC 1.13.11.12) 효소에 의해 촉진된다. 지방산 히드로퍼옥시드라 불리는 산소 첨가된 생성물은 식물에서 많은 중요한 호르몬에 대한 전구체(예, 리폭신, 자스몬산, 트라우마산) 및 향미제/방향제 분자(예, 시스-3-헥센올, 1-옥텐-3-올)이다.

자스몬산과 같은 화합물은 알렌 옥시드 신타아제(AOS라 칭함) 및 알렌 옥시드 시클라아제(ACS라 칭함)-의존성 경로를 거쳐 13-히드로퍼옥시리놀레산과 같은 히드로퍼옥시드로부터 생성된다. 자스몬산은 옥타데카노이드 경로를 거쳐 스트레스 및 질환 내성 신호화 반응에 포함된다. 13-히드로퍼옥시리놀레산은 퍼옥시게나아제에 의해 이화되어 큐틴질 단량체가 형성될 수 있다. 대안적으로, 13-히드로퍼옥시리놀레산은 히드로퍼옥시드 리아제에 의해 이화되어 궁극적으로는 휘발성 알데히드 및 트라우마산이 형성된다.

지방산 히드로퍼옥시드 리아제(HPO 리아제)는 다중불포화 지방산 히드로퍼옥시드내의 탄소-탄소 결합의 분열을 촉진시켜 사슬이 짧은 알데히드 및 옥소-산을 생성시킨다[참고문헌 : Vick, et al. (1976) Plant Physiol. 57:780-788]. 사슬이 짧은 휘발성 알데히드와 같은 지방산 히드로퍼옥시드의 용해 생성물은 식물종에서 일반적이다. 사슬이 짧은 휘발성 알데히드는 다양한 식물의 잎, 야채 및 열매에서 "녹색 노우트"의 원인이 된다. "녹색 노우트"는 식용 식물 조직의 맛과 향의 품질에 기여하는 휘발성 분자이다. 이들 품질은 종종 연초록색, 또는 "녹색" 특성으로서 언급된다. 지방산 9-히드록퍼옥시드 리아제(9-HPO 리아제 또는 9-HPOL)에 의한 지방산 9-히드로퍼옥시드의 용해에 의해 생성된 (3Z,6Z)-노나디엔올과 같은 그 밖의 사슬이 짧은 휘발성 알데히드는 열매 및 야채에 멜론 향기 및/또는 멜론향, 또는 때때로 "멜론" 또는 "신선한" 특성으로도 언급되는 향을 제공한다. 이러한 특성은 향미제 및 착향제와 관련된 산업에 중요하다.

더욱이, 사슬이 짧은 알데히드는 또한 질병에 대한 내성과 관련되어 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 크로프트(Croft) 등[참고문헌: Plant Physiol. 101:13-24 (1993)]은 최근에 (3Z)-헥센올 및 (2E)-헥센알 수준이 강낭콩 식물에서의 과민 반응 동안 증가한다고 보고하였다. 또한, 이들은 (2E)-헨센알이 효과적인 항균제인 것을 입증하였다.

히드로퍼옥시드(HPO 리아제 또는 HPOL으로도 불리움)의 특성화는 식물 지방산 대사 시스템에 관한 추가의 연구에, 및 향기 및 향을 포함하여 증가된 감각기 특성에 의한 형질전환된 식물의 개발에 유용하다. 식물 메카니즘에 관한 연구는 식용 식물 조직의 감각기 품질을 증대시키거나, 조절하거나, 변형시키거나, 변경시키는 수단을 제공한다. 더욱이, HPO 리아제 및 이의 생성물의 생리학적인 역할을 밝히는 것은 HR 반응과 같은 질환 내성 반응의 추가의 연구에 유용할 수 있다. 유전자 공학에 적용하는데 유용할 수 있는 유전자 코딩 단백질의 핵산 서열이 특히 관심을 끈다.

본 발명은 식물에 유전자 공학 기술을 적용하는 것에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 식물의 히드로퍼옥시드 리아제 서열, 및 상기 서열을 사용하는 방법에 관한 것이다.

발명의 요약

본 발명은 히드로퍼옥시드 리아제(본원에서 HPO 리아제 및 HPOL로도 불리움) 및 특히 HPO 리아제 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 식물 공급원으로부터 유도된 것을 포함한다.

본 발명의 한 일면에 따르면, HPO 리아제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다. 특히, 13-HPO 리아제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리누클레오티드와 9-HPO 리아제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리누클레오티드가 제공된다.

본 발명의 한 일면은 부분적으로 또는 완전한 HPO 리아제 코딩화 서열을 포함하는 올리고누클레오티드와 관련된다.

HPO 리아제의 전사 또는 전사와 번역(발현)에 사용될 수 있는 재조합 DNA 구성물을 제공하는 것 또한 본 발명의 한 일면이다. 특히, 숙주 세포에서 전사 또는 전사와 번역을 할 수 있는 구성물이 제공된다. 특히 바람직한 구성물은 식물 세포에서 전사 또는 전사와 번역을 행할 수 있는 구성물이다.

본 발명의 또 다른 일면에 따르면, 숙주 세포 또는 이들의 자손에서 HPO 리아제를 생성시키기 위한 방법이 제공된다. 특히, 숙주 세포는 HPO 리아제의 전사 또는 전사와 번역에 사용될 수 있는 DNA 구성물에 의해 형질전환되거나 트렌스펙션된다. HPO 리아제를 함유하는 재조합 세포도 또한 본 발명의 일부에 속한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 효모, 박테리아, 곤충 및 식물 세포를 포함한다.

또 다른 일면에 따르면, 본 발명은 숙주 세포의 휘발성 내용물을 변형시키는데 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 및 식물 숙주 세포를 포함한다. 이러한 변형된 휘발성 내용물을 지니는 숙주 세포도 또한 그 안에서 주형화된다.

본 발명의 더욱 또 다른 일면에 따르면, 질환에 대한 변경된 반응을 갖는 숙주 식물을 생성시키는데 본 발명의 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 사용하는 방법이 제공된다.

HPO 리아제 단백질의 발현 억제에 의해 수득되어진 변형된 숙주 세포 및 오일도 또한 본 발명의 일부로서 간주된다.

도면의 간단한 설명

도 1은 아라비도프시스(Arabidopsis) HPO 리아제의 완전한 누클레오티드 서열을 도시하는 도면이다.

도 2는 피망 HPO 리아제와 아라비도프시스 HPO 리아제 유사 서열의 아미노산 서열을 비교하는 도면이다.

도 3은 아라비도프시스 알렌 옥시드 신타아제와 아라비도프시스 HPO 리아제 유사 서열의 아미노산 서열을 비교하는 도면이다.

도 4는 토마토의 HPO 리아제의 완전한 핵산 서열을 도시하는 도면이다.

도 5는 오이의 알렌 옥시드 신타아제의 완전한 누클레오티드 서열을 도시하는 도면이다.

도 6은 오이의 9-히드로퍼옥시드 리아제의 완전한 누클레오티드 서열을 도시하는 도면이다.

도 7은 보존된 펩티드 서열이 많은, 피망, 바나나 및 아라비도프시스 HPO 리아제 사이의 아미노산 서열 배열을 도시하는 도면이다.

도 8은 피망 HPOL (CaHPOL), 토마토 열매 HPOL (LeHPOL), 오이 배축 HPOL (CsC17HPOL, 슈도진(pseudo gene) 유전자), 아리비도프시스 개화 HPOL (AtHPOL), 바나나 잎 HPOL (MsHPOL), 오이 배축 9-HPOL (Cs15HPOL), 구아율 AOS (GuAOS), 아마씨 AOS (LiAOS) 및 아라비도프시스 AOS (AtAOS)의 핵산 서열(도 8a) 및 아미노산 서열(도 8b)에 대해 오른편 상단 코너에서는 퍼센트 유사성을 제공하고 오른편 하단 코너에서는 퍼센트 분산성을 나타내는 표이다.

도 9는 리놀레산 13-히드로퍼옥시드(도 9a) 및 리놀레산 9-히드로퍼옥시드(도 9b) 기질을 사용한 오이 9-HPO 리아제의 기체 크로마토그래피(GC) 분석을 나타내는 도면이다.

도 10은 리놀레산 13-히드로퍼옥시드 및 리놀레산 9-히드로퍼옥시드 기질을 사용하여 E. coli로부터 오이 9-HPO 리아제의 분광광도 검정 결과를 도시하는 도면이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 히드로퍼옥시드 리아제(본원에서는 HPO 리아제 및 HPOL로도 언급됨), 특히 식물원으로부터 HPO 리아제 단백질을 코딩시키는 단리된 HPO 리아제 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 히드로퍼옥시드 리아제는 식물 효소 반응성 조건하에서 지방산 히드로퍼옥시드로부터 사슬이 짧은 알데히드 및 옥사-산을 형성시키는 능력을 나타내는, 세포로부터 수득할 수 있는 폴리펩티드와 같이 숙주 세포원으로부터 아미노산을 코딩하는 어떠한 핵산 서열도 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "효소 반응성 조건"은 어떠한 필요 조건이 효소가 작용하도록 하는 환경(즉, 온도, pH, 억제 물질의 결여와 같은 인자)에서 이용될 수 있음을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "HPO 리아제 코딩화 서열"은 지방산 히드로퍼옥시드로부터 사슬이 짧은 알데히드 및 옥소-산을 생성시킬 수 있는 히드로퍼옥시드 리아제 폴리펩티드를 코딩시키는 어떠한 폴리누클레오티드 서열을 의미하는데 사용된다. HPO 리아제 코딩화 서열은 특별한 지방산 히드로퍼옥시드에 대하여 우선적으로 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 특별한 지방산 히드로퍼옥시드는 지방산 13-히드로퍼옥시드 및 지방산 9-히드로퍼옥시드를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "13-히드로퍼옥시드 리아제(13-HPO 리아제 또는 13-HPOL)는 지방산 13-히드로퍼옥시드로부터 사슬이 짧은 알데히드 및 옥소-산을 형성하는 어떠한 효소를 의미한다. 사슬이 짧은 알데히드의 예는 시스 3-헥센알을 포함하지만 이에 국한되지 않으며, 옥소-산의 예는 12-옥소-(9Z)도데세노산을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 지방산 13-히드로퍼옥시드의 예는 리놀레산 13-히드로퍼옥시드를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "9-히드로퍼옥시드 리아제(9HPO 리아제 또는 9-HPOL)는 지방산 9-히드로퍼옥시드로부터 사슬이 짧은 알데히드 및 옥소-산을 형성하는 어떠한 효소를 의미한다. 사슬이 짧은 알데히드의 예는 (3Z,6Z)-노나디엔알을 포함하지만 이에 국한되지 않으며, 옥소산의 예는 9-옥소-노나노산을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 지방산 9-히드로퍼옥시드의 예는 리놀레산 9-히드로퍼옥시드 또는 9-히드로퍼옥시드-(10E,12Z,15Z)-옥타데카디에노산을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.

단리된 단백질, 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드

본 발명의 첫 번째 일면은 단리된 HPO 리아제 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 폴리누클레오티드 서열은 서열표에 나타내어진 서열 및 상기 서열과 밀접하게 관련된 다른 폴리누클레오티드 서열 및 이들의 변형체의 군으로부터 선택된 추론된 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리누클레오티드를 포함한다.

본 발명은 서열표에 나타내어진 바와 같은 각각의 코딩 서열과 전체 길이에 걸쳐 동일한 폴리누클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 리더 또는 분비성 서열, 프리(pre)-, 프로(pro)- 또는 프레프로(prepro)-단백질 서열을 코딩하는 서열과 같은 그 밖의 코딩 서열을 갖는 리딩 프레임에서 성숙한 폴리펩티드 또는 이들의 단편에 대한 서열 뿐만 아니라 성숙한 폴리펩티드 또는 이들의 단편에 대한 코딩 서열을 제공한다. 폴리누클레오티드는 비코딩 서열, 예를 들어 전사되고 비번역된 서열, 종결 신호, 리보솜 결합 자리 및 mRNA를 안정화시키는 서열, 인트론, 폴리아데닐화 신호와 같은 비코딩 5' 및 3' 서열을 포함하며 이에 국한되지 않는 비코딩 서열, 및 추가의 아미노산을 코딩하는 추가의 코딩 서열을 포함한다. 예를 들어, 마커 서열은 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하기 위해 포함될 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 또한 유전자 발현을 조절하는 자연 관련 서열 및 구조 유전자를 포함하는 폴리누클레오티드를 포함한다.

본 발명은 또한 하기 화학식의 폴리누클레오티드를 포함한다 :

X-(R₁)_n-(R₂)-(R₃)_n-Y

상기 식에서, 5'말단에서 X는 수소이고, 3' 말단에서 Y는 수소 또는 금속이고, R₁및 R₃은 어떠한 핵산 잔기이고, n은 1 내지 3000, 바람직하게는 1 내지 1000 사이의 정수이고, R₂는 본 발명의 핵산 서열, 특히 서열표에 나타내어진 군으로부터 선택된 핵산 서열이다. 상기 화학식에서, R₂는 이의 5' 말단 잔기가 R₁에 결합된 상태로 좌측에, 이의 3' 말단 잔기가 R₃에 결합된 상태로 우측에 있도록 배향된다. R이 1을 초과하는 어느 R기에 의해 나타내어지는 핵산 잔기의 어떠한 스트레치도 이종중합체 또는 단일중합체일 수 있으며, 바람직하게는 이종중합체이다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드의 변이체를 코딩하는 본원에 기술된 폴리누클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 본 발명의 폴리누클레오티드의 단편인 변이체는 본 발명의 온길이 폴리누클레오티드를 합성하는데 사용될 수 있다. 바람직한 구체예는 본 발명의 폴리펩티드 서열의 5 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2, 1개 또는 0개의 아미노산 잔기가 어떠한 조합 형식으로든 치환되거나, 부가되거나, 삭제되는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리누클레오티드이다. 이들이 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드의 특성 또는 활성을 변경시키지 않도록 휴지 상태의 치환, 부가 및 삭제가 특히 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 전체 길이에 대하여 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리누클레오티드 및 상기 폴리누클레오티드에 상보적인 폴리누클레오티드에 50%, 60% 또는 70% 이상이 동일한 폴리누클레오티드가 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리누클레오티드 및 이에 상보적인 폴리누클레오티드에 전체 길이에 대하여 80% 이상이 동일한 영역을 포함하는 폴리누클레오티드가 더욱 바람직하다. 이와 관련하여, 전체 길이에 대하여 90% 이상이 동일한 폴리누클레오티드가 특히 바람직하며, 95% 이상이 동일한 폴리누클레오티드가 더욱 특히 바람직하다. 또한, 97% 이상이 동일한 폴리누클레오티드가 더 바람직하며 98% 및 99% 이상이 동일한 폴리누클레오티드가 더욱 더 바람직하고, 99% 이상이 동일한 폴리누클레오티드가 가장 바람직하다.

바람직한 구체예는 서열표에 나타내어진 폴리누클레오티드에 의해 코딩된 성숙한 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적인 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리누클레오티드이다.

본 발명은 또한 상기한 서열에 하이브리다이징되는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 엄격한 조건하에서 상기한 폴리누클레오티드에 하이브리다이징되는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "엄격한 조건" 및 "엄격한 하이브리다이제이션 조건"은 서열간에 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상 동일성이 존재하는 경우에 하이브리다이제이션이 일반적으로 일어날 것이라는 것을 의미한다. 엄격한 하이브리다이제이션 조건의 예는 50% 포름아미드, 5xSSC (150mM NaCl, 15mM 트리나트륨 시트레이트), 50mM 나트륨 포스페이트(pH 7.6), 5x덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 20㎍/ml의 변성되고 전단된 연어 정액 DNA를 함유하는 용액 및 42℃에서 하룻밤 인큐베이션시킨 후, 약 65℃에서 0.1xSSC중에서 하이브리다이제이션 지지물을 세척하는 것이다. 그 밖의 하이브리다이제이션 및 세척 조건은 널리 공지되어 있으며, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, cold Spring Harbor, NY (1989), particularly Chapter 11]에 예시되어 있다.

본 발명은 엄격한 하이브리다이제이션 조건하에서 서열표에 나타내어진 폴리누클레오티드 서열에 대하여 완전한 서열을 함유하는 적합한 라이브러리를 상기 폴리누클레오티드 서열 또는 이들의 단편의 서열을 갖는 프로브로 스크리닝하고; 상기 폴리누클레오티드 서열을 단리시킴으로써 수득될 수 있는 폴리누클레오티드로 필수적으로 구성되는 폴리누클레오티드를 제공한다. 상기 폴리누클레오티드를 수득하는데 유용한 단편은 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 프로브 및 프라이머를 포함한다.

본 발명의 폴리누클레오티드 검정법과 관련하여 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 본 발명의 폴리누클레오티드는 폴리펩티드를 코딩하는 온길이 cDNA 또는 게놈 클론을 단리시키고 서열표에 나타내어진 폴리누클레오티드와 매우 높은 서열 유사성을 갖는 cDNA 또는 게놈 클론을 단리시키기 위해 RNA, cDNA 또는 게놈 DNA에 대한 하이브리다이제이션 프로브로 사용될 수 있다. 상기 프로브는 일반적으로 15개 이상의 염기를 포함할 것이다. 바람직하게는, 상기 프로브는 30개 이상의 염기를 함유할 것이고, 50개 이상의 염기를 함유할 수 있다. 특히 바람직한 프로브는 30 내지 50개의 염기를 포함할 것이다.

서열표에 나타내어진 폴리누클레오티드 서열을 포함하거나 상기 서열에 의해 포함되어지는 각 유전자의 코딩 영역은 올리고누클레오티드 프로브를 합성하기 위해 서열표에 제공된 DNA 서열을 사용하여 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 그런 다음, 본 발명의 유전자의 서열에 상보적인 서열을 갖는 라벨링된 올리고누클레오티드는 프로브를 하이브리다이징시키는 다수의 라이브러리를 동정하기 위해 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된다. 예를 들어, HPO 리아제 EST 서열에 상응하는 합성 올리고누클레오티드가 제조된다. 올리고누클레오티드는 HPO 리아제 유전자의 5' 및 3' 말단 서열을 수득하기 위해 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 기술에서 프라이머로서 사용된다. 대안적으로, 낮은 축퇴의 올리고누클레오티드가 특별한 HPO 리아제 펩티드로부터 제조될 수 있는 경우에, 상기 프로브는 HPO 리아제 유전자 서열에 대해 유전자 라이브러리를 스크리닝하는데 직접 사용될 수 있다. 특히, 파아지 벡터에서 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것은 저수준의 바탕 하이브리다이제이션으로 인해 상기 방법에서 유용하다.

전형적으로, 핵산 프로브를 사용하여 수득할 수 있는 HPO 리아제 서열은 표적 HPO 리아제 서열과 프로브로서 사용되는 코딩화 서열 사이의 60-70% 서열 동일성을 나타낼 것이다. 그러나, 50-60% 정도의 서열 동일성을 갖는 긴 서열도 수득될 수 있다. 핵산 프로브는 핵산 서열의 긴 단편일 수 있거나, 짧은 올리고누클레오티드 프로브일 수 있다. 긴 핵산 단편이 프로브(약 100bp 보다 큰)로서 사용되는 경우, 프로브로서 사용된 서열로부터 20-50% 이탈부(즉, 50 내지 80% 서열 상동)를 갖는 표적 샘플로부터 서열을 수득하기 위해서는 보다 낮은 엄격한 조건에서 스크리닝할 수 있다. 올리고누클레오티드 프로브는 HPO 리아제 효소를 코딩하는 전체 핵산 서열보다 상당히 짧을 수 있지만, 약 10개 이상, 바람직하게는 15개 이상, 보다 바람직하게는 약 20개 이상의 누클레오티드이어야 한다. 고도의 서열 동일성은 짧은 영역이 긴 영역에 대립되는 것으로서 사용되는 경우에 요망된다. 이와 같이, 그밖에 관련된 HPO 리아제 유전자를 검출하고 회복시키기 위해 올리고누클레오티드 프로브를 설계하는데 고도로 보존된 아미노산 서열의 영역을 동정하는 것이 바람직할 수 있다. 짧은 프로브는 종종 특히 고도로 보존된 서열이 동정될 수 있는 경우에, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 특히 유용하다[참고문헌: Gould, et al., PNAS USA (1989) 86:1934-1938].

본 발명의 또 다른 일면은 HPO 리아제 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 폴리펩티드는 폴리펩티드 및 이들의 단편, 특히 HPO 리아제 활성을 나타내는 폴리펩티드, 및 또한 서열표에 나타내어진 서열의 군으로부터 선택된 폴리펩티드 서열에 50%, 60% 또는 70% 이상의 동일성, 바람직하게는 80% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드 뿐만 아니라 서열표에 나타내어진 단리된 폴리펩티드를 포함하며, 30개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 일부도 또한 포함한다.

당분야에 널리 인지되어 있는 바와 같이, "동일성"은 서열들을 비교함으로써 측정되는 바와 같이 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리누클레오티드 서열 사이의 관계이다. 당분야에서, "동일성"은 또한 이러한 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 측정되는 바와 같이 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드 서열 사이의 서열 관련 정도를 의미한다. "동일성"은 하기 참고문헌에 기술된 방법을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다 [참고문헌 : Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., Stockton Press, New York (1991); and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math, 48:1073 (1998)]. 동일성을 측정하는 방법은 시험된 서열 사이의 가장 큰 매치를 제공하도록 구상된다. 더욱이, 동일성을 측정하는 방법은 공용 프로그램으로 분류된다. 2개의 서열 사이의 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램은 GCG[Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 3897 (1984)]; 3개는 누클레오티드 서열 질문(BLASTIN, BLASTX 및 TBLASTX)으로 설계되고, 2개는 단백질 서열 질문(BLASTP 및 TBLASTN)으로 설계된 5개의 BLAST 프로그램의 세트[Coulson, Trends in Biotechnology, 12:76-80 (1994); Birren, et al., Genome Analysis, 1:543-559 (1997)]을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 공급원[BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)]으로부터 공용된다. 널리 공지된 스미쓰 워터맨(Smith Waterman) 연산법이 또한 동일성을 측정하는 데에 사용될 수 있다.

폴리펩티드 서열 비교를 위한 파라미터는 하기 사항을 포함하는 것이 통상적이다 :

연산법 : Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)

비교 매트릭스 : 헨티코프(Hentikoff) 및 헨티코프의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10915-10919 (1992)]으로부터의 BLOSSUM62

갭 페널티 : 12

갭 길이 페널티 : 4

이들 파라미터를 갖는 사용될 수 있는 프로그램은 위스콘신 매디슨에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)으로부터 "갭" 프로그램으로서 공용된다. 단부 갭에 대한 페널티가 없는 상기 파라미터는 펩티드 비교를 위한 비실행 파라미터이다.

폴리누클레오티드 서열 비교용 파라미터는 하기 사항을 포함한다 :

연산법 : Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)

비교 매트릭스 : 매치 = +10; 미스매치 = 0

갭 페널티 : 50

갭 길이 페널티 : 3

이들 파라미터를 갖는 사용될 수 있는 프로그램은 위스콘신 매디슨에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)으로부터 "갭" 프로그램으로서 공용된다. 상기 파라미터는 핵산 비교를 위한 비실행 파라미터이다.

본 발명은 또한 하기 화학식의 폴리펩티드를 포함한다 :

X-(R₁)_n-(R₂)-(R₃)_n-Y

상기식에서,

아미노 말단에서, X는 수소이고, 카르복실 말단에서, Y는 수소 또는 금속이며,

R₁및 R₃는 아미노산 잔기이고,

n은 1 내지 1000의 정수이고,

R₂는 본 발명의 아미노산 서열, 특히 서열표에 기재된 군으로부터 선택된 아미노산 서열이다.

상기 식에서, R₂는 이것의 아미노 말단 잔기가 R₁에 결합되어 좌측에 있고, 이것의 카르복실 말단 잔기가 R₃에 결합되어 우측에 있도록 배향된다. R 기(여기에서, R은 1보다 크다)에 의해 표시되는 아미노산 잔기의 임의의 스트레치는 이종 중합체 또는 동종 중합체, 바람직하게는 이종 중합체이다.

본 발명의 폴리펩티드는 성숙 단백질일 수 있거나, 융합 단백질의 일부일 수 있다.

폴리펩티드의 단편 및 변형체가 또한 본 발명의 일부인 것으로 여겨진다. 단편은 상기 기술된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 전부가 아닌 일부와 전체적으로 동일한 아미노산을 갖는 변형된 폴리펩티드이다. 단편은 "프리-스탠딩"일 수 있거나, 단편이 일부 또는 한 영역을, 바람직하게는 단일 연속 영역으로서 형성하는 더 큰 폴리펩티드 내에서 이루어질 수 있다. 바람직한 단편은 유사한 활성 또는 개선된 활성을 갖거나 감소된 활성을 갖는 것을 포함하여 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 조절하는 단편인 생물학적 활성 단편이다. 또한, 동물, 특히 사람에게서 항원성이거나 면역원성인 단편이 포함된다.

폴리펩티드의 변형체는 또한, 유사한 특징을 갖는 또 다른 치환체 의한 잔류물의 치환인 보존성 아미노산 치환에 의해 서열표에 기재된 서열로부터 변하는 폴리펩티드이다. 일반적으로, 이러한 치환은 Ala, Val, Leu 및 Ile 중에서; Ser과 Thr 사이에서; Asp와 Glu 사이에서; Asn과 Gln 사이에서; Lys와 Arg 사이에서; 또는 Phe와 Thr 사이에서 이루어진다. 임의의 조합물에서 5 내지 10개; 1 내지 5개; 1 내지 3개 또는 1개의 아미노산이 치환되거나, 결실되거나, 첨가된 변형체가 특히 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드의 단편인 변형체가 펩티드 합성에 의해 상응하는 온길이 폴리펩티드를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 이들 변형체는 본 발명의 온길이 폴리펩티드를 생성시키기 위한 중간생성물로서 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드는 예를 들어 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이 식물 숙주 세포와 같은 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 성숙 단백질 및 추가의 아미노 또는 카르복실 말단 아미노산, 또는 성숙 폴리펩티드 내의 아미노산(예를 들어, 단백질의 성숙 형태가 하나보다 많은 폴리펩티드 사슬을 갖는 경우)인 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 이러한 서열은 예를 들어, 전구물질로부터 성숙 형태로 단백질을 처리하는 역할을 하거나, 단백질 운반을 제공하거나, 단백질 반감기를 단축 또는 연장시키거나, 검정 또는 생성에서 단백질의 조절을 촉진시킬 수 있다. 세포 효소가 성숙 단백질로부터 임의의 추가의 아미노산을 제거하기 위해 사용될 수 있다.

하나 이상의 프로서열에 융합된 폴리펩티드의 성숙 형태를 갖는 전구물질 단백질은 폴리펩티드의 비활성 형태일 수 있다. 비활성 전구물질은 프로서열이 제거되는 경우에 활성화되는 것이 일반적이다. 프로서열의 일부 또는 전부는 활성화 전에 제거될 수 있다. 이러한 전구물질 단백질은 일반적으로 프로단백질로 불리운다.

하기에 제공되는 실시예에서, 아라비도프시스로부터의 핵산 서열이 피망 HPO 리아제와 매우 유사한 진뱅크로부터 확인된다. 아라비도프시스 서열은 알렌 옥시드 합성 효소를 코드화하는 것으로 이미 공지되어 있다.

피망 HPO 리아제, 아라비도프시스 알렌 옥시드 합성 효소[Laudert, et al. (1996) Plant Mol Biol 31(2)323-335] 및 진뱅크로부터의 아라비도프시스 서열 사이의 핵산 서열 비교는 알렌 옥시드 핵산 합성 효소보다 피망 HPO 리아제와 더 유사함을 제시한다.

또한, 하기의 실시예에는, 오이(쿠쿰바 사티부스)로부터의 핵산 서열이 오이 배축으로부터 단리된 전체 RNA로부터 이루어진 cDNA로부터 확인된다. 온길이 코드화 서열이 수득되고, 온길이 서열에 의해 코드화된 생성물은 (3Z, 6Z)-노나디에날 및 9-옥소-노난산을 생성시키기 위한 기질 리놀레산 9-히드로퍼옥시드에 대한 활성을 나타낸다.

식물 구성물 및 사용방법

숙주 세포에서 본 발명의 HPO 리아제 서열의 전사 또는 전사와 번역(발현)을 위해서는, 재조합 DNA 구성물에 누클레오티드 서열을 사용하는 것이 중요하다. 숙주 식물 세포에서 본 발명의 HPO 리아제 서열의 전사 또는 전사와 번역(발현)을 위해서는, 재조합 DNA 구성물에 본 발명의 폴리누클레오티드 서열을 사용하는 것이 특히 중요하다.

발현 구성물은 본 발명의 HPO 리아제를 코드화하는 핵산 서열에 조작적으로 결합된 숙주 세포에서 작용성인 프로모터 및 숙주 식물 세포에서 작용성인 전사 말단 영역을 포함하는 것이 일반적이다. 식물 숙주 세포에서 작용성인 프로모터(또는 전사 개시 영역으로 언급됨)를 사용하는 것이 특히 중요하다.

당업자들은 많은 프로모터가 식물 세포에서 작용성이고 관련 문헌에 기술되어 있음을 인지할 것이다. 엽록체 및 색소체 특이적 프로모터, 엽록체 또는 색소체 작용성 프로모터, 및 엽록체 또는 색소체 작동 프로모터가 또한 구상된다.

식물 세포에서 작용성인 한세트의 프로모터는 대부분의 식물 기관에서 고도의 발현을 제공하는 CaMV35S 또는 FMV35S 프로모터와 같은 구조적 프로모터이다. CaMV35S 또는 FMV35S 프로모터의 증강되거나 중복된 변형체가 본 발명의 실시에 유용하다 [참조 : Odell, et al. (1985) Nature 313:810-812; Rogers, U.S. Patent Number 5,378,619]. 그 외에, 잎, 줄기, 뿌리, 덩이줄기, 종자, 과실 등과 같은 식물의 특정 조직에서 HPO 리아제 유전자를 발현시키는 것이 또한 바람직할 수 있고, 선택된 프로모터는 바람직한 조직 및 발육 특이성을 가져야 한다.

식물 종자 조직에서 우선적으로 발현되는 전사 개시 영역으로부터 본 발명의 핵산 서열을 발현시키는 것이 특히 중요하다. 이러한 종자 우선적 전사 개시 서열의 예로는 식물 저장 단백질 유전자를 코드화하는 서열 또는 유지 종자에서 지방산 생합성에 수반되는 유전자로부터 유도되는 서열이 있다. 이러한 프로모터의 예로는 나핀[Kridl et al., Seed Sci. Res. 1:209:219 (1991)], 파세올린, 제인, 콩 트립신 억제제, ACP, 스테아로일-ACP 탈포화효소, β-콘글리신의 콩 α' 서브유닛[soy 7s, (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:8560-8564 (1986))] 및 올레오신과 같은 유전자로부터의 5' 조절 영역이 있다.

특정 아세포 구획, 예를 들어 미토콘드리온, 내형질세망, 액포, 엽록체 또는 다른 색소체 구획에 단백질 제공 HPO 리아제를 편재화시키는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 관심있는 유전자가 엽록체와 같은 색소체에 대해 표적화될 경우, 예를 들어 구성물은 또한 색소체에 유전자를 이동시키기 위한 서열의 사용을 이용할 것이다. 이러한 서열은 본원에서 엽록체 전사 펩티드(CTP) 또는 색소체 전사 펩티드(PTP)로서 언급된다. 상기 방식으로, 관심있는 유전자가 색소체 내로 직접 삽입되는 경우, 발현 구성물은 전사 펩티드를 코드화하는 유전자를 부가적으로 함유하여 관심있는 유전자를 색소체로 이동시킬 것이다. 엽록체 전사 펩티드는 관심있는 유전자로부터 유도될 수 있거나, CTP를 갖는 이종 서열로부터 유도될 수 있다. 이러한 전사 펩티드는 당분야에 공지되어 있다 [참조예 : Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res Common. 196:1414-1421; and Shah et al. (1986) Science 233:478-481].

예정된 용도에 의존하여, 구성물은 전체 HPO 리아제 단백질, 또는 이것의 일부를 코드화하는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 주어진 HPO 리아제 단백질의 안티센스 억제가 바람직한 경우, 전체 HPO 리아제 서열은 필요하지 않다. 또한, 구성물에 사용되는 HPO 리아제 서열이 프로브로서 사용되도록 예정된 경우, HPO 리아제 서열, 예를 들어 고도로 보존된 HPO 리아제 영역을 코드화키는 것으로 발견된 서열의 특정 부분만을 함유하는 구성물을 제조하는 것이 유리할 수 있다.

당업자는 숙주 세포에서 내인성 서열의 발현을 억제하는 다양한 방법이 있음을 인지할 것이다. 이러한 방법은 안티센스 억제[Smith, et al. (1988) Nature 334:724-726], 동시 억제[Napoli, et al. (1989) Plant Cell 2:279-289], 리보자임[PCT Publication WO 97/10328], 및 센스와 안티센스의 조합[Waterhous, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959-13964]. 숙주 세포에서 내인성 서열을 억제하는 방법은 억제시키려는 서열의 일부 이상의 전사 또는 전사와 번역을 사용하는 것이 통상적이다. 이러한 서열은 내인성 서열의 코드화 및 비코드화 영역에 상동일 수 있다.

조절 전사 종결 영역이 또한 본 발명의 식물 발현 구성물에 제공될 수 있다. 전사 종결 영역은 HPO를 코드화하는 DNA 서열, 또는 상이한 유전자 공급원으로부터 유도되는 편리한 전사 종결 영역, 예를 들어 전사 개시 영역과 자연적으로 관련된 전사 종결 영역에 의해 제공될 수 있다. 당업자는 식물 세포에서 전사를 종결시킬 수 있는 임의의 편리한 전사 종결 영역이 본 발명의 구성물에 사용될 수 있다.

대안적으로, 구성물은 숙주 식물 세포 색소체로부터 직접 HPO 리아제 서열을 발현시키도록 제조될 수 있다. 이러한 구성물 및 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Svab, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530 and Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917] 및 미국 특허 제5,693,507호에 공지되어 있는 것이 일반적이다.

발현 구성물을 함유하는 재조합 DNA 구성물이 도입된 식물 세포, 조직, 기관 또는 식물이 형질전환되고, 형질감염되고 유전자교환되는 것으로 여겨진다. 유전자 교환 또는 형질전환된 세포 또는 식물은 또한, 세포 또는 식물의 자손, 및 교배에서 모체와 같은 유전자 교환 식물을 사용하는 번식 프로그램으로부터 생성되고, HPO 리아제 핵산 서열의 존재로부터 유발되는 변경된 표현형을 나타내는 자손을 포함한다.

증가되거나 감소된 발현을 위해 관심있는 DNA 서열로서 HPO 리아제를 갖는 식물 발현 또는 전사 구성물이 매우 다양한 식물 수명으로, 특히 식용 및 공업용의 식물유를 생성시키는 데에 수반되는 식물 수명으로 사용될 수 있다. 종자, 과실, 식물 및 잎 작물이 가장 바람직하다. 관심있는 식물은 평지씨(카놀라 및 고 에루스산 변형체), 해바라기, 잇꽃, 목화, 콩, 땅콩, 코코넛 및 야자유, 옥수수, 토마토, 딸기, 피망 및 멜론이 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 재조합 구성물을 숙주 세포에 도입시키기 위한 방법에 의존하여, 다른 DNA 서열이 필요할 수 있다. 중요하게는, 본 발명은 쌍자엽식물 및 단자엽식물에 유사하게 적용될 수 있고, 새롭고/거나 개선된 형질전환 및 조절 기술에 쉽게 적용될 수 있을 것이다.

특히 관심있는 것은, HPO 리아제 구성물을 식물에서 사용하여, 휘발물함량이 변화된, 식물, 또는 잎, 줄기, 뿌리, 복제물 및 종자를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 식물 일부를 생성시키는 것이다.

유전자 서열은 특히, 식물 우선적 서열을 제공하는 것이 바람직한 경우에, 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있는 것으로 숙고된다. 따라서, 바람직한 구조 유전자의 전부 또는 일부 (HPO 리아제 단백질을 코드화하는 유전자의 일부)는 선택된 숙주에 의해 우선되는 코돈을 사용하여 합성될 수 있다. 숙주 우선적 코돈은 예를 들어, 바람직한 숙주 종에서 발현되는 단백질에서 가장 자주 사용되는 코돈으로부터 결정될 수 있다.

당업자라면 항체 제제, 핵산 프로브(DNA 및 RNA) 등이 다수의 식물 공급원으로부터 "상동" 또는 "관련" 서열을 스크리닝하여 회수하기 위해 제조되고, 사용될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 상동 서열은 서열의 동일성이 있는 경우에 발견되며, 이는 서열 정보, 핵산 또는 아미노산의 비교시에 또는 공지된 HPO LYASE와 후보체 공급원 간의 하이브리드화 반응을 통해 결정될 수 있다. 보존적 변형, 예를 들어 Glu/Asp, Val/Ile, Ser/Thr, Arg/Lys 및 Gln/Asn이 서열 상동성을 결정하는데 또한 고려될 수 있다. 아미노산 서열은 두 개의 완전한 성숙 단백질 간의 서열 동일성이 25%로 적은 경우에 상동인 것으로 간주된다. [참조: Doolittle, R.F., OF URFS and ORFS (University Science Books, CA, 1986)]

따라서, 그 밖의 HPO 리아제는 본원에 제공된 특정 서열로부터 수득될 수 있다. 또한, 예시된 HPO 리아제 서열 및 이러한 예시된 서열을 사용하여 수득한 서열로부터의 합성 단백질 모델링을 위한 변형된 아미노산 서열과 출발 물질을 포함하는 천연 및 합성 서열을 수득할 수 있음은 명백할 것이다. 변형된 아미노산 서열로는, 부분적으로 합성되건 온전히 합성되건, 변이된 서열, 트렁케이팅된(truncated) 서열, 증대된 서열 등이 있다. 식물 제제로부터 실제로 정제되거나 동일하거나 이것과 동일한 단백질을 코드화하는 서열은, 단백질 또는 서열을 얻기 위해 사용한 방법과 무관하게, 천연 유도된 것으로 동일하게 간주된다.

면역학적 스크리닝을 위해, 단백질에 대한 항체가, 토끼 또는 마우스에게 정제된 단백질 또는 이것의 일부를 주입시킴으로써 제조될 수 있으며, 이러한 항체 제조 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 모노클로날 또는 폴리클로날 항체가 생성될 수 있지만, 전형적으로 폴리클로날 항체가 유전자 단리를 위해 더욱 유용하다. 웨스턴 분석은 관련 단백질이 바람직한 식물 종의 미정제 추출물에 존재하는 지를 결정하기 위해 수행될 수 있으며, 코드화된 단백질에 대한 항체와의 교차 반응에 의해 결정된다. 교차 반응성이 관찰된 경우, 관련 단백질을 코드화하는 유전자는 바람직한 식물 종을 나타내는 발현 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리된다. 발현 라이브러리는 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York]에 기재된 람다 gt11을 포함하여 다수의 시판 벡터에서 구성될 수 있다.

가능한 숙주 세포로는 원핵 세포 및 진핵 세포 둘 모두가 있다. 숙주 세포는 의도하는 용도에 따라 단세포일 수 있거나 다세포계의 분화되거나 미분화된 생물체에서 발견될 수 있다. 본 발명의 세포는 존재하는 야생형 세포에 대해 외래인 HPO 리아제를 가짐으로써, 예를 들어 숙주 종에 대해 고유하지 않은 HPO 리아제를 코드화하는 재조합 핵산 구성물을 가짐으로써 구별될 수 있다. 바람직한 숙주 세포로는 박테리아, 효모, 곤충, 포유동물 및 식물 숙주 세포가 있다. 특히 바람직한 숙주 세포로는 효모 및 식물 숙주 세포가 있다.

원핵 세포로는 그람 네거티브 박테리아 뿐만 아니라 그람 포지티브 박테리아, 예를 들어 대장균 및 바실루스 서브틸리스 스트레인이 있다. 적합한 예는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 하기 시시예에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 오이 배축으로부터 단리된 HPO 리아제는 대장균 스트레인 M15에서 발현된다. 대장균으로부터 발현된 단백질은 리놀레산 9-히드로퍼옥시드로부터 알데히드 3(Z)-논에날(nonenal) 및 2(E)-논에날을 생성시킬 수 있다. 따라서, 오이 배축으로부터 단리된 HPO 리아제는 9-HPO 리아제를 코드화시킨다.

진핵 숙주 세포로는 효모를 포함하는 균류, 곤충 세포 및 식물 세포가 있다. 효모 세포에서 관심있는 DNA 서열을 발현시키는 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 문헌["Guide to yeast genetics and molecular biology", Guthrie and Fink, eds. Methods in enzymology, Academic Press, Inc. Vol 194 (1991) and "Gene expression technology", Goeddel ed, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., Vol 185 (1991)]에 개괄적으로 기재되어 있다. 또한, HPO 리아제 유전자를 발현시키는 방법은 본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 유럽 특허 출원 EP 0 801 133 A2에 기재되어 있다.

균류 재조합 벡터는 재조합 DNA 방법에 통상 적용될 수 있는 임의의 벡터일 수 있다. 벡터의 선택은, 벡터를 도입시키려는 균류 숙주 세포와 벡터의 양립가능성에 좌우되는 것이 전형적일 것이다. 벡터는 선형 또는 폐환 플라스미드일 수 있다. 벡터 시스템은 하나의 벡터 또는 플라스미드, 또는 균류 숙주의 게놈에 도입시키려는 전체 DNA를 함께 함유하는 두 개 이상의 벡터 또는 플라스미드일 수 있다.

균류 벡터는 자체 복제성 벡터, 즉, 염색체외 물질로 존재하며, 복제가 염색체 복제와 무관한 벡터, 예를 들어 플라스미드, 염색체외 엘리먼트, 미소염색체(minichromosome), 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자체 복제를 보장하는 임의의 수단을 함유할 수 있다. 대안적으로, 벡터는, 균류 세포에 도입되는 경우, 게놈에 삽입되어, 이것이 삽입된 염색체(들)과 함께 복제되는 벡터일 수 있다. 삽입을 위해, 벡터는 상동 재조합 또는 비상동 재조합에 의해 벡터를 게놈에 삽입시키기 위한 벡터의 핵산 서열에 좌우될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 상동 재조합에 의해 균류 숙주의 게놈내로의 삽입을 유도시키는 추가의 핵산 서열을 함유할 수 있다. 추가의 핵산 서열에 의해, 벡터는 숙주 세포내에, 염색체(들)의 정확한 위치(들)에 삽입될 수 있다. 정확한 위치에 삽입될 가능성을 높이기 위해, 상동 재조합의 가능성을 높이기 위한 상응하는 표적 서열과 고도로 상동인 충분한 수의 핵산, 바람직하게는 400bp 내지 1500bp, 더욱 바람직하게는 800bp 내지 1000bp를 각각 함유하는 두 개의 핵산 서열이 바람직하게는 존재해야 한다. 이들 핵산 서열은 균류 숙주 세포의 게놈 내의 표적 서열과 상동인 임의의 서열일 수 있으며, 또한, 비코딩 또는 코딩 서열일 수 있다.

자체 복제를 위해, 벡터는 해당 숙주 세포에서 자체 복제할 수 있게 하는 복제 기원을 추가로 포함할 수 있다. 효모 숙주 세포에서 사용되는 복제 기원의 예로는 2 미크론 복제 기원 및 CEN3과 ARS1의 조합물이 있다. 선택된 균류 숙주 세포와 양립가능한 임의의 복제 기원이 사용될 수 있다.

본 발명의 균류 벡터는 형질전환된 세포의 선택을 용이하게 하는 하나 이상의 선택성 마커를 함유하는 것이 바람직하다. 선택성 마커는 예를 들어, 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속 내성, 독립영양체에 대한 원영양성 등을 제공하는 생성물을 발현시키는 유전자이다. 선택성 마커는 amdS(아세트아미다아제), argB(오르니틴 카바모일트란스퍼라아제), bar(포스피노트리신 아세틸트란스퍼라아제), hygB(히그로마이신 포스포트란스퍼라아제), niaD(니트레이트 환원효소), pyrG(오로티딘-5'-포스페이트데카르복실라아제) 및 sC(술페이트 아데닐트란스퍼라아제) 및 trpC(안트라닐레이트 신타아제)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 아스퍼길루스(Aspergillus) 세포에서 사용하기에 바람직한 마커로는 아스퍼길루스 니둘란스(nidulans) 또는 아스퍼길루스 오리재(oryzae)의 amdS 및 pyrG 마커, 및 스트렙토마이시스 히그로스코피쿠스의 bar 마커가 있다. 또한, 선택은 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 WO 91/17243호에 기재된 동시-형질전환(co-transformation)에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 적합한 프로모터 서열에 작동적으로 결합될 수 있다. 프로모터 서열은 핵산 서열의 발현을 위해 균류 숙주 세포에 의해 인식되는 핵산 서열이다. 프로모터 서열은 단백질 또는 이것의 단편의 발현을 매개하는 전사 및 번역 조절 서열을 함유한다.

프로모터는 선택된 균류 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 핵산 서열일 수 있으며, 숙주 세포에 동종이거나 이종인 폴리펩티드를 코드화하는 유전자로부터 수득될 수 있다. 섬사상 균류 숙주에서 본 발명의 핵산 구성물을 전사시키기 위해 적합한 프로모터의 예로는 아스퍼길루스 오리재 TAKA 아밀라아제, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 아스파르트산 프로테이나아제, 아스퍼길루스 니거(niger) 또는 아스퍼길루스 아와모리(awamori) 알칼리 프로테아제, 아스퍼길루스 오리재 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 아스퍼길루스 니둘란스 아세트아미다아제 및 이들의 하이브리드가 있다. 효모 숙주의 경우, 유용한 프로모터는 사카로마이시스 세리비시애(Saccharomyces cerevisiae) 에놀라아제(eno-1) 프로모터이다. 특히 바람직한 프로모터는 TAKA 아밀라아제, NA2-tpi (아스퍼길루스 니거 중성 알파-아밀라아제 및 아스퍼길루스 오리재 트리오스 포스페이트 이소머라아제로부터의 프로모터의 하이브리드) 및 glaA 프로모터이다.

본 발명의 단백질 또는 이것의 단편을 코드화하는 핵산 분자는 이것의 3' 말단에서 종결 서열에 또한 작동적으로 결합될 수 있다. 종결 서열은 단백질 또는 이것의 단편을 코드화하는 핵산 서열에 고유할 수 있거나 외래 공급원으로부터 수득될 수 있다. 선택된 균류 숙주 세포에서 기능성인 임의의 종결제가 본 발명에서 사용될 수 있지만, 특히 바람직한 종결제는 아스퍼길루스 오리재 TAKA 아밀라아제, 아스퍼길루스 니거 글루코아밀라아제, 아스퍼길루스 니둘란스 안트라닐레이트 신타아제, 아스퍼길루스 니거 알파-글루코시다아제 및 사카로마이시스 세레비시애 에놀라아제를 코드화하는 유전자로부터 수득된다.

본 발명의 단백질 또는 이것의 단편을 코드화하는 핵산 분자는 적합한 리더 서열에 또한 작동적으로 결합될 수 있다. 리더 서열은 균류 숙주에 의한 번역에서 중요한 mRNA의 비번역되는 영역이다. 리더 서열은 단백질 또는 이것의 단편을 코드화하느 핵산 서열의 5' 말단에 작동적으로 결합된다. 리더 서열은 단백질 또는 이것의 단편을 코드화하는 핵산 서열에 고유할 수 있거나 외래 공급원으로부터 수득될 수 있다. 선택된 균류 숙주 세포에서 기능성인 임의의 리더 서열이 본 발명에서 사용될 수 있지만, 특히 바람직한 리더는 아스퍼길루스 오리재 TAKA 아밀라아제 및 아스퍼길루스 오리재 트리오스 포스페이트 이소머라아제로부터 수득된다.

폴리아데닐화 서열은 본 발명의 핵산 서열의 3' 말단에 또한 작동적으로 결합될 수 있다. 폴리아데닐화 서열은 전사되는 경우, 균류 숙주에 의해 인식되어, 전사된 mRNA에 폴리아데노신 잔기를 첨가시키는 서열이다. 폴리아데닐화 서열은 단백질 또는 이것의 단편을 코드화하는 핵산 서열에 고유할 수 있거나 외래 공급원으로부터 수득될 수 있다. 선택된 균류 숙주에서 기능성인 임의의 폴리아데닐화 서열은 본 발명에서 사용될 수 있지만, 특히 바람직한 폴리아데닐화 서열은 아스퍼길루스 오리재 TAKA 아밀라아제, 아스퍼길루스 니거 글루코아밀라아제, 아스퍼길루스 니둘란스 안트라닐레이트 신타아제 및 아스퍼길루스 니거 알파-글루코시다아제를 코드화하는 유전자로부터 수득된다.

단백질 또는 이것의 단편을 수득하기 위해 세포를 파괴시키는 것을 방지하고, 발현된 단백질 또는 이것의 단편이 세포 내에서 분해될 수 있는 양을 최소화시키기 위해, 단백질 또는 이것의 단편의 발현이 세포외에서 분비되는 생성물을 생성시키는 것이 바람직하다. 이를 위해, 본 발명의 단백질 또는 이것의 단편은 단백질 또는 이것의 단편의 아미노 말단에 결합되어 있는 신호 펩티드에 결합될 수 있다. 신호 펩티드는 단백질 또는 이것의 단편을 균류 숙주로부터 배지로 분비되게 할 수 있는 아미노산 서열이다. 신호 펩티드는 본 발명의 단백질 또는 이것의 단편에 고유할 수 있거나 외래 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열의 코딩 서열의 5' 말단은 번역 리딩 프레임적으로 분비 단백질 또는 이것의 단편을 코드화하는 코딩 영역의 단편과 천연적으로 결합된 신호 펩티드 코딩 서열을 본래 함유할 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열의 5' 말단은 분비 단백질 또는 이것의 단편을 코드화하는 코딩 서열의 일부에 대해 외래인 신호 펩티드 코딩 영역을 함유할 수 있다. 외래 신호 펩티드는 코딩 서열이 신호 펩티드 코딩 영역을 정상적으로 함유하지 않는 경우에 필요할 수 있다. 대안적으로, 외래 신호 펩티드는 바람직한 단백질 또는 이것의 단편의 분비를 개선시키기 위해 천연 신호 펩티드를 간단히 대체할 수 있다. 외래 신호 펩티드 코딩 영역은 아스퍼길루스 종으로부터의 글루코아밀라아제 또는 아밀라아제 유전자, 리조무코르 미에헤이로부터의 리파아제 또는 프로테이나아제 유전자, 사카로마이시스 세레비시애로부터의 알파 인자에 대한 유전자 또는 소 프리프로키모신 유전자로부터 수득될 수 있다. 균류 숙주 세포에 대한 효과적인 신호 펩티드로는 아스퍼길루스 오리재 TAKA 아밀라아제 신호, 아스퍼길루스 니거 중성 아밀라아제 신호, 리조무코르 미에헤이 아스파르트산 프로테이나아제 신호, 휴미콜라 라누기노수스(Humicola lanuginosus) 셀룰라아제 신호 또는 리조무코르 미에헤이 리파아제 신호가 있다. 그러나, 단백질 또는 이것의 단편이 선택된 균류 숙주에서 분비되게 할 수 있는 임의의 신호 펩티드가 본 발명에서 사용될 수 있다.

본 발명의 단백질 또는 이것의 단편을 코드화하는 핵산 분자는 프로펩티드 코딩 영역에 또한 결합될 수 있다. 프로펩티드는 아프로프로테인 또는 프로엔자임의 아미노 말단에서 발견되는 아미노산 서열이다. 프로프로테인으로부터 프로펩티드를 분해하면 성숙한 생화학적 활성 단백질이 생성된다. 생성된 폴리펩티드는 프로폴리펩티드 또는 프로엔자임 (또는 몇몇 경우에 자이모겐(zymogen))으로서 공지되어 있다. 프로폴리펩티드는 일반적으로 불활성 상태이며, 프로폴리펩티드 또는 프로엔자임으로부터 프로펩티드를 촉매 분해 또는 자가촉매 분해에 의해 성숙한 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 코딩 영역은 단백질 또는 이것의 단편에 대해 고유할 수 있거나 외래 공급원으로부터 수득될 수 있다. 외래 프로펩티드 코딩 영역은 사카로마이시스 세레비시애 알파-인자 유전자 또는 미셀리오프토라 더모필리아 (Myceliophthora thermophilia) 락카아제 유전자로부터 수득될 수 있다 (참조: WO 95/33836, 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음).

본 발명의 재조합 발현 벡터를 구성하기 위해 상기 기재된 엘리먼트를 연결시키는데 사용되는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다 [참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)].

또한, 본 발명은, 본 발명의 재조합 벡터와 함께 유리하게 사용되는 본 발명의 방법에 의해 생성된 재조합 균류 숙주 세포에 관한 것이다. 세포는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 후, 벡터가 숙주 염색체에 삽입되는 것이 바람직하다. 균류 숙주 세포의 선택은 주로 단백질 또는 이것의 단편 및 이것의 공급원에 좌우될 것이다. 균류 숙주 세포는 예를 들어, 효모 세포 또는 섬사상 균류 세포일 수 있다.

본원에 사용된 "효모"로는 아스코스포로제너스(Ascosporogenous) 효모 (Endomycetales), 바시디오스포로제너스(Basidiosporogenous) 효모 및 펀지 임퍼펙티(Fungi Imperfecti)(Blastomycetes)에 속하는 효모가 있다. 아스코스포로제너스 효모는 스퍼모프토라세애(Spermophthoraceae) 및 사카로마이세타세애(Saccharomyccetaceae) 과(family)로 나뉜다. 후자의 과는 4개의 아과(subfamily), 스키조사카로마이코이데애(Schizosaccharomycoideae)(예를 들어, 스키조사카로마이시스(Schizosaccharomyces) 속), 나드소니오이데애(Nadsonioideae), 리포마시코이데애(Lipomycoideae) 및 사카로마이코데애(Saccharomycoideae) (예를 들어, 속 피키아(Pichia), 클루이베로마이시스(Kluyveromyces) 및 사카로마이시스(Saccharomyces))로 구성되어 있다. 바시디오스포로제너스(Basidioporogenous) 효모로는 루코스포리딤(Leucosporidim), 로도스포리디움(Rhodosporidium), 스포리디오볼루스(Sporidiobolus), 피로바시디움(Filobasidium) 및 필로바시디엘라(Filobasidiella). 펑기 임페르펙티(Fungi Imperfecti)에 속하는 효모는 두개의 부류, 즉 스포로볼로미세타세아에(Sporobolomycetaceae)(예를 들어, 소로볼로미세스(Sorobolomyces) 및 불러라(Bullera)속)) 및 크립토콕카세아에(Cryptococcaceae)(예를 들어, 칸디다(Candida)속)로 나뉜다. 효모에 대한 분류는 차후에 변경될 수 있기 때문에, 본 발명을 위해 효모는 문헌에 기재된 바와 같이 정의될 것이다[참고: Biology and Activities of Yeast, Skinner et al., Soc. App. Bacteril. symposium Series No. 9, (1980), 본원에서 참고 문헌으로 인용됨]. 효모의 생물학 및 효모 유전적 특질의 조작은 당해기술분야에 공지되어 있다[참조예: Biochemistry and Genetics of Yeast, Bacil et al.(ed.), 2nd edition, 1987; The Yeasts, Rose and Harrison(eds.), 2nd ed.,(1987); and the Molecular Biology of the Yeast Saccharromyces, Strathern et al.(eds), (1981), 모두 본원에 참고 문헌으로 인용됨].

본 발명의 재조합 진균 숙주 세포는, 단백질 또는 이의 단편의 발현에 유리한 하나 이상의 인자, 예를 들어, 활성물질(예컨대, 트랜스 작용 인자), 카페론 및 프로세싱 프로테아제를 코드화하는 하나 이상의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 이러한 인자를 코드화하는 핵산은 바람직하게는 단백질 또는 이의 단편을 코드화하는 핵산에 작용가능하게 연결되지 않는다. 활성 물질은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열의 전사를 활성화시키는 단백질이다[참조: Kudla et al., EMBO 9:1355-1364(1990); Jarai and Buxton, Current Genetics 26:2238-244(1994); Verdier, Yeast 6:271-297(1990), 이들 문헌은 모두 참고 문헌으로 인용됨]. 활성물질을 코드화하는 핵산 서열은 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 힘 활성물질 단백질 1(hap1), 사카로미세스 세레비시아에 갈락토스 대사 단백질 4(gal4) 및 아스퍼길루스 니둘란스(Aspergillus nudulans) 암모니아 조절 단백질(areA)을 코드화하는 유전자로부터 얻어질 수 있다. 추가 예는 문헌을 참조한다[참조: Verdier, Yeast 6:271-297(1990); MacKenzie et al., Journal of Gen. Microbiol. 139:2295-2307(1993), 두 문헌 모두 본원의 참고 문헌으로 인용됨]. 카페론은 적절히 중첩하는 데 있어서 또 다른 단백질을 보조하는 단백질이다[참조: Hartl et al., TIBS 19:20-2591994); Bergeron et al., TIBS 19:124-128(1994); Demolder et al., J. Biotechnology 32: 179-189(1994); Craig, Science 260:1902-1903(1993); Gething and Sambrook, Nature 355:33-45(1992); Puig and Gilbert, J Biol. Chem. 269;7764-7771(1994); Wang and Tsou, FASEB Journal 7:1515-11157(1993); Robinson et al., Bio/Technology 1:381-384(1994), 이들 문헌은 모두 참고 문헌으로 인용됨]. 카페론을 코드화시키는 핵산 서열은 아스퍼길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 단백질 디술파이드 아이소머라제, 사카로미세스 세레비시아에 칼넥신(Saccharomyces cerevisiae calnexin), 사카라로미세스 세레비시아에 BiP/GRP78 및 사카로미세스 세레비시아에 Hsp70을 코드화시키는 유전자로부터 수득될 수 있다. 추가 예로, 문헌을 참조한다[참조: Gething and Sambrook, Nature 355:33-45(1992); Hartl et al., TIBS 19:20-25(1994)]. 프로세싱 프로테아제는 프로펩티드를 분해하여 성숙한 생화학적으로 활성인 폴리펩티드를 생성하는 프로테아제이다[참조: Enderlin and Ogrydziak, Yeast 10:67-79(1994); Fuller et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 86:1434-1438(1989); Julius et al., Cell 37:1075-1089(1984); Julius et al., Cell 32:839-852(1983); 이들 문헌은 모두 본원에서 참고 문헌으로 인용됨]. 프로세싱 프로테아제를 코드화하는 핵산 서열은 아스퍼길루스 니게르(niger) Kex2, 사카라로미세스 세레비시아에 디펩티딜아미노펩티다아제, 사카라미세스 세레비시아에 Kex2 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 이염기성 프로세싱 엔도프로테아제(xpr6)를 코드화하는 유전자로부터 얻어질 수 있다. 진균 숙주 세포의 선택에 작용을 하는 어떠한 인자도 본 발명에 사용될 수 있다.

진균 세포는 원형질체 형성, 원형질체의 형질 전환 및 세포벽의 재생을 포함하는 방법에 의해 공지된 그 자체의 방법으로 형질전환될 수 있다. 아스퍼길루스숙주 세포의 형질 전환에 적합한 방법은 유럽 특허 제 238 023호 및 문헌에 기재되어 있다[참고: Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 81:1470-1474(1984), 두 문헌 모두 본원에 참고 문헌으로 인용됨]. 푸사리움(Fusarium) 종을 형질 전환시키는 적합한 방법은 본원에 참고 문헌으로 인용되는 문헌에 기술되어 있다[참고: Malardier et al., Gene 78:147-156(1989)]. 효모는 문헌에 기술된 방법을 사용하여 형질 전환될 수 있다[참조: Becker and Guarente, In: Abelson and Simon,(eds.), guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods Enzymol. Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., J. Bacteriology 153:163(1983); Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 75: 1920(1978), 이들 문헌은 모두 본원에서 참고문헌으로 인용됨].

본 발명은 또한 단백질 또는 이의 단편을 발현시키기 위한 조건하에서 재조합 진균 숙주 세포를 배양시키는 것을 포함하여 단백질 또는 이의 단편을 생성시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 진균 세포는 당해 공지된 방법을 사용하여 단백질 또는 이의 단편을 생성시키기에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 단백질 또는 이의 단편을 발현 및/또는 분리시키는 조건하에서 및 적합한 배지중에서 수행되는 실험실 또는 공업용 발효기에서 쉐이크 플라스크 배양, 소규모 또는 대규모 발효(지속적, 배치, 공급 배치, 또는 고체 상태 발효를 포함)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 당해 공지된 방법을 사용하여 탄소 및 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양 배지 중에서 수행된다[참조예: Bennett and LaSure(eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, (1991), 이 문헌은 본원에 참고 문헌으로 인용됨]. 적합한 배지가 통상의 공급자로부터 입수되거나 공개된 조성에 따라 제조될 수 있다[참조: catalogues of the American Type Culture Collection, Manassas, VA]. 단백질 또는 이의 단편이 영양 배지로 분비되는 경우에, 단백질 또는 이의 단편은 배지로부터 직접 회수될 수 있다. 이의 단백질 또는 단편이 분비되지 않는 경우, 세포 용해물로부터 회수된다.

발현된 단백질 또는 이의 단편은 특정 단백질 또는 단편에 특이적인 당해 공지된 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 검출 방법은 특정 항체, 효소 생성물의 형성, 효소 기질의 소멸이 사용되는 것을 포함한다. 예를 들어, 단백질 또는 이의 단편이 효소 활성을 가지는 경우, 효소 검정이 사용될 수 있다. 다르게는, 단백질 또는 이의 단편에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체가 사용되는 경우, 면역검정은 단백질 또는 이의 단편에 대한 항체를 사용하여 사용될 수 있다. 효소 검정 및 면역 검정 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

형성되는 단백질 또는 이의 단편은 당해 공지된 방법에 의해 회수될 수 있다. 예를 들어, 단백질 또는 이의 단편은 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전법을 포함하나 이로 제한되지 않는 통상의 방법에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다. 회수된 단백질 또는 이의 단편은 이후 추가로 여러 크로마토그래피 방법, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 겔투과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다.

곤충 숙주 세포에서 가치 있는 DNA 서열을 발현시키기 위한 방법 또한 당해 널리 공지되어 있으며, 문헌에서 검토되어 있다[참조: Lucow and Summers, (1988) Bio/technology 6:47-55, 이 문헌은 본원에 참고 문헌으로 인용됨].

HPO 리아제 효소로서 확인된 핵산 서열에 의해 코드화된 단백질의 활성 및 특이성을 확인하기 위해, 바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 곤충 세포 배양물 중에서 수행될 수 있다. 이러한 바쿨로바이러스 발현 시스템은 당해 공지되어 있으며, 본원에 참고 문헌으로 인용되는 리(Lee) 등에 의한 미국 특허 제 5,348,886호에 기술되어 있다.

또한, 기타 발현 구성물이 상이한 발현 시스템을 사용하여 단백질 활성을 검정하도록 제조될 수 있다. 이러한 발현 구성물은 효모 또는 원핵 생물 숙주로 형질전환되고, HPO 리아제 활성에 대해 검정된다. 이러한 발현 시스템은 당해 공지되어 있으며 시판되는 공급원을 통해 용이하게 입수할 수 있다.

이러한 형질 전환된 식물을 수득하는데 있어서 형질전환 방법은 본 발명에 중요하지 않으며, 식물 형질전환의 다양한 방법이 현재 이용가능하다. 게다가, 형질전환 곡물에 이용가능한 더욱 새로운 방법이 하기에 직접적으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 아그로박테리움 감염에 자연적으로 민감한 많은 식물 종이 아그로박테리움 매개된 형질전환의 3분 또는 2분 벡터 방법을 통해 성공적으로 형질전환될 수 있다. 많은 실례에 있어서, T-DNA 한쪽 또는 양쪽, 특히 왼쪽 및 오른쪽 가장자리, 더욱 특히 오른쪽 가장자리에 접해있는 구성물을 갖는 것이 바람직할 것이다. 이는 T-DNA 가장자리가 다른 모드의 형질전환을 갖는 용도를 발견할 수 있지만, 특히 구성물이 형질전환에 대한 방식으로서 A. 투메파시엔스 또는 A. 리조겐을 사용할 경우, 유용하다. 또한, 미세주입, DNA 입자 충격 및 전기영동 기술이 개발되었으며, 이는 다양한 모노코트 및 디코트 식물 종을 형질전환시킨다.

정상적으로, DNA 구성물에 포함되는 것은 숙주에서 발현에 대해 필요한 조절 영역을 가지며, 형질전환체 세포의 선택을 제공하는 구조적 유전자일 것이다. 유전자는 세포파괴제, 예를 들어, 항생 물질, 중금속, 독소 등에 대한 저항성을 제공할 수 있으며, 영양 요구성 숙주에 대한 원형, 바이러스 면역성 또는 이 유사성을 제공하는 보완성을 제공할 수 있다. 상이한 숙주 종의 수에 따라, 이들의 발현 구성물 또는 성분이 도입되며, 선택을 위한 상이한 조건이 상이한 숙주에 이용되는 하나 이상의 마커가 사용될 수 있다.

아그로박테리움이 식물 세포 형질전환에 사용되는데 있어서, 아그로박테리움 숙주에 존재하는 T-DNA 또는 Ti- 또는 Ri-플라스미드와의 상동 재조합에 대한 아그로박테리움 숙주로 도입될 수 있는 벡터가 사용될 수 있다. 재조합을 위한 T-DNA를 함유하는 Ti- 또는 Ri-플라스미드는 무장되거나(혹 형성을 유도할 수 있음) 비무장되며(혹 형성을 유도할 수 없음), 후자는 vir 유전자가 형질전환된 아그라박테리움 숙주에 존재하는 한 허용가능하다. 무장된 플라스미드는 정상적인 식물세포 및 혹의 혼합을 제공할 수 있다.

아그로박테리움이 숙주 식물 세포를 형질전환시키기 위한 비히클로서 사용되는 일부 실례에서, T-DNA 가장자리 영역(들)에 의해 가장자리화된 발현 또는 전사 구성물은 대장균 및 아그로박테리움에서 복제가능한, 문헌에 설명된 넓은 숙주 범위 벡터로 삽입될 것이다. 일반적으로 pRK2 또는 이들의 유도체가 사용된다. 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 인용된 디타(Ditta) 등의 문헌[Proc.Nat.Acad.Sci., U.S.A. (1980) 77:7347-7351] 및 EPA 0 120 515호를 참조한다. 대안적으로, 식물 세포에서 발현되는 서열을 별도의 복제 서열을 함유하는 벡터에 삽입시킬 수 있으며, 별도의 복제 서열중 하나는 대장균에서 벡터를 안정화시키고, 다른 것은 아그로박테리움에서 안정화시킨다. 예를 들어, 맥브리드(McBride) 및 섬머펠트(Summerfelf)(Plant Mol. Biol. (1990) 14:269-276)를 참조하길 바라며, 여기에서 복제의 pRiHRI(Jouanin, et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 201:370-374) 오리진이 사용되며, 숙주 아그로박테리움 세포에서 식물 발현 벡터의 부가된 안정도를 제공한다.

발현 구성물에 포함된 것과 T-DNA는 하나 이상의 마커가 될 수 있으며, 이는 형질전환된 아그로박테리움 및 형질전환된 식물 세포를 선택할 수 있게 한다. 많은 수의 마커가 식물 세포에 사용하기 위해 개발되어 있으며, 예컨데, 클로로암페니콜, 카나마이신, 아미노글리코시드 G418, 히드로마이신 등에 저항적이다. 사용된 특정 마커는 본 발명에 필수적인 것은 아니며, 특정 숙주 및 구성 방식에 따라 또 다른 마커가 바람직할 수 있다.

아그로박테리움을 사용하여 식물 세포를 형질전환시키는데 있어서, 식물이 형질전환을 위해 충분한 시간 동안 형질전환된 아그로박테리움과 혼합되고 인큐베이팅될 수 있으며, 박테리아는 괴사되고, 식물 세포는 적당한 선택 배지에서 배양된다. 유합 조직이 형성되면, 수트(shoot) 형성이 공지된 방법에 따라 적당한 식물 호르몬을 사용함으로써 촉진될 수 있으며, 수트는 식물의 재생성을 위한 루팅 배지로 이동된다. 그 후, 식물은 반복 발생을 확립하고, 식물성 오일의 분리를 위해 사용되는 종자로 성장될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 일면은, 숙주 세포의 휘발성 조성물을 변형시키는 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 상기 방법은 숙주 세포내 휘발성 화합물의 수준을 증가시키거나 감소시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 일반적으로 본 발명의 폴리누클레오티드를 숙주 세포에 직접 발현시키는 발현 구성물의 사용을 포함한다.

특히 가치가 있는 것은 숙주 식물 세포에 휘발성 화합물을 수준을 변형시키는 발현 구성물을 사용하는 것이다. 매우 특히, 상기 방법은 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 괴경, 과일, 꼬투리, 종자 및 식물 종자로부터 얻어진 식물 부분에서의 휘발성 화합물의 수준을 변형시키는 데 있어서의 용도를 발현하는 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 박테리아 및 식물 조직에서 아라비도프시스로부터 HPO 리아제를 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도하는 발현 구성물이 제공된다.

본 발명에서 특히 가치가 있는 것은, 식물 과일 및 조직에서 사슬이 짧은 휘발성 알데히드의 생성이 증가하면서 형질전환된 식물을 제조하는 이러한 발현 구성물의 용도이다. 이러한 휘발성 알데히드는 과일, 야채 및 생염(또는 "그린 노우트(green notes)"라고도 함)의 특징적인 맛의 중요 성분이다. 따라서, 본 발명의 HPO 리아제 서열은 개선된 그린 노우트 맛 특성을 갖는 형질전환된 식물을 생성시키는 발현 구성물로 사용될 수 있다.

지질 과산화를 증가시키고, 이로써 식물 조직에서의 "그린 노우트" 및/또는 "멜론" 맛/향기, 식물의 동시발현 또는 지질 과산화에 관여하는 제 2 유전자를 갖는 식물 조직에서의 다른 9-HPO 리아제 및/또는 13-HPO 리아제의 증가가 본 발명을 사용하여 발견될 수 있다. 예를 들어, 리폭시게나아제와 같은 지질 과산화에 관여하는 또 다른 단백질을 코드화하는 DNA 서열을 갖는 식물 조직에서의 13-HPO 리아제 및/또는 9-HPO 리아제 서열의 동시 발현은 지질 과산화를 증가시키고, 식물 조직에서 생성된 사슬이 짧은 전체 알데히드를 증가시킬 수 있다. 이러한 사슬이 짧은 알데히드의 증가는 식용 식물 조직의 "그린 노우트" 및/또는 "멜론" 맛을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 9-HPO 리아제를 발현시키는 숙주 세포는 여러 적용에 사용하기 위해 "생" 및/또는 "멜론" 노우트에 기여하는 휘발성 알데히드의 신규 공급원을 제공한다. 추가로, 숙주 세포는 또한 예를 들어 리폭시게나아제와 같은 지질 과산화에 관여하는 효소 생성의 증가를 제공하는 구성물을 함유할 수 있다. 또한, 숙주 세포는 또한 특히 지방산의 양을 증가시키거나, 지방산에서의 전반적인 증가를 가질 수 있다. 이러한 숙주 세포는 변이생성과 같은 전통 육종 기술 뿐만 아니라 변경된 지방산 조성으로 유전적으로 조작된 숙주를 사용하여 얻어질 수 있다.

추가로, 본 발명의 HPO 리아제 서열의 발현을 제공하는 구성물을 함유하는 식물 숙주 세포는 조미료 및 방향성 제품에 사용하기 위한 알코올을 제조 반응에서 알데히드의 공급원으로 사용된다. 이러한 방법은 당해 공지되어 있으며, 예를 들어, 본원에서 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,695,973호 및 PCT 공개 WO 95/26413호에 기술되어 있다. 일반적으로, 알데히드 및 알코올의 혼합물은 이러한 방법으로부터 수득된다. 상기 방법은 일반적으로 하나 이상의 불포화 지방산, 비교적 높은 수준의 리폭시게나아제 및 히드로퍼옥시드 리아제의 효소 활성을 가지는 식물 재료 및 알코올 수소 이탈 효소의 공급원을 함유하는 반응 혼합물을 포함한다.

불포화 지방산은 다양할 수 있으며, 단일 불포화 지방산류 뿐만 아니라 수개의불포화 지방산의 혼합물을 포함할 수 있다. 지방산은 유리 산 형태로 제공되며, 예를 들어, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산(알파 및 감마 형), 아라키돈산, 에이코사펜타엔산 및 리신놀레산을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

알코올 데히드로게나아제 공급원은 비효모성 곰팡이 뿐만 아니라 효모를 포함한다. 알코올 데히드로게나아제는 알데히드를 알코올로 전환시키는 능력을 갖는다. 효모 및 비효모성 곰팡이는 환원제로서 니코틴 아데닌 디누클레오티드(NADH) 의 공급원을 추가로 제공한다.

본 발명의 핵산 서열은 또한 다양한 병원체에 대하여 증가된 내성을 갖는 형질전환된 식물에 대한 발현 구성물에서 사용될 수 있다. 본 발명의 HPO 리아제 서열을 발현시키는 형질전환된 식물은 (3Z)-헥센알 및 (2E)-헥센알과 같이 HR 반응에 연루된 알데히드의 증가된 생성으로 인해 병원체 공격에 대한 반응으로 증대된 과민 반응(HR 반응)을 나타낼 수 있다[참고문헌: Croft, et al. (1993) Plant Physiol. 101:13-24]. (2E)-헥센알과 같은 알데히드는 증대된 질환 내성에 추가로 기여하는 효과적인 항균제인 것으로 밝혀졌다[참고문헌: Croft, et al. (1993), 상기 참조]. 더욱이, 이들 화합물은 식물에서 일반적인 손상 반응에 포함될 수 있다.

향 및 향기의 생성을 위해 원핵생물 및/또는 진핵생물 숙주 세포에서 9-HPO 리아제의 발현을 유도하기 위해 구성물에서 9-HPO 리아제 핵산 서열을 사용하는 것은 본 발명에서 특별한 관심을 끈다.

본 발명은 지금까지 일반적으로 기술되었지만, 본 발명을 비제한적으로 설명하기 위해 포함되어진 하기 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이다.

실시예 1 : 아라비도프시스 HPO 리아제 서열의 동정

피망으로부터의 히드로퍼옥시드 리아제를 코딩하는 핵산 단편을 미리 클로닝시키고 서열화하였다[참고문헌: Matsui, et al. (1996) FEBS Letters 394:21-24]. 누클레오티드 서열을 사용하여 HPO 리아제 관련 서열에 대한 진뱅크(Genbank)를 조사하였다. 아라비도프시스로부터의 게놈 서열을 함유하는 진뱅크로부터 확인되는 하나의 기탁물(기탁 번호 Z97339, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank/Index.html))은 알렌 옥시드 신타아제를 코딩하는 것으로 보고되었다[참고문헌: Laudert, et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31:323-335].

제네틱스 맥(Genetyx Mac)(소프트웨어 디벨로프먼트 컴패니 리미티드(Software Development Co. Ltd.)을 사용하여 피망 HPO 리아제인 아라비도프시스 알렌 옥시드 신타아제[참고문헌: Laudert, et al., (1996) 상기 참조]와 진뱅크로부터의 아라비도프시스 HPO 리아제 유사 서열 사이의 서열 비교는 HPO 리아제 유사 서열이 알렌 옥시드 신타아제 서열(39% 동일성)(도 3 참조) 보다 피망 HPO 리아제(57% 동일성)(도 2 참조)에 더 유사하다는 것을 나타낸다.

실시예 2 : 아라비도프시스 cDNA 라이브러리의 구성

아라비도프시스 탈리아나의 실생 식물, 개화, 및 장각과 조직으로부터 총 RNA를 단리하여 상보성(cDNA) 라이브러리를 구성시켰다. 과정은 웹(Webb) 및 냅(Knapp)의 DNA 단리 프로토콜과 같다[참고문헌: D.M. Webb and S.J. Knapp, (1990) Plant Molec. Reporter, 8, 180-185]. 다음의 설명은 1g 생체중 조직을 사용한 것으로 가정한 것이다. 동결된 종자 조직을 액체 질소하에서 분쇄시켰다. 0.2g의 불용성 폴리비닐피롤리돈과 함께 분말을 100ml REC 완충액(50mM Tris-HCl, pH 9, 0.8M NaCl, 10mM EDTA, 0.5% w/v CTAB(세틸트리메틸-암모늄 브로마이드))에 첨가하고, 실온에서 분쇄시켰다. 파쇄액을 12,000xg의 속도로 5분 동안 원심분리시켜서 불용성 물질을 펠릿화하였다. 생성된 상청액 분획을 클로로포름으로 추출해내고 상층을 회수하였다.

그런 다음, 1용적 RecP(50mM Tris-HCl, pH 9, 10mM EDTA 및 0.5%(w/v) CTAB)를 첨가하여 RNA를 침전시키고 사용전에 간단하게 원심분리하여 수거하였다. RNA 펠릿을 0.4ml의 1M NaCl중에 재용해시켰다. RNA 펠릿을 수중에 재용해시키고 페놀/클로로포름으로 추출해냈다. 충분량의 3M 포타슘 아세테이트(pH 5)를 첨가하여 혼합물을 아세테이트중에서 0.3M이 되게 한 후, 2용적의 에탄올을 첨가하여 RNA를 침전시켰다. 에탄올로 세척한 후, 최종 RNA 침전물을 수중에 용해시키고 동결상태로 저장하였다.

대안적으로, 제조업자의 프로토콜에 따라서 TRIzol 시약(메릴랜드 게이더스버그에 소재하는 비알엘 라이프 테크놀로지즈(BRL Life Technologies))을 사용하여 총 RNA를 수득할 수도 있다.

제조업자의 설명서에 따라서 마라톤 cDNA 증폭 킷(Marathon cDNA Amplification Kit)(캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클론테크(Clontech))을 사용하여 RNA로부터 상보성 DNA (cDNA)를 수득하였다.

실시예 3 : HPO 리아제 서열의 클로닝

아라비도프시스 cDNA 진뱅크 서열에 의해 코딩된 단백질에 특성을 부여하기 위해, 아라비도프시스 HPO 리아제 유사 cDNA에 상응하는 전체 코딩 영역을 수득하였다(도 1 참조). 합성 올리고누클레오티드 프라이머를 설계하여 실시예 2에서 수득된 RNA로부터의 HPO 리아제 유사 서열로부터 5' 및 3' 말단을 증폭시켰다. 아라비도프시스 HPO 리아제 유사 서열에 따라서 프라이머를 설계하고 cDNA 말단 반응의 급속 증폭(Rapid Amplification of cDNA Ends : RACE)에 사용하였다[참고문헌: Frohman et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002]. 제조업자의 프로토콜에 따라서 마라톤 cDNA 증폭 킷(클론테크)을 사용하여 cDNA 클론으로부터 플랭킹 서열을 증폭시켰다.

한 쌍의 프라이머를 설계하여 상기 실시예 2에 기술된 라이브러리로부터의 아라비도프시스 HPO 리아제 유사 cDNA로부터 5' 및 3' 영역을 증폭시켰다. 이들 두 개의 프라이머, 즉, HPOL28(3' RACE에 대해, 5'-CGGTTCCTCTGCGCCTCTCTCGCCGGCG-3') 및 HPOL21(5' RACE에 대해, 5'-GCGGAACCGGAGGACTAAAACGCAGC-3')을 마라톤 cDNA 증폭 킷에 제공된 어댑터 특이 서열(AP1 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3')로 PCR 반응시켰다. HPO 리아제 유사 cDNA의 5'-영역을 증폭시키기 위해, 프라이머 AP1 및 HPOL 21을 사용하였고, 3' 영역을 증폭시키기 위해, AP1 프라이머를 프라이머 HPOL28과의 반응에 사용하였다. 사이클 조건은 1분 동안 94℃ 및 이어서 5초 동안 94℃에서 5회 증폭, 4분 동안 72℃ 및 이어서 5초 동안 94℃에서 5회 증폭, 4분 동안 70℃, 및 마지막으로 5초 동안 94℃에서 25 사이클 및 4분 동안 68℃.

상기한 장각과 조직으로부터 수득된 RNA와의 3' RACE 반응으로부터 1100bp의 하나의 단일 단편을 수득하였다. PCR 생성물이 HPO 리아제 유사 서열에 상응하는 서열을 함유하는지의 여부를 확인하기 위해, 상기한 바와 같은 조건을 사용하여 겔 정제된 1100bp 단편으로 제 2 라운드의 PCR 반응을 수행하였다. 프라이머 HPOL13 (5'-CTTGGCGTAGTTCCTCAGCCTCTTG-3') 및 AP2 (5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3')로 반응을 수행하여 HPO 리아제 유사 서열의 확인용으로 약 1000bp 단편을 증폭시켰다. 재증폭된 1000bp 단편을 겔 정??고 pCR2.1 TOPO 벡터(캘리포니아 칼스배드에 소재하는 인비트로겐(Invitrogen))내로 클로닝시켜 플라스미드 pCGN8094를 생성시켰다.

5' RACE 반응에 의해 많은 비특이적 단편이 생성되었다. 1000bp 단편을 겔로부터 삭제하고, pCR2.1 TOPO(인비트로겐) 클로닝 벡터내로 클로닝시키고 플라스미드 pCGN8091을 생성시켰다.

도 1은 아라비도프시스 HPO 리아제의 완전한 누클레오티드 서열을 도시하고 있다. cDNA는 5'- 및 3'-비코딩 영역의 1687bp, 및 47 및 137bp의 서열을 갖는다. 5'-비코딩 영역에는 정지 코돈이 개시 코돈과 함께 존재한다. 가장 긴 ORF는 계산된 분자량이 54851Da인 492개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 코딩한다.

아라비도프시스 HPO 리아제 서열의 발현 패턴을 결정하기 위해, 메틸 자스모네이트 및 병원체의 공격을 받은 손상된 아라비도프시스의 잎 뿐만 아니라 다양한 기관으로부터 단리된 총 RNA의 노던 블롯 분석을 수행하였다.

TRIzol 시약(메릴랜드 게이더스버그에 소재하는 라이프 테크놀로지즈)을 사용하여 실생 식물을 발아시킨 지 2, 3, 4, 5 및 6일 후에 로제타 잎, 줄기에 매달린 잎, 줄기, 개화, 녹색 싹, 시든 꽃, 개화, 장각과(5-10mm), 장각과(〈5mm)로부터 총 RNA를 단리하였다. 단리된 RNA 샘플(10-20㎍)을 포름알데히드 아가로오스 겔상에서 분리시키고 하이본드(Hybond)-N(아머샴(Amersham))으로 옮겼다. 옮겨진 RNA를 6xSSC, 5x 덴하르트 용액, 0.2% SDS, 20㎍/ml 연어 정액 DNA, 20mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH 7.0) 및 65℃에서 아라비도프시스 HPO 리아제 cDNA의 5' 절반에 상응하는 프로브로 하룻밤 하이브리다이징시켰다. 하이브리다이징된 막을 20분 동안 60℃에서 2xSSC, 0.1% SDS로 1회 세척하고, 20분 동안 60℃에서 0.25xSSC, 0.1% SDS로 2회 세척하였다. HPO 리아제 유전자에 상응하는 1.6kb 전사물을 조사된 모든 조직 공급원으로부터 단리된 RNA에서 관찰하였다. 개화에서 가장 높은 수준의 발현이 관찰되었다. 약 3.0 및 3.3kb의 추가의 밴드를 관찰하였는데, 이것은 아마도 전사중에 인트론-엑손 접합부의 통독으로 인한 것으로 믿어진다. 또한, 문헌[Rojo, et al. (1998) Plant Journal 13:153-165]에는 HPO 리아제의 프로브를 사용한 노던 블롯 분석에서 상이한 크기의 두 개의 mRNA 밴드의 하이브리다이제이션이 보고되어 있다.

HPO 리아제 서열이 손상에 대한 반응으로 발현되지는의 여부를 결정하기 위해 메틸 자스모네이트 RNA를 손상된 잎 및 메틸 자스모네이트(MJ)에 의해 처리된 잎으로부터 단리하였다. 진균 공격에 의한 유도에 대하여 HPO 리아제 발현을 조사하였다.

아라비도프시스 탈리아나 에코타입 No-O를, 65% 상대 습도에서 22℃에서 16시간 빛을 쪼이면서 3주간 토양에서 발육시켰다. 손상을 위해, 각각의 잎을 주맥을 따라 잎의 상부 1/3 지점에 헤모스탯으로 1회 손상시켰다. 각각의 로제트에서는, 잎의 절반을 손상시키고, 나머지 절반을 보전시켰다. 이들은 각각 국소 잎 및 전체 잎으로서 언급된다.

MJ에 의한 처리를 위해, 식물을 9.25L 들이 밀폐 용기에 넣었다. 순수한 MJ(10 또는 50㎕, Aldrich Co. Milwaukee, WI)를 4개의 면(cotton) 스웝에 도포시키고, 식물을 직접 건드리지 않으면서 용기에 넣었다. 용기를 개봉할 때마다 새로운 MJ로 처리한 면 스웝으로 교환하였다. 병원체 유도를 위해, 균류인 보트리티스 시네레아의 포자를 3주된 식물의 로제트 잎에 1% 글루코오스 중의 1㎖ 당 10⁶개 포자의 농도로 분무시켰다.

전체 RNA는 제조업자에 의해 기술된 바와 같이 TRIzol 시제(Life Technologies)를 사용하여 조직으로부터 단리하고, 상기 기술된 바와 같이 막에 전달하였다.

HPO 리아제 mRNA의 발현은 손상된지 6시간 및 24시간째에 관찰되었다. HPO 리아제 유도의 고수준은 헤모스탯으로 손상된 잎에서 나타났다. 유도는 처리한지 6시간 후에는 뚜렷하였고, HPO 리아제 mRNA의 양은 적어도 24시간까지는 증가하였다. 전체 잎에서, HPO 리아제 mRNA의 유도가 또한 명백하였다. 처리한지 6시간 후에, HPO 리아제 mRNA의 수준은 국소 잎의 수준과 거의 동일하지만, 양은 그 후 약간만 증가하며, 처리한지 24시간 후에는, 수준은 국소 잎의 수준 보다 유의할 만하게 낮아졌다.

메틸 자스모네이트로 처리한 식물은 HPO 리아제의 저발현을 입증하며, 조사된 모든 시간점에서 10㎕ 및 50㎕ 처리 둘 모두에서 관찰되었다.

균류 병원체인 보트리티스 시네레아로 감염시킨 경우, HPO 리아제 발현을 유도시키지 않았다. 그러나, 괴사 병변은 접종한지 5 내지 6일된 처리 식물의 잎 표면에서 관찰되었다.

실시예 4 HPO 리아제 발현 구성물의 제조

구성물의 한 세트를, 식물 또는 박테리아 숙주에 형질전환시켜서, 아라비도프시스 HPO 리아제 유사 서열을 추가로 특징화하기 위해 제조하였다. pCGN8091 내의 5' RACE 생성물을 프라이머 Alex2 (5'-CGGGATCCATGTTGTTGAGAACGATGGCGGCG-3') 및 Alex4 (5'-CAATCTCCGGCGTTCTCGTCG-3')를 사용하여 PCR 증폭시켰다. Alex2 프라이머는 PCR 생성물을 pQE30 발현 벡터(Qiagen, Hilden, Germany) 내로 벡터의 ATG 개시 코돈에 대해 프레임적으로 편리하게 클로닝시키기 위해 제한 엔도누클레아제 부위 BamHI을 함유한다. 올리고누클레오티드 프라이머(각각 0.2μM) 이외에, PCR 반응 혼합물은 각각 0.2mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 1.0% 글리세롤, 0.2mM Tris-HCl(pH 8.3), 4.6mM KCl, 1.5mM EDTA, 15μM 디티오트레이톨, 7.3㎍/㎖ BSA, 1.1mM KOAc 및 0.1 유닛 Pfu의 DNA 중합효소 (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 함유하였다. 혼합물을 하기 조건을 사용하여 증폭시켰다: 95℃ 10분의 1 사이클; 94℃ 20초, 60℃ 30초 및 72℃ 1.5분의 30 사이클; 및 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) 9800 더모사이클러(thermocycler)에서의 72℃ 7분의 1 사이클. 생성되는 PCR 생성물을 BamHI 및 BindIII로 분해시키고, 벡터 pQE30에 연결시켜서, 벡터 pCGN8099를 생성시켰다. 아라비도프시스 HPO 리아제의 3' 말단을 pCGN8094로부터의 pCGN8099의 HindIII 부위 내로 클로닝시켜서, 대장균 발현 벡터 pCGN8100을 생성시켰다.

식물 형질전환용 이중 벡터인 pCGN5138을 pCGN1558로부터 구성하였다 (참조: McBride and Summerfelt, (1990) Plant Molecular Biology, 14:269-276). pCGN1558의 폴리링커를 HindIII/EcoRI 단편으로서 독특한 제한 엔도누클레아제 부위인 HindIII, SseI/PstI, NotI, BamHI, SwaI, XbaI, PacI, AscI 및 Asp718을 함유하는 폴리링커로 대체시켰다.

아라비도프시스 HPO 리아제 유사 누클레오티드 서열의 안티센스 구성물을 아라비도프시스의 형질전환을 위해 제조하였다. pCGN8091로부터의 5' 1000bp 누클레오티드를 코드화하는 핵산 서열을 EcoRI 단편으로서 플라스미드 PBluescript II SK(Stratagene, La Jolla, CA) 내에 클로닝시켜서, 벡터 pCGN8093을 생성시켰다. pCGN8090으로부터의 3' RACE 생성물을 HindIII 단편으로서 pCGN8093 내에 클로닝시켜서, 플라스미드 pCGN8094 내의 온길이 HPO 리아제 코딩 서열을 생성시켰다. pCGN8094의 KpnI 부위를, KpnI를 분해시키고 이 부위를 클레노우 단편으로 충전시킴으로써 제거시키고, HPO 리아제 코딩 서열을 이 플라스미드로부터 SmaI 단편으로서 pCGN8059의 StuI 부위 내로 클로닝시켰다. 이것에 의해, 플라스미드 pCGN8101이 생성되었다. 플라스미드 pCGN8059는 35S 프로모터와 hsp70 리더 서열의 다운스트림에서 다중 클로닝 부위를 함유하여, 35S 프로모터 서열로부터의 발현용의 서열을 클로닝시킬 수 있다. 이러한 벡터는 또한 노팔린 신타아제 전사 종결 (nos 3') 서열을 함유한다 (참조: Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci (1983) 80:4803-4807 and Depicker et al., J. Molec. Appl. Genet. (1982) 1: 562-573). 35S 프로모터/hsp70 리더, 안티센스 아리비도프시스 HPO 리아제 서열 및 nos3' 종결 서열을 함유하는 단편을 pCGN8101로부터 NotI 단편으로서 pCGN5138의 동일한 부위 내로 클로닝시켜서, 안티센스 발현 구성물 pCGN5102를 생성시켰다.

실시예 5 대장균 발현

발현 벡터 pCGN8100을 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌[(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York]에 기재된 칼슘 클로라이드 방법을 이용하여 대장균(스트레인 M15, Qiagen, Hilden, Germany) 내로 형질전환시켰다. 형질전환된 콜로니를 쉬바타(Shibata) 등의 문헌[(1995) Plant Cell Physiol. 97:1059-1072]에 기재된 피망 HPO 리아제에 대해 유도시킨 항체를 사용하여 HPO 리아제 단백질의 발현에 대해 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 스크리닝하였다.

히드로퍼옥시드 리아제 활성을 문헌[Matsui, et al.,(1991), Phytochemistry, 30:2109-2113]에 기재된 기체 크로마토그래피(GC) 방법에 따라 측정하였다.

표 1

샘플	영역	nmole	nmole/10분/mg
8100	24677	130	153
대조군	4089	28	24

표 1에 기재된 GC 분석 결과는 아라비도프시스 HPO 리아제형 서열이 HPO 리아제 효소를 코드화한다는 것을 입증한다.

실시예 6. 안티센스 HPO 리아제 구성물로의 아라비도프시스 형질전환

관심있는 DNA 서열을 식물 숙주 게놈에 삽입하고, 표현형 변화를 달성하도록 전사 또는 전사 및 번역을 달성하는 다양한 방법이 개발되어 왔다.

식물 이중 구성물, 즉 pCGN8101을 식물 형질전환에 사용하여 식물 조직으로부터의 아라비도프시스 HPO 리아제형 서열의 안티센스 핵산 서열 발현을 유도하였다.

발베르켄스(Valverkens) 등에 의한 문헌[Proc.Nat.Acad. Sci. (1988) 85:5536-5540], 벤트(Bent) 등에 의한 문헌[(1994), Science 265:1856-1860], 또는 베크톨드(Bechtold) 등에 의한 문헌[(1993), C.R.Acad.Sci, Life sciences 316:1194-1199]에 의해 설명된 바와 같은 아그로박테리움 매개된 형질전환에 의해 수득될 수 있다.

실시예 7. 유전자 이식 식물의 분석

pCGN8101을 함유하는 유전자이식 아라비도프시스 식물을 문헌[Shibata et al. (1995) Plant Cell Physiol. 36:147-156]에 설명된 바와 같은 단백질 추출물의 고압 액화된 크로마토그래피(HPLC)분석으로 헥산알(Hexenal)의 감소된 생성물에 대해 분석하였다.

본 발명의 아라비도프시스 HPO 리아제를 과다발현하는 유전자 이식 식물은 시바타(Shibata)(1995) 등에 의한 상기 문헌에 설명된 광도계 분석 또는 HPLC 분석을 사용하여 스크리닝될 수 있다.

실시예 8. 추가적인 HPO 라아제 서열의 확인

추가적인 HPO 라아제형 서열을 토마토 및 오이 조직으로부터 수득하였다. 총 RNA를 오이 배축 및 익지않은 토마토 조직으로부터 제조업자 프로토콜에 따라서 TRI졸 시약(Gibco-BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD)을 사용하여 분리하였다.

제조업자 방법에 따른 마라톤 cDNA 증폭 킷(Marathon cDNA Amplification Kit)(Clontech, Palo Alto. CA)을 사용하여 상보적 DNA(cDNA)를 수득하였다.

피망(Matsui, et al. (1996) 상기 언급된 문헌), 바나나(European Patnet Application, Publication Number EP 0 801 133 A2) 및 아라비도프시스로부터의 HPO 리아제의 서열을 클러스탈더블유(ClustalW)(http://www.clustalw.gonome.ad.jp/)를 사용하여 정렬시키고, 7개의 보존된 펩티드 서열을 확인하였다(위에 대해서는 도 7을 참조하고, 리스팅에 대해서는 표 2 참조).

표 2.

합성 올리고누클레오티드의 세트(표 2)를 상기에서 수득된 cDNA로의 중합효소 사슬 반응으로 합성하여 HPO 리아제 서열에 상동성인 서열을 확인하였다. PCR 반응을 제조업자 프로토콜에 따른 반응 조건을 사용하여 유리한 cDNA 중합효소 혼합(Advantage cDNA Polymerase Mix)(Clonetech, Palo Alto, CA)를 사용하여 수행하였다. 올리고누클레오타이드 명칭에서 문자 "S"는 센스 가닥을 증폭시키도록 고안된 PCR 프라이머, 또는 전 반응 프라이머를 나타낸다. 문자 "AS"는 안티 센스 가닥을 증폭시키도록 고안된 PCR 프라이머, 또는 역 반응 프라이머를 나타낸다. 올리고누클레오티드 서열에서, 문자 "N"은 A, C, G 또는 T를 의미하며, 문자 "S"는 이 위치에서 C 또는 G를 의미하며, 문자 "Y"는 C 또는 T를 의미하며, 문자 "R"은 이 위치에서 A 또는 G를 의미한다.

약 475bp의 단일 PCR 생성물을 오이 및 토마토(상기에 설명된)로부터 수득된 cDNA로 프라이머, 즉 4HPOL3S 및 11HPOL7AS를 함유하는 반응에서 증폭시켰다. 토마토 및 오이로부터의 475bp PCR 생성물을 플라스미드 pCR2.1TOPO(시험관내)로 클로닝하여 각각 플라스미드 T15 및 C15를 수득하였다. 6HPOL4S 및 11HPOL7AS로의 PCR 반응에서, 약 200bp의 단일 생성물을 오이 배축 조직으로부터 수득된 cDNA와의 증폭 반응으로부터 수득하였다. 200bp 생성물을 pCR2.1 TOPO(시험관내)로 클로닝하고, 플라스미드 C17를 수득하였다.

각 PCR 생성물의 누클레오티드 서열을 자동 시퀀싱으로 측정하였다. 수득된 서열을 벨 후추, 아라비도프시스 및 바나나 잎으로부터의 HPO 리아제의 핵산 및 아미노산 서열 뿐만 아니라, 구아율((1995) J.Biol. Chem. 270(15):8487-8494), 아미씨((1993) Proc Nalt Acad Sci USA 90(18):8519-8523) 및 아라비도프시스로부터 알렌 옥시드 신타아제를 코딩하는 DNA 및 아미노산 서열과 비교하였다.

결과는 T15 핵산 서열이 벨 후추 HPO 리아제 DNA 서열과 약 85% 유사하며, 아미노산 서열은 약 88% 유사하다는 것을 보여주고 있다. 게다가, T15 서열은 또한, 다른 HPO 리아제 핵산 서열과 약 55% 이상 유사하며, 아미노산 서열과는 약 57% 이상 유사하다. 또한, T15 아미노산 서열은 알렌 옥시드 신타아제 서열과 단지 약 41%만 유사하다. C17 서열은 또한, HPO 리아제 서열과 비슷한 유사 패턴을 따른다. 따라서, T15 및 C17 서열은 HPO 리아제에 아주 유사한 단백질을 코드화한다.

그러나, 서열 비교 결과(도 8)는 C15 핵산 서열이 다른 HPO 리아제 핵산 서열과 50 내지 54% 유사하며, 알렌 옥시드 신타아제 DNA 서열과는 약 58% 유사하다. 게다가, 계통된 C15의 아미노산은 HPO 리아제 아미노산 서열과 약 38 내지 42% 유사하며, AOS 아미노산 서열과 약 51% 유사하다. 따라서, C15 서열은 공지된 HPO 리아제 서열 둘 모두로부터 분기된 단백질을 코드화하며, 알렌 옥시드 신타아제 서열과 더욱 유사하다.

각각의 PCR 생성물의 누클레오티드 서열을 자동화된 시퀀싱으로 측정하였다. 수득된 서열은 진뱅크(Genbank)를 조사하는데 사용하였다. 조사 결과는 T15 및 C17로부터의 서열이 HPO 리아제 서열과 유사한 반면, C1의 서열은 알렌 옥시드 신타아제 서열과 유사하다는 것을 확인시켜 주었다.

T15, C15 및 C17에 대한 온길이 코딩 서열을 수득하기 위해, 제조업자 프로토콜에 따라 마라톤 cDNA 증폭 킷(클론테크) 및 표 3에 기재된 올리고누클레오티드를 사용한 RACE PCR 반응을 이용하였다.

표 3

토마토 및 오이로부터 수득된 DNA와의 증폭 반응으로부터의 PCR 생성물을 pCR2.1 TOPO로 클로닝하였다. 토마토(pCGN8380(5'RACE) 및 pCGN8304(3' RACE)), 오이, C15(pCGN8320(5'RACE) 및 pCGN8306(3'RACE)) 및 C17(pCGN8301(5' RACE) 및 pCGN8307(3' RACE))로부터의 5' 내지 3'-RACE 생성물의 서열을 시퀀싱하고, pGCN8305, pCGN8309 및 pCGN8308로부터 수득된 각각의 서열과 정렬시켜 토마토 HPO 리아제형 서열(도 4), 오이 HPO 리아제형 서열(도 6) 및 오이 알렌 옥시드 신타아제형 서열(도 5)에 상응하는 예비적인 온길이 서열을 수득하였다.

실시예 9. 발현 구성물의 제조

오이로부터 신규한 서열을 추가로 특징화시키기 위해 식물 또는 박테리아 숙주로의 형질전환을 위한 구성물의 세트를 제조하였다. 오이(C15) 알렌 옥시드 신타아제형 서열에 대한 온길이 코딩 서열을 생성시키기 위해, 5'RACE(pCGN8302) 및 3'RACE(pCGN8306)으로부터 서열을 PCR 증폭하여 독특한 제한 엔도누클레아제 부위에 결합시켰다.

5' C15 서열을 상기 설명된 PCR 증폭 반응에서 프라이머(4KMC15ES1 5'-CGGGATCCATGGCTTCTTCCTCCCCTGAACTTC-3' 및 5KMC15EAS2 5'-TGCCCGACCCATTTCAGTATAGTGGG-3')를 사용하여 증폭하였다. 프라이머 4KMC15EAS1을 5' 영역으로부터 증폭되며, 개시 코돈(ATG) 및 BamHI 부위를 함유한다. 3'C15 서열을 마라톤 킷(BRL-Lifetechnologies, gaithersburg, MD) 및 프라이머 6KMC15ES3(5'-TTCACACCATTCCCCTGCCTTTCTTCCC-3')에 제공된 AP1 프라이머를 사용하여 증폭하였다. C15 온길이 클론의 서열은 도 6에 도시되어 있다.

A. 박테리아 발현 구성물

5' RACE PCR 증폭 생성물을 BamHI 및 XbaI(C15 서열에 내생적인 독특한 부위)로 절단하고, XbaI 및 SmaI으로 절단된 3' RACE PCR 반응의 증폭 생성물로 발현 벡터 pQE30(시험관내)으로 클로닝하였다. 이러한 구성물은 대장균 발현 벡터에 C15 cDNA의 온길이의 코드화 서열을 제공하여 벡터 pCGN8333을 생성시켰다. 또한, 온길이 서열을 플라스미드 pUC119로 클로닝하여 벡터 pCGN8334를 생성시켰다.

B. 식물 발현 구성물

식물 형질전환을 위한 이분 벡터, 즉 pCGN5138을 pCGN1558로부터 구성하였다(McBride and Summerfelt, (1990) Plant Molecular Biology, 14:269-276). pCGN1558의 폴리링커를 독특한 제한 엔도누클레아제 부위, 즉 HindⅢ, SseI/PstI, NotI, BamHI, SwaI, XbaI, PacI, AscI 및 Asp718를 함유하는 폴리링커를 갖는 HindⅢ/EcoRI 단편으로서 대체하였다.

식물에서의 발현을 위한 식물 구조 프로모터로부터 발현되는 C15의 온길이 코딩 서열을 클로닝하였다. 발현 카세트를 이분 벡터, pCGN5138로 클로닝하여 벡터 pCGN8337를 생성시켰다.

실시예 10. 대장균에서 오이 C15의 발현

발현 벡터, pCGN8333을 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌[(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.]에 설명된 염화 칼슘 과정을 이용하여 대장균(계통 M15, Qiagen, Hilden, Germany)으로 형질전환하였다. 형질전환된 콜로니를 문헌[Shibata, et al. (1995) Plant Cell Physiol, 97:1059-1072]에 설명된 바와 같은 벨 후추 HPO 리아제에 대한 증가된 항체를 사용하여 HPO 리아제 단백질의 발현에 대한 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 스크리닝하였다.

히드로퍼옥시드 리아제 활성을 기질로서 리놀산 13-히드로퍼옥시드 및 리놀산 9-히드로퍼옥시드 둘 모두를 사용하여, 문헌[Matsui, et al.(1991), Phytochemistry, 30:2109-2113]에 설명된 스펙트로포토메틱 및 기체 크로마노그래피(GC) 방법에 의해 측정하였다.

가스 크로마토그래피 분석 결과(도 9)는 오일 C15 서열에 의해 코드화된 단백질이 리놀산 13-히드로퍼옥시드 기질(도 9A)에서보다 리놀산 9-히드로퍼옥시드(도 9B)에 대해 더 높은 활성을 갖는다는 것을 입증하였다. 스펙트로포토메틱 분석 결과는 추가로, 선택적인 단백질이 9-히드로퍼옥시드 기질에 대한 오이 HPO 리아제 핵산 서열에 의해 코드화된다는 것을 추가로 입증하고 있다. 스펙트로포스메틱 분석 결과는 도 10에 기재되어 있다.

따라서, 오이 C15 서열은 9-히드로퍼옥시드 리아제를 코드화하는 핵산의 첫 번째로 공지된 클로닝을 나타낸다.

본 명세서에 언급된 모든 문헌 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에서 인지될 수 있다. 개별적인 문헌 또는 특허 출원이 참고문헌으로서 특이적이고 개별적으로 본원에 언급되어 있지만, 이러한 모든 문헌 및 특허 출원은 동일한 정도로 본원에 참고문헌으로서 인용되었다.

상기 발명이 명백한 이해를 목적으로 구체예 및 실시예의 상세한 방식으로 설명되어 있지만, 첨부된 청구범위의 사상내에 특정 변형 및 변동이 실행될 수 있다는 것은 자명할 것이다.

Claims (29)

1. 아라비도프시스(Arabidopsis) HPO 리아제의 단리된 누클레오티드 서열.
2. 제 1항에 있어서, 도 1에 도시된 서열을 포함함을 특징으로 하는 누클레오티드 서열.
3. 이종 누클레오티드 서열에 결합된 제 1항의 누클레오티드 서열을 포함하는 구성물.
4. 토마토 HPO 리아제의 단리된 누클레오티드 서열.
5. 제 4항에 있어서, 도 4에 도시된 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 누클레오티드 서열.
6. 이종 누클레오티드 서열에 결합된 제 4항의 누클레오티드 서열을 포함하는 구성물.
7. 오이 HPO 리아제의 단리된 누클레오티드 서열.
8. 제 7항에 있어서, 도 5에 도시된 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 누클레오티드 서열.
9. 이종 누클레오티드 서열에 결합된 제 7항의 누클레오티드 서열을 포함하는 구성물.
10. HPO 리아제를 포함하는 단리된 누클레오티드 서열을 수득하는 방법으로서, 하기의 서열로 구성된 군으로부터 선택된 올리고누클레오티드를 사용하여 PCR 반응으로부터 증폭 생성물을 수득하는 것을 포함하는 방법:
11. 하기의 서열로 구성된 군으로부터 선택된 올리고누클레오티드를 포함하는 PCR 증폭 생성물 :
12. HPO 리아제를 코드화하는 누클레오티드 서열에 결합된 숙주 세포에서 전사를 유도할 수 있는 DNA 서열을 포함하는 구성물로서, HPO 리아제가 하기의 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며 바나나 또는 피망 HPO 리아제가 아닌 방법 :
13. 제 3항, 제 6항, 제 9항 또는 제 12항에 따른 구성물로부터 HPO 리아제를 발현시키는 것을 포함하여, 식물 병원체에 대한 식물의 내성을 증가시키는 방법으로서, HPO 리아제 코드화 서열이 식물 세포에서 발현을 유도할 수 있는 DNA 서열에 연결되는 방법.
14. 제 3항, 제 6항, 제 9항 또는 제 12항에 따른 구성물로부터 HPO 리아제를 발현시키는 것을 포함하여, 식물의 휘발성 조성물을 증가시키는 방법으로서, HPO 리아제 코드화 서열이 식물 세포에서 발현을 유도할 수 있는 DNA 서열에 연결되는 방법.
15. 지방산 9-히드로퍼옥시드에 대하여 활성을 지닌 히드로퍼옥시드 리아제를 코드화하는 단리된 핵산 서열.
16. 제 15항에 있어서, 서열이 리놀레산 9-히드로퍼옥시드에 대하여 활성을 지님을 특징으로 하는 서열.
17. 제 15항에 있어서, 서열이 식물 공급원으로부터 수득될 수 있음을 특징으로 하는 서열.
18. 제 15항에 있어서, 서열이 오이로부터 수득될 수 있음을 특징으로 하는 서열.
19. 제 15항에 있어서, 서열이 오이 배축으로부터 수득됨을 특징으로 하는 서열.
20. 제 15항에 있어서, 도 6에 도시된 서열을 포함함을 특징으로 하는 서열.
21. 숙주 세포에서 작용하는 프로모터, 9-히드로퍼옥시드 리아제를 코드화하는 서열 및 전사 종결 서열을 포함하는 구성물.
22. 제 21항에 있어서, 9-히드로퍼옥시드 리아제 서열이 식물로부터 단리됨을 특징으로 하는 구성물.
23. 제 21항에 있어서, 9-히드로퍼옥시드 리아제 서열이 오이로부터 단리됨을 특징으로 하는 서열.
24. 제 21항에 따른 구성물로부터 HPO 리아제를 발현시키는 것을 포함하여, 식물 병원체에 대한 식물의 내성을 증가시키는 방법으로서, HPO 리아제 코드화 서열이 식물 세포에서 발현을 유도할 수 있는 DNA 서열에 연결됨을 특징으로 하는 방법.
25. 제 21항에 따른 구성물로부터 HPO 리아제를 발현시키는 것을 포함하여, 숙주 세포의 휘발성 조성물을 증가시키는 방법으로서, HPO 리아제 코드화 서열이 숙주 세포에서 발현을 유도할 수 있는 DNA 서열에 연결되는 방법.
26. 제 25항에 있어서, 숙주 세포가 식물 세포임을 특징으로 하는 방법.
27. 제 25항에 있어서, 숙주 세포가 미생물 세포임을 특징으로 하는 방법.
28. 제 27항에 있어서, 미생물 세포가 효모 세포임을 특징으로 하는 방법.
29. 제 25항에 있어서, 숙주 세포로부터 물질을 수확하고 수확된 물질에 휘발성 조성물을 농축시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.