CN1537861A - 从大豆中分离到的种子特异性启动子序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从大豆中分离到的种子特异性启动子序列及其应用。本发明包括具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明包括利用该启动子序列来改变植物种子成分的植物基因工程方法，更具体地说，在这一启动子下游衔接异源或同源基因，并构建到植物表达载体，转化宿主植物，在其种子或其它部位，表达目的蛋白，实现品质改良或药用用途。本发明克隆的种子特异性启动子——大豆β－伴球蛋白α－亚基基因的启动子对今后转基因大豆的研究、乃至所有转基因植物的研究具有重大应用前景。

Description

从大豆中分离到的种子特异性启动子序列及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地讲，涉及到一种从大豆中分离到的种子特异性启动子序列及其应用。从大豆总DNA中克隆出这一种子特异性启动子，并与不同的植物表达载体连接，转化不同的植物品种，使其转基因植株的种子中特异表达其下游基因的方法和应用。

背景技术

外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用。因此，选择合适的植物启动子，并改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。目前在植物表达载体上应用的启动子分为两大类，即组成型启动子和特异性启动子。其中组成型启动子是植物基因工程中广泛应用的启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV 35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actin1启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会持续表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起受体植物的形态发生改变，影响受体植物的正常生长发育。而特异性启动子由于它只有在受体植物的特定部位和特定时间或特定条件下启动其下游基因的启动子，避免了组成型启动子的不足。特异性启动子也可分为两大类，即组织器官特异性启动子和诱导特异性启动子。特异性启动子进一步分为两大类，即组织器官特异性启动子和诱导特异性启动子。所谓组织器官特异性启动子是指种子特异性启动子[Beachy RN，et al.(1985)Accumulation and assembly of soybean β-conglycinin inseeds of transformed petunia plants.The EMBO Journal，4(12)，3047-3053]、胚乳特异性启动子[V.Colot，et al.(1987)Localization of sequence in wheat endosperm protein genes which confertissue-specific expression in tobacco.The EMBO Journal，6(12)：3559-3564]、根特异性启动子[Yamamoto YT，et al.(1991)Characterization of cis-acting sequences regulating root-specific geneexpression in tobacco.Plant Cell，3，371～382]、韧皮部特异性启动子[Bostwick DE，etal.(1994)Organization and characterizaion of cucurbita phloem lectin genes.Plant Moleculariology，26，887～897]等等。所谓诱导特异性启动子是指损伤诱导[Farmer EE，etal.(1992)Octadecanid precursors of jasmonic acid activate the synthesis of wound-inducibleproteinase inhibitors.Plant Cell，4，129～134].、化学诱导[Williams S，et al.(1992)Chemicalregulation of Bacillus thuringiensis δ-endotoxin expression in transgenic plants.Biol/Technol，10，540～543.]、光诱导[Sonnewald U，et al.(1992)Expression of mutant patatin Protein intransgenic Tobacco plants：Role of glycans and intracellular location.Plant Cell，2，345～355.]、热激诱导特异性启动子[Schoffl F，et al.(1989)The function of plant heat shockpromoter elements in the regulated expression of chimaeric genes in transgenic tobacco.MolGen Genet，217(2-3)，246～53]等等。种子特异性启动子，由于它只有在植物种子成熟中、后期大量表达其下游基因，而且所表达的外源蛋白大都集中在种子中，这样使其外源蛋白容易储藏、容易易运输而备受关注。因此，种子特异性表达启动子的克隆和应用就成为植物基因工程研究的一个热点。

1985年，Beachy等人[Beachy RN，et al.(1985)Accumulation and assembly of soybeanβ-conglycinin in seeds of transformed petunia plants.The EMBO Journal，4(1 2)，3047-3053]研究大豆伴球蛋白基因时发现，β-伴球蛋白α`-亚基基因启动子具有很强的时序调控功能，并在转基因植株中只有在种子成熟中、后期大量表达其下游基因，而转基因植株的其它部位很少表达。随之，多种作物品中的种子特异性启动子相继克隆出来，如大豆β-菜豆蛋白启动子[Altenbach SB，et al，.(1989)Enhancement of the methionine content of seed proteinsby the expression of a chimeric gene encoding a methionine-rich protein in transgenic plants.Plant Mol Biol，13(5)：513-22]、大豆谷蛋白Gt1启动子[Zheng Z.，et al.(1995)The Bean SeedStorage Protein[beta]-Phaseolin Is Synthesized，Processed，and Accumulated in the VacuolarType-II Protein Bodies of Transgenic Rice Endosperm.Plant Physiology，109：777-786]和野生大豆Arcelin-5蛋白基因启动子[Goossens A.，et al.(1999)The arcelin-5 gene f phaseolusvulgaris directs high seed-specific expression in transgenic phaseolus acutifolius and arabidopsispplants.Plant Physiology，120，1095-1104]；还有油菜napinB蛋白启动子[Ericson ML.，et al.(1991)Analysis of the promoter region of napin genes from Brassica napus demonstrates bindingof nuclear protein in vitro to a conserved sequence motif.Eur J.Biochem，197，741-746]、油菜NapA基因启动子[Stalberg K.，et al.(1993)Deleion analysis of a 2S seed storage proteinpromoter of Brassica napus in transgenic tobacco.Plant Molecular Biology，23，671-683]和咖啡11S种子贮藏蛋白基因启动子[Marraccini P.，et al.(1999)Molecular cloning of the complete11S seed storage protein gene of Coffea arabica and promoter analysis in transgenic plants.PlantPhysiol.Biochem，37(4)：273-282]等等。这些种子特异性启动子大多数都表现出其种子特异性表达活性，即只有在受体植物种子或胚乳中特异性表达，而其它组织中几乎不表达或表达量很少。

目前，国内的种子特异性启动子的研究进展也很快。已经克隆到的种子特异性启动子有：油菜Napin蛋白基因的启动子BcNA1[Shi Dong-Qiao(石东乔)，et al.(2000)Cloning thepromoter of BcNA1 from Brassica napus and Fad2 gene from Arabidopsis thaliana andconstruction of the plant expression vector.High Technology Letters，6(1)，81～88]和Napin蛋白基因的启动子nap300[李丽，等.(2001)种子特异性启动子(napinB promoter)分离、表达载体构建及转基因植物获得.植物学通报，18(2)：216～220]；玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子[赵倩，等.(1999)玉米19kD醇溶贮藏蛋白基因启动子种子特异性表达控制区段的分析.植物学报，41(1)，51～54]；水稻醇溶蛋白启动子Gt1[张宪银，等.(2002)水稻胚乳特异性启动子Gt1的克隆及其功能验证.作物学报，28(1)110～114]、水稻醇溶蛋白启动子I[游志鹏，等(1999)水稻种子贮存醇溶蛋白4a基因的启动子I及其调控元件.农业生物技术学报，7(2)，103～108]；棉花Lea蛋白基因启动子[罗克明，等.(2002)棉花Lea蛋白D-113基因启动子的克隆及序列分析.遗传学报，29(2)，161～165]；甘薯贮藏蛋白基因启动子[陈克贵，等(2000)甘薯贮藏蛋白基因启动子和信号肽编码区克隆及序列分析.作物学报，26(5)，594～598]等。

发明内容

本发明的目的是提供一种从大豆中分离到的种子特异性启动子序列及其应用。本发明在于转基因植株中使其外源基因的表达局限于种子中，避免了外源基因在其它部位持续表达所带来的不利影响。因此，本发明对作物品种的品质改良和转基因植物来生产药用蛋白非常有用。

本发明提供从大豆中分离的种子特异性启动子核酸序列，它是β-伴球蛋白α-亚基基因的启动子序列。具体讲是大豆β-伴球蛋白α-亚基基因的启动子核苷酸序列及其应用。将该启动子下游衔接其它外源基因，并与不同的表达载体连接，转化到植物中，利用其种子特异性表达活性，在种子中特异性表达其下游基因的方法和应用。

本发明的目的是提供含有该启动子核苷酸序列与其它外源基因连接，构建功能性表达的表达载体。

本发明的另一个目的是提供含有该启动子核苷酸序列或该启动子核苷酸序列与其它外源基因连接的表达载体转化宿主细胞或宿主组织及其后代。

本发明的另一个目的是提供一种用含有该启动子核苷酸序列或该启动子核苷酸序列与其它外源基因连接的表达载体转化宿主细胞或宿主组织及其后代细胞，并以此来进行作物品种的品质改良或生产药用蛋白质等。

本发明包括：

(1)具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或

(2)与(1)所述的核酸序列互补的核酸序列；或

(3)与(1)或(2)的核酸序列具有基本序列同源性的核酸序列；或

(4)是(1)、(2)或(3)的核酸序列的类似物的核酸序列；或

(5)与(1)、(2)、(3)或(4)的核酸序列，在杂交条件下杂交的核酸序列

本发明的第二方面，提供了含有上述核苷酸序列的表达载体，以及用上述核苷酸序列或表达载体转化的宿主细胞或宿主组织及其后代细胞。

本发明的第三方面，提供了一种用含有该启动子核苷酸序列或该启动子核苷酸序列与其它外源基因连接的表达载体转化的宿主细胞或宿主组织及其后代细胞来进行作物品质改良或生产药用蛋白等。

本发明所述的植物宿主细胞或宿主组织是植物种子细胞或植物种子本身，或它们的后代，蛋白质或脂肪酸组成已经改变的植物种子细胞或植物种子本身。

本发明所述的在植物组织中表达种子特异性启动子的方法，包括下述步骤：

(1)将含有上述核苷酸序列的表达载体载体导入植物细胞。

(2)使所述的植物细胞生长成能够结种子的成熟植物。

本发明可用于生产人类食品、动物饲料、化妆品或药品。

本发明所述的大豆种子特异性启动子序列的分离方法包括下述步骤：

(1)提取大豆总DNA。

(2)设计并合成如下两条引物：

引物1：5`-GCG  AAG CTT CAA AAA CGC AAT CAC ACA CA-3`

                    HindIII

引物2：5`-GAA  TCT AGA AAC CGC GCT CTC ATC ATA GTA TAT-3`

                    XbaI

两个引物的5`端分别加入了限制性内切酶HindIII位点和限制性内切酶XbaI位点。

(3)以大豆总DNA为模板，进行PCR反应：

反应组分                  加入量

缓冲液(10×)

(含20mmol/L MgCl₂)       5μl

dNTP(2.5mmol/L)           2μl

引物1(1μmol/L)           2μl

引物2(1μmol/L)            2μl

Taq(5u/μl)                0.5μl

H₂O                       36.5μl

模板DNA(0.1μg/μl)        2μl

总体积                     50μl

扩增条件：94℃5min 94℃ 30s，52℃ 1min，72℃ 2min，共35个循环；72℃ 10min。

(4)回收PCR片段，亚克隆到测序载体；再转化到大肠杆菌感受态细胞，在含氨苄青霉素，终浓度为50-100μg/ml的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒，经HindII和XbaI双酶切和PCR扩增鉴定阳性克隆。

(5)对阳性克隆进行测序，确证启动子片断。

本发明中所述的核酸序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入、倒位的核苷酸序列，即原始分离序列的人工突变体，它还具有它的的启动子功能。还可以是所述的核苷酸序列与其它的启动子序列的融合序列。

本发明中所述的其它外源基因是指任何一段核酸序列，并具有编码某种蛋白质或其它活性物质功能的，包括RNA或DNA序列，该序列与种子特异性启动子正常情况不相结合。此核酸序列包括不同于启动子的植物植物种类得到的异源核酸序列，以及从相同于启动子的植物种类得到的同源核酸序列，但这些序列与野生型(非转基因)植物的启动子无关。

本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何一种载体，例如pBI121等。

本发明中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法等。

本发明中所述的宿主细胞或宿主组织及其后代细胞是指所有植物细胞或植物组织或由这些细胞或组织发育成熟的整体植株(包括种子)。

术语“核酸序列”指含有天然存在的碱基，糖和糖之间(支链)的键的核苷酸或核苷单体的序列。该序列也包括含有发挥相似功能的非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列。

术语“种子特异性启动子”是指在启动子控制下表达的基因在有或没有基本表达的植物种子中优先表达。

术语“具有基本序列同源性的序列”是指与(1)或(2)中的序列相比有轻微的或无关紧要的序列变化的那些核酸序列，这些序列以基本相同的方式发挥作用并且能够驱动其下游基因的种子特异性表达。这些变化可能是由于局部的突变或结构上的修饰。

术语“杂交的序列”是指可以在严格杂交条件下与(1)、(2)、(3)或(4)的序列杂交的核酸序列。“严格杂交条件”是指本领域技术人员已知的，或者可以在《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯编著，科学出版社，第二版，1993)中的通用方案中找到。

本发明克隆的种子特异性启动子—大豆β-伴球蛋白α-亚基基因的启动子是国内首次克隆到的大豆种子特异性启动子，而且是这一启动子的种子特异性启动子活性的功能验证。本发明在于转基因植株中使其外源基因的表达局限于种子中，避免了外源基因在其它部位持续表达所带来的不利影响。因此，本发明对作物品种的品质改良和转基因植物来生产药用蛋白非常有用。这一启动子的研究和开发，对今后转基因大豆、乃至所有转基因植物具有重大应用前景。

附图说明

图1：种子特异性启动子片断BCSP666的电泳图。

图2：种子特异性启动子-大豆β-伴球蛋白α-亚基基因的启动子(BCSP666)序列。

图3：本发明的植物表达载体的构建流程图。

图4：转基因植株和野生型植株荧光分析。

图5：转基因拟南芥和野生型拟南芥不同样品不同处理时间荧光值分析。

具体实施方式

实施例1.种子特异性大豆启动子序列(Beta conglycinin subunit promoter 666，简称BCSP666)的分离

大豆吉育43种子种植于花盆，使其长出幼嫩的叶片后，取200mg鲜嫩的叶片，用SDS-CTAB改进法提取总DNA，取5μl DNA样品，琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。

设计并合成如下两条引物，并且为以后的克隆和构建的需要，在两个引物P1和P2的5`端分别加入了限制型内切酶HindIII位点和限制型内切酶XbaI位点：

引物1：5`-GCG  AAG CTT CAA AAA CGC AAT CAC ACA CA-3`

HindIII

引物2：5`-GAA  TCT AGA AAC CGC GCT CTC ATC ATA GTA TAT-3`

XbaI

以大豆吉育43总DNA为模板，进行PCR反应，其反应体系如下：

反应组分                    加入量

缓冲液(10×)

(含20mmol/L MgCl₂)         5μl

dNTP(2.5mmol/L)             2μl

引物1(1μmol/L)             2μl

引物2(1μmol/L)             2μl

Taqase(5u/μl)              0.5μl

H₂O                        36.5μl

模板DNA(0.1μg/μl)         2μl

总体积                      50μl

扩增条件：94℃5min； 94℃30s，52℃1min，72℃2min，共35个循环；72℃10min；电泳检测结果表明(如图1所示)，扩增得到大小约700bp的DNA片断。用UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)回收，把回收片段亚克隆到测序载体pGEM-T(Promega公司产品)中；连接产物转化到用CaCl₂法处理的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素(终浓度为50～100μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素(终浓度为50～100g/ml)的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法[Sambroook，et al.，1989，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory，New York，p19-21]提取质粒，经限制型内切酶HindII和XbaI双酶切和PCR扩增鉴定阳性克隆，测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)，确证pT-BCSP666含有BCSP666启动子片断，如图2所示。

实施例2：植物表达载体pBI121-666的构建

构建流程如图3所示，用碱裂解法提取以上pT-BCSP666质粒，经HindIII和XbaI酶切后，释放出BCSP666启动子片断，与经过同样酶切的植物表达载体pBI121的大片断相连，然后将连接产物用CaCl₂法转化到大肠杆菌DH5α，提取重组质粒pBI121-666，并进行PCR及酶切鉴定，确证pBI121-666含有BCSP666启动子片断。

实施例3：农杆菌介导的拟南芥的转化

利用冻融法将重组的植物表达载体pBI121-666转入根癌农杆菌LBA4404，转化方法参照Hofen等[Hofen R，Willmitzer L，(1988)Storage of competent cells for Agrobacteriumtransformation.Nucleic Acids Research，16，9877]。

拟南芥的转化参照Clough等[Clough SJ，Bent AF.(1998)Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal，16(6)，735～743]的Floral dip方法进行。转化受体为拟南芥(Arabidopsis thaliana)。将过夜培养的农杆菌LBA4404(含有pBI121-666)菌液，用Floral dip浸染液稀释2-3倍，把将要开花的花蕾浸泡在含有农杆菌的浸染液里5分钟，用滤纸吸干多余的菌液，25～28℃暗培养24小时。然后，将转化的植株开花结果后，收集种子。

实施例4：转基因拟南芥的筛选和检测

将收集到的种子，进行表面消毒后，种植在含有卡那霉素的1/2MS培养基上进行筛选。在卡那霉素抗性培养基上能够正常生长的拟南芥植株转接到花盆，使其开花结果，收集种子。共筛选到50株能够在卡纳霉素抗性培养基上正常生长的拟南芥苗，并转接到花盆后存活48株，每个植株取一叶片，用SDS-CTAB改进法[刘小勇等(1997)提取植物和微生物DNA的SDS-CTAB改进法.北京林业大学学报，19(3)，100～103]提取植物总DNA，用克隆BCSP666启动子所用的引物(引物1、引物2)进行PCR扩增，结果表明，50株拟南芥中，有28株表现阳性，扩增出666bp的片断，而其它20株和野生型拟南芥均未能扩增出此片断。

实施例5：转基因拟南芥的GUS基因表达分析

GUS基因的分析方法根据Jefferson等人[Jefferson RA.(1987)Assaying chimeric genes inplants：The GUS gene fusion system.Plant Molecular Biology Reporter，5(4)，387～405]，取植物材料(叶片和种子)100mg，放入1.5ml的离心管中，加入100μl提取缓冲液，研磨成匀浆，离心12000rpm，4℃，10min，吸取上清，即为GUS酶粗提取液，将此GUS酶粗提取液加至700μl的MUG溶液(提取缓冲液中加入1μmol/L的MUG)中，混匀，37℃下进行反应，于反应开始后不同时间取样各100μl，注入盛有2.9ml的反应终止液(0.2mol/L Na₂CO₃)的离心管中终止反应，用RF-540型荧光光度计在激发365nm、发射455nm、狭缝10nm条件下测定各样品的荧光。结果发现，与对照株相比，转基因拟南芥的叶片的提取液中并未发现较高的GUS酶活性，而转基因植株的种子中却有较高的GUS活性，如图3-1；而且用不同时间处理后的不同样品的曲线图表明，只有转基因植株的种子才具有较高的GUS活性，如图3-2。

由此可知，本发明所述的大豆种子特异性启动子确实具有种子特异性表达活性。

序列列表

SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>从大豆中分离到的种子特异性启动子序列及其应用

<130>030928

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>666

<212>DNA

<213>大豆种子特异性启动子(Glycine max)

<400>1

caaaaacgca atcacacaca gtggacccaa aagccatgca caacaacacg tactcaccaa  60

ggtgcaatcg tgctgcccaa aaacattcac caactcaatc catgatgagc ccacacattt    120

gttgtttgta accaaatctc aaacgcggtg ttctctttgg aaagcaacca tatcagcata    180

tcacactatc tagtctcttg gatcatgcat gcgcaaccaa aagacaacac ataaagtatc    240

ctttcgaaag caatgtccaa gtccatcaaa taaaattgag acaaaatgca acctcacccc    300

acttcactat ccatggctga tcaagatcgc cgcgtccatg tgggtctaaa tgccatgcac    360

atcaacacgt actcaacatg cagcccaaat tgctcaccat cgctcaacac atttcttgtt    420

aatttctaag tacactgcct atgcgactct aacccgatca caaccatctt ccgtcacatc    480

aattttgttc aattcaacac ccgtcaactt gcatgccacc ccatgcatgc aagttaacaa    540

gagctatatc tcttctatga ctataaatac ccgcaatctc ggtccaggtt ttcatcatcg    600

agaactagtt caatatccta gtatacctta ataaataatt taatatacta tgatgagagc    660

gcggtt                                                               666

Claims (8)

1、一种从大豆中分离到的种子特异性启动子序列，其特征在于它包括：

(1)具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或

(2)与(1)所述的核酸序列互补的核酸序列；或

(3)与(1)或(2)的核酸序列具有基本序列同源性的核酸序列；或

(4)是(1)、(2)或(3)的核酸序列的类似物的核酸序列；或

(5)与(1)、(2)、(3)或(4)的核酸序列，在杂交条件下杂交的核酸序列。

2、一种表达载体，其特征在于它是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体。

3、一种基因工程化的宿主细胞或宿主组织，它是用含有权利要求书2所述的重组载体转化的植物宿主细胞或植物宿主组织。

4、按照权利要求3所述的植物宿主细胞或宿主组织，其特征在于植物宿主细胞或宿主组织是植物种子细胞或植物种子本身，或它们的后代，蛋白质或脂肪酸组成已经改变的植物种子细胞或植物种子本身。

5、一种在植物组织中表达权利要求书1所述的种子特异性启动子的方法，其特征在于它的步骤包括：

(1)将权利要求书2所述的重组载体导入植物细胞，

(2)使所述的植物细胞生长成能够结种子的成熟植物。

6、按照权利要求5所述的，在植物组织中表达所述的种子特异性启动子的方法，其特征在于所述的植物是拟南芥。

7、权利要求书1～6任一项用于生产人类食品、动物饲料、化妆品或药品。

8、权利要求书1所述的大豆种子特异性启动子序列的分离方法，其特征在于它包括下述步骤：

(1)提取大豆总DNA；

(2)设计并合成如下两条引物：

引物1：5`  -GCG AAG CTT CAA AAA CGC AAT CAC ACA CA-3`

                HindIII

引物2：5`-GAA TCT AGA AAC CGC GCT CTC ATC ATA GTA TAT-3`

                XbaI

两个引物的5`端分别加入了限制性内切酶HindIII位点和限制性内切酶XbaI位点；(3)以大豆总DNA为模板，进行PCR反应：

反应组分             加入量

缓冲液(10×)(含20mmol/LMgCl₂)   5μl

dNTP(2.5mmol/L)                   2μl

引物1(1μmol/L)                   2μl

引物2(1μmol/L)                   2μl

Taq(5u/μl)                       0.5μl

H₂O                             36.5μl

模板DNA(0.1μg/μl)               2μl

总体积                            50μl

扩增条件：94℃5min；94℃ 30s，52℃1min，72℃ 2min，共35个循环；72℃10min；

(4)回收PCR片段，亚克隆到测序载体；再转化到大肠杆菌感受态细胞，在含氨苄青霉素，终浓度为50-100μg/ml的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒，经HindII和XbaI双酶切和PCR扩增鉴定阳性克隆；

(5)对阳性克隆进行测序，确证启动子片断。