CN101709307B - 一种生产可降解塑料的转基因植物的获得方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种生产可降解塑料的转基因植物的获得方法，解决聚酯对植物体的伤害，克服基因沉默，提高PHB表达量等问题，包括(1)启动子的克隆及启动子载体的构建；(2)将启动子载体与phbA、phbB、phbC基因相连，构建表达载体；(3)将表达载体导入植物受体中，即可得到转基因植物，启动子为种子特异性启动子，是以蚕豆的总DNA为模板而克隆的Leg基因启动子，具有序列表所示的核苷酸序列，构建的启动子载体为Leg-GUS，构建的表达载体为pSCAB，植物受体是苍耳。培育出的苍耳种子中PHB平均积累量超过鲜重的28％，为转基因植物生产可降解塑料研究提供了可行的方法和经验，开创了我国在转基因植物生产可降解塑料研究的新局面。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种生产可降解塑料的转基因植物的获得方法。
背景技术
随着工业的发展，塑料与钢材、水泥、木材成为并驾齐驱的新型基础材料行业，而且其应用领域远远超过另外三大产业。近年来中国塑料包装材料需求大幅增加，已渗透到国民经济各部门以及人民生活的各个领域。目前，全球年消费塑料达2.4亿吨，年增长4％左右；中国塑料年消费量已达4000多万吨，预计今后几年仍将以至少8％的年平均速度增长。但是一次性塑料包装材料、一次性日用杂品、农用地膜和医疗材料中大部分是难以降解和不宜回收利用的。它们对环境的污染、对生态平衡的严重破坏已引起了社会极大的关注。塑料产业发展面临能源供应日趋紧张和环境污染两大问题。因此，寻找可替代石油的新资源，研发环境友好材料，减少污染物的产生和排放，已经成为塑料业界的紧迫任务之一。同时，通过节能减排来促进经济结构的调整和经济增长方式的转变，是中国经济保持稳健发展的必然选择。
生物降解塑料被认为是在原料利用、产品制造、使用或者再生循环利用等环节中对环境负荷最小的材料，具有资源和能源消耗少、排放少、再生利用率高、对生态和环境无污染等特点，有益于减少石油基塑料制品所带来的环境污染和对不可再生石油资源的依赖，可实现最低成本地减少污染物排放，最大限度地利用资源，是当前实现节能减排的重要途径之一。生物降解塑料代替普通塑料已成为必然。
聚-β-羟基丁酸酯(PHB)及其它类型的聚β羟基链烷酸酯同属于聚酯类物质，是自然界中多种细菌的碳源及能源储备物。这种聚酯的物理化学特性与传统塑料相似，而且具有生物可降解性，如取代化学合成塑料将能从源头解决塑料废弃物引起的“白色污染”。目前，PHB主要通过细菌发酵法进行小规模生产，但因价格过高，在市场上无法与化学合成塑料竞争，难以推广。而众所周知，转基因植物能以二氧化碳为碳源、太阳能为能源合成目的产物，大大降低成本，为生产具有市场竞争力的新型生物可降解塑料提供可行途径。同细菌发酵系统相比，植物具有可利用自身丰富的碳源、不需要昂贵的发酵底物、生产成本低、可对真核蛋白进行正确翻译后加工、形成具有活性的分子和不需要复杂的发酵后加工过程等特点，植物作为生物反应器具有巨大潜力。该反应过程为：β-酮硫裂解酶(phbA编码)催化两分子乙酰CoA缩合生成乙酰乙酰CoA；乙酰乙酰CoA经乙酰乙酰CoA还原酶(phbB编码)的作用还原为D-3-羟丁酰CoA；PHB合酶(phbC编码)催化单体D-3-羟丁酰CoA聚合成PHB。
上述利用转基因植物生产PHB的过程中，外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用。因此，选择合适的植物启动子，并改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。目前在植物表达载体上应用的启动子分为两大类，即组成型启动子和特异性启动子。种子特异性启动子，由于它只在植物种子成熟中、后期大量表达其下游基因，而且所表达的外源蛋白大都集中在种子中，这样使其外源蛋白容易储藏、容易运输而备受关注。因此，种子特异性表达启动子的克隆和应用就成为植物基因工程研究的一个热点。目前，用于生产PHB的启动子主要有大豆β-菜豆蛋白启动子、大豆谷蛋白Gtl启动子、油菜napinB蛋白启动子、油菜NapA基因启动子等，但这些启动子存在表达量低、基因沉默，并且不能实现在PHB在种子中的特异性表达，不能有效的规避PHB对植物的毒害作用。
发明内容
本发明为了解决聚酯对植物体的伤害，克服基因沉默，提高PHB表达量等问题，提供一种生产可降解塑料的转基因植物的获得方法。
本发明是采用如下技术方案实现的：一种生产可降解塑料的转基因植物的获得方法，包括以下步骤：(1)启动子的克隆及启动子载体的构建；(2)将启动子载体与phbA、phbB、phbC基因相连，构建表达载体；(3)将所构建的表达载体导入植物受体中，即可得到转基因植物，本发明的创新点在于所述启动子为种子特异性启动子，该启动子是以蚕豆的总DNA为模板而克隆的Leg基因启动子，具有如序列表中所示的核苷酸序列。经序列分析表明，此DNA片段含有3061个核苷酸。该序列也含有一些在进化上保守性很高的序列，是重要的基因表达调控元件，在种子特异性表达中起调控作用，这些序列包括：RY重复序列、ACGT、AGCCCCA等。
本发明所述构建后的表达载体可以以现有技术中任何一种方法转化至植物受体中，例如，农杆菌介导法、基因枪法、电激法等。
所构建的启动子载体为Leg-GUS，所构建的表达载体为pSCAB。采用荧光监测分析和组织化学分析方法，通过对GUS基因的定量监测，分析基因在不同组织的表达进行分析。
所述的植物受体是苍耳。苍耳种子含油量高，种子发育过程中脂肪酸大量合成，从碳源转向乙酰CoA的代谢十分旺盛，将PHB合成定位种子，可最大限度的减少PHB积累对植物生长发育造成的影响，提高产量，同时产物集中便于提取。本发明对所使用的苍耳品种没有特殊限定，可以是蒙古苍耳(Xanthiummongolicum kitag)或刺苍耳、近无刺苍耳、蒙古苍耳、偏基苍耳等。转化后的苍耳组织可通过已知的方法培育成植株，这是本领域的普通技术人员很容易实现的。
本发明将以上的Leg基因启动子和用于合成PHB的phbA、phbB、phbC三个基因相连构建表达载体并转化至苍耳，培育出的苍耳种子中PHB平均积累量超过鲜重的28％，为转基因植物生产可降解塑料研究提供了可行的方法和经验，不但开创了我国在转基因植物生产可降解塑料研究的新局面，还为国际上相关研究提供了有力的实验依据。由此可见，通过基因工程方法改变植物的代谢途径，使碳源流向PHB合成途径来生产PHB，不仅可以解决人类面临的能源危机、环境污染等问题，甚至影响产业组织和结构调整，并带来巨大的经济效益和社会效益。以生物降解塑料取代化学合成塑料，可望彻底根治“白色污染”。
附图说明
图1为Leg-GUS启动子载体的构建流程图
图2为种子特异性表达载体pSCAB的结构示意图
图3为转基因苍耳(with Leg-GUS)的PCR检测电泳图
图4为PHB标准品的气相色谱分析图谱
图5为转基因苍耳(with Leg-GUS)中PHB的气相色谱分析图谱
图6为未转基因苍耳成熟种子的透射电镜照片
图7为转基因苍耳胚乳中生成的PHB颗粒透射电镜照片
具体实施方式
1.蚕豆Leg基因启动子的克隆及其载体的构建：
(1)根据蚕豆基因组序列资料设计兼并性引物，以蚕豆总DNA为模板，PCR的方法实现扩增。扩增引物为：
引物P1：
5`cttgctgtg cagctcgcct agtgaagct 3`
引物P2：
5`acccagata caatcgctgt taacgtagt 3`
94℃5min；94℃30s，55℃1min，72℃2min共35个循环；72℃10min。
即可产生约3.2kb的DNA片段，经测序后的结果见序列表。
在此基础上设计并合成如下两个引物，实现HindIII和Sal I酶切位点的整合：
引物L1：
5’-gcgaagcttgtgtcgctcagctcgcctagtg-3’
HindIII
引物L2：
5’-cgcgtcgaagcgacaattgcaggcagca-3’
Sal I
两个引物的5’端分别引入了HindIII位点和Sal I位点。以蚕豆总DNA为模板，94℃5min；94℃30s，54℃1min，63℃2min，共3个循环；然后94℃30s，65℃1min，72℃2min共32个循环；72℃10min扩增，即可产生DNA片段(Leg启动子)。将此DNA片段经HindIII和Sal I酶切后与经同样酶切的pBluescript
SK相连，用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆并提取重组质粒pSB，进行PCR及酶切鉴定，进行测序，确证pSB为含有Leg基因启动子的重组质粒。
(2)启动子载体Leg-GUS的构建：
提取以上pSB质粒，经HindIII和Sal I酶切后，释放出Leg启动子片段。
Leg-GUS构建：
Leg-GUS是在pB I 121基础上，将CaMV35S启动子置换为蚕豆的Leg启动子构建而成，还包括GUS基因、Kan筛选标记基因及T-DNA左右边界序列。Pst I和HindIII分别双酶切Leg-T和pBluescript SK+，将Leg-T切下的小片段(3.2Kbp)和pBluescript SK+的大片段(2.96kb)连接，获得整合Leg的中间质粒Leg-SK(6.16kb)。Sal I和HindIII分别双酶切Leg-SK和pB I 121，将Leg-SK切下的小片段(3.2K bp)与pBI121载体片段(12.2kb)连接，得到启动子载体(15.4kb)。
2.种子特异性表达载体pSCAB的构建
通过酶切及连接方法，将phbA、phbB和phbC分别与启动子载体Leg-GUS和导肽控制的中间质粒pP7SA，pP7Sbh和pP7SC连接。再将pP7SC与pP7SA的插入片断连接得到中间质粒pBICA，然后切下整个插入片段，连入pSB得到含有三个基因片段的种子特异性表达载体pSCAB，其结构如图2。
3.农杆菌介导的苍耳转化
利用冻融法将种子特异性表达载体pSCAB转入根癌农杆菌LBA4404，转化方法参照。Hofen(Hofen R，Willmitzer L.Storage of competent cells forAgrobacterium transformation.Nucl.Acids Res.，1988，16：9877.)
苍耳的转化参照Horsch(Horsch RB，Fry JE，Hoffillan NL，etal.，A simpleand general method for transfetring genes into plants，Science，1985，227：1229-1231.)的叶盘法进行。转化受体为苍耳(Xanthium sibiricum Patr.)。将过夜培养的农杆菌LBA4404菌液用MS液体培养基稀释4-5倍，将剪成0.5cm2左右的苍耳叶片在上述菌液中浸泡5分钟后，吸干多余菌液，25-28℃暗培养两天。
共培养后的叶片转移至筛选培养基上，25℃、每日16小时光照/8小时黑暗条件下培养，待芽长出并达5cm高时，将其转到生根培养基上，使其生根，待根系发育茁壮再将其移入花盆或试验田。在苍耳开花前两天用一较大的羊皮纸杂交袋罩住花序，直至开花7天后再取下，确保自花授粉。
4.转基因苍耳的分子生物学检测
(1).Leg基因启动子的PCR检测：
提取苍耳再生苗的总DNA，用克隆的蚕豆Leg基因启动子所用引物(引物：L1、L2)进行PCR扩增得到约3.2kb特异带，如图3所示，与Leg-GUS扩增结果一致，初步说明Leg整合到苍耳基因组DNA中。从所有呈PCR阳性植株中随机选取三株进行PCR-Southern分析，结果显示转化苍耳基因组DNA中扩增带可与DIG标记的Leg探针产生杂交信号，证明Leg已经整合。Southern结果进一步证实，Leg、gus以及Nos终止子正确连接并确已整合到苍耳基因组DNA中，我们已获得转基因苍耳植株。
(2).转基因植物的PCR检测。
提取转基因苍耳总DNA作为模板。
PCR引物的设计如下所示：
phbA基因(1.2kb)的对应引物为：
A1：5`-CACCATGACTGACGTTGTC-3`
A2：5`-GAAGAGCTCTTCCTTAATTT-3`
PhbB基因(780bp)的对应引物为：
B1：5`-TGACCATGACTCAGCGCATTG-3`
B2：5`-AGGCAAGCTTGTCAGCCCATATG-3`
phbC基因(670bp)的对应引物为：
C1：5`-CTTCCATCATGTTGCGCAC-3`
C2：5`-GAAGTCATCCGCTGCATTC-3`
反应条件为：94℃5min；94℃30s，55℃1min，72℃2min共35个循环；72℃10min。
5.转基因苍耳种子PHB含量分析
参照Nawrath等人(Nawrath C，Poirier Y，Somerville C.Targeting of thepolyhydroxybutyrate biosynthetic pathwayto the plastids of Arabidopsis thalianaresults in high levels of polymer accumulation.Proc NatlAcad Sci USA，1994，91：12760-12764)的方法，略有改动。取200mg左右经冷冻干燥并磨碎的植物叶片，用无水甲醇于55℃处理24h，初步去除植物中的脂肪酸、糖和叶绿素，室温下让残留的甲醇挥发完全.加入2mL氯仿，55℃提取24h.加入2mL酯化液(5g/L棕榈酸作内标，溶解于97％体积的甲醇和3％体积的浓硫酸中)于酯化管中，加盖密闭.同时精确称取10mg PHB标准品，加入2mL氯仿和2mL酯化液于酯化管中，100℃酯化4h.冷却至室温后，加入1mL蒸馏水，充分振荡混匀，离心分层.待氯仿相与水相完全分离后，取氯仿相依照HP公司的Hewlett Packard6890气相色谱仪说明书进行气相色谱分析，进样量为1μL。通过和PHB标准品各成分保留时间的比较，确定植物提取液中的PHB成分，并用峰面积积分法计算各单体成分的含量。
如图4、5所示，以购买自Sigma公司的PHB为标准品，结果显示转基因苍耳种子的氯仿提取液在保留时间为5.168min时出现1个色谱峰，说明转基因苍耳中确实合成了PHB，最高含量为4.8mg/g干重。
6.透射电子显微镜观察苍耳种子中PHB颗粒的积累
选取气相色谱检测PHB含量较高的转基因苍耳的种子做透射电子显微镜观察(如图6所示，以未转基因的苍耳成熟种子做对照)，如图7所示，转基因苍耳的种子胚乳中可见大量的透明电子体聚集，直径约为0.2～1μm，和细菌中的PHB颗粒类似，证明转基因苍耳种子胚乳中的透明电子体为PHB颗粒。
SEQUENCE LISTING
<110>山西九龙湾农林科技开发有限公司
<120>一种生产可降解塑料的转基因植物的获得方法
<160>1
<210>1
<211>3061
<212>DNA
<213>Vicia faba
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Claims (1)
1.一种生产可降解塑料的转基因植物的获得方法，包括以下步骤：
(1)启动子的克隆及启动子载体的构建；(2)将启动子载体与phbA、phbB、phbC基因相连，构建表达载体；(3)将所构建的表达载体导入植物受体中，即可得到转基因植物，其特征是所述启动子为种子特异性启动子，该启动子是以蚕豆的总DNA为模板而克隆的Leg基因启动子，该Leg基因启动子的核苷酸序列为：
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3061 ttcttattat tttctaatga aaata；
所构建的启动子载体为Leg-GUS，所构建的表达载体为pSCAB，所述的植物受体是苍耳，phbA、phbB和phbC是合成聚-β-羟基丁酸酯(PHB)的三个基因；
Leg-GUS是在pB I 121基础上，将CaMV35S启动子置换为蚕豆的Leg启动子构建而成，再通过酶切及连接方法，将phbA、phbB和phbC分别与启动子载体Leg-GUS和导肽控制的中间质粒pP7SA，pP7Sbh和pP7SC连接，再将pP7SC与pP7SA的插入片断连接得到中间质粒pBICA，然后切下整个插入片段，连入pSB得到含有三个基因片段的种子特异性表达载体pSCAB，然后将种子特异性表达载体pSCAB转入根癌农杆菌LBA4404，再转化至苍耳。
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