CN101914534B

CN101914534B - 幼苗及种子特异表达型大豆GmPLPA基因启动子及其应用

Info

Publication number: CN101914534B
Application number: CN 201010168982
Authority: CN
Inventors: 李文滨; 罗秋兰; 赵琳; 韩英鹏
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2010-05-05
Filing date: 2010-05-05
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2030-05-05
Also published as: CN101914534A

Abstract

本发明公开了一种幼苗及种子特异表达型大豆GmPLPA基因启动子及其应用。本发明提供的启动子为序列1所示的DNA分子或其部分片段。GmPLPA基因启动子在大豆中是首次被克隆。本发明的启动子可应用于在植物发育的特定时期(如幼苗期)或植物的特定组织(如种子)表达靶基因，避免组成型启动子启动靶基因造成的资源浪费，具有特异性强效率高的优点。本发明提供的启动子可应用于定向培育安全性高的转基因植物新品种，对于植物育种和靶基因功能及作用机理的研究，具有很大价值。

Description

幼苗及种子特异表达型大豆GmPLPA基因启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种幼苗及种子特异表达型大豆GmPLPA基因启动子(pGmPLPA)及其应用。

背景技术

真核生物基因表达的调节，一方面受控于基因调控的顺式作用元件，另一方面同时受到一系列反式作用因子的调控，即具调控作用的蛋白质因子。作用于真核细胞基因表达的顺式作用元件由启动子和调节序列组成。启动子(promoter)是一段能够被RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，能活化RNA聚合酶，指导全酶与模板的结合，决定转录起始的特异形式及频率。多数启动子位于基因的5’端上游。

根据启动子的转录模式可将其分为5类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子、双向启动子、可变启动子和诱导型启动子。诱导型启动子能控制基因在特定时期、特定部位表达，既避免目的基因在宿主细胞内高表达对宿主细胞生长的影响，又可使宿主细胞对特定的环境信号作出反应，如：光响应启动子、温度响应启动子等。强诱导型启动子对于建立一个高效、实用的表达系统是非常重要的。

深入研究启动子的功能不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，而且具有广泛的应用价值。

当前高等植物启动子分离及分析方法有以下五种：利用启动子探针质粒载体筛选启动子；加接头的PCR的方法；热不对称交错PCR(Termal Asymmetric InterlacedPCR，Tail-PCR)；环状PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)；Site Finding-PCR。

目前，商业化生产的转基因植物中广泛应用的启动子是组成型启动子，它们驱动外源基因在植物各种组织和所有发育阶段表达。不但增加了植物的代谢负担，而且造成物质和能量的巨大浪费，往往还会引起植物形态发生改变，甚至影响植物生长发育。采用特异性启动子使外源基因能够定时、定点、定量地在植物中表达，是植物基因工程研究的重要内容，这需要从主要农作物中分离出诱导特异性启动子和组织特异性启动子。通过鉴定后，确定它们的特异性作用元件，并将各特异元件组装起来形成一种能定时、定量和定点驱动目的基因表达的复合启动子，以满足基因工程的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种幼苗及种子特异表达型大豆GmPLPA基因启动子及其应用。

本发明提供的DNA片段(GmPLPA基因启动子)，来源于大豆东农L13，为如下1)至9)中任一所述的DNA分子：1)序列表的序列1自5’端第943至1497位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表的序列1自5’端第831至1497位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表的序列1自5’端第633至1497位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表的序列1自5’端第359至1497位核苷酸所示的DNA分子；5)序列表的序列1自5’端第284至1497位核苷酸所示的DNA分子；6)序列表的序列1自5’端第14至1497位核苷酸所示的DNA分子；7)序列表中序列1所示的DNA分子；8)在严格条件下与1)至7)中任一所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；9)与1)至7)中任一所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有以上任一所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为在pBI121的多克隆位点插入所述DNA片段得到重组质粒。

扩增以上任一所述DNA片段的引物对也属于本发明的保护范围。

以上任一所述DNA片段可应用于启动目的基因表达。所述目的基因表达可为时间特异性表达和/或组织特异性表达；所述时间特异性表达具体可为苗期表达或种子形成期表达；所述组织特异性表达具体可为拟南芥根特异性表达、烟草叶片特异性表达或大豆种子特异性表达。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将以上任一所述DNA片段导入目的植物，得到转基因植物。所述方法可为：将以上任一所述DNA片段导入所述目的植物，在所述目的植物中用所述DNA片段启动目的基因的表达，得到时间特异性表达所述目的基因和/或组织特异性表达所述目的基因的转基因植物。所述时间特异性表达具体可为苗期或种子形成期表达；所述组织特异性表达具体可为拟南芥根特异性表达、烟草叶片特异性表达或大豆种子特异强表达。所述拟南芥优选为拟南芥品种哥伦比亚生态型品种。所述烟草优选为烟草品种Petite Havana SR1。所述大豆优选为大豆品种黑农44。所述目的基因优选为GUS基因。所述方法优选为将所述重组载体导入所述目的植物。

以上任一所述DNA片段均可应用于培育转基因植物，如培育抗病性和/或产量和/或耐逆性高于出发植物的转基因植物。

可采用任何一种引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明的GmPLPA基因启动子转入植物，启动靶基因在植物幼苗或种子中特异性表达。如通过农杆菌侵染法转化烟草、拟南芥或大豆，得到纯合的GmPLPA基因启动子转基因植株。为了便于对转基因细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入了植物可选择性标记(GUS等)或具有抗性的抗生素标记物。用于转化的生物可以是细菌细胞，动物细胞和植物。一旦将本发明的启动子导入出发植物的基因组，获得转基因植物，就可能通过无性或有性繁殖获得后代，或者从该植株及其后代通过克隆获得繁殖材料来生产植物。

本发明的启动子可应用于在植物发育的特定时期(如幼苗期)或植物的特定组织(如种子)表达靶基因，避免组成型启动子启动靶基因造成的资源浪费，具有特异性强效率高的优点。本发明提供的启动子可应用于定向培育安全性高的转基因植物新品种，对于植物育种和靶基因功能及作用机理的研究，具有很大价值。

附图说明

图1为CTAB法提取大豆基因组DNA；1-6：大豆基因组DNA。

图2为GmPLPA基因启动子的PCR扩增结果；a：第一轮PCR；b：巢式PCR；M：DL2000Marker；1：PCR产物。

图3为PlantCARE在线分析启动子顺式元件结果。

图4为PBI121-pGmPLPA酶切鉴定结果；M：DL15000Marker；1：HindIII单酶切PBI121-pGmPLPA；2：PBI121-pGmPLPA质粒(泳道2有3条带，是质粒的三种状态，线性、螺旋状和超螺旋状；3：步骤一的PCR产物；4：HindIII和BamH I双酶切PBI 121-pGmPLPA。

图5为T₀代转全长pGmPLPA烟草的PCR鉴定图；M：DL2000Marker；其余泳道为PCR鉴定产物，具有特异条带的为转基因植株，没有特异条带的为假阳性植株。

图6为T₁代转全长pGmPLPA拟南芥PCR鉴定图；M：DL2000Marker；其余泳道为PCR鉴定产物，具有特异条带的为转基因植株，没有特定条带的为假阳性植株。

图7为T₀代全长pGmPLPA过表达大豆的PCR鉴定图；M：DL2000Marker；1-6：PCR产物，其中4，5，6具有特异条带，为全长pGmPLPA过表达大豆。

图8为实施例2中，T₀代转基因烟草的GUS染色结果；1：转基因烟草；2：野生型烟草。

图9为实施例2中，不同生长时期的T₂代转基因烟草的GUS染色结果；1：7天的烟草幼苗；2：15天的烟草幼苗；3：20天的烟草幼苗；4：30天烟草的叶片；5：40天烟草的叶片；天数均自播种之日开始计。

图10为实施例2中，不同生长时期的T₂代转基因拟南芥的GUS染色结果；1：7天的拟南芥幼苗；2：15天的拟南芥幼苗；3：20天的拟南芥幼苗；4：30天的拟南芥；5：40天的拟南芥花序和幼果；天数均自播种之日开始计。

图11为实施例2中，T₂代过表达大豆种子的GUS染色结果；1：50天的过表达大豆的荚皮；2：50天的过表达大豆的种子及荚皮；3；50天的过表达大豆的幼嫩子叶；4：60天的过表达大豆的子叶；5：50天的过表达大豆的种皮；6：60天的过表达大豆的种皮；A：50天的过表达大豆的幼嫩种子及荚皮(放大图)；CK：60天的野生大豆的种皮；天数均自播种之日开始计。

图12为GmPLPA基因启动子5’各缺失片段电泳图；M：50bp Marker；1-7分别代表实施例2的步骤二的PCR产物(全长启动子)、DNA片段①、DNA片段②、DNA片段③、DNA片段④、DNA片段⑤、DNA片段⑥。

图13为启动子各个缺失片段含有的各顺式元件以及相对位置。

图14为pGmPLPA启动子各5′端缺失片段转基因植物的GUS染色结果；1-7分别代表全长启动子、DNA片段①、DNA片段②、DNA片段③、DNA片段④、DNA片段⑤、DNA片段⑥转化得到的转基因植物；CK：野生型植物；A：烟草；B：拟南芥。

图15为pGmPLPA启动子各个缺失片段转基因拟南芥的GUS荧光定量柱形图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。Marker均购自大连宝生物公司。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、启动子的获得

一、启动子的获得

根据Clontech公司的GenomeWalker^TM Universal Kit进行。

1、CTAB法提取大豆叶片基因组DNA

取大豆品种东农L13的新鲜叶片1g，在液氮冷冻下迅速研磨成粉末，然后将粉末放到50ml离心管中，加入15ml提取缓冲液，充分混匀，65℃水浴2h，期间每隔15min轻轻颠倒混匀；加等体积CI(CI∶氯仿∶异戊醇＝24∶1)，颠倒混匀，3000rpm/15min，抽取上清；重复一次；加入50μl RNA消化酶，室温消化30min；加入等体积预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置1h；用牙签挑出DNA于1.5ml离心管中；加1ml 70％乙醇，1000rpm离心1min，洗两次；沉淀抽干，加适量ddH₂O溶解，达到终浓度0.1μg/μl，-20℃保存。基因组DNA的电泳图见图1。

2、限制性内切酶消化大豆基因组DNA

采用四种限制性内切酶：Dra I、EcoRV、Pvu II和Stu I酶切大豆基因组DNA，酶切体系见表1。

表1酶切体系

试剂	每管加入量(μl)
		限制性内切酶	8
反应buffer	10
		基因组DNA	25
ddH₂O	57

3、酚氯仿法纯化酶切产物

每管酶切产物中加入95μl酚氯仿；低速震荡5-10s，充分混匀后3000rpm离心5min；抽取上清，加入等体积的氯仿；同样轻轻混匀后3000rpm离心5min；取上清每管加入2倍体积预冷的95％乙醇，1/10体积的3M NaAc(PH4.5)和20μg的糖元提取缓冲液，充分混匀，14000rpm 4℃离心15min；弃上清，沉淀抽干，加20μl ddH₂O溶解，-20℃保存。

4、加入接头

按照表2依次加入各个成分，轻轻混匀后，16℃孵育过夜，70℃变性连接酶5min，每管加入72μl TE(10/1，PH7.5)，低速震荡混匀。

表2步骤四中各个组分的加入量

试剂	每管加入量(μl)
		已纯化消化后的DNA	4
GenomeWalker接头(25μM)	1.9
		10×连接酶缓冲液	1.6
T4连接酶(6U/μl)	0.5
		总体积	8

5、引物设计

根据发明人已经克隆的PAS/LOV protein A(GmPLPA)基因5’端序列，设计如下引物，用于GmPLPA上游启动子区域扩增：

基因反义和巢氏引物(5’→3’)：

pGSP1：GTCGAAGGAACGCTGGATTGTTG；

pNGSP1：ATCGGCATCGGCGTTGTTGGTG。

6、制备PCR Master混合物。

7、进行PCR扩增：

7个循环：94℃25s，72℃3min；

32个循环：94℃25s，67℃3min；

67℃7min。

8、将第一轮PCR产物按1∶50比例稀释，作为巢式PCR模板，引物为pNGSP1(10μM)和AP2(10uM)，反应体系不足加水补足，进行巢式PCR。每个样品各取8μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。PCR产物-20℃保存。

9、PCR产物的纯化和胶回收

按照上海华舜生物工程有限公司的小量胶回收试剂盒回收DNA片段，PCR产物连接到pGEM-T Vector(promega公司)，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆测序。

10、pGmPLPA序列的获得和启动子顺式元件分析

根据GmPLPA 5’端扩增序列和GmPLPA基因序列进行拼接，得到GmPLPA基因5’端ATG前启动区域pGmPLPA(启动子)。

二、GmPLPA基因启动子的生物学分析

PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线分析启动子的各个顺式元件组成，结果见图3所示。该启动子含有107个顺式作用元件，其中包括激素调节元件、光反应元件、周期控制元件、增强子、TATA box、GC box等等。

实施例2、启动子的功能验证

一、设计引物

根据序列1所示的pGmPLPA(启动子)设计引物，在5’和3’两端分别引入BamH I和HindIII酶切位点；引物如下(5’→3’)：

pGmPLPA正义引物：GGCAAGCTTTGGTATCGTAATCGGCA；

pGmPLPA反义引物：CGGGGATCCCGTTGTTGGTGTTGTTG。

二、pGmPLPA(启动子)的制备

1、提取东农L13(东北农业大学保证向公众提供；参考文献：Lin Zhao and WenbinLi*(2008)A RAV-like transcript ion factor control photosynthesi s andsenescence in soybean.Planta.227：1389-1399)叶片的基因组DNA。

2、PCR扩增

按次序加入以下PCR反应成分：

大豆基因组(0.1μg/μl) 1μL

10×PCR缓冲液 5μL

dNTP Mix(10mM) 1μL

GmPLPA正义引物 1μL

GmPLPA反义引物 1μL

PCR级水 40.5μL

LA Taq酶 0.5μL

总体积 50μL

PCR反应条件：94℃5min；35个循环：94℃30s，62℃30s，72℃2.5min；72℃5min。

PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，进行测序，结果表明，除了引物中所引入的酶切识别位点，PCR产物的核苷酸序列如序列表的序列1自5’端第14至1497位核苷酸所示。

三、pGmPLPA农杆菌双元表达载体的构建

1、将步骤二的PCR产物用限制性内切酶BamH I和HindIII进行双酶切，回收1500bp左右的酶切产物；

2、将pBI121载体(购自北京拜尔迪生物技术有限公司，产品货号：MP-091)用限制性内切酶BamH I和HindIII进行双酶切，回收载体骨架；

3、将该步骤1回收的酶切产物与步骤2回收的载体骨架连接，得到重组质粒；

4、重组质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定结果见图4；

5、将酶切鉴定正确的重组质粒进行测序鉴定。

结果表明：得到了重组质粒pBI121-pGmPLPA(在pBI121的BamH I和HindIII酶切位点之间，用序列1自5’端第14至1497位核苷酸所示的DNA取代了质粒中的Ca35S组成型启动子)。

四、重组农杆菌的构建

将步骤三制备的重组质粒pBI121-pGmPLPA转化农杆菌LBA4404(购自英竣公司，产品编号：18313015)，得到重组农杆菌。

五、转pGmPLPA植物的获得

1、转pGmPLPA烟草的获得(烟草叶盘转化)

将无菌烟草(品种为Petite Havana SR1，购自LEHLE SEEDS，产品编号：NT-02)叶片切去边缘和主要叶脉，切成大小1cm²的外植体；外植体在步骤四制备的重组农杆菌菌液中浸泡10min；用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，将小叶片摆放在铺有一层滤纸的芽分化培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+100μM As+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH5.8)上进行共培养，25℃暗培养3天；将经过共培养的烟草外植体转移到抗性芽筛选培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+300mg/L卡那霉素+500mg/头孢曲松钠+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH5.8)进行培养，光照周期为16h/8h(光照/黑暗)，期间继代一次，一月后即可生芽，待抗性芽生长至1cm高时，切下小芽转入生根培养基(1/2MS+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢曲松钠+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH5.8)中诱导生根，一周后就会有不定根形成，即为T₀代幼苗。

T₀代幼苗移栽一周后，采取叶片并提取基因组DNA，进行PCR鉴定(正义引物：TGGTATCGTAATCGGCA；反义引物：CGTTGTTGGTGTTGTTG)。反应条件：94℃5min；35个循环：94℃30s，60℃30s，72℃2.5min；72℃5min。结果见图5。共得到20株转pGmPLPA(全长启动子)的T₀代植株。T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₂代表示T₁代植株的自交后代。

2、对照烟草的获得

用pBI121代替pBI121-pGmPLPA，转化农杆菌LBA4404(购自英竣公司，产品编号：18313015)，得到重组农杆菌。用重组农杆菌转化无菌烟草(品种为Petite HavanaSR1)，方法同步骤1，得到T₀、T₁和T₂代转空载体对照烟草。

3、转pGmPLPA拟南芥的获得(粉管浸染法)

将拟南芥(哥伦比亚生态型，购自LEHLE SEEDS，产品编号WT-02)倒置，使花蕾朝下浸入步骤四的重组农杆菌渗透液中，停留一秒，取出花蕾，轻轻抖落植株上的多余渗透液，将植株正置。转化后的植株用硬塑料板保护后盖好保鲜膜，暗培养一天后，转至温室中正常培养，直到开花结荚收集种子(T₁代种子)。

取0.1g T₁代种子，4℃春化三天，加入含吐温的乙醇，在摇床上振荡10分钟。用离心机甩一下，用移液器吸去上清。重复一至二次。在超净台下，每个管加入乙醇，用移液器把种子转移到灭过菌的滤纸上，吹干。把种子均匀的撒在含有3％蔗糖的卡那霉素(50mg/L)抗性培养基上。用封口膜封好平皿，25℃，16h/8h(光照/黑暗)培养，具有卡那抗性的苗在抗性平板上能够正常生长呈绿色，而非抗性苗则黄化死去。待平板上的绿苗长出四片真叶时可将其移至土中，盖上保鲜膜保水两大后揭去，培养到幼苗长出一片真叶且较粗壮时可剪取叶片，提基因组，进行PCR鉴定，鉴定引物同转基因烟草鉴定引物，结果见图6。共得到50株转pGmPLPA(全长启动子)的T₁代植株。T₂代表示T₁代的自交后代。

4、对照拟南芥的获得

用pBI121代替pBI121-pGmPLPA，转化农杆菌LBA4404(购自英竣公司，产品编号：18313015)，得到重组农杆菌。用重组农杆菌转化拟南芥(哥伦比亚生态型)，方法同步骤3，得到T₁和T₂代转空载体对照拟南芥。

5、pGmPLPA过表达大豆的获得(下胚轴转化法)

将大豆(黑农44，购自维农种业)氯气灭菌16小时后，种植于萌发培养基(MS+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH5.8)，七天后切取1cm长的下胚轴作为外植体，在步骤四制备的重组农杆菌菌液中浸泡30min；用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，将下胚轴平放在铺有一层滤纸的共培养培养基(1/2MS大量盐+MS铁盐+1.67mg/L 6-BA+40μM As+1mg/LNa₂S₂O₃+1mg/L Cys+1.0mg/L DTT+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH5.6)上；25℃暗培养3天；将共培养后的下胚轴转移至芽分化培养基(1/2MS大量盐+MS铁盐+3mg/L 6-BA+3％蔗糖+20mg/L头孢曲松钠+0.8％琼脂，pH5.8)，生长点朝上插入培养基中，培养一周，光照周期为16h/8h(光照/黑暗)；之后转移至芽筛选培养基(1/2MS大量盐+MS铁盐+1mg/L6-BA+0.2mg/L IBA+75mg/L卡那霉素+20mg/L头孢曲松钠+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH5.8)培养1-2月，期间每隔10天继代一次，直至抗性芽生长至1cm高时，切下小芽转入生根培养基(1/2MS大量盐+MS铁盐+1mg/L IBA+75mg/L卡那霉素+20mg/L头孢曲松钠+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH5.8)，15天后形成不定根，移栽即为T₀代幼苗。

T₀代幼苗移栽一周后，采取叶片并提取基因组DNA，进行PCR鉴定。由于在大豆基因组中存在GmPLPA基因，因此PCR鉴定采用的引物是GUS基因引物(正义引物：AACTGCTGCTGTCGGCTTTA；反义引物：GATTCATTGTTTGCCTCCCT)。反应条件：94℃5min；35个循环：94℃20s，58℃30s，72℃1min；72℃5min。结果见图7。共得到3株pGmPLPA(全长启动子)过表达的T₀代植株。T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₂代表示T₁代植株的自交后代。

6、对照大豆的获得

用pBI121代替pBI121-pGmPLPA，转化农杆菌LBA4404(购自英竣公司，产品编号：18313015)，得到重组农杆菌。用重组农杆菌转化大豆(黑农44，购自维农种业)，方法同步骤5，得到T₁和T₂代转空载体对照大豆。

六、GUS组织化学染色

GUS组织化学染色观察如下植株(烟草和拟南芥)在不同发育期中启动子的启动效应：转pGmPLPA的T₀烟草(随机选取10株)、转GmPLPp的T₂代烟草(随机选取10株)、T₀代转基空载体烟草(随机选取10株)、T₂代转空载体烟草(随机选取10株)、转pGmPLPA的T₂代拟南芥(随机选取20株)、T₂代转空载体拟南芥(随机选取20株)、野生型烟草(10株)和野生型拟南芥(20株)。分别取pGmPLPA过表达的T₂代大豆、转空载体大豆和野生型大豆(各随机选取三株)50天和60天的幼荚、幼嫩种子、种皮和叶片进行GUS组织化学染色。

GUS染色：按照Jefferson的方法，将待测样品与X-Gluc染色反应液(100mmol/LKH₂PO₄，PH7.0；0.5mmol/L K₄[Fe(CN)₆]；0.5mmol/L K₃[Fe(CN)₆]；0.1％Triton X-100；0.5mg/ml X-Gluc[X-glucuronide，Molecular probe])于37℃保温24h后观察。叶片等绿色组织用95％乙醇脱色后观察、照相。

T₀代和T₂代烟草染色结果分别见图8及图9。T₂代拟南芥染色结果见图10。T₂代大豆染色结果见图11。比较不同组织：在烟草幼苗的叶片中启动活性最强；在拟南芥幼苗的根部中启动活性最强；在大豆的幼嫩种子中启动活性最强；表明启动子为组织特异性启动子。比较不同发育期：在转基因烟草中30天启动子启动活性开始减弱；在拟南芥中15天后逐渐沉默，直到成株观察不到GUS活性；在大豆中也呈现类似的规律，但是在60天生长的过量表达启动子大豆的幼嫩种子启动活性明显强于50天生长的大豆幼嫩种子，表明启动子特定在幼苗和种子中具有高的启动活性，在成熟植株中除了种子外，启动活性消失，是个组织特异性表达启动子。

在转空载体的植株生长过程中，所有组织器官均呈现高强度的GUS表达活力。野生型植株中，均观察不到GUS活性。

七、GUS荧光定量分析

GUS荧光定量分析按照Jefferson的方法，测定如下植株在不同时期中的启动子的GUS活性：T₂代转基因烟草(来自3株T₁代转基因烟草的自交后代)、T₂代转空载体烟草(来自3株T₁代转空载体烟草的自交后代)、T₂代转基因拟南芥(来自3株T₁代转基因拟南芥的自交后代)、T₂代转空载体烟草(来自3株T₁代转空载体拟南芥的自交后代)、野生型烟草和野生型拟南芥。

1、GUS提取：100mg材料(整株)至于液氮中研磨成粉末；加入3倍体积的提取缓冲液(50mM磷酸钠pH 7.0，10mM EDTA，0.1％Triton X-100，0.1％十二烷基肌氨酸钠，10mM β-疏基乙醇)，研成匀浆；4000rpm离心10min，收集上清(GUS提取液)，4℃保存备用。

2、GUS提取液蛋白含量测定按照Bradford法：首先制作标准曲线：配制BSA浓度为1.0-25.0mg/ml的梯度液，与考马斯亮蓝G250溶液(100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 95％乙醇中，加100ml磷酸，加H₂O定容至1L，过滤后于4℃保存)以4∶1(体积比)混匀，测量595nm的吸光值，对吸收值和对应蛋白浓度进行统计处理得到回归方程；植株总蛋白含量测定：GUS提取液20μL加水补至4ml，加入1ml考马斯亮蓝G250溶液，混匀，测定595nm的吸收值，根据回归方程计算样品总蛋白含量。

3、酶反应：将反应缓冲液(GUS提取缓冲液中加入1mM MUG[4-甲基伞形酮β-D葡萄糖苷])于37℃预热；取一个1.5ml离心管加入200μL反应缓冲液，再加入20μLGUS提取液混匀，立刻取出100μL加入到900μL反应终止液(0.2M Na₂CO₃)中，作为反应零时样品(荧光测定时以此为空白)，并开始严格计时；将反应管放入37℃水浴中进行酶反应30min，取出100μL加入到900μL反应终止液中混匀，荧光测定备用。

4、荧光测定：制作标准曲线，配制1mM 4-MU(4-甲基伞形酮)母液，按1∶9体积比用反应终止液稀释成1nM-100mM梯度液，在激发光365nm，发射光455nm，狭缝2.5-10nm条件下用日立F-7000荧光分光光度计测定样品的荧光，以反应终止液为空白，对荧光值和对应4-MU浓度进行统计处理得到回归方程；样品荧光测定：以0时为空白，在上述条件下测定各管荧光强度，从回归方程计算4-MU含量。

5、GUS活性计算：酶活力单位定义：每分钟水解4-MUG生成1pM 4-MU的酶量作为一个活力单位；GUS基因表达活性：以mg蛋白的酶活力来计算，结果表示成pmoles·MU min^-1mg^-1 protein。对每个生长时期的植株GUS活性进行统计分析，计算平均值和方差。

GUS荧光定量结果见表3。

表3不同生长时期的转基因拟南芥和烟草GUS活性

CK为生长7天的野生型烟草和拟南芥的GUS荧光定量结果。由于采用整株植株作为样本，受到叶绿色的影响，野生型植株中也具有本底值。对转基因植株荧光定量分析显示：pGmPLPA启动子在转基因拟南芥和烟草中均在幼嫩的苗中具有强表达，随着植株生长活性逐渐减弱直至消失，进一步证实该pGmPLPA启动子为幼苗特定时期表达启动子。对转空载体植株荧光定量分析显示：组成型启动子Ca35S在植株整个生长发育过程中均表达且表达量几乎相同。

实施例3、5’端缺失法研究pGmPLPA启动子的结构与功能相互关系

一、各个DNA片段的制备

采用相同的下游引物，不同的上游引物，将序列1所示的启动子进行一系列缺失，制备不同长度的DNA片段。上游引物中，均引入HindIII位点。各个DNA片段的下游引物均为pGmPLPA反义引物(5’→3’)：CGGGGATCCCGTTGTTGGTGTTGTTG。各个DNA片段的大小及其上游引物(5’→3’)如下：

DNA片段①：1214bp，为序列表的序列1自5’端第284至1497位核苷酸所示的DNA；上游引物：GGCAAGCTTGATACCATGATAAATC；

DNA片段②：1139bp，为序列表的序列1自5’端第359至1497位核苷酸所示的DNA；上游引物：GGCAAGCTTGCAAGGTAAAACTCATTA；

DNA片段③：865bp，为序列表的序列1自5’端第633至1497位核苷酸所示的DNA；：引物GGCAAGCTTACTTCAACTTAATTAAAT

DNA片段④：667bp，为序列表的序列1’自5端第831至1497位核苷酸所示的DNA；上游引物：GGCAAGCTTTATAAGTTTGATATTTA

DNA片段⑤：555bp，为序列表的序列1’自5端第943至1497位核苷酸所示的DNA；上游引物：GGCAAGCTTGTACAGAACTTACCTA。

DNA片段⑥：162bp，为序列表的序列1’自5端1336至1497位核苷酸所示的DNA；上游引物：GGCAAGCTTCGTCGTTTTCATGACTC。

采用TaKaRa公司的高保真Taq酶，以东农L13叶片的基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果见图12。各个缺失片段包含的主要顺式元件以及相对位置表示在图13中。

二、各个DNA片段的启动活性分析

利用实施例2的步骤二的PCR产物(全长启动子)和步骤一制备的各个DNA片段制备重组表达载体及含有重组表达载体的重组农杆菌，方法同实施例2。

用重组农杆菌转化烟草叶盘(方法同实施例2)，对培养15天的T₀代烟草叶盘进行GUS染色(见图14A，CK为野生型烟草叶盘)，对各缺失片段GUS阳性转基因烟草叶盘(10个)进行GUS荧光定量分析，方法均同实施例2。

用重组农杆菌转化拟南芥，方法同实施例2，对培养15天的T₂代植株进行GUS染色(见图14B)，对各缺失片段GUS阳性转基因拟南芥进行GUS荧光定量分析(10株)，方法均同实施例2。结果见表4和图15。

表4转各个外源DNA 15天生长T₂代拟南芥GUS荧光定量分析结果

外源DNA	GUS活力(pmoles·MU min^-1mg^-1protein)
		全长启动子	512.93±20.08
DNA片段①	508.70±18.64
		DNA片段②	440.40±22.36
DNA片段③	584.17±18.17
		DNA片段④	424.93±28.55
DNA片段⑤	256.10±38.17
		DNA片段⑥	115.9±38.54

GUS染色结果显示：除了DNA片段⑥，其余各个片段均具有启动活性，DNA片段③具有最高的启动活性。GUS荧光定量分析结果显示：全长启动子和DNA片段①具有相近的启动活性，DNA片段②相对具有稍微低的GUS启动活性，DNA片段③却呈现高启动子活性，DNA片段④开始呈现降低趋势，直到DNA片段⑥启动活性完全消失。该结果显示可能在序列1自5’端第359至632至位核苷酸之间存在某种沉默因子的存在，而预测的位于序列1自5’端第943至1335位核苷酸之间的TATA盒和CAAT盒可能是启动子的启动元件。

序列表

<110>东北农业大学

<120>幼苗及种子特异表达型大豆GmPLPA基因启动子及其应用

<130>CCGNARY102228

<160>1

<210>1

<211>1500

<212>DNA

<213>大豆东农L13

<400>1

cgacggcccg ggctggtatc gtaatcggca aggcacaaaa gaggttgcaa tggtaaaaag 60

tcaatatgtt ttgagtaaag aaagggtgag caatattgtt gaagaaggat ctgcattggg 120

aactggaaat ggtgagtagc aagactgttt ctctaaacaa aaaaaatgaa cgaagcgaaa 180

aaaaagaagc gttgggatca aactgatttt gacattggct agtgcaaaga taatgacttg 240

caaacaaaat gaagcagccg aaaaatgaag ggtggtatga cttgatacca tgataaatct 300

catgtttgtc atgaatgaat gagtgcaaat ggaagagaga aaaaaagaga aagataaagc 360

aaggtaaaac tcattaatat tggggtaatg ttcaaatgag caaaccccac tcataacata 420

aatgcaatgt gccttatata gcataattag ttagtaacta acttataact agttaatcta 480

atttgtaact aaccaaacta attttaacta actaaactaa tcttatcttt aatatttcat 540

gtcaatttta tttttatatg aaatgaaata aaaatatgta acaacaattt tgaatcgaat 600

tagattaacc agttaaatta aattgttcac ggacttcaac ttaattaaat ccaagttaat 660

tttttttttt ttatatcaaa cttgaaccat atcaaggctt atggaatcca gccaagataa 720

actcatatta actcattttc ggccccaggg gaaagtataa tatagtacgg atgcaattag 780

catgcatgtc aaaatcaaac tcatgtgagg taattaatat ttcaaaataa tataagtttg 840

atatttatta ttaatgtgaa catcttgttg gcaactaatt agtatgaatt atttgaactt 900

tgagatctat gagttctcaa aatcaaactt atctcatttt ttgtacagaa cttacctaaa 960

cttttcgtaa ccaagttttt ttttcgtaca tgaagttgaa aaactacgtg tagtgatgta 1020

ctgtgcatga taagttgata actactacta gtattgttaa tgggttaccg taagaggaaa 1080

aaaggataaa gttaaaaaag catagcgata tttaattgaa tttataagga aaatgtaaga 1140

aatttatgtg actccggttt gctgcgtagg ggaatggttc ctccctcagt tgcttccttc 1200

ctcttgtgtc cacccagttc cccctttcat tttccattca ataattcaaa caccagttaa 1260

tggctaccct tctattccac cacaattcgc ctcagatatt ctcctcctcc ttcttcttct 1320

cacatcatta aacgccgtcg ttttcatgac tccataattc accggaagca gaacaacaac 1380

aagaagcagc agcagcagcg cgagttcaca tgggattggg aacaaccgcg agaagcagaa 1440

gaagaatcgt catcgaagaa ggttctagaa caagaacaca caacaacacc aacaacgccg 1500

Claims

1.DNA片段，为如下1)至7)中任一所述的DNA分子：

1)序列表的序列1自5’端第943至1497位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表的序列1自5’端第831至1497位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表的序列1自5’端第633至1497位核苷酸所示的DNA分子；

4)序列表的序列1自5’端第359至1497位核苷酸所示的DNA分子；

5)序列表的序列1自5’端第284至1497位核苷酸所示的DNA分子；

6)序列表的序列1自5’端第14至1497位核苷酸所示的DNA分子；

7)序列表中序列1所示的DNA分子。

2.含有权利要求1中任一所述DNA片段的重组载体。

3.含有权利要求1中任一所述DNA片段的表达盒。

4.含有权利要求1中任一所述DNA片段的转基因细胞系。

5.含有权利要求1中任一所述DNA片段的重组菌。

6.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pBI121的多克隆位点插入权利要求1中任一所述DNA片段得到重组质粒。

7.权利要求1中任一所述DNA片段在启动目的基因表达中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述目的基因表达为时间特异性表达和/或组织特异性表达；所述时间特异性表达为苗期表达或种子形成期表达；所述组织特异性表达为拟南芥根特异性表达、烟草叶片特异性表达或大豆种子特异性表达。

9.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求1中任一所述DNA片段导入目的植物，得到转基因植物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：是将权利要求1中任一所述DNA片段和目的基因导入所述目的植物，在所述目的植物中用所述DNA片段启动所述目的基因的表达，得到时间特异性表达所述目的基因和/或组织特异性表达所述目的基因的转基因植物；所述时间特异性表达为苗期或种子形成期表达；所述组织特异性表达为拟南芥根特异性表达、烟草叶片特异性表达或大豆种子特异性表达。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述拟南芥为拟南芥品种哥伦比亚生态型拟南芥；所述烟草为烟草品种Petite Havana SR1；所述大豆为大豆品种黑农44；所述目的基因为GUS基因；所述方法为将权利要求6所述重组载体导入所述目的植物。

12.权利要求1所述DNA片段在培育转基因植物中的应用。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于：所述转基因植物为抗病性和/或产量和/或耐逆性高于出发植物的转基因植物。