CN101818151A - 一种大豆种子特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大豆种子特异性启动子，属于大豆天冬氨酸蛋白酶基因启动子的序列及其应用。其核苷酸序列如Sequence NO.1所述；制备方法包括下列步骤：soyAP1基因上游远端序列的克隆，对soyAP1基因ATG上游序列进行分析，设计各缺失片段分别为SAP1，SAP2，soyAP1-p和SAP4；利用引物扩增soyAP1-p片段，将soyAP1-p扩增片段与克隆载体pMD18-T进行连接，鉴定后测序，验证序列正确。本发明中克隆了大豆的soyAP1-p启动子，在大豆种子中特异性表达；该启动子的获得为大豆转基因研究提供有利工具，特别为利用大豆种子作为生物反应器的研究和开发创造了条件。

Description

一种大豆种子特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及大豆天冬氨酸蛋白酶基因启动子的序列及其应用。

背景技术

大豆是我国重要的经济作物，籽粒中含有丰富的蛋白质、脂类和多种营养元素，磷、铁、钙矿质比其他作物高几十倍，并含有多种维生素，特别是大豆中含有人体不能合成的8种必需氨基酸，是其他谷类作物不能比拟的。大豆不仅是人类蛋白和脂类的主要来源，医疗保健作用非常明显。因此，以大豆种子作为生物反应器，利用植物基因工程方法，在转基因大豆种子中产生具有工业用途及药用价值的大豆新品种已成为人们研究的热点。

在转基因大豆中增加或降低某些物质含量，实现外源目的基因在转基因大豆中正常、有效表达，首要考虑的问题是选择适合的植物启动子。目前在植物表达载体中广泛应用的是组成型启动子，在该类启动子的调控下，外源基因在转基因植物的所有部位和发育阶段都会表达，造成植物营养不必要的浪费，有时还会影响到植物的正常生长发育。种子特异性启动子能够调控外源基因在种子中特异性表达，使所表达的外源蛋白都集中在种子中，因此，种子特异性启动子是大豆品质改良工程中必不可少的有利工具。目前，已克隆获得的种子特异性启动子主要来自于粮食作物及油料作物种子中的蛋白、氨基酸、淀粉、脂类等合成代谢途径中相关的酶基因的启动子。一些种子特异性启动子在应用中显现出了极显著的效果，如玉米胚乳特异启动子驱动小麦基因在玉米中表达，降低了籽粒的硬度，有利于玉米的湿磨及家畜饲喂；水稻中Ole18基因启动子驱动RINO1基因在种子中特异表达，降低了水稻籽粒中植酸含量；napin基因启动子参与的自我剪切载体在油菜种子中特异表达，应用于建立无标记的安全转基因植物等。

在大豆基因工程研究利用中，可以使用来自近缘的其他植物的种子特异性启动子，但是有时种子特异性启动子在非本植物中表达时易出现非种子特异表达，如蚕豆USP基因启动子可以驱动报告基因在转基因拟南芥种子中特异性表达，但该启动子驱动报告基因在转基因豌豆的花药、花粉和种皮中都表达；有时种子特异表达的强度也可能会发生改变。如：棉花的α-球蛋白启动子在转基因拟南芥和烟草中驱动GUS的表达活性只是棉花中16.7％和1％，说明在大豆转基因研究中，利用大豆本身的种子特异性启动子是十分必要的。

大豆中已克隆的种子特异性启动子并在转基因研究中得到应用的主要有：伴大豆球蛋白、球蛋白和油质蛋白的启动子，与其他粮食作物相比数量较少。可能是由于专利保护的原因，一些大豆种子特异性启动子不能被利用；水稻的谷蛋白，醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白启动子是种子特异性启动子，但大豆不属于谷类作物，所以在大豆中不存在谷蛋白和醇溶蛋白这两种蛋白基因的启动子；与淀粉合成有关的种子特异启动子有小麦的淀粉粒结合淀粉合成酶和水稻的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的启动子，但大豆种子中碳的贮藏主要与三酰基甘油有关，而不是淀粉，大豆中与淀粉合成有关的种子特异表达基因可能相对较少。因此，获得一种新的大豆种子特异性启动子，对大豆新品种的研究开发及植物基因工程发展具有推动作用。

发明内容

本发明提供一种大豆种子特异性启动子，以解决目前缺少大豆种子特异性启动子的问题。

本发明采取的技术方案是：

一种大豆种子特异性启动子，其核苷酸序列如Sequence NO.1所述。

本发明所述的大豆种子特异性启动子的制备方法，包括下列步骤：

a.soyAP1基因上游远端序列的克隆：

利用TAIL-PCR方法，设计3个嵌套引物：

SP1：5’-GAAACGCGGTTAGGAAAACAGATGAG-3’

SP2：5’-GAGGAATAGGTTTACCGATACGTGGAGA-3’

SP3：5’-CAGTAGTGTCACACCTTCCTTCCTCTTT-3’

与随机兼并引物AD4：5’-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3’，进行三次PCR反应，获得865bp的上游远端序列；

b、对soyAP1基因ATG上游序列进行分析，设计各缺失片段分别为SAP1，SAP2，soyAP1-p和SAP4；

c.利用Y3：5’-GGGCTGCAGTTAAATTTATTGATGAAAGG-3’和

Y5：5’GGGCCATGGGTTCTCCTATTCATCCAAAT-3’这对引物扩增soyAP1-p片段；

d.将soyAP1-p扩增片段与克隆载体pMD18-T进行连接，鉴定后测序，验证序列正确。

本发明所述的大豆种子特异性启动子在作为大豆种子特异性启动子中的应用。

天冬氨酸蛋白酶(APs)是各种植物中广泛存在的一种酶，一些APs在各种组织中普遍表达，如大麦AP在根、茎、叶、花中表达；一些APs具有组织特异性，只存在于干种子和豆荚中，或只在花和豆荚中等等。大豆中有两个天冬氨酸蛋白酶基因soyAP1和soyAP2，其中soyAP1基因在种子中，尤其在干种子中表达。本发明通过对soyAP1基因上游1650bp的序列(命名为SAP1)进行缺失分析，发现长度为1255bp的片段(命名为soyAP1-p)，其核苷酸序列如SequenceNO.1所述，在大豆各组织中进行瞬时表达时表现出种子特异性，且启动下游基因在种子中的表达能力与CaMV35S组成型启动子相近，明确soyAP1-p启动子是种子特异性启动子。

所述soyAP1-p启动子序列中含有多种与种子特异表达相关的顺式作用元件，参见图7：对种子特异性基因高水平表达十分重要的RY-repeat，常出现在参与三酰基甘油合成和植物种子特异表达基因启动子中的E-box，增强转录的顺式元件CAAT，胚乳表达顺式作用元件Skn-1motif，胚表达顺式作用元件SEF3、SEF4、种子特异元件AACA、ACGT。

此外，soyAP1-p启动子序列中还含有：与光应答有关的顺式作用元件GT1(GRWAAW)7个；2个W-box(TGACY)是WRKY转录因子的结合位点；1个CNGTTR基序是MYB转录因子的结合位点；8个AAAG核心序列是DOF转录因子的结合位点。

本发明所述的soyAP1-p启动子具有明显启动子特性，与现已知启动子无同源性，通过瞬时表达证明其能驱动基因在大豆种子中特异性表达，是一个全新的种子特异性启动子。

本发明的有益效果是：本发明中克隆了大豆的soyAP1-p启动子，研究该启动子在大豆中的组织表达特性及表达效率，为其有效应用提供依据；该启动子的获得为大豆转基因研究提供有利工具，特别为利用大豆种子作为生物反应器的研究和开发创造了条件。

附图说明

图1是TAIL-PCR扩增soyAP1基因上游远端SAP1-b片段的电泳图；

图2是soyAP1基因上游远端SAP1-b片段与T载体连接的重组质粒酶切鉴定；

图3是SAP1片段及其缺失片段的PCR扩增电泳图；

图4是SAP1片段及其缺失片段与T载体连接后的酶切鉴定；

图5是SAP1片段及其缺失片段与表达载体连接后的酶切鉴定；

图6是各表达载体转化农杆菌的PCR鉴定；

图7是soyAP1-p启动子的序列分析；

图8是SAP1片段及其缺失片段的荧光定量检测结果；

图9是GUS组织化学染色观察结果，A：根；B：茎；C：叶；D：种子a：未侵染的大豆；b：GUS基因由CaMV35S组成型启动子驱动；c：GUS基因由SAP1启动子驱动；d：GUS基因由soyAP1-p启动子驱动。

具体实施方式

实施例1：soyAP1基因上游远端片段SAP1-b的克隆及SAP1的序列分析

1、引物的设计与合成

根据大豆基因组中soyAP1基因ATG上游的一段785bp已知序列，其核苷酸序列如Sequence NO.2所述，简称SAP1-a，设计合成3个嵌套引物SP1～SP3；参照论文《大豆种子特异性启动子的克隆及序列分析》(财音青格乐，李明春，蔡易.作物学报，2005，31(1)：11-17)和《Rapid isolation and functional analysis of promoter sequences of the nitrateresuctase gene from Chlorella ellipsoidea》(Peng Wang，Yongru Sun，Xia Li.Journal of AppliedPhycology，2004，16：11-16.)中所述的TAIL-PCR方法，合成随机兼并引物ADl～AD4：

SP1：5’-GAAACGCGGTTAGGAAAACAGATGAG-3’

SP2：5’-GAGGAATAGGTTTACCGATACGTGGAGA-3’

SP3：5’-CAGTAGTGTCACACCTTCCTTCCTCTTT-3’

AD1：5’-NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT-3’

AD2：5’-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3’

AD3：5’-(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA-3’

AD4：5’-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3’

2、TAIL-PCR方法扩增未知序列

A.采用CTAB法提取，从吉豆2号大豆品种叶片中提取基因组DNA，并进行纯化。

B.TAIL-PCR方法扩增：

a.1st PCR反应

以大豆基因组DNA作为模板，当以AD4primer作为上游引物时扩增出未知序列，SP1primer为下游引物，进行1st PCR反应。

扩增反应体系：

Template(基因组DNA)：        0.5ul

dNTP Mixture(10mM each)：    1ul

10×LAPCR Buffer(Mg⁺plus)：  2.5ul

LATaq(5U/ul)：               0.3ul

AD4primer(100uM)：           0.5ul

SP1primer(10uM)：            1ul

dH₂O：                       up to 25ul

扩增反应条件：

92C     3min

95℃    1min

94℃    30s，25℃    3min，72℃    2min

72℃    10min

b.2nd PCR反应

取1ul 1st PCR反应液作为2nd PCR反应的模板，以AD4 primer作为上游引物，SP2 primer为下游引物，进行2nd PCR反应。

扩增反应体系：

Template(1st PCR反应液)：    1ul

dNTP Mixture(10mM each)：    2ul

10×LAPCR Buffer(Mg⁺plus)：  5ul

LATaq(5U/ul)：               0.5ul

AD4 primer(100uM)：          1ul

SP2 primer(10uM)：           2ul

dH₂O：                       up to 50ul

扩增反应条件：

72℃    10min

c.3rd PCR反应

取1ul 2nd PCR反应液作为3rd PCR反应的模板，以AD4primer作为上游引物，SP3primer为下游引物，进行3rd PCR反应。

扩增反应体系：

Template(2nd PCR反应液)：    1ul

dNTP Mixture(10mM each)：    2ul

10×LAPCR Buffer(Mg⁺plus)：  5ul

LATaq(5U/ul)：               0.5ul

AD4 primer(100uM)：          1ul

SP3 primer(10uM)：           2ul

dH₂O：                       up to 50ul

扩增反应条件：

72℃    10min

得到的指数扩增产物，在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。图1所示，M为DL2000marker，1为二次PCR扩增结果，2为三次PCR扩增结果，扩增出的片段长度在750bp-1000bp之间，与pMD18-T克隆载体连接后进行酶切鉴定，如图2所示：M：2000bp DNA Marker；1、2：Hind III和XbaI双酶切，测序后可知长度为911bp，该片段3‘端有46bp的序列与soyAP1基因ATG上游近端的785bp已知序列相同，其余865bp为上游远端序列，简称SAP1-b，其核苷酸序列如Sequence NO.3所述。

本实施例中采用TAIL-PCR方法扩增未知序列。该方法通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段。该方法操作简便，成本较低，特异性高，重复性好，能够在较短的时间内获得目标片段。

实施例2：SAP1片段及其5’端缺失片段的克隆

SAP1的序列分析：

soyAP1基因ATG上游近端785bp的已知序列SAP1-a，和扩增的865bp上游远端序列SAP1-b，共1650bp，命名为SAP1。在线软件Neural Network Promote Prediction对大豆SAP1，其核苷酸序列如Sequence NO.4所述，进行基础启动子预测，在195bp-245bp，499bp-549bp，771bp-821bp，871bp-921bp，1042bp-1092bp和1144bp-1194bp的位置存在基础启动子序列，可能性分别是0.82、0.78、0.52、0.62、0.77和0.75，前两个基础启动子区预测值较高。根据真核细胞基因启动子的基本特征，推测可能的转录起始位点在553bp处的A。

对SAP1序列进行分析后，设计该片段及其5’端缺失片段序列的PCR引物：上游引物Y1，Y2，Y3，Y4，下游引物Y5(引物序列如下)，扩增后的片段分别为SAP1(-552～+1098)，SAP2(-356～+1098)，soyAP1-p(-157～+1098)和SAP4(-34～+1098)。

Y1：5’-AGTGGAGTAGCAAAGGACGAGAGGTA-3’

Y2：5’-GGGCTGCAGTCACCCTGCAAAAAAG-3’(加横线者为PstI酶切位点)

Y3：5’-GGGCTGCAGTTAAATTTATTGATGAAAGG-3’(加横线者为PstI酶切位点)

Y4：5’-GGGCTGCAGAAATGAAGGTGTAACTG-3’(加横线者为PstI酶切位点)

Y5：5’-GGGCCATGGGTTCTCCTATTCATCCAAAT-3’(加横线者为NcoI酶切位点)；

PCR扩增反应体系为：

Template(基因组DNA)：      0.5ul

dNTP Mixture(10mM each)：  0.5ul

10×ExPCR Buffer(Mg⁺plus)：2.5ul

ExTaq(5U/ul)：             0.3ul

Y1/Y2/Y3/Y4(10uM)：        1ul

Y5(10uM)：                 1ul

dH₂O：                     up to 25ul

扩增反应条件：

94℃    5min

72℃    10min

将上述序列的扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测；如图3所示，M为DL2000marker，1、2、3、4分别为SAP1、SAP2、soyAP1-p、SAP4的扩增结果。将这4个片段分别与pMD18-T克隆载体连接，分别获得重组质粒pMD18-T-SAP1、pMD18-T-SAP2、pMD18-T-soyAP1-p和pMD18-T-SAP4，通过蓝白斑筛选阳性克隆，对4个重组质粒用PstI单酶切和PstI、NcoI双酶切进行鉴定，结果图4所示，M：2000bp DNA Marker；1、2、3、4分别为PstI和NcoI双酶切重组质粒pMD18-T-SAP1、pMD18-T-SAP2、pMD18-T-soyAP1-p和pMD18-T-SAP4，表明4个片段已完全插入pMD18-T载体中。将4个重组质粒进行测序，验证正确。

实施例3：瞬时表达载体的构建及农杆菌介导法侵染大豆根、茎、叶、种子

将pMD18-T-SAP1、pMD18-T-SAP2、pMD18-T-soyAP1-p、pMD18-T-SAP4质粒载体和pCAMBIA1301载体分别用PstI和NcoI进行双酶切，将酶切前4个质粒载体得到的小片段分别与酶切pCAMBIA1301载体得到的大片段连接，分别得到SAP1、SAP2、soyAP1-p、SAP4与GUS基因融合的表达载体pCAM-SAP1、pCAM-SAP2、pCAM-soyAP1-p和pCAM-SAP4。同样用PstI和NcoI两个酶对这4个载体质粒进行酶切鉴定，结果图5所示，M：2000bp DNAMarker；1、2、3、4：分别为PstI和NcoI双酶切表达载体pCAM-SAP1、pCAM-SAP2、pCAM-soyAP1-p和pCAM-SAP4，证明pCAM-SAP1、pCAM-SAP2、pCAM-soyAP1-p和pCAM-SAP4表达载体构建正确。

通过冻融法，将pCAM-SAP1、pCAM-SAP2、pCAM-soyAP1-p和pCAM-SAP4载体质粒转化农杆菌EHA105，菌液PCR对其进行验证，图6所示，M：2000bp DNA Marker；1、2、3、4：分别为表达载体pCAM-SAP1、pCAM-SAP2、pCAM-soyAP1-p和pCAM-SAP4的农杆菌菌液PCR扩增产物，证实各载体转入农杆菌。

参照胡新文《Embryo and anther regulation of the mabinlin II sweet protein gene in CapparismasaikaiLevl》(Xin-Wen Hu，Si-Xin Liu，Jian-Chun Guo.Funct Integr Genomics，2009，9：351-361)的方法，农杆菌介导法转化大豆根、茎、叶、种子。将大豆幼苗的根、茎剪成小块，取幼嫩叶片，种子去种皮后切成两瓣，浸没在分别含有pCAM-SAP1、pCAM-SAP2、pCAM-soyAP1-p、pCAM-SAP4质粒和含有CaMV35S启动子的pCAMBIA1301载体质粒的农杆菌EHA105的重悬液中(菌体重悬后OD₆₀₀约为0.2)，真空压力0.09-0.1MPa，15分钟。侵染后，在16h光照、8h小时黑暗光周期、22℃条件下，共培养1d。

实施例4：荧光定量检测

荧光定量检测参照《植物基因工程原理和技术第二版》(王关林，方宏筠著，北京：科学出版社，2002)和《Assaying chimeric genes in plants：The GUS gene fusion system》(JeffersonJefferson R A.Plant Molecular Biology Reporter，1987，5(4)：387-405)的方法进行。取未侵染和侵染各表达载体的大豆种子约100mg，分别放入研钵中，用液氮研磨成粉末，加入600ul提取缓冲液，离心后的上清液为GUS蛋白粗提液。样品粗提液分为两部分，一部分采用Bradford法测定GUS蛋白含量；另一部分用于荧光定量检测，粗提液中加2mmol L^-1的GUS反应底物4-MUG，37℃保温15min后，加0.2mmol L^-1 Na₂CO₃反应终止液终止反应，在激发波长365nm，发射波长455nm下，测定荧光值。GUS活性用获得的荧光值除以蛋白浓度和时间得到相对活性。荧光测定结果如图8显示，侵染pCAM-SAP1、pCAM-soyAP1-p和含有CaMV35S启动子的pCAMBIA1301质粒载体的大豆种子的GUS荧光值相近，说明SAP1片段和soyAP1-p启动子驱动下游基因在种子中表达的能力与CaMV35S启动子相近的；侵染pCAM-SAP2质粒载体的种子的荧光值明显较pCAM-SAP1和pCAM-soyAP1-p质粒载体的种子的荧光值低，在SAP1序列的-552～-356之间可能存在影响种子表达的负调控元件。

实施例5：瞬时表达的显微观察

对启动下游基因在种子中表达较高的含有SAP1和soyAP1-p序列的表达载体侵染的大豆各组织进行GUS组织化学染色，同样参照王关林和Jefferson的方法进行。取出部分未侵染和侵染分别含有pCAM-SAP1、pCAM-soyAP1-p和含有CaMV35S启动子的pCAMBIA1301质粒载体的大豆根、茎、叶、种子，放入GUS染色液中，该GUS染色液包括：50mmol L^-1磷酸钠缓冲液pH 7.0，10mmol L^-1EDTA，1mmol L^-1X-Gluc，0.1％TritonX-100，10mmol L^-1巯基乙醇，37℃温育过夜，75％乙醇脱色，10倍显微镜下观察染色情况，参见图9。与未侵染的大豆种子、根、茎、叶相比，转化pCAMBIA1301表达载体的大豆种子、根、茎、叶被X-Gluc溶液染成蓝色，说明该载体中的GUS报告基因能够被CaMV35S组成型启动子激活表达。转化pCAM-SAP1载体的大豆根基本没有被染色，茎和叶显现较浅的蓝色，种子染色相对较深；转化pCAM-soyAP1-p载体的大豆根、茎、叶的颜色与未侵染的大豆根、茎、叶差不多，种子染色相对较深；说明soyAP1-p启动子序列具有种子特异表达特性，以上的实验证明soyAP1-p启动子序列能够驱动基因在大豆种子中特异性表达，是一个全新的种子特异性启动子。

实施例1至实施例4中pCAMBIA-1301其核苷酸序列如Sequence NO.5所述，限制性内切酶HindIII、XbaI、PstI、NcoI、pMD18-T克隆载体、ExTaq、T4连接酶均购自Takara公司，DNA凝胶回收试剂盒购自维特洁公司，5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸(X-Gluc)购自Clontech公司，4-MU和4-MUG购自Sigma公司，大肠杆菌DH 5α感受态购自北京鼎国生物技术公司，PCR引物和DNA序列测定由上海生工生物工程公司合成，其他试剂均为进口或国产分析纯。

实施例1至实施例4中，实验所用的主要仪器，PCR扩增仪(Bio-Rad Peltier ThermalCycler)，电泳仪(Bio-Rad3000xi)；高速冷冻离心机(Sigma 2K-15)；凝胶成相分析仪(英国UVItec公司)；6010紫外可见光光度计(安捷伦上海分析仪器有限公司)。

实施例1至实施例4中，采用的DNA提取、PCR、酶切、连接、转化等基因工程操作方法记载于《分子克隆实验指南第三版》中((美)J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出版)和《植物基因工程原理和技术第二版》中(王关林，方宏筠著，北京：科学出版社，2002)。

核苷酸或氨基酸序列表

<110>吉林大学

<120>一种大豆种子特异性启动子及其应用

<130>jluwqy-zy

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1255

<212>DNA

<213>大豆

<400>1

ttaaatttat tgatgaaagg aaaattcaat tgaatccctt taaacatagt ttggaatatc     60

cttaaaaaca tgatttgtga agattggaag ataatttaac aaaaagtata aatgtataat    120

aggaaatgaa ggtgtaactg tgtaagtgaa gacaagcata aaagagaaat gaggagaggg    180

aggtgaggtg tcgcgtgcta aggaagccaa gtggtgcaga tgctggcatc gttttctagt    240

tttaagggat tctgttgcaa accccactcg ctacgtatct gcatgcatga tgcatatgca    300

tatgcatggt ctcagggtaa accgttcctt tttcttcatt catctttacc aacccatcct    360

ttcatatcta cggccaagat cacgtagaaa tggacggtga tgattgaaag attgcaccgc    420

caagtttatt tgttgtttta ggggaatttg gcctgcgttg cgttcttatt aggcgagaag    480

aaaggaataa aggggaagga aggtgtgaca ctactgtcat actgcactgc ttacaacttt    540

tttctctttc tctcaattca attgccttct cccctgcgaa tctcttctcc acgtatcggt    600

aaacctattc ctctaacccc cattctcatt ctttcatcgc attttacttt attcatctta    660

aacagccctc agtctctcat ctgttttcct aaccgcgttt cattttttat ttattttgtt    720

tttatgcgca gattgtccct gcaaattgca ctttataata taaataatcg ctttttattt    780

tctgtttatg tcaggcgaat tcaatttttt ttcttttgct tcccttgttt cggtggataa     840

caaaaaaaaa ataaaatcta ttatcgaggt ctctttttca aattgcacgg atgcgtcgat     900

tttttttcga taaaaaaaaa tccatatcgg tatgatcgaa cacatgatat tttttttcgt     960

tcgtatacca ttcggtgatt tttttttata atttttcaca actcaatttt cttgttttgt    1020

ttgcattggt ttttgtggaa tagactattt ttttgactga aatggtggaa tagactatag    1080

agattagaag aactgacaca agattttgaa atgtctcgtt tttttttcac gtccccataa    1140

taatatattt agcattttca cttgttagtt aaagcccaca tcccctaatt tagagtaatt    1200

atttatgtgc taacaattgc aattaaagtt tatttatttg gatgaatagg agaac         1255

<210>2

<211>785

<212>DNA

<213>大豆

<400>2

aggcgagaag aaaggaataa agaggaagga aggtgtgaca ctactgtcat actgcactgc      60

ttataacttt tttctctttc tctcaattca attgccttct cccctgcgaa tctcttctcc     120

acgtatcggt aaacctattc ctctaacccc cattctcatt ctttcatcgc attttacttt     180

attcatctta aacagccctc agtctctcat ctgttttcct aaccgcgttt cattttttat     240

ttattttgtt tttatgcgca gattgtccct gcaaattgca ctttataata taataatcgc     300

tttttatttt ctgtttatgt caggcgaatt caattttttt tcttttgctt cccttgtttc     360

ggtggataac aaaaaaaaaa taaaatctat tatcgaggtc tctttttcaa attgcacgga     420

tgcgtcgatt ttttttcgat aaaaaaaaat ccatatcggt atgatcgaac acatgatatt     480

ttttttcgtt cgtataccat tcggtgattt tttttttata atttttcaca actcaatttt     540

cttgttttgt ttgcattggt ttttgtggaa tagactattt ttttgactga aatggtggaa     600

tagactatag agattagaag aactgacaca agattttgaa atgtctcgtt tttttttcac    660

gtccccataa taatatattt agcattttca cttgttagtt aaagcccaca tcccctaatt    720

tagagtaatt atttatgtgc taacaattgc aattaaagtt tattaatttg gatgaatagg    780

agaac                                                                785

<210>3

<21t>865

<212>DNA

<213>大豆

<400>3

agtggagtag caaaggacga gaggtagggg tgtagggaaa ttgccaacag ggtagttttg     60

ggagtaagaa ttttgggagt gataatagca accctcaagt aagtccttta gcagaccaaa    120

cactaaaaat acaaacgaat aaacatctaa tgggccttag actcaggctt aaattgaaga    180

accatacatg tcagtgtcac cctgcaaaaa aggtgagaac tgagaactat tacaaaattg    240

ttatatgact gcatgctgag atttattaaa ttcttaaccg accttaaaac tcttatgtaa    300

atgtgttttt tcagcgtgat tttttttatt ttcaatttat tttaatattc taaaaatcat    360

caagttctat gattactttt ttttaatatc aaatattaaa tttattgatg aaaggaaaat    420

tcaattgaat ccctttaaac atagtttgga atatccttaa aaacatgatt tgtgaagatt    480

ggaagataat ttaacaaaaa gtataaatgt ataataggaa atgaaggtgt aactgtgtaa    540

gtgaagacaa gcataaaaga gaaatgagga gagggaggtg aggtgtcgcg tgctaaggaa    600

gccaagtggt gcagatgctg gcatcgtttt ctagttttaa gggattctgt tgcaaacccc    660

actcgctacg tatctgcatg catgatgcat atgcatatgc atggtctcag ggtaaaccgt    720

tcctttttct tcattcatct ttaccaaccc atcctttcat atctacggcc aagatcacgt    780

agaaatggac ggtgatgatt gaaagattgc accgccaagt ttatttgttg ttttagggga    840

atttggcctg cgttgcgttc ttatt                                          865

<210>4

<211>1650

<212>DNA

<213>大豆

<400>4

agtggagtag caaaggacga gaggtagggg tgtagggaaa ttgccaacag ggtagttttg      60

ggagtaagaa ttttgggagt gataatagca accctcaagt aagtccttta gcagaccaaa     120

cactaaaaat acaaacgaat aaacatctaa tgggccttag actcaggctt aaattgaaga     180

accatacatg tcagtgtcac cctgcaaaaa aggtgagaac tgagaactat tacaaaattg     240

ttatatgact gcatgctgag atttattaaa ttcttaaccg accttaaaac tcttatgtaa     300

atgtgttttt tcagcgtgat tttttttatt ttcaatttat tttaatattc taaaaatcat     360

caagttctat gattactttt ttttaatatc aaatattaaa tttattgatg aaaggaaaat     420

tcaattgaat ccctttaaac atagtttgga atatccttaa aaacatgatt tgtgaagatt     480

ggaagataat ttaacaaaaa gtataaatgt ataataggaa atgaaggtgt aactgtgtaa     540

gtgaagacaa gcataaaaga gaaatgagga gagggaggtg aggtgtcgcg tgctaaggaa     600

gccaagtggt gcagatgctg gcatcgtttt ctagttttaa gggattctgt tgcaaacccc     660

actcgctacg tatctgcatg catgatgcat atgcatatgc atggtctcag ggtaaaccgt     720

tcctttttct tcattcatct ttaccaaccc atcctttcat atctacggcc aagatcacgt     780

agaaatggac ggtgatgatt gaaagattgc accgccaagt ttatttgttg ttttagggga     840

atttggcctg cgttgcgttc ttattaggcg agaagaaagg aataaagggg aaggaaggtg     900

tgacactact gtcatactgc actgcttaca acttttttct ctttctctca attcaattgc     960

cttctcccct gcgaatctct tctccacgta tcggtaaacc tattcctcta acccccattc    1020

tcattctttc atcgcatttt actttattca tcttaaacag ccctcagtc tctcatctgtt    1080

ttcctaaccg cgtttcattt tttatttatt ttgtttttat gcgcagattg tccctgcaaa    1140

ttgcacttta taatataaat aatcgctttt tattttctgt ttatgtcagg cgaattcaat    1200

tttttttctt ttgcttccct tgtttcggtg gataacaaaa aaaaaataaa atctattatc    1260

gaggtctctt tttcaaattg cacggatgcg tcgatttttt ttcgataaaa aaaaatccat    1320

atcggtatga tcgaacacat gatatttttt ttcgttcgta taccattcgg tgattttttt    1380

ttataatttt tcacaactca attttcttgt tttgtttgca ttggtttttg tggaatagac    1440

tatttttttg actgaaatgg tggaatagac tatagagatt agaagaactg acacaagatt    1500

ttgaaatgtc tcgttttttt ttcacgtccc cataataata tatttagcat tttcacttgt    1560

tagttaaagc ccacatcccc taatttagag taattattta tgtgctaaca attgcaatta    1620

aagtttattt atttggatga ataggagaac                                     1650

<210>5

<211>11849

<212>DNA

<213>合成

<400>5

gatctgaggg taaatttcta gtttttctcc ttcattttct tggttaggac ccttttctct      60

ttttattttt ttgagctttg atctttcttt aaactgatct attttttaat tgattggtta     120

tggtgtaaat attacatagc tttaactgat aatctgatta ctttatttcg tgtgtctatg     180

atgatgatga tagttacaga accgacgact cgtccgtcct gtagaaaccc caacccgtga     240

aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattga     300

tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt     360

taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg     420

cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt     480

cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta     540

tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtatcac     600

cgtttgtgtg aacaacgaac tgaactggca gactatcccg ccgggaatgg tgattaccga     660

cgaaaacggc aagaaaaagc agtcttactt ccatgatttc tttaactatg ccggaatcca     720

tcgcagcgta atgctctaca ccacgccgaa cacctgggtg gacgatatca ccgtggtgac     780

gcatgtcgcg caagactgta accacgcgtc tgttgactgg caggtggtgg ccaatggtga     840

tgtcagcgtt gaactgcgtg atgcggatca acaggtggtt gcaactggac aaggcactag     900

cgggactttg caagtggtga atccgcacct ctggcaaccg ggtgaaggtt atctctatga     960

actcgaagtc acagccaaaa gccagacaga gtctgatatc tacccgcttc gcgtcggcat    1020

ccggtcagtg gcagtgaagg gccaacagtt cctgattaac cacaaaccgt tctactttac    1080

tggctttggt cgtcatgaag atgcggactt acgtggcaaa ggattcgata acgtgctgat    1140

ggtgcacgac cacgcattaa tggactggat tggggccaac tcctaccgta cctcgcatta    1200

cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat ggcatcgtgg tgattgatga    1260

aactgctgct gtcggctttc agctgtcttt aggcattggt ttcgaagcgg gcaacaagcc    1320

gaaagaactg tacagcgaag aggcagtcaa cggggaaact cagcaagcgc acttacaggc    1380

gattaaagag ctgatagcgc gtgacaaaaa ccacccaagc gtggtgatgt ggagtattgc    1440

caacgaaccg gatacccgtc cgcaaggtgc acgggaatat ttcgcgccac tggcggaagc    1500

aacgcgtaaa ctcgacccga cgcgtccgat cacctgcgtc aatgtaatgt tctgcgacgc    1560

tcacaccgat accatcagcg atctctttga tgtgctgtgc ctgaaccgtt attacggatg    1620

gtatgtccaa agcggcgatt tggaaacggc agagaaggta ctggaaaaag aacttctggc    1680

ctggcaggag aaactgcatc agccgattat catcaccgaa tacggcgtgg atacgttagc    1740

cgggctgcac tcaatgtaca ccgacatgtg gagtgaagag tatcagtgtg catggctgga    1800

tatgtatcac cgcgtctttg atcgcgtcag cgccgtcgtc ggtgaacagg tatggaattt    1860

cgccgatttt gcgacctcgc aaggcatatt gcgcgttggc ggtaacaaga aagggatctt    1920

cactcgcgac cgcaaaccga agtcggcggc ttttctgctg caaaaacgct ggactggcat    1980

gaacttcggt gaaaaaccgc agcagggagg caaacaagct agccaccacc accaccacca    2040

cgtgtgaatt acaggtgacc agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa    2100

gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga    2160

attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt    2220

ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg    2280

caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattaaact    2340

atcagtgttt gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa    2400

taacggatat ttaaaagggc gtgaaaaggt ttatccgttc gtccatttgt atgtgcatgc    2460

caaccacagg gttcccctcg ggatcaaagt actttgatcc aacccctccg ctgctatagt    2520

gcagtcggct tctgacgttc agtgcagccg tcttctgaaa acgacatgtc gcacaagtcc    2580

taagttacgc gacaggctgc cgccctgccc ttttcctggc gttttcttgt cgcgtgtttt    2640

agtcgcataa agtagaatac ttgcgactag aaccggagac attacgccat gaacaagagc    2700

gccgccgctg gcctgctggg ctatgcccgc gtcagcaccg acgaccagga cttgaccaac    2760

caacgggccg aactgcacgc ggccggctgc accaagctgt tttccgagaa gatcaccggc    2820

accaggcgcg accgcccgga gctggccagg atgcttgacc acctacgccc tggcgacgtt    2880

gtgacagtga ccaggctaga ccgcctggcc cgcagcaccc gcgacctact ggacattgcc    2940

gagcgcatcc aggaggccgg cgcgggcctg cgtagcctgg cagagccgtg ggccgacacc    3000

accacgccgg ccggccgcat ggtgttgacc gtgttcgccg gcattgccga gttcgagcgt    3060

tccctaatca tcgaccgcac ccggagcggg cgcgaggccg ccaaggcccg aggcgtgaag    3120

tttggccccc gccctaccct caccccggca cagatcgcgc acgcccgcga gctgatcgac    3180

caggaaggcc gcaccgtgaa agaggcggct gcactgcttg gcgtgcatcg ctcgaccctg    3240

taccgcgcac ttgagcgcag cgaggaagtg acgcccaccg aggccaggcg gcgcggtgcc    3300

ttccgtgagg acgcattgac cgaggccgac gccctggcgg ccgccgagaa tgaacgccaa    3360

gaggaacaag catgaaaccg caccaggacg gccaggacga accgtttttc attaccgaag    3420

agatcgaggc ggagatgatc gcggccgggt acgtgttcga gccgcccgcg cacgtctcaa    3480

ccgtgcggct gcatgaaatc ctggccggtt tgtctgatgc caagctggcg gcctggccgg    3540

ccagcttggc cgctgaagaa accgagcgcc gccgtctaaa aaggtgatgt gtatttgagt    3600

aaaacagctt gcgtcatgcg gtcgctgcgt atatgatgcg atgagtaaat aaacaaatac    3660

gcaaggggaa cgcatgaagg ttatcgctgt acttaaccag aaaggcgggt caggcaagac    3720

gaccatcgca acccatctag cccgcgccct gcaactcgcc ggggccgatg ttctgttagt    3780

cgattccgat ccccagggca gtgcccgcga ttgggcggcc gtgcgggaag atcaaccgct    3840

aaccgttgtc ggcatcgacc gcccgacgat tgaccgcgac gtgaaggcca tcggccggcg    3900

cgacttcgta gtgatcgacg gagcgcccca ggcggcggac ttggctgtgt ccgcgatcaa    3960

ggcagccgac ttcgtgctga ttccggtgca gccaagccct tacgacatat gggccaccgc    4020

cgacctggtg gagctggtta agcagcgcat tgaggtcacg gatggaaggc tacaagcggc    4080

ctttgtcgtg tcgcgggcga tcaaaggcac gcgcatcggc ggtgaggttg ccgaggcgct    4140

ggccgggtac gagctgccca ttcttgagtc ccgtatcacg cagcgcgtga gctacccagg    4200

cactgccgcc gccggcacaa ccgttcttga atcagaaccc gagggcgacg ctgcccgcga    4260

ggtccaggcg ctggccgctg aaattaaatc aaaactcatt tgagttaatg aggtaaagag    4320

aaaatgagca aaagcacaaa cacgctaagt gccggccgtc cgagcgcacg cagcagcaag    4380

gctgcaacgt tggccagcct ggcagacacg ccagccatga agcgggtcaa ctttcagttg    4440

ccggcggagg atcacaccaa gctgaagatg tacgcggtac gccaaggcaa gaccattacc    4500

gagctgctat ctgaatacat cgcgcagcta ccagagtaaa tgagcaaatg aataaatgag    4560

tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg catggaaaat caagaacaac caggcaccga    4620

cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac gggcggttgg ccaggcgtaa gcggctgggt    4680

tgtctgccgg ccctgcaatg gcactggaac ccccaagccc gaggaatcgg cgtgacggtc    4740

gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg gtggagaagt    4800

tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagcacgc cccggtgaat    4860

cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg gcaaccgccg gcagccggtg    4920

cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc agattttttc gttccgatgc    4980

tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga cgtggccgtt ttccgtctgt    5040

cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga gcttccagac gggcacgtag    5100

aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga ttacgacctg gtactgatgg    5160

cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga agggaaggga gacaagcccg    5220

gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt ctgccggcga gccgatggcg    5280

gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt aaacaccacg cacgttgcca    5340

tgcagcgtac gaagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac ggtatccgag ggtgaagcct    5400

tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg gccggagtac atcgagatcg    5460

agctagctga ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa gaacccggac gtgctgacgg    5520

ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg ttttctctac cgcctggcac    5580

gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa gacgatctac gaacgcagtg    5640

gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg caagctgatc gggtcaaatg    5700

acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc tggcccgatc ctagtcatgc    5760

gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc ctaatgtacg gagcagatgc    5820

tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg tctctttcct gtggatagca    5880

cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa cccgtacatt gggaacccaa    5940

agccgtacat tgggaaccgg tcacacatgt aagtgactga tataaaagag aaaaaaggcg    6000

atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg    6060

cataactgtc tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa agcgcctacc cttcggtcgc    6120

tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc ggccgctggc cgctcaaaaa    6180

tggctggcct acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca agccgcgccg tcgccactcg    6240

accgccggcg cccacatcaa ggcaccctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac    6300

ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc    6360

agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc    6420

cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg    6480

tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc    6540

gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc    6600

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata    6660

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg    6720

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct    6780

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa    6840

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc    6900

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt    6960

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg    7020

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg    7080

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct    7140

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc    7200

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg    7260

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc    7320

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt    7380

aagggatttt ggtcatgcat tctaggtact aaaacaattc atccagtaaa atataatatt    7440

ttattttctc ccaatcaggc ttgatcccca gtaagtcaaa aaatagctcg acatactgtt    7500

cttccccgat atcctccctg atcgaccgga cgcagaaggc aatgtcatac cacttgtccg    7560

ccctgccgct tctcccaaga tcaataaagc cacttacttt gccatctttc acaaagatgt    7620

tgctgtctcc caggtcgccg tgggaaaaga caagttcctc ttcgggcttt tccgtcttta    7680

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ccacatcggc cagatcgtta ttcagtaagt aatccaattc ggctaagcgg ctgtctaagc    7800

tattcgtata gggacaatcc gatatgtcga tggagtgaaa gagcctgatg cactccgcat    7860

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ttggaacagg cagctttcct tccagccata gcatcatgtc cttttcccgt tccacatcat    8040

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ccagcttata taccttagca ggagacattc cttccgtatc ttttacgcag cggtattttt    8160

cgatcagtttt ttcaattcc ggtgatattc tcattttagc catttattat ttccttcctc    8220

ttttctacag tatttaaaga taccccaaga agctaattat aacaagacga actccaattc    8280

actgttcctt gcattctaaa accttaaata ccagaaaaca gctttttcaa agttgttttc    8340

aaagttggcg tataacatag tatcgacgga gccgattttg aaaccgcggt gatcacaggc    8400

agcaacgctc tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttc    8460

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tgtggtgtaa acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg    8700

tactgaatta acgccgaatt aattcggggg atctggattt tagtactgga ttttggtttt    8760

aggaattaga aattttattg atagaagtat tttacaaata caaatacata ctaagggttt    8820

cttatatgct caacacatga gcgaaaccct ataggaaccc taattccctt atctgggaac    8880

tactcacaca ttattatgga gaaactcgag cttgtcgatc gacagatccg gtcggcatct    8940

actctatttc tttgccctcg gacgagtgct ggggcgtcgg tttccactat cggcgagtac    9000

ttctacacag ccatcggtcc agacggccgc gcttctgcgg gcgatttgtg tacgcccgac    9060

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cccgaacatc gcctcgctcc agtcaatgac cgctgttatg cggccattgt ccgtcaggac    9360

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ttgccagtga tacacatggg gatcagcaat cgcgcatatg aaatcacgcc atgtagtgta    9540

ttgaccgatt ccttgcggtc cgaatgggcc gaacccgctc gtctggctaa gatcggccgc    9600

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aaactcccca atgtcaagca cttccggaat cgggagcgcg gccgatgcaa agtgccgata    9780

aacataacga tctttgtaga aaccatcggc gcagctattt acccgcagga catatccacg    9840

ccctcctaca tcgaagctga aagcacgaga ttcttcgccc tccgagagct gcatcaggtc     9900

ggagacgctg tcgaactttt cgatcagaaa cttctcgaca gacgtcgcgg tgagttcagg     9960

ctttttcata tctcattgcc ccccgggatc tgcgaaagct cgagagagat agatttgtag    10020

agagagactg gtgatttcag cgtgtcctct ccaaatgaaa tgaacttcct tatatagagg    10080

aaggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc gtcatccctt acgtcagtgg agatatcaca    10140

tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt    10200

gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca tcttgaacga tagcctttcc    10260

tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggtgcc accttccttt tctactgtcc ttttgatgaa    10320

gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc gatattaccc tttgttgaaa    10380

agtctcaata gccctttggt cttctgagac tgtatctttg atattcttgg agtagacgag    10440

agtgtcgtgc tccaccatgt tatcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac    10500

gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc    10560

agaggcatct tgaacgatag cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggtgccacc    10620

ttccttttct actgtccttt tgatgaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag    10680

gtttcccgat attacccttt gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt    10740

atctttgata ttcttggagt agacgagagt gtcgtgctcc accatgttgg caagctgctc    10800

tagccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac    10860

gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc    10920

actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt    10980

gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacga attcgagctc    11040

ggtacccggg gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttggcac tggccgtcgt    11100

tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca    11160

tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca    11220

gttgcgcagc ctgaatggcg aatgctagag cagcttgagc ttggatcaga ttgtcgtttc    11280

ccgccttcag tttagcttca tggagtcaaa gattcaaata gaggacctaa cagaactcgc    11340

cgtaaagact ggcgaacagt tcatacagag tctcttacga ctcaatgaca agaagaaaat    11400

cttcgtcaac atggtggagc acgacacact tgtctactcc aaaaatatca aagatacagt    11460

ctcagaagac caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct    11520

cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg    11580

ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg cctctgccga    11640

cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc    11700

aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc    11760

acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga    11820

gagaacacgg gggactcttg accatggta                                      11849

Claims (3)

1.一种大豆种子特异性启动子，其特征在于：其核苷酸序列如Sequence NO.1所述。

2.如权利要求1所述的大豆种子特异性启动子的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

a.soyAP1基因上游远端序列的克隆：

利用TAIL-PCR方法，设计3个嵌套引物：

SP1：5’-GAAACGCGGTTAGGAAAACAGATGAG-3’

SP2：5’-GAGGAATAGGTTTACCGATACGTGGAGA-3’

SP3：5’-CAGTAGTGTCACACCTTCCTTCCTCTTT-3’

与随机兼并引物AD4：5’-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3’，进行三次PCR反应，获得865bp的上游远端序列；

b、对soyAP1基因ATG上游序列进行分析，设计各缺失片段分别为SAP1，SAP2，soyAP1-p和SAP4；

c.利用Y3：5’-GGGCTGCAGTTAAATTTATTGATGAAAGG-3’和

Y5：5’-GGGCCATGGGTTCTCCTATTCATCCAAAT  -3’这对引物扩增soyAP1-p片段；

d.将soyAP1-p扩增片段与克隆载体pMD18-T进行连接，鉴定后测序，验证序列正确。

3.如权利要求1所述的大豆种子特异性启动子在作为大豆种子特异性启动子中的应用。

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