CN105838733A - Cas9 介导的香石竹基因编辑载体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及Cas9介导的香石竹基因编辑载体和应用，首先，构建含香石竹目标基因靶位点的CRISPR‑Cas9系统，将Cas9表达载体导入根癌农杆菌C58菌株，再将香石竹叶片的基部放入预培养培养基，22±2℃光照培养3‑4天，将含Cas 9表达载体的农杆菌活化，再将预培养后的外植体浸入已活化备好的农杆菌菌液中20‑30分钟，吸干菌液，接着转入共培养基中，22±2℃暗培养3‑4天，再转置到筛选培养基培养，22±2℃光照培养，分化出再生芽，将再生芽转入增殖培养基中进行增殖筛选培养，并检测阳性转基因再生植株，对靶位点进行测序，检测香石竹目标基因靶点的突变株系。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种Cas9 介导的香石竹基因编辑载体和应用。
背景技术
RNAi干扰技术和基因编缉技术是研究基因功能方法，RNAi介导的基因下调是减少细胞中目的基因表达产物的最常用方法，然而，RNAi无法完全去除目的基因。与此相反，基因组编辑技术改变遗传密码，引起基因敲除，以致完全缺失基因功能。目前，有两种技术可用于高效地形成双链断裂：TALEN（Transcription Activator-like Effector Nucleases）和CRISPR-Cas（Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeat Associated）蛋白。TALEN是由带特异结合位点的DNA结合蛋白和限制性内切酶Fok1融合而成的嵌合体蛋白。CRISPR-Cas的作用机理是一个带特异结合位点的sgRNA（single guide RNA）引导Cas9核酸酶到靶位点。两种技术都是运用核酸酶来切割靶序列，所得到的双链断裂或被修复或导致细胞死亡。TALEN技术构建体系比较麻烦，Cas9技术构建体统简单。
香石竹别名康乃馨、麝香石竹，石竹科，石竹属，宿根草本植物。香石竹是著名的“母亲节”之花。在香石竹中，目前有学者利用RNAi干扰技术研究香石竹基因功能，但转基因的效率低，且不能彻底敲掉目标基因。因此如何克服现有技术的不足是目前基因工程技术领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供了一种Cas9 介导的香石竹基因编辑载体，与采用该编辑载体定向突变香石竹目标基因的方法，本发明利用Cas9技术，在香石竹中实现特定位点的基因编缉，从而造成基因序列永久的突变，为研究基因功能奠定基础。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
Cas9 介导的香石竹基因编辑载体，包括AtU6启动子调控sgRNA表达的表达框AtU6-sgRNA和2×35S启动子调控Cas9表达的表达框2×35S-Cas9。
本发明还要求保护所述Cas9 介导的香石竹基因编辑载体在香石竹基因功能研究或香石竹基因工程育种中的应用。
一种定向突变香石竹基因的方法，采用上述Cas9 介导的香石竹基因编辑载体，包括以下步骤：
步骤（1），构建Cas 9介导的香石竹基因编辑载体：
将AtU6启动子调控含靶序列的sgRNA表达的表达框和2×35S启动子调控Cas9表达的表达框通过T4连接酶连入PCAMBIA1301载体中，得到Cas 9表达载体，即Cas 9介导的香石竹基因编辑载体；所述的Cas 9表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示；靶序列通过重叠PCR法插入AtU6-sgRNA表达框；
步骤（2），农杆菌转化香石竹：
采用冻融法将步骤（1）构建好的Cas9表达载体转化到农杆菌中，然后将含Cas9表达载体的农杆菌与相同体积的50 V/V %甘油水溶液混合均匀，得到含Cas9表达载体的农杆菌菌液，置于-80℃冰箱内保存；
步骤（3），香石竹外植体预培养：
取无菌的香石竹组培苗最顶端的1-3节叶片，将叶片的基部沿垂直于基部轴向切成2-5毫米的薄片，接种于预培养培养基中，22±2℃条件下光照培养3-4天，得到预培养的叶片；
所述的预培养培养基为MS+TDZ 0.1-0.5mg/L +NAA 0.1-0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂9-11g/L，pH为5.8；
步骤（4），农杆菌菌液培养：
将步骤（2）得到的含Cas9表达载体的农杆菌菌液20-50μL加入到添加卡那霉素和利福平的YEB液体培养基中，于28℃下，180-200 rmp振荡培养16-20小时，得到活化的农杆菌菌液；所述的活化的农杆菌菌液OD600值为0.5-0.8；所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液体培养基是在YEB液体培养基中添加卡那霉素至终浓度为50-80mg/L，且同时添加利福平至终浓度为50-80mg/L；
步骤（5），香石竹遗传转化：
在摇床上，将步骤（3）预培养的叶片浸入步骤（4）得到的活化的农杆菌菌液中，以50-80rmp的速度振荡，20-30分钟后取出；将叶片放在灭过菌的滤纸上吸干多余的菌液，然后将叶片转入共培养的培养基中，在22±2℃条件下暗培养3-4天，再转入筛选培养基中，进行筛选培养，40-60天更换培养基一次，待分化出丛生的再生芽，将再生芽转入增殖培养基中进行增殖筛选培养，得到转基因再生植株；
所述的共培养的培养基为MS+TDZ 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+AS 20-30 mg/L，蔗糖30g/L，琼脂9-11g/L，pH为5.8；
所述的筛选培养基为MS+TDZ 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+ Cef 300-400 mg/L+Hyg 6-10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂9-11g/L，pH为5.8。
所述的增殖培养基为MS+BA 0-0.1mg/L+NAA 0-0.1mg/L+ Hyg 6-10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂9-11g/L，pH为5.8；
步骤（6），香石竹阳性转基因再生植株的验证：
提取步骤（5）增殖筛选培养得到的转基因再生植株DNA，采用PCR法扩增Cas 9片断（可扩增全部Cas 9片断，也可扩增部分Cas 9片断），能扩增出Cas 9片断的植株为阳性转基因再生植株；然后在靶位点两端设计引物，扩增阳性转基因再生植株含目标靶点的DNA片断，测序法检测靶点的编辑情况。
进一步，优选的是所述农杆菌选用根癌农杆菌C58。
进一步，优选的是步骤（1）的构建Cas 9介导的香石竹基因编辑载体的具体方法如下：
采用KpnI/SalI 双酶切AtU6-26SK质粒，SalI/EcoRI 双酶切35S-Cas9-SK质粒和KpnI/EcoRI 双酶切PCAMBIA1301质粒，并分别回收三种双酶切产物，采用T4连接酶在16℃下将三种的双酶切产物连接16小时，采用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过PCR法筛选阳性克隆，并进行测序验证，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示的Cas 9表达载体。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明利用新型的基因编缉系统CRISPR-Cas系统，对香石竹目标基因进行定向编缉，可以获得基因功能缺失的突变体，为香石竹基因功能的研究及利用转基因技术培育优良性状的种质打下基础。
本发明在香石竹中建立了一种定向突变目标基因的方法，与RNAi技术相比，实现在香石竹中特定位点的定向基因编缉，从而造成基因序列永久的缺失；Cas 9技术与TALEN技术相比，具有操作简单，耗时较短，可缩短一倍的时间，费用较低，费用可节省60－70%，这为基因功能的研究以及利用转基因技术来培育新品种奠定基础。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1利用重叠PCR技术拼接含靶序列的sgRNA表达盒电泳图。A：1-2为PrimerF1和Primer2105R1引物扩增sgRNA表达盒部分片断； B: 1-2为Primer2105F2和PrimerR2引物扩增sgRNA表达盒部分片断； C: 1-2为引物PrimerF1和PrimerR2进行重叠PCR扩增含2105三个靶点的sgRNA 表达盒。M：Marker。
图2为Cas 9 载体构建过程示意图；
图3为含目标靶点的Cas 9载体PCR鉴定结果电泳图；其中，M：Marker；1-4：4个单克隆sgRNA表达盒PCR鉴定；5-8:4个单克隆Cas9表达盒PCR鉴定；9-12：4个单克隆潮霉素基因PCR鉴定。
图4 农杆菌中Cas9表达盒部分片断的PCR鉴定结果电泳图；其中，M：Marker；1-4：4个单克隆Cas9表达盒PCR鉴定；5：水对照。
图5为2105Cas 9载体的转基因再生植株PCR鉴定结果电泳图；其中，1-12：12株增殖筛选培养得到的转基因再生植株PCR鉴定；WT：野生型；－：阴性水对照；+：阳性大肠杆菌液对照；M：Marker.
图6为转基因阳生再生植株靶点DNA片断扩增结果电泳图，1-7：7株阳性植株靶点DNA片断扩增产物；8：水对照。
图7为编缉靶点的测序图，序列图显示N>S 和I>M突变；图中标出protospacer和PAM位置，以及氨基酸编码的序列。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
AtU6-26SK和35S-Cas9-SK质粒由上海植物逆境生物学研究中心朱健康研究员馈赠，sgRNA表达盒和Cas9表达盒的序列见文章(Feng Z, Zhang B, Ding W, Liu X, YangD, Wei P, Cao F, Zhu S, Zhang F, Mao Y et al. 2013. Efficient genome editingin plants using a CRISPR/Cas system. Cell Res 23(10): 1229-1232.)。
如果没有特别指出，百分号为质量百分数，溶液的溶剂为水。
下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例1
（1） 构建Cas 9介导的香石竹基因编辑载体
1）采用重叠PCR扩增含2105靶点的sgRNA 表达盒。
第一轮PCR：以AtU6-26SK为模板，分别以PrimerF1和Primer2105R1、Primer2105F2和PrimerR2为引物，用TransStart TaqDNA Polymerase 进行特异PCR扩增出500多bp的片断和100多bp的二个片断。扩增体系皆为50微升，
其中PCR反应体系：上下游引物各为1微升，dNTP 4微升，模板 DNA 1微升，TransStartTaqDNA Polymerase 1微升，10×buffer 5微升，补加双蒸水至50微升。
反应条件为 94 ℃预变性 10分钟，94 ℃ 30秒，64 ℃ 30秒，72 ℃ 30分钟，共35个循环，72 ℃再延伸10分钟。
第二轮PCR：以扩增出500多bp的片断和100多bp的二个片断为模板，用引物PrimerF1和PrimerR2进行重叠聚合酶链式反应，扩增含有目的片断的sgRNA 表达盒。反应分两步进行，第一步，在50微升体系中加500多bp的片断和100多bp的二个片断各1 微升，dNTP 4微升，TransStart TaqDNAPolymerase 1 微升，10×buffer 5微升，加水至50微升，反应条件为 94 ℃预变性 10分钟，94 ℃ 30秒，64 ℃ 30秒，72 ℃30秒，共10个循环，72℃再延伸10分钟；第二步：在第一步50 微升反应体系中补加物PrimerF1和PrimerR2引物各1 微升，反应循环为30个。（图1）
将含有2105靶位点序列的DNA片断连入pEASY-Blunt Cloning Vector克隆载体（北京全式金），挑选阳性克隆并测序。测序与靶位点序列一致的为阳性克隆。
2）构建Cas 9 和sgRNA 表达盒的双价表达载体
提取DcPS1基因含2105靶点的AtU6-26SK、35S-Cas9-SK和PCAMBIA1301质粒。
DcPS1基因2105靶点的核苷酸序列为5’-gttctgtcatagggcgattgggg-3’（SEQ IDNO.2）2105靶点为SEQ ID NO.1的第16646-第16665碱基。
采用KpnI/SalI 双酶切AtU6-26SK质粒，SalI/EcoRI 双酶切35S-Cas9-SK质粒和KpnI/EcoRI 双酶切PCAMBIA1301质粒。回收双酶切产物，T4连接酶（NEB）16℃连接16小时，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（图2）。挑取白色大肠杆菌，放入2毫升氨苄抗性的液体培养基内，于37℃ 200转/分振荡培养16小时，得到黄色的菌液。
所述的氨苄抗性的液体培养基的制备方法是：将10克胰蛋白胨、5克酵母粉和10克NaCl加入到水中，并定容至1升，调pH为7.0，于121℃下，高压灭菌20min，冷却后加入100毫克/毫升的氨苄青霉素水溶液1毫升，即得。
采用PCR鉴定阳性克隆，分别在sgRNA表达盒、Cas9表达盒和潮霉素磷酸转移酶（Hyg）基因上设计1对引物。sgRNA表达盒部分片断扩增采用的引物为ATU6-26SK-11F和ATU6-26SK-645R；Cas9表达盒部分片断扩增所采用的引物为35SCAS9-701F和35SCAS9-1460R；潮霉素磷酸转移酶（Hyg）基因部分片断扩增HYG-35F和HYG-727R；
PCR反应体系：
菌液1微升；
HYG-35F和HYG-727R引物
10× Taq Buffer， 2微升；
MgCl2， 25毫摩尔/升， 1.2微升；
dNTP， 2.5毫摩尔/升， 1.6微升；
Taq， 5单位/微升， 0.15微升；
双蒸水 余量；
总计 20 微升。
Ps：6种引物的浓度均为10微摩尔/升，加入的体积均为1微升
PCR反应条件： 95 ℃ 5分钟，95 ℃ 30秒，58 ℃ 30 秒，72 ℃ 1分钟，35 个循环，72℃ 5分钟。
琼脂糖凝胶电泳观察结果，三对引物均扩增出目地条带的为1个阳性克隆（图3）。即ATU6-26SK-11F和ATU6-26SK-645R引物扩增出635bp的条带，35SCAS9-701F和35SCAS9-1460R引物扩增出760bp的条带，HYG-35F和HYG-727R引物引物扩增出693bp的条带。
测序鉴定，选取三对引物扩增片断大小正确的3个阳性克隆送去上海捷瑞生物技术有限公司测序，使用的测序引物为ATU6-26SK-645R，所测序列与2105靶点碱基序列相同的克隆为阳性克隆。
表 引物的序列。
其中FP为上游引物，RP为下游引物。
（2）Cas9表达载体转化农杆菌
采用冻融法将构建好的Cas 9表达载体转入C58农杆菌。具体操作如下：向冰上刚融化的50微升农杆菌感受态细胞中加入1微克Cas 9表达载体质粒DNA，混匀后冰上放置30分钟，液氮速冻5分钟，37℃水浴3分钟至全融，冰上放置2分钟，加入到1毫升YEB液体培养基中，28℃，200转/分恢复培养3小时，5000转/分离心3分钟，收集菌体，均匀涂于事先加有50毫克/升卡那抗性和50毫克/升利福平的YEB平板上，28℃倒置避光培养2天。
所述的YEB液体培养基的制备方法是将5克胰蛋白胨、1克酵母粉、5克蔗糖和0.5克MgSO4，一起加入到水中，并采用NaOH调节pH，最终定容至1升，pH为7.2-7.5，再于121℃高压灭菌20分钟，即得。
上述卡那抗性和利福平的YEB平板的制备方法是将5克胰蛋白胨、1克酵母粉、5克蔗糖、0.5克 MgSO4和琼脂1.5克，一起加入到水中，调pH，定容至100毫升，pH为7.2-7.5，再于121℃高压灭菌20分钟，接着冷却到60℃时加入50毫克/毫升的卡那霉素水溶液100微升和50毫克/毫升利福平水溶液100微升，倒平板，即得
从平板上随机挑取10个单菌落，分别接种于50毫升含50毫克/升卡那抗性和50毫克/升利福平的YEB液体培养基中，该含卡那抗性和利福平的YEB液体培养基的制备方法是：将5克胰蛋白胨、1克酵母粉、5克蔗糖和0.5克 MgSO4，一起加入到水中，并采用NaOH调节pH，最终定容至1升，pH为7.2-7.5，再于121℃高压灭菌20分钟，冷却后加入50毫克/毫升的卡那霉素水溶液1毫升和50毫克/毫升利福平水溶液1毫升，即得。
28℃，200 转/分恒温振荡培养2天，取少量菌液进行PCR扩增鉴定。
PCR反应体系：
菌液 1微升；
上游引物35SCAS9-701F 10微摩尔/升 1微升；
下游引物35SCAS9-1460R 10微摩尔/升 1微升；
10× Taq Buffer 2微升；
MgCl2 25毫摩尔/升 1.2微升；
dNTP 2.5毫摩尔/升 1.6微升；
Taq 5单位/微升 0.15微升；
双蒸水 余量；
总计 20 微升。
PCR反应条件： 95 ℃ 5分钟，95 ℃ 30秒，58 ℃ 30 秒，72 ℃ 1分钟，35 个循环，72 ℃ 5分钟。
PCR扩增鉴定结果（图4）。
将鉴定的Cas 9表达载体的农杆菌与相同体积的50 V/V %甘油水溶液混合均匀，置于-80 ℃冰箱内保存。
（3）香石竹外植体预培养
在超净工作台上，取无菌的香石竹组培苗‘马斯特’叶片，用镊子小心撕下最顶端1-3节叶片，将叶片的基部横切成2-5毫米的薄片，薄层背面朝下接种于MS+TDZ（苯基噻二唑基脲）0.5 mg/L +NAA（萘乙酸）0.5 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂9-11 g/L，pH为5.8预培养培养基中，24 ℃条件下光照培养4天。
（4）农杆菌菌液培养
吸取含Cas 9表达载体的农杆菌菌液20μL接种于30毫升YEB液体培养基摇菌培养，YEB液体培养基中添加终浓度50毫克/升卡那霉素和终浓度50毫克/升利福平，28℃条件下，180rmp 振荡培养16小时，当OD600为0.5时，得到含Cas 9表达载体的农杆菌菌液，用于农杆菌浸染。
（5）香石竹遗传转化
将预培养的叶片浸入到含Cas 9表达载体的农杆菌菌液30分钟，此过程放在摇床上，80rmp不断振荡以使菌液与外植体充分接触。将叶片放在灭过菌的滤纸上吸干多余的菌液，转入MS+ TDZ 0.5 mg/L +NAA 0.5 mg/L +AS（乙酰丁香酮）20 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂11 g/L，pH为5.8的共培养的培养基中，在24℃条件下暗培养4天，再转入MS+ TDZ 0.5 mg/L +NAA0.5 mg/L + 400 mg/L Cef（头孢氨噻肟） + 6 mg/L Hyg，蔗糖30 g/L，琼脂11 g/L，pH为5.8筛选培养基中，进行筛选培养，60天更换成新的筛选培养基，待分化出再生芽，将再生芽转入MS+BA（6-苄氨基嘌呤）0.1 mg/L +NAA 0.1 mg/L + 6 mg/L Hyg，蔗糖30 g/L，琼脂11g/L，pH为5.8增殖培养基中进行增殖筛选培养。
（6）香石竹阳性转基因再生植株的验证
香石竹DcPS1基因Cas 9表达载体采用PCR法验证阳性转基因再生植株和测序法检测对靶点是否切割。首先提取增殖筛选培养得到的转基因再生植株的DNA进行PCR扩增；
PCR反应体系：
DNA 50纳克，
上游引物35SCAS9-701F 10微摩尔/升 1微升；
下游引物35SCAS9-1460R 10微摩尔/升 1微升；
10× Taq Buffer 2微升；
MgCl2 25毫摩尔/升 1.2微升；
dNTP 2.5毫摩尔/升 1.6微升；
Taq 5单位/微升 0.15微升；
双蒸水 余量；
总计 20 微升。
PCR反应条件： 95 ℃ 5分钟，95 ℃ 30秒，58 ℃ 30 秒，72 ℃ 1分钟，35 个循环，72 ℃ 5分钟。
引物扩出含目的条带（与‘+’泳道扩增条带相一致的条带）的片断为阳性转基因再生植株（图5），1、7、8、9泳道能扩出条带，为阳性转基因再生植株。对93株增殖筛选培养得到的转基因再生植株进行筛选，共检测到27株阳性转基因再生植株，占到所有再生植株的29%。
以阳性转基因再生植株基因组DNA为模板进行PCR扩增；
PCR反应体系：
DNA 50纳克，
上游引物PS1-1752F 10微摩尔/升 1微升；
下游引物PS1-2311R 10微摩尔/升 1微升；
10× Taq Buffer 2微升；
MgCl2 25毫摩尔/升 1.2微升；
dNTP 2.5毫摩尔/升 1.6微升；
Taq 5单位/微升 0.15微升；
双蒸水 余量；
总计 20 微升。
PCR反应条件： 95 ℃ 5分钟，95 ℃ 30秒，58 ℃ 30 秒，72 ℃ 1分钟，35 个循环，72 ℃ 5分钟。
将扩增得到的含靶序列的560bp的DNA片断（图6），克隆到PMD18T载体（Takara）并进行测序检测。测序结果发现其中有4株植株的靶位点出现了单碱基突变，其中，两株发生氨基酸的突变，两株未产生氨基酸的变异，Cas 9表达载体对靶点进行了编缉，产生了基因突变（图7）。
实施例2
一种定向突变香石竹基因的方法，采用Cas9 介导的香石竹基因编辑载体，包括以下步骤：
步骤（1），构建Cas 9介导的香石竹基因编辑载体：
将AtU6启动子调控sgRNA表达的表达框和2×35S启动子调控Cas9表达的表达框通过T4连接酶连入PCAMBIA1301载体中，得到Cas 9表达载体；所述的Cas 9表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示；
步骤（2），农杆菌转化香石竹：
采用冻融法将步骤（1）构建好的Cas9表达载体转化到农杆菌中，然后将含Cas9表达载体的农杆菌与相同体积的50 V/V %甘油水溶液混合均匀，得到含Cas9表达载体的农杆菌菌液，置于-80℃冰箱内保存；
步骤（3），香石竹外植体预培养：
取无菌的香石竹组培苗最顶端的1节叶片，将叶片的基部沿垂直于基部轴向切成2毫米的薄片，接种于预培养培养基中，22±2℃条件下光照培养3天，得到预培养的叶片；
所述的预培养培养基为MS+TDZ 0.1 mg/L +NAA 0.1 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂9 g/L，pH为5.8；
步骤（4），农杆菌菌液培养：
将步骤（2）得到的含Cas9表达载体的农杆菌菌液20μL加入到添加卡那霉素和利福平的YEB液体培养基中，于28℃下，200rmp振荡培养16小时，得到活化的农杆菌菌液；所述的活化的农杆菌菌液OD600值为0.5；所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液体培养基是在YEB液体培养基中添加卡那霉素至终浓度为80mg/L，且添加利福平至终浓度为80mg/L；
步骤（5），香石竹遗传转化：
在摇床上，将步骤（3）预培养的叶片浸入步骤（4）得到的活化的农杆菌菌液中，以50rmp的速度振荡，30分钟后取出；将叶片放在灭过菌的滤纸上吸干多余的菌液，然后将叶片转入共培养的培养基中，在22±2℃条件下暗培养3天，再转入筛选培养基中，进行筛选培养，40天更换培养基一次，待分化出丛生的再生芽，将再生芽转入增殖培养基中进行增殖筛选培养，得到转基因再生植株；
所述的共培养的培养基为MS+TDZ 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L+AS 20mg/L，蔗糖30g/L，琼脂9g/L，pH为5.8；
所述的筛选培养基为MS+TDZ 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L+ Cef 300 mg/L+ Hyg 6mg/L，蔗糖30g/L，琼脂9g/L，pH为5.8。
所述的增殖培养基为MS+BA 0mg/L+NAA 0mg/L+ Hyg 6mg/L，蔗糖30g/L，琼脂9g/L，pH为5.8；
步骤（6），香石竹阳性转基因再生植株的验证：
提取步骤（5）增殖筛选培养得到的转基因再生植株DNA，采用PCR法扩增Cas 9片断，能扩增出Cas 9片断的植株为阳性转基因再生植株；然后在靶位点两端设计引物，扩增阳性转基因再生植株含目标靶点的DNA片断，测序法检测靶点的编辑情况。
实施例3
一种定向突变香石竹基因的方法，采用Cas9 介导的香石竹基因编辑载体，包括以下步骤：
步骤（1），构建Cas 9介导的香石竹基因编辑载体：
采用KpnI/SalI 双酶切AtU6-26SK质粒，SalI/EcoRI 双酶切35S-Cas9-SK质粒和KpnI/EcoRI 双酶切PCAMBIA1301质粒，并分别回收三种双酶切产物，采用T4连接酶在16℃下将三种的双酶切产物连接16小时，采用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过PCR法筛选阳性克隆，并进行测序，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示的Cas 9表达载体；
步骤（2），农杆菌转化香石竹：
采用冻融法将步骤（1）构建好的Cas9表达载体转化到农杆菌中，然后将含Cas9表达载体的农杆菌与相同体积的50 V/V %甘油水溶液混合均匀，得到含Cas9表达载体的农杆菌菌液，置于-80℃冰箱内保存；
步骤（3），香石竹外植体预培养：
取无菌的香石竹组培苗最顶端的3节叶片，将叶片的基部沿垂直于基部轴向切成5毫米的薄片，接种于预培养培养基中，22±2℃条件下光照培养4天，得到预培养的叶片；
所述的预培养培养基为MS+TDZ 0.3mg/L +NAA 0.3mg/L，蔗糖30g/L，琼脂11g/L，pH为5.8；
步骤（4），农杆菌菌液培养：
将步骤（2）得到的含Cas9表达载体的农杆菌菌液50μL加入到添加卡那霉素和利福平的YEB液体培养基中，于28℃下，190rmp振荡培养20小时，得到活化的农杆菌菌液；所述的活化的农杆菌菌液OD600值为0.8；所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液体培养基是在YEB液体培养基中添加卡那霉素至终浓度为50mg/L，且添加利福平至终浓度为50mg/L；
步骤（5），香石竹遗传转化：
在摇床上，将步骤（3）预培养的叶片浸入步骤（4）得到的活化的农杆菌菌液中，以80rmp的速度振荡， 20分钟后取出；将叶片放在灭过菌的滤纸上吸干多余的菌液，然后将叶片转入共培养的培养基中，在22±2℃条件下暗培养4天，再转入筛选培养基中，进行筛选培养， 60天更换培养基一次，待分化出丛生的再生芽，将再生芽转入增殖培养基中进行增殖筛选培养，得到转基因再生植株；
所述的共培养的培养基为MS+TDZ 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+AS 30 mg/L，蔗糖30g/L，琼脂11g/L，pH为5.8；
所述的筛选培养基为MS+TDZ 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+ Cef 400 mg/L+ Hyg 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂11g/L，pH为5.8。
所述的增殖培养基为MS+BA 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L+ Hyg 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂11g/L，pH为5.8；
步骤（6），香石竹阳性转基因再生植株的验证：
提取步骤（5）增殖筛选培养得到的转基因再生植株DNA，采用PCR法扩增Cas 9片断，能扩增出Cas 9片断的植株为阳性转基因再生植株；然后在靶位点两端设计引物，扩增阳性转基因再生植株含目标靶点的DNA片断，测序法检测靶点的编辑情况。
实施例4
一种定向突变香石竹基因的方法，采用Cas9 介导的香石竹基因编辑载体，包括以下步骤：
步骤（1），构建Cas 9介导的香石竹基因编辑载体：
采用KpnI/SalI 双酶切AtU6-26SK质粒，SalI/EcoRI 双酶切35S-Cas9-SK质粒和KpnI/EcoRI 双酶切PCAMBIA1301质粒，并分别回收三种双酶切产物，采用T4连接酶在16℃下将三种的双酶切产物连接16小时，采用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过PCR法筛选阳性克隆，并进行测序，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示的Cas 9表达载体；
步骤（2），农杆菌转化香石竹：
采用冻融法将步骤（1）构建好的Cas9表达载体转化到农杆菌中，然后将含Cas9表达载体的农杆菌与相同体积的50 V/V %甘油水溶液混合均匀，得到含Cas9表达载体的农杆菌菌液，置于-80℃冰箱内保存；
步骤（3），香石竹外植体预培养：
取无菌的香石竹组培苗最顶端的2节叶片，将叶片的基部沿垂直于基部轴向切成4毫米的薄片，接种于预培养培养基中，22±2℃条件下光照培养3.5天，得到预培养的叶片；
所述的预培养培养基为MS+TDZ 0.2mg/L +NAA 0.2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂10g/L，pH为5.8；
步骤（4），农杆菌菌液培养：
将步骤（2）得到的含Cas9表达载体的农杆菌菌液40μL加入到添加卡那霉素和利福平的YEB液体培养基中，于28℃下，180rmp振荡培养18小时，得到活化的农杆菌菌液；所述的活化的农杆菌菌液OD600值为0.7；所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液体培养基是在YEB液体培养基中添加卡那霉素至终浓度为60mg/L，且添加利福平至终浓度为60mg/L；
步骤（5），香石竹遗传转化：
在摇床上，将步骤（3）预培养的叶片浸入步骤（4）得到的活化的农杆菌菌液中，以66rmp的速度振荡，25分钟后取出；将叶片放在灭过菌的滤纸上吸干多余的菌液，然后将叶片转入共培养的培养基中，在22±2℃条件下暗培养3.7天，再转入筛选培养基中，进行筛选培养，50天更换培养基一次，待分化出丛生的再生芽，将再生芽转入增殖培养基中进行增殖筛选培养，得到转基因再生植株；
所述的共培养的培养基为MS+TDZ 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+AS 25 mg/L，蔗糖30g/L，琼脂9.5g/L，pH为5.8；
所述的筛选培养基为MS+TDZ 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+ Cef 380 mg/L+ Hyg 8mg/L，蔗糖30g/L，琼脂9.8g/L，pH为5.8。
所述的增殖培养基为MS+BA 0.06mg/L+NAA 0.08mg/L+ Hyg 7mg/L，蔗糖30g/L，琼脂10.5g/L，pH为5.8；
步骤（6），香石竹阳性转基因再生植株的验证：
提取步骤（5）增殖筛选培养得到的转基因再生植株DNA，采用PCR法扩增Cas 9片断，能扩增出Cas 9片断的植株为阳性转基因再生植株；然后在靶位点两端设计引物，扩增阳性转基因再生植株含目标靶点的DNA片断，测序法检测靶点的编辑情况。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID NO.1
gatctgaggg taaatttcta gtttttctcc ttcattttct tggttaggac ccttttctct 60
ttttattttt ttgagctttg atctttcttt aaactgatct attttttaat tgattggtta 120
tggtgtaaat attacatagc tttaactgat aatctgatta ctttatttcg tgtgtctatg 180
atgatgatga tagttacaga accgacgact cgtccgtcct gtagaaaccc caacccgtga 240
aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattga 300
tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt 360
taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg 420
cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt 480
cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta 540
tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtatcac 600
cgtttgtgtg aacaacgaac tgaactggca gactatcccg ccgggaatgg tgattaccga 660
cgaaaacggc aagaaaaagc agtcttactt ccatgatttc tttaactatg ccggaatcca 720
tcgcagcgta atgctctaca ccacgccgaa cacctgggtg gacgatatca ccgtggtgac 780
gcatgtcgcg caagactgta accacgcgtc tgttgactgg caggtggtgg ccaatggtga 840
tgtcagcgtt gaactgcgtg atgcggatca acaggtggtt gcaactggac aaggcactag 900
cgggactttg caagtggtga atccgcacct ctggcaaccg ggtgaaggtt atctctatga 960
actcgaagtc acagccaaaa gccagacaga gtctgatatc tacccgcttc gcgtcggcat 1020
ccggtcagtg gcagtgaagg gccaacagtt cctgattaac cacaaaccgt tctactttac 1080
tggctttggt cgtcatgaag atgcggactt acgtggcaaa ggattcgata acgtgctgat 1140
ggtgcacgac cacgcattaa tggactggat tggggccaac tcctaccgta cctcgcatta 1200
cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat ggcatcgtgg tgattgatga 1260
aactgctgct gtcggctttc agctgtcttt aggcattggt ttcgaagcgg gcaacaagcc 1320
gaaagaactg tacagcgaag aggcagtcaa cggggaaact cagcaagcgc acttacaggc 1380
gattaaagag ctgatagcgc gtgacaaaaa ccacccaagc gtggtgatgt ggagtattgc 1440
caacgaaccg gatacccgtc cgcaaggtgc acgggaatat ttcgcgccac tggcggaagc 1500
aacgcgtaaa ctcgacccga cgcgtccgat cacctgcgtc aatgtaatgt tctgcgacgc 1560
tcacaccgat accatcagcg atctctttga tgtgctgtgc ctgaaccgtt attacggatg 1620
gtatgtccaa agcggcgatt tggaaacggc agagaaggta ctggaaaaag aacttctggc 1680
ctggcaggag aaactgcatc agccgattat catcaccgaa tacggcgtgg atacgttagc 1740
cgggctgcac tcaatgtaca ccgacatgtg gagtgaagag tatcagtgtg catggctgga 1800
tatgtatcac cgcgtctttg atcgcgtcag cgccgtcgtc ggtgaacagg tatggaattt 1860
cgccgatttt gcgacctcgc aaggcatatt gcgcgttggc ggtaacaaga aagggatctt 1920
cactcgcgac cgcaaaccga agtcggcggc ttttctgctg caaaaacgct ggactggcat 1980
gaacttcggt gaaaaaccgc agcagggagg caaacaagct agccaccacc accaccacca 2040
cgtgtgaatt acaggtgacc agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa 2100
gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga 2160
attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt 2220
ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg 2280
caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattaaact 2340
atcagtgttt gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa 2400
taacggatat ttaaaagggc gtgaaaaggt ttatccgttc gtccatttgt atgtgcatgc 2460
caaccacagg gttcccctcg ggatcaaagt actttgatcc aacccctccg ctgctatagt 2520
gcagtcggct tctgacgttc agtgcagccg tcttctgaaa acgacatgtc gcacaagtcc 2580
taagttacgc gacaggctgc cgccctgccc ttttcctggc gttttcttgt cgcgtgtttt 2640
agtcgcataa agtagaatac ttgcgactag aaccggagac attacgccat gaacaagagc 2700
gccgccgctg gcctgctggg ctatgcccgc gtcagcaccg acgaccagga cttgaccaac 2760
caacgggccg aactgcacgc ggccggctgc accaagctgt tttccgagaa gatcaccggc 2820
accaggcgcg accgcccgga gctggccagg atgcttgacc acctacgccc tggcgacgtt 2880
gtgacagtga ccaggctaga ccgcctggcc cgcagcaccc gcgacctact ggacattgcc 2940
gagcgcatcc aggaggccgg cgcgggcctg cgtagcctgg cagagccgtg ggccgacacc 3000
accacgccgg ccggccgcat ggtgttgacc gtgttcgccg gcattgccga gttcgagcgt 3060
tccctaatca tcgaccgcac ccggagcggg cgcgaggccg ccaaggcccg aggcgtgaag 3120
tttggccccc gccctaccct caccccggca cagatcgcgc acgcccgcga gctgatcgac 3180
caggaaggcc gcaccgtgaa agaggcggct gcactgcttg gcgtgcatcg ctcgaccctg 3240
taccgcgcac ttgagcgcag cgaggaagtg acgcccaccg aggccaggcg gcgcggtgcc 3300
ttccgtgagg acgcattgac cgaggccgac gccctggcgg ccgccgagaa tgaacgccaa 3360
gaggaacaag catgaaaccg caccaggacg gccaggacga accgtttttc attaccgaag 3420
agatcgaggc ggagatgatc gcggccgggt acgtgttcga gccgcccgcg cacgtctcaa 3480
ccgtgcggct gcatgaaatc ctggccggtt tgtctgatgc caagctggcg gcctggccgg 3540
ccagcttggc cgctgaagaa accgagcgcc gccgtctaaa aaggtgatgt gtatttgagt 3600
aaaacagctt gcgtcatgcg gtcgctgcgt atatgatgcg atgagtaaat aaacaaatac 3660
gcaaggggaa cgcatgaagg ttatcgctgt acttaaccag aaaggcgggt caggcaagac 3720
gaccatcgca acccatctag cccgcgccct gcaactcgcc ggggccgatg ttctgttagt 3780
cgattccgat ccccagggca gtgcccgcga ttgggcggcc gtgcgggaag atcaaccgct 3840
aaccgttgtc ggcatcgacc gcccgacgat tgaccgcgac gtgaaggcca tcggccggcg 3900
cgacttcgta gtgatcgacg gagcgcccca ggcggcggac ttggctgtgt ccgcgatcaa 3960
ggcagccgac ttcgtgctga ttccggtgca gccaagccct tacgacatat gggccaccgc 4020
cgacctggtg gagctggtta agcagcgcat tgaggtcacg gatggaaggc tacaagcggc 4080
ctttgtcgtg tcgcgggcga tcaaaggcac gcgcatcggc ggtgaggttg ccgaggcgct 4140
ggccgggtac gagctgccca ttcttgagtc ccgtatcacg cagcgcgtga gctacccagg 4200
cactgccgcc gccggcacaa ccgttcttga atcagaaccc gagggcgacg ctgcccgcga 4260
ggtccaggcg ctggccgctg aaattaaatc aaaactcatt tgagttaatg aggtaaagag 4320
aaaatgagca aaagcacaaa cacgctaagt gccggccgtc cgagcgcacg cagcagcaag 4380
gctgcaacgt tggccagcct ggcagacacg ccagccatga agcgggtcaa ctttcagttg 4440
ccggcggagg atcacaccaa gctgaagatg tacgcggtac gccaaggcaa gaccattacc 4500
gagctgctat ctgaatacat cgcgcagcta ccagagtaaa tgagcaaatg aataaatgag 4560
tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg catggaaaat caagaacaac caggcaccga 4620
cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac gggcggttgg ccaggcgtaa gcggctgggt 4680
tgtctgccgg ccctgcaatg gcactggaac ccccaagccc gaggaatcgg cgtgacggtc 4740
gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg gtggagaagt 4800
tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagcacgc cccggtgaat 4860
cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg gcaaccgccg gcagccggtg 4920
cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc agattttttc gttccgatgc 4980
tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga cgtggccgtt ttccgtctgt 5040
cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga gcttccagac gggcacgtag 5100
aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga ttacgacctg gtactgatgg 5160
cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga agggaaggga gacaagcccg 5220
gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt ctgccggcga gccgatggcg 5280
gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt aaacaccacg cacgttgcca 5340
tgcagcgtac gaagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac ggtatccgag ggtgaagcct 5400
tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg gccggagtac atcgagatcg 5460
agctagctga ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa gaacccggac gtgctgacgg 5520
ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg ttttctctac cgcctggcac 5580
gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa gacgatctac gaacgcagtg 5640
gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg caagctgatc gggtcaaatg 5700
acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc tggcccgatc ctagtcatgc 5760
gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc ctaatgtacg gagcagatgc 5820
tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg tctctttcct gtggatagca 5880
cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa cccgtacatt gggaacccaa 5940
agccgtacat tgggaaccgg tcacacatgt aagtgactga tataaaagag aaaaaaggcg 6000
atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg 6060
cataactgtc tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa agcgcctacc cttcggtcgc 6120
tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc ggccgctggc cgctcaaaaa 6180
tggctggcct acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca agccgcgccg tcgccactcg 6240
accgccggcg cccacatcaa ggcaccctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 6300
ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc 6360
agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc 6420
cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 6480
tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 6540
gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 6600
ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 6660
acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 6720
cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 6780
caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 6840
gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 6900
tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 6960
aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 7020
ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 7080
cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 7140
tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 7200
tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 7260
ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 7320
aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 7380
aagggatttt ggtcatgcat tctaggtact aaaacaattc atccagtaaa atataatatt 7440
ttattttctc ccaatcaggc ttgatcccca gtaagtcaaa aaatagctcg acatactgtt 7500
cttccccgat atcctccctg atcgaccgga cgcagaaggc aatgtcatac cacttgtccg 7560
ccctgccgct tctcccaaga tcaataaagc cacttacttt gccatctttc acaaagatgt 7620
tgctgtctcc caggtcgccg tgggaaaaga caagttcctc ttcgggcttt tccgtcttta 7680
aaaaatcata cagctcgcgc ggatctttaa atggagtgtc ttcttcccag ttttcgcaat 7740
ccacatcggc cagatcgtta ttcagtaagt aatccaattc ggctaagcgg ctgtctaagc 7800
tattcgtata gggacaatcc gatatgtcga tggagtgaaa gagcctgatg cactccgcat 7860
acagctcgat aatcttttca gggctttgtt catcttcata ctcttccgag caaaggacgc 7920
catcggcctc actcatgagc agattgctcc agccatcatg ccgttcaaag tgcaggacct 7980
ttggaacagg cagctttcct tccagccata gcatcatgtc cttttcccgt tccacatcat 8040
aggtggtccc tttataccgg ctgtccgtca tttttaaata taggttttca ttttctccca 8100
ccagcttata taccttagca ggagacattc cttccgtatc ttttacgcag cggtattttt 8160
cgatcagttt tttcaattcc ggtgatattc tcattttagc catttattat ttccttcctc 8220
ttttctacag tatttaaaga taccccaaga agctaattat aacaagacga actccaattc 8280
actgttcctt gcattctaaa accttaaata ccagaaaaca gctttttcaa agttgttttc 8340
aaagttggcg tataacatag tatcgacgga gccgattttg aaaccgcggt gatcacaggc 8400
agcaacgctc tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttc 8460
aaacccggca gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc 8520
cgccttacaa cggctctccc gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt 8580
ggtgattttg tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg caggatatat 8640
tgtggtgtaa acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg 8700
tactgaatta acgccgaatt aattcggggg atctggattt tagtactgga ttttggtttt 8760
aggaattaga aattttattg atagaagtat tttacaaata caaatacata ctaagggttt 8820
cttatatgct caacacatga gcgaaaccct ataggaaccc taattccctt atctgggaac 8880
tactcacaca ttattatgga gaaactcgag cttgtcgatc gacagatccg gtcggcatct 8940
actctatttc tttgccctcg gacgagtgct ggggcgtcgg tttccactat cggcgagtac 9000
ttctacacag ccatcggtcc agacggccgc gcttctgcgg gcgatttgtg tacgcccgac 9060
agtcccggct ccggatcgga cgattgcgtc gcatcgaccc tgcgcccaag ctgcatcatc 9120
gaaattgccg tcaaccaagc tctgatagag ttggtcaaga ccaatgcgga gcatatacgc 9180
ccggagtcgt ggcgatcctg caagctccgg atgcctccgc tcgaagtagc gcgtctgctg 9240
ctccatacaa gccaaccacg gcctccagaa gaagatgttg gcgacctcgt attgggaatc 9300
cccgaacatc gcctcgctcc agtcaatgac cgctgttatg cggccattgt ccgtcaggac 9360
attgttggag ccgaaatccg cgtgcacgag gtgccggact tcggggcagt cctcggccca 9420
aagcatcagc tcatcgagag cctgcgcgac ggacgcactg acggtgtcgt ccatcacagt 9480
ttgccagtga tacacatggg gatcagcaat cgcgcatatg aaatcacgcc atgtagtgta 9540
ttgaccgatt ccttgcggtc cgaatgggcc gaacccgctc gtctggctaa gatcggccgc 9600
agcgatcgca tccatagcct ccgcgaccgg ttgtagaaca gcgggcagtt cggtttcagg 9660
caggtcttgc aacgtgacac cctgtgcacg gcgggagatg caataggtca ggctctcgct 9720
aaactcccca atgtcaagca cttccggaat cgggagcgcg gccgatgcaa agtgccgata 9780
aacataacga tctttgtaga aaccatcggc gcagctattt acccgcagga catatccacg 9840
ccctcctaca tcgaagctga aagcacgaga ttcttcgccc tccgagagct gcatcaggtc 9900
ggagacgctg tcgaactttt cgatcagaaa cttctcgaca gacgtcgcgg tgagttcagg 9960
ctttttcata tctcattgcc ccccgggatc tgcgaaagct cgagagagat agatttgtag 10020
agagagactg gtgatttcag cgtgtcctct ccaaatgaaa tgaacttcct tatatagagg 10080
aaggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc gtcatccctt acgtcagtgg agatatcaca 10140
tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt 10200
gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca tcttgaacga tagcctttcc 10260
tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggtgcc accttccttt tctactgtcc ttttgatgaa 10320
gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc gatattaccc tttgttgaaa 10380
agtctcaata gccctttggt cttctgagac tgtatctttg atattcttgg agtagacgag 10440
agtgtcgtgc tccaccatgt tatcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac 10500
gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc 10560
agaggcatct tgaacgatag cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggtgccacc 10620
ttccttttct actgtccttt tgatgaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag 10680
gtttcccgat attacccttt gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt 10740
atctttgata ttcttggagt agacgagagt gtcgtgctcc accatgttgg caagctgctc 10800
tagccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac 10860
gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc 10920
actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt 10980
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacga attcccgatc 11040
tagtaacata gatgacaccg cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt 11100
ttctatcgcg tattaaatgt ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa 11160
taacgtcatg cattacatgt taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat 11220
gataatcatc gcaagaccgg caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt 11280
tgaacgatcg gggaaattcg agctctatcg atcaatcagg atccttactt tttctttttt 11340
gcctggccgg cctttttcgt ggccgccggc cttttgtcgc ctcccagctg agacaggtcg 11400
atccgtgtct cgtacaggcc ggtgatgctc tggtggatca gggtggcgtc cagcacctct 11460
ttggtgctgg tgtacctctt ccggtcgatg gtggtgtcaa agtacttgaa ggcggcaggg 11520
gctcccagat tggtcagggt aaacaggtgg atgatattct cggcctgctc tctgatgggc 11580
ttatcccggt gcttgttgta ggcggacagc actttgtcca gattagcgtc ggccaggatc 11640
actctcttgg agaactcgct gatctgctcg atgatctcgt ccaggtagtg cttgtgctgt 11700
tccacaaaca gctgtttctg ctcattatcc tcgggggagc ccttcagctt ctcatagtgg 11760
ctggccaggt acaggaagtt cacatatttg gagggcaggg ccagttcgtt tcccttctgc 11820
agttcgccgg cagaggccag cattctcttc cggccgtttt ccagctcgaa cagggagtac 11880
ttaggcagct tgatgatcag gtcctttttc acttctttgt agcccttggc ttccagaaag 11940
tcgatgggat tcttctcgaa gctgcttctt tccatgatgg tgatccccag cagctctttc 12000
acactcttca gtttcttgga cttgcccttt tccactttgg ccaccaccag cacagaatag 12060
gccacggtgg ggctgtcgaa gccgccgtac ttcttagggt cccagtcctt ctttctggcg 12120
atcagcttat cgctgttcct cttgggcagg atagactctt tgctgaagcc gcctgtctgc 12180
acctcggtct ttttcacgat attcacttgg ggcatgctca gcactttccg cacggtggca 12240
aaatcccggc ccttatccca cacgatctcc ccggtttcgc cgtttgtctc gatcagaggc 12300
cgcttccgga tctcgccgtt ggccagggta atctcggtct tgaaaaagtt catgatgttg 12360
ctgtagaaga agtacttggc ggtagccttg ccgatttcct gctcgctctt ggcgatcatc 12420
ttccgcacgt cgtacacctt gtagtcgccg tacacgaact cgctttccag cttagggtac 12480
tttttgatca gggcggttcc cacgacggcg ttcaggtagg cgtcgtgggc gtggtggtag 12540
ttgttgatct cgcgcacttt gtaaaactgg aaatccttcc ggaaatcgga caccagcttg 12600
gacttcaggg tgatcacttt cacttcccgg atcagcttgt cattctcgtc gtacttagtg 12660
ttcatccggg agtccaggat ctgtgccacg tgctttgtga tctgccgggt ttccaccagc 12720
tgtctcttga tgaagccggc cttatccagt tcgctcaggc cgcctctctc ggccttggtc 12780
agattgtcga actttctctg ggtaatcagc ttggcgttca gcagctgccg ccagtagttc 12840
ttcatcttct tcacgacctc ttcggagggc acgttgtcgc tcttgccccg gttcttgtcg 12900
cttctggtca gcaccttgtt gtcgatggag tcgtccttca gaaagctctg aggcacgata 12960
tggtccacat cgtagtcgga cagccggttg atgtccagtt cctggtccac gtacatatcc 13020
cgcccattct gcaggtagta caggtacagc ttctcgttct gcagctgggt gttttccacg 13080
gggtgttctt tcaggatctg gctgcccagc tctttgatgc cctcttcgat ccgcttcatt 13140
ctctcgcggc tgttcttctg tcccttctgg gtggtctggt tctctctggc catttcgatc 13200
acgatgttct cgggcttgtg ccggcccatc actttcacga gctcgtccac caccttcact 13260
gtctgcagga tgcccttctt aatggcgggg ctgccggcca gattggcaat gtgctcgtgc 13320
aggctatcgc cctggccgga cacctgggct ttctggatgt cctctttaaa ggtcaggctg 13380
tcgtcgtgga tcagctgcat gaagtttctg ttggcgaagc cgtcggactt caggaaatcc 13440
aggattgtct tgccggactg cttgtcccgg atgccgttga tcagcttccg gctcagcctg 13500
ccccagccgg tgtatctccg ccgcttcagc tgcttcatca ctttgtcgtc gaacaggtgg 13560
gcataggttt tcagccgttc ctcgatcatc tctctgtcct caaacagtgt cagggtcagc 13620
acgatatctt ccagaatgtc ctcgttttcc tcattgtcca ggaagtcctt gtccttgata 13680
attttcagca gatcgtggta tgtgcccagg gaggcgttga accgatcttc cacgccggag 13740
atttccacgg agtcgaagca ctcgattttc ttgaagtagt cctctttcag ctgcttcacg 13800
gtcactttcc ggttggtctt gaacagcagg tccacgatgg cctttttctg ctcgccgctc 13860
aggaaggcgg gctttctcat tccctcggtc acgtatttca ctttggtcag ctcgttatac 13920
acggtgaagt actcgtacag caggctgtgc ttgggcagca ccttctcgtt gggcaggttc 13980
ttatcgaagt tggtcatccg ctcgatgaag ctctgggcgg aagcgccctt gtccaccact 14040
tcctcgaagt tccagggggt gatggtttcc tcgctctttc tggtcatcca ggcgaatctg 14100
ctgtttcccc tggccagagg gcccacgtag taggggatgc ggaaggtcag gatcttctcg 14160
atcttttccc ggttgtcctt caggaatggg taaaaatctt cctgccgccg cagaatggcg 14220
tgcagctctc ccaggtggat ctggtggggg atgctgccgt tgtcgaaggt ccgctgcttc 14280
cgcagcaggt cctctctgtt cagcttcacg agcagttcct cggtgccgtc catcttttcc 14340
aggatgggct tgatgaactt gtagaactct tcctggctgg ctccgccgtc aatgtagccg 14400
gcgtagccgt tcttgctctg gtcgaagaaa atctctttgt acttctcagg cagctgctgc 14460
cgcacgagag ctttcagcag ggtcaggtcc tggtggtgct cgtcgtatct cttgatcata 14520
gaggcgctca ggggggcctt ggtgatctcg gtgttcactc tcaggatgtc gctcagcagg 14580
atggcgtcgg acaggttctt ggcggccaga aacaggtcgg cgtactggtc gccgatctgg 14640
gccagcaggt tgtccaggtc gtcgtcgtag gtgtccttgc tcagctgcag tttggcatcc 14700
tcggccaggt cgaagttgct cttgaagttg ggggtcaggc ccaggctcag ggcaatcagg 14760
tttccgaaca ggccattctt cttctcgccg ggcagctggg cgatcagatt ttccagccgt 14820
ctgctcttgc tcagtctggc agacaggatg gccttggcgt ccacgccgct ggcgttgatg 14880
gggttttcct cgaacagctg gttgtaggtc tgcaccagct ggatgaacag cttgtccacg 14940
tcgctgttgt cggggttcag gtcgccctcg atcaggaagt ggccccggaa cttgatcatg 15000
tgggccaggg ccagatagat cagccgcagg tcggccttgt cggtgctgtc caccagtttc 15060
tttctcaggt ggtagatggt ggggtacttc tcgtggtagg ccacctcgtc cacgatgttg 15120
ccgaagatgg ggtgccgctc gtgcttctta tcctcttcca ccaggaagga ctcttccagt 15180
ctgtggaaga agctgtcgtc caccttggcc atctcgttgc tgaagatctc ttgcagatag 15240
cagatccggt tcttccgtct ggtgtatctt cttctggcgg ttctcttcag ccgggtggcc 15300
tcggctgttt cgccgctgtc gaacagcagg gctccgatca ggttcttctt gatgctgtgc 15360
cggtcggtgt tgcccagcac cttgaatttc ttgctgggca ccttgtactc gtcggtgatc 15420
acggcccagc ccacagagtt ggtgccgatg tccaggccga tgctgtactt cttgtcggct 15480
gctgggactc cgtggatacc gaccttccgc ttcttctttg gggccatctt atcgtcatcg 15540
tctttgtaat caatatcatg atccttgtag tctccgtcgt ggtccttata gtccatctcg 15600
agtatcgttc gtaaatggtg aaaattttca gaaaattgct tttgctttaa aagaaatgat 15660
ttaaattgct gcaatagaag tagaatgctt gattgcttga gattcgtttg ttttgtatat 15720
gttgtgttga ggtcgaggtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata gaggaagggt 15780
cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc agtggagata tcacatcaat 15840
ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc ctcgtgggtg 15900
ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttc aacgatggcc tttcctttat 15960
cgcaatgatg gcatttgtag gagccacctt ccttttccac tatcttcaca ataaagtgac 16020
agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttccggatat caccctttgt tgaaaagtct 16080
caattgccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt tttggagtag acaagtgtgt 16140
cgtgctccac catgttatca catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt 16200
ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg 16260
catcttcaac gatggccttt cctttatcgc aatgatggca tttgtaggag ccaccttcct 16320
tttccactat cttcacaata aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc 16380
cggatattac cctttgttga aaagtctcaa ttgccctttg gtcttctgag actgtatctt 16440
tgatattttt ggagtagaca agtgtgtcgt gctccaccat gttgacctgc aggcatgcaa 16500
gcttgtcgac ctcgagcggc cgccagtgtg atggatatct gagaaaggcc cttcgaaggg 16560
acaaaaaaag caccgactcg gtgccacttt ttcaagttga taacggacta gccttatttt 16620
aacttgctat ttctagctct aaaaccaatc gccctatgac agaacaatca ctacttcgac 16680
tctagctgta tataaactca gcttcgtttt cttatctaag cgatgtggga cttttgaaga 16740
ttgttttcaa cttaaatggg cctatataag aaatactatt gttctttccc atataaatgg 16800
gcctgcttct cttctttcag attcccaggg gccttttgaa gattatcttc atatcttaag 16860
aatgaagatg ttttattcaa tcaaattctt gaaggttcga tgcctaatca ttctaatcct 16920
gggacaaact atgaaacaag atacaaaaac tccgaatgga aagttaaaaa gaagaaaacg 16980
aaagctacgg ttcaagaaaa tgtaagctga taaacaaaaa aaaactgtat gaacgaagaa 17040
gaagaaaaaa agctaagaag aaatgatgta ttgtgcggaa ggcaagtcga gtttccgttg 17100
ttcaacgaag cttaagggca attccagcac actggcggcc gttactagtg gatccgagct 17160
cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggca ctggccgtcg 17220
ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 17280
atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 17340
agttgcgcag cctgaatggc gaatgctaga gcagcttgag cttggatcag attgtcgttt 17400
cccgccttca gtttagcttc atggagtcaa agattcaaat agaggaccta acagaactcg 17460
ccgtaaagac tggcgaacag ttcatacaga gtctcttacg actcaatgac aagaagaaaa 17520
tcttcgtcaa catggtggag cacgacacac ttgtctactc caaaaatatc aaagatacag 17580
tctcagaaga ccaaagggca attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcc ggaaacctcc 17640
tcggattcca ttgcccagct atctgtcact ttattgtgaa gatagtggaa aaggaaggtg 17700
gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggccat cgttgaagat gcctctgccg 17760
acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc 17820
caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg 17880
cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg 17940
agagaacacg ggggactctt gaccatggta 17970
SEQ ID NO.2
gttctgtcat agggcgattg ggg 23
SEQ ID NO.3
ttgggtaccg agctcggatc cactagtaac 30
SEQ ID NO.4
caatcgccct atgacagaac aatcactact tcgactct 38
SEQ ID NO.5
gttctgtcat agggcgattg gttttagagc tagaaatagc 40
SEQ ID NO.6
accgtcgacc tcgagcggcc 20
SEQ ID NO.7
tcggatccac tagtaacggc 20
SEQ ID NO.8
gccagtgtga tggatatctg c 21
SEQ ID NO.9
cacaatccca ctatccttcg 20
SEQ ID NO.10
gctgtccacc agtttctttc 20
SEQ ID NO.11
agaagtttct gatcgaaaag ttc 23
SEQ ID NO.12
ccatacaagc caaccacgg 19
SEQ ID NO.13
gagtcatcaa cctggtgtag aaa 23
SEQ ID NO.14
cctcctcatc atcattccct 20
Claims (5)
1.Cas9 介导的香石竹基因编辑载体，其特征在于：包括AtU6启动子调控sgRNA表达的表达框AtU6-sgRNA和2×35S启动子调控Cas9表达的表达框2×35S-Cas9。
2.权利要求1任一项所述Cas9 介导的香石竹基因编辑载体在香石竹基因功能研究或香石竹基因工程育种中的应用。
3.一种定向突变香石竹基因的方法，采用权利要求1所述的Cas9 介导的香石竹基因编辑载体，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1），构建Cas 9介导的香石竹基因编辑载体：
将AtU6启动子调控含靶序列的sgRNA表达的表达框和2×35S启动子调控Cas9表达的表达框通过T4连接酶连入PCAMBIA1301载体中，得到Cas 9表达载体；所述的Cas 9表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示；靶序列通过重叠PCR法插入AtU6-sgRNA表达框；
步骤（2），农杆菌转化香石竹：
采用冻融法将步骤（1）构建好的Cas9表达载体转化到农杆菌中，然后将含Cas9表达载体的农杆菌与相同体积的50 V/V %甘油水溶液混合均匀，得到含Cas9表达载体的农杆菌菌液，置于-80℃冰箱内保存；
步骤（3），香石竹外植体预培养：
取无菌的香石竹组培苗最顶端的1-3节叶片，将叶片的基部沿垂直于基部轴向切成2-5毫米的薄片，接种于预培养培养基中，22±2℃条件下光照培养3-4天，得到预培养的叶片；
所述的预培养培养基为MS+TDZ 0.1-0.5mg/L +NAA 0.1-0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂9-11g/L，pH为5.8；
步骤（4），农杆菌菌液培养：
将步骤（2）得到的含Cas9表达载体的农杆菌菌液20-50μL加入到添加卡那霉素和利福平的YEB液体培养基中，于28℃下，180-200 rmp振荡培养16-20小时，得到活化的农杆菌菌液；所述的活化的农杆菌菌液OD600值为0.5-0.8；所述的添加卡那霉素和利福平的YEB液体培养基是在YEB液体培养基中添加卡那霉素至终浓度为50-80mg/L，且同时添加利福平至终浓度为50-80mg/L；
步骤（5），香石竹遗传转化：
在摇床上，将步骤（3）预培养的叶片浸入步骤（4）得到的活化的农杆菌菌液中，以50-80rmp的速度振荡，20-30分钟后取出；将叶片放在灭过菌的滤纸上吸干多余的菌液，然后将叶片转入共培养的培养基中，在22±2℃条件下暗培养3-4天，再转入筛选培养基中，进行筛选培养，40-60天更换培养基一次，待分化出丛生的再生芽，将再生芽转入增殖培养基中进行增殖筛选培养，得到转基因再生植株；
所述的共培养的培养基为MS+TDZ 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+AS 20-30 mg/L，蔗糖30g/L，琼脂9-11g/L，pH为5.8；
所述的筛选培养基为MS+TDZ 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L+ Cef 300-400 mg/L+Hyg 6-10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂9-11g/L，pH为5.8；
所述的增殖培养基为MS+BA 0-0.1mg/L+NAA 0-0.1mg/L+ Hyg 6-10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂9-11g/L，pH为5.8；
步骤（6），香石竹阳性转基因再生植株的验证：
提取步骤（5）增殖筛选培养得到的转基因再生植株DNA，采用PCR法扩增Cas 9片断，能扩增出Cas 9片断的植株为阳性转基因再生植株；然后采用PCR法扩增阳性转基因再生植株含靶序列的DNA片断，测序法检测靶序列的编辑情况。
4.根据权利要求3所述的定向突变香石竹目标基因的方法，其特征在于：所述农杆菌选用根癌农杆菌C58。
5.根据权利要求3所述的定向突变香石竹目标基因的方法，其特征在于：步骤（1）的构建Cas 9介导的香石竹基因编辑载体的具体方法如下：
采用KpnI/SalI 双酶切含靶序列的AtU6-26SK质粒，SalI/EcoRI 双酶切35S-Cas9-SK质粒和KpnI/EcoRI 双酶切PCAMBIA1301质粒，并分别回收三种双酶切产物，采用T4连接酶在16℃下将三种的双酶切产物连接16小时，采用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过PCR法筛选阳性克隆，并进行测序验证，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示的Cas 9表达载体。
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