WO2016042267A1 - Procédé de production d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols chez un organisme eucaryote - Google Patents

Procédé de production d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols chez un organisme eucaryote Download PDF

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WO2016042267A1
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WO
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compound
cells
defensin
interest
sterol
Prior art date
Application number
PCT/FR2015/052485
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Inventor
Pierre BERTHOMIEU
Oriane MITH
Laurence MARQUES-BASTIDE
Véronique PERRIER
Eric Dubreucq
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Institut National De La Recherche Agronomique
Centre International D'etudes Superieures En Sciences Agronomiques
Universite De Montpellier
Centre National De La Recherche Scientifique
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
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    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound

Definitions

  • the present invention is in the field of controlling the expression of metabolic pathways in eukaryotic organisms. More particularly, it relates to a method for producing a compound of interest synthesized by a eukaryotic organism in the sterol biosynthetic pathway, or derived from a compound synthesized by a eukaryotic organism in this sterol biosynthesis pathway.
  • the present invention also relates to recombinant eukaryotic cells particularly adapted to the implementation of such a method, as well as the use of recombinant yeast cells for the production of a compound of interest of the sterol biosynthetic pathway or derived from a compound of the sterol biosynthetic pathway.
  • Organism metabolism engineering is a growing field of biotechnology.
  • the control of the metabolic pathways makes it possible in particular to produce or overproduce compounds of interest, to modulate the cellular characteristics, to increase the performance of processes using these organisms, etc.
  • the present invention aims to remedy the disadvantages of the activation methods of the sterol biosynthesis pathway proposed by the prior art, in particular to the disadvantages described above, by proposing an alternative method for the activation of this biosynthetic pathway in a eukaryotic organism, which is simple and inexpensive to implement, and which allows to overproduce, with a high yield, a compound of interest produced by this organism in the sterol biosynthetic pathway, or a compound of interest derived of a compound produced by this eukaryotic organism in the sterol biosynthetic pathway.
  • the expression "compound of interest derived from a compound produced by a eukaryotic organism in the sterol biosynthetic pathway” is intended to mean a compound obtained by biotransformation of said compound produced in the sterol biosynthesis pathway by an enzyme or a plurality of enzymes expressed by said eukaryotic organism, either natively or following modification (s) of said eukaryotic organism.
  • yeast it has notably been established by the present inventors that the cells expressing a plant defensin encoded by a gene of the Plant Defensin type 1 family, subjected to an excess of zinc in the cell culture medium, for example at a concentration of zinc in this culture medium of about 20 mM, accumulate a large amount of sterols.
  • the unsaponifiable fraction of lipids extractable with hexane, that is to say neutral lipids, is then composed of more than 80% of sterols.
  • Such an accumulation is notably associated with an activation of the ERG3, ERG25, ERG27, ERG8 and MVD1 genes, as well as the ERG1, ERG2, ERG9, ERG10, ERG13, ERG20, ERG24 and ERG26 genes of the yeast involved in the biosynthetic pathway.
  • ERG3, ERG25, ERG27, ERG8 and MVD1 genes as well as the ERG1, ERG2, ERG9, ERG10, ERG13, ERG20, ERG24 and ERG26 genes of the yeast involved in the biosynthetic pathway.
  • ergosterol as well as the UPC2 gene, which is an activator of this pathway.
  • the sterol biosynthesis pathway in yeast is in particular partially described in the publications of Burg et al., 201 1, and Shobayashi et al., 2005.
  • a method for producing a compound of interest of the sterol biosynthesis pathway in a eukaryotic organism that is to say a compound synthesized by this eukaryotic organism in the sterol biosynthesis pathway, or a compound derived from a compound of the sterol biosynthesis pathway in said eukaryotic organism, by activation of the sterol biosynthesis pathway in said eukaryotic organism.
  • This method comprises a step of in vitro culture of cells of this organism expressing a defensin, in particular modified to express or overexpress a defensin, in a culture medium adapted to their development and containing at least one element selected from transition metals, the lead and selenium.
  • This element is present in excess in the culture medium, that is to say, according to the present invention, at a concentration greater than or equal to the concentration of said element which is necessary to induce the overproduction of said compound of interest, in particular, said compound of the sterol biosynthesis pathway, by said cells.
  • overproduction is meant the production, by said cells, of an amount of said compound of interest, in particular of said sterol biosynthesis pathway compound, at least 2 times greater than the amount produced by said cells under conditions of identical culture, when the culture medium contains said element at the minimum concentration necessary for optimal growth of said cells.
  • the minimum concentration in the culture medium necessary for the optimal growth of the cells depends not only on the element itself, but also on the element.
  • the minimum concentration to be provided in the culture medium to meet the metabolic needs and ensure the optimal growth of the cells can be determined by the method known as "puise and shift", which is one of the methods the most effective proposed by the prior art.
  • the minimum concentration in a given element is determined during a culture conducted in chemostat.
  • the initial value of concentration tested is generally obtained by elemental analysis of the biomass studied. This method was initially described by Kuhn et al., 1979. By way of example, it has been described in the publication of Medaglia and Panke, 2010, the use of this method to optimize a culture medium of Staphylococcus galinarum.
  • the minimum zinc concentration of a commercial synthetic medium such as Yeast Nitrogen Base (DIFCO), necessary for the optimal growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae (for 10 g / L of glucose, ie a final biomass from 0.1 to 5 g / L according to the culture conditions) is 2.5 ⁇ .
  • the minimum concentration necessary for optimal cell growth may be zero, ie the culture medium must be lacking to ensure optimal growth, or even sometimes growth, cells. This is the case, for example, for the cadmium transition metal.
  • This concentration of said element allowing the triggering in eukaryotic cells of the metabolic response corresponding to the overexpression of the sterol biosynthesis pathway, in the presence of defensin may for example be determined by a method of analyzing the effect of different concentrations of said element: either on the expression of the genes involved in the sterol biosynthesis pathway by comparison of the transcriptome of cells cultured on the one hand on medium containing said element at the minimum concentration, and on the other hand on medium enriched in said element; either on increasing the concentration of sterols or metabolites stoichiometrically associated with the concentration of sterols, by comparing the composition of cells cultured firstly on a medium containing said element at the minimum concentration, and secondly on medium enriched in said element.
  • the determination may be made by the method of shift 'described above. It can also be carried out in a simpler way, for example by running in parallel batch cultures of the strain producing defensin in media containing increasing concentrations of said element, starting from the minimum concentration necessary for the optimal growth of the cells.
  • the culture medium used according to the invention also comprises the substances necessary for the growth of the cells and for the biosynthesis of the sterols.
  • This medium can be both liquid and solid.
  • the culture conditions, and in particular the culture temperature, are dependent on the particular eukaryotic organism considered, and their definition falls within the skill of those skilled in the art.
  • the transition metal present in the culture medium may in particular be zinc, cadmium, nickel, cobalt or copper.
  • It may otherwise be selected from scandium, titanium, vanadium, chromium, manganese, iron, yttrium, zirconium, niobium, molybdenum, technetium, ruthenium, rhodium, palladium silver, lanthanum, hafnium, tantalum, tungsten, rhenium, osmium, iridium, platinum, gold and mercury.
  • the transition metal present in the culture medium is chosen from the transition metals of column 10, column 11 or column 12 of the classification. periodic elements.
  • the culture medium may contain, as an element in excess, a single element selected from transition metals, lead and selenium, or a plurality of such elements.
  • Defensins are well known in themselves. These are small cationic proteins synthesized by invertebrates, vertebrates, plants and fungi that are involved in the innate immune defense system (Ganz et al., 1995, Boman, 1998). Several biological activities of defensins have been described in the literature, including antibacterial and antifungal activities (Ganz et al., 1995, Lay et al., 2005), as well as the ability of some defensins to confer zinc tolerance to plants and yeasts (Mirouze et al., 2006, Shahzad et al. , 2013).
  • Plant defensins are rich in cysteines and have a three-dimensional globular structure stabilized by four disulfide bridges. They share a characteristic motif, the CSa motif, which is composed of an ⁇ -helix and two or three antiparallel ⁇ sheets stabilized by three or four disulphide bridges, and / or a so-called gamma-core loop, characterized by a GXC- X3-9-C, which may be located between the second and third ⁇ sheets (Cornet et al., 1995, Lay et al., 2005, Van der Weerden et al., 2013a, 2013b, Munoz et al., 2014).
  • the eukaryotic cells subjected to the culturing step are modified to express or overexpress a defensin of plant origin.
  • the eukaryotic cells subjected to the culturing step are preferably modified to express or overexpress a defensin:
  • defensin AhPDF1 .1 b to Arabidopsis halleri of amino acid sequence SEQ ID No: 2 (accession numbers GenBank: HF545648 for the nucleotide sequence and CCN97877 for the protein sequence, Shahzad et al., 2013).
  • This defensin was originally named AhPDF1 .1 (Mirouze et al., 2006, GenBank accession numbers: AY961376 for the nucleotide sequence and AAY27736 for the protein sequence);
  • Defensin type 1 in particular with defensin AhPDF1 .1 b to Arabidopsis halleri of sequence SEQ ID No: 2.
  • the percentage of amino acid identity between two peptide sequences can be determined conventionally in itself, by comparing the optimally aligned sequences. Such optimal alignment can in particular be achieved by computer means adapted for this purpose, for example by means of the BLAST software.
  • the amino acid differences between the sequence tested and the reference sequence can consist of deletions, insertions and / or substitutions of one or more amino acids, consecutive or not.
  • defensins having a three-dimensional structure comprising a CSa type motif and / or a gamma-core loop and / or at least 30% amino acid identity with a defensin of plant origin encoded by a gene of the family of Plant Defensin type 1, and usable in the context of the invention, are:
  • defensin AhPDF1 .4 to Arabidopsis halleri of amino acid sequence SEQ ID No: 4 (GenBank accession number: CCN97876), and of nucleotide sequence SEQ ID No: 3 (GenBank accession number: HF545647) .
  • This defensin has a CScc type pattern and a gamma-core loop. It has 38% amino acid identity with AhPDFI .1b;
  • the plant defensin of the Medicago sativa plant (GenBank accession numbers: AY681971 for the nucleotide sequence and AAV85436 for the protein sequence).
  • This defensin has a CScc type motif and a gamma-core loop (Sagaram et al., 201 1). It has 29% amino acid identity with AhPDFI .1b in the mature protein.
  • the process according to the invention by a deregulation of the metabolism of the cells of the eukaryotic organism, more particularly of the sterol biosynthesis pathway, advantageously makes it possible to increase the rate of production by the cells of any compound of interest synthesized in the sterol biosynthesis pathway.
  • the expression of a defensin in the cell combined with the presence in excess in the culture medium of at least one element selected from transition metals, lead and selenium, activates the vast majority of the genes involved in the sterol biosynthesis pathway, leading to a greatly increased production, successively, of each of the intermediate compounds synthesized in this pathway, and leading to a very high accumulation of the final compound.
  • the element chosen from the transition metals, lead and selenium is present in the culture medium at a concentration greater than or equal to the concentration in this element which is necessary to induce the production, by the cells, of an amount of the compound of interest, in particular of said sterol biosynthesis pathway compound, at least 5-fold, preferably at least 10-fold, and for example at least 50-fold
  • the culture medium still contains the element at the minimum concentration necessary for optimum growth of the cells.
  • the eukaryotic organism is chosen from yeasts, fungi, algae and microalgae, plants and animals.
  • the cells of said organism subjected to the culture step in accordance with the present invention are modified so as to be able to produce such defensin.
  • the eukaryotic organism is of the type naturally producing a defensin, for example a plant organism
  • the cells of this organism subjected to the culture step according to the present invention may be modified so as to be able to overexpress a defensin.
  • This defensin may be the defensin they produce naturally or another defensin, including a particular defensin as defined above.
  • the cells of the eukaryotic organism are recombinant cells into which a nucleotide sequence coding for defensin to be expressed or overexpressed has been introduced.
  • a modification of the cells can be carried out by any method conventional in itself and known to those skilled in the art, for example by transformation of the strain with an appropriate expression vector comprising one or more genes coding for defensin or a of his precursors.
  • Each of these genes can be placed under control of both a constitutive promoter and an inducible promoter.
  • the cells may especially be yeast cells, for example Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris or Yarrowia lipolytica, genetically modified to express a plant defensin, in particular a defensin encoded by a gene of the family of PDF1, for example AhPDFI .1 b .
  • the concentration in the culture medium of the element chosen from the abovementioned list is at least 1 mM, preferably at least 5 mM, and preferably at least 10 mM. This concentration is in particular between 15 and 30 mM, for example about 20 mM. Such a concentration advantageously makes it possible to obtain the highest activation levels of the sterol biosynthesis pathway, in particular when the element contained in the culture medium is zinc and the culture medium is the medium usually used.
  • DIFCO Yeast Nitrogen B Base
  • the concentration in the culture medium of the element selected from the above list can be for example between 10 and 100 ⁇ .
  • the method comprises a prior step of in vitro culturing of the cells in a culture medium adapted to the development of cells and containing the aforementioned elements, that is to say the transition metals, selenium and lead, at their minimum concentrations necessary for cell growth.
  • This so-called pre-culture step can be carried out in the same culture medium as the culture step in the presence of an excess of at least one of said elements, or in a different medium.
  • the method according to the invention then advantageously makes it possible to decouple the production of biomass and the production of a compound of interest produced in the sterol biosynthesis pathway. It makes it possible to produce, in a preliminary step, a large quantity of biomass, then, in a second step, to trigger the activation of the sterol biosynthesis pathway, in particular by simply adding that a larger quantity of the element in the culture medium, so as to produce, in high quantities, the target compound of interest.
  • the process according to the invention is thus also expressed under the terms of a process for increasing the production rate, by a eukaryotic organism, of a compound of interest that can be synthesized by this organism in this biosynthetic pathway. or derived from such a compound.
  • the method according to the invention preferably comprises a subsequent step of collecting the cells of the eukaryotic organism having accumulated the compound of interest, and, where appropriate, of extracting the compound of interest.
  • the extraction of the compound of interest which has been produced in large quantities by the cells can be carried out according to any conventional technique in itself, starting from, in particular, depending on the given compound, a cell lysate or culture supernatant.
  • This extraction may comprise a purification step of the compound of interest produced, for example by crystallization or by a chromatography technique such as affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), etc.
  • the compound of interest is a final compound of the sterol biosynthetic pathway in the eukaryotic organism considered, in particular a sterol.
  • the organism is a yeast
  • the compound of interest may be ergosterol.
  • the compound of interest produced may be an intermediate of the sterol biosynthesis pathway.
  • the cells of the eukaryotic organism subjected to the culture step in the presence of said at least one element may then be recombinant cells which are modified according to the invention to inhibit an enzymatic activity involved in the biotransformation of this intermediate compound in the pathway.
  • sterol biosynthesis in particular to inhibit the expression of a gene coding for such an enzymatic activity.
  • Such a modification of the cells makes it possible to block the sterol biosynthesis pathway downstream of the intermediate compound of interest whose production is desired, in order to avoid the biotransformation of the latter and consequently to cause its accumulation in the cells. .
  • This modification can be carried out by any known method in the field of genetic engineering, in particular by mutagenesis.
  • the cells of the eukaryotic organism, expressing or overexpressing a defensin can be brought together in the culture medium with a reagent. having an effect of inhibiting an enzymatic activity involved in the biotransformation of said intermediate compound in the sterol biosynthetic pathway.
  • a reagent having an effect of inhibiting an enzymatic activity involved in the biotransformation of said intermediate compound in the sterol biosynthetic pathway.
  • Such an inhibitory effect can be applied at different levels in the sterol biosynthetic pathway, and is well documented in the prior art, for example in the publication by Burden et al., 1989. In most cases, the action of this type of inhibitor is exerted directly on the enzyme involved, without the expression of the corresponding gene being affected.
  • terbinafine is an inhibitor of squalene epoxidase, whose action causes the accumulation of squalene in yeasts such as S. cerevisiae, as described in particular in the publication of Nowosielski et al., 201 1.
  • the process according to the invention can be used to produce a large quantity of intermediate compounds of the sterol biosynthetic pathway of particular chemical and / or economic interest, for example: farnesyl- diphosphate (FPP), which gives access to isoprenoids and terpenes, including carotenoids; squalene, used for example as a medical adjuvant, as an antioxidant or in cosmetics; lanosterol, a component of lanolin, which can be used in cosmetics, in pharmacy or for the treatment of leather, for example.
  • FPP farnesyl- diphosphate
  • squalene used for example as a medical adjuvant, as an antioxidant or in cosmetics
  • lanosterol a component of lanolin, which can be used in cosmetics, in pharmacy or for the treatment of leather, for example.
  • the cells of the eukaryotic organism may, for example, be modified to inhibit the expression of a gene chosen from ERG1, associated with the enzymatic activity of biotransformation of squalene; NCP1, also associated with enzymatic activity of biotransformation of squalene; ERG1 1, associated with the enzymatic activity of lanosterol biotransformation ERG9, associated with the enzymatic activity of biotransformation of FPP, in the sterol biosynthesis pathway; ERG2, associated with the enzymatic activity of biotransformation of fecosterol; or else ERG3, associated with the enzymatic activity of biotransformation of epistérol.
  • ERG1 associated with the enzymatic activity of biotransformation of squalene
  • NCP1 also associated with enzymatic activity of biotransformation of squalene
  • ERG1 associated with the enzymatic activity of lanosterol biotransformation
  • ERG9 associated with the enzymatic activity of biotransformation of F
  • Eukaryotic strains in particular yeasts, modified to inhibit an enzymatic activity involved in the biotransformation of an intermediate compound of the sterol biosynthesis pathway, into another compound of the sterol biosynthesis pathway, have been developed by genetic engineering and described by the prior art.
  • an ERG2 mutant and an ERG3 mutant allowing the accumulation of fecosterol and epistérol respectively, are available from the EUROSCARF Resource Center (Frankfurt), under accession numbers Y00788 and Y02667, respectively.
  • the compound of interest is a compound derived from a compound of the sterol biosynthesis pathway, for example derived from a final compound of this pathway, or derived from an intermediate compound thereof. way.
  • the cells of the eukaryotic organism subjected to the culturing step in the presence of said at least one element are then recombinant cells which are modified to activate at least one or even more enzymatic activity (s) involved in the biotransformation of said compound of the pathway. sterol biosynthesis in said compound of interest.
  • the activation of such an enzymatic activity may in particular be carried out by modifying the cells by introducing a nucleotide sequence coding for an enzyme exhibiting said enzymatic activity, so as to cause the expression of this enzyme in the cells. Otherwise, it can be performed by modifying the cells to cause overexpression of an enzyme naturally produced in the cells and exhibiting said enzymatic activity.
  • said eukaryotic cells may be modified on the one hand to activate said enzymatic activity (s) involved in the biotransformation of said compound of the sterol biosynthesis pathway into said compound of interest, and secondly modified to inhibit an enzymatic activity involved in the biotransformation of said intermediate compound in the sterol biosynthesis pathway, in particular to inhibit the expression of a gene coding for such enzymatic activity, as described above.
  • the cells of the eukaryotic organism subjected to the culture step in the presence of an excess of said at least one element may be recombinant yeast cells modified to activate: a C-methyltransferase activity, so as to allow the overproduction by said cells, from ergosterol, of 24-ethyl-sterol and 24-ethylidene-sterol, as described in Husselstein et al., 1996;
  • the cells of the eukaryotic organism subjected to the culture step in the presence of an excess of said at least one element may be recombinant yeast cells modified to on the one hand inhibit an A22-desaturase activity and on the other hand to activate A7-reductase and adrenodoxin reductase activities, so as to allow to overproduce, in the presence of defensin and an excess of the element in the culture medium, pregnenolone, or if appropriate of progesterone by simultaneous activation of a ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase / isomerase activity.
  • yeast cells thus modified, but not yet expressing defensin are described in the publication by Duport et al., 1998.
  • the process according to the invention may otherwise be used to modify the composition of an oil extractable from a eukaryotic organism by increasing or decreasing the proportion of a particular compound of interest in that oil. It II is then advantageously applied in the field of edible or industrial oils, or in that of biofuels, which it allows in particular to enrich in a given compound.
  • Another aspect of the invention is the combined use of eukaryotic cells modified to express or overexpress a defensin, in particular a defensin as described above, and the presence in the culture medium of these cells, in excess, of an element selected from transition metals, for example zinc, cadmium, nickel, cobalt and copper, selenium and lead, for the production of a compound of interest in the sterol biosynthetic pathway in said eukaryotic cells, or derived from a compound of this biosynthetic pathway.
  • transition metals for example zinc, cadmium, nickel, cobalt and copper, selenium and lead
  • Such use is aimed in particular at ergosterol production, with a production yield advantageously high.
  • the culture conditions may meet one or more of the features described above.
  • the invention relates to the use of a recombinant yeast strain expressing defensin for the production, with increased yield, of a compound of interest of the sterol biosynthetic pathway or derived from a compound of the sterol biosynthesis pathway in yeast.
  • cells of this recombinant yeast strain are subjected to an in vitro culture step, in a culture medium adapted to the development of said cells and containing at least one element chosen from transition metals, for example zinc, cadmium, nickel, cobalt and copper, lead and selenium, at a concentration greater than or equal to the concentration of said element which is necessary to induce the overproduction of said compound of interest, in particular said compound of the route of sterol biosynthesis by said cells.
  • overproduction is meant the production, by said cells, of an amount of said compound of interest, in particular of said sterol biosynthesis pathway compound, at least 2 times greater than the amount produced by said cells under conditions identical cultures, with the only difference that the culture medium contains said element at the minimum concentration necessary for optimal growth of said cells.
  • Defensin can in particular be a defensin:
  • the culture conditions of the cells may in particular meet one or more of the characteristics described above.
  • Another subject of the present invention is a recombinant eukaryotic cell modified to express or overexpress a defensin, in particular a defensin as described above, and modified to inhibit an enzymatic activity involved in the biotransformation of an intermediate compound of the pathway. sterol biosynthesis in this cell, in particular to inhibit the expression of a gene coding for such enzymatic activity.
  • this eukaryotic cell may be modified to inhibit the expression of a gene selected from ERG1, NCP1, ERG2, ERG3, ERG1 1 and ERG9.
  • Such inhibition can be carried out by any conventional method in itself for the skilled person.
  • it can be carried out by genetic engineering techniques, by establishing so-called "knock-out" mutants by insertion of a recombinant DNA into the gene concerned, or by genetic mutagenesis.
  • This eukaryotic cell may be further modified to activate an enzymatic activity involved in the conversion of this intermediate compound into a compound of interest.
  • the present invention relates to a recombinant eukaryotic cell modified to express or overexpress a defensin, in particular a defensin as described above, and modified to activate an enzymatic activity involved in the transformation of a compound, especially a final compound, from the sterol biosynthetic pathway, into a compound of interest distinct from this pathway.
  • Such cells according to the invention may in particular be yeast cells, in particular of the species Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris or Yarrowia lipolytica, expressing a plant defensin, in particular of the type encoded by a gene of the PDF1 family, for example the Defensine AhPDFI .1 b.
  • FIG. 1 shows the superposition of the structures obtained by molecular modeling, respectively of the defensin AhPDF1.1b and of the reference radish defensin RsAFPI;
  • FIG. 2 represents the map of the empty vector pYX212
  • FIG. 3 shows a plate obtained by thin layer chromatography (TLC) for the fractions respectively of unsaponifiable neutral lipids (lanes 1 to 4) and of other unsaponifiable lipids (lanes 5 to 8) extracted from the cells after culture of the strain.
  • TLC thin layer chromatography
  • FIG. 4 shows a chromatogram obtained by gas chromatography for the product obtained by preparative TLC from the fraction of unsaponifiable neutral lipids extracted from the cells after culture of the Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 expressing the plant defensin AhPDFI .1 b, in the presence of 20 mM zinc in the culture medium;
  • FIG. 5 shows the mass spectra obtained for (A) the peak at the retention time of 15.34 min of the chromatogram of FIG. 4, (B) pure ergosterol; and FIG. 6 illustrates the projection on the ergosterol biosynthesis pathway in yeast, of the results of the differential expression of the genes involved in this biosynthetic pathway between the two following conditions: recombinant yeast expressing the defensin AhPDFI.
  • a strain of Saccharomyces cerevisiae was modified to express the plant defensin of Arabidopsis halleri AhPDFI .1b, and then cultured in the presence of excess zinc, according to the present invention, as follows.
  • Defensin AhPDFI .1 b'Arabidopsis halleri (GenBank accession number: HF545648, nucleotide sequence SEQ ID No: 1, amino acid sequence SEQ ID No: 2) was first subjected to a Molecular modeling study (Swiss Model, Geno3D or PyMol), and its structure was superimposed on that of radish defensin RsAFPI (amino acid sequence: accession number GenBank AAA69541, nucleotide sequence: accession number GenBank U18557 ), which has been widely described in the literature (Terras et al., 1995) that it has a CScc pattern structure and gamma-core loop.
  • the representation obtained is shown in FIG. There is a perfect superposition of the two defensins, demonstrating that the defensin AhPDFI .1 b Orabidopsis halleri has a CScc pattern structure and gamma-core loop.
  • the coding sequence of the defensin AhPDFI.1 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vector pYX212 (sold by the company Ingenenius), whose map is shown in FIG. 2, at the sites of EcoRI and Xhol restriction.
  • the coding sequence is under the control of the constitutive promoter of the yeast triose phosphate isomerase (TPI) and upstream of the yeast heat shock protein HSF1 (YGL073w) terminator.
  • TPI yeast triose phosphate isomerase
  • HSF1 yeast heat shock protein
  • the recombinant plasmid obtained, as well as the empty plasmid pFL38H carrying the HIS3 gene conferring histidine auxotrophy, described in the publication by Talke et al., 2006, were introduced into the yeast strain BY4741 (Mat a, his3A1 , leu2A0, met15A0, ura3A0) using the PEG and lithium chloride transformation method (Gietz & Woods, 2002).
  • a transformation of strain BY4741 was carried out in parallel with the empty plasmids pYX212 and pFL38H and serves as a negative control.
  • the recombinant strains were cultured at 30 ° C. at a density of about 50 CFU / cm 2 on a solid medium (1.43 g / l Yeast Nitrogen Base without amino acids or ammonium (Ref 233520, Difco), 20 g / ml).
  • the neutral lipids were extracted with hexane and the remaining lipids (polar) were extracted with a mixture of chloroform / methanol (2V / 1 V) according to the protocol described by Lomascolo et al., 1994. Each of the lipid fractions was then saponified according to the AFNOR NFT 60-205 standard and samples of the unsaponifiable fractions containing between 50 and 100 ⁇ g of lipids were taken.
  • TLC silica gel plate Ref 60 F 254 from E. MERCK KGaA.
  • different quantities (respectively 5, 10, 25 and 50 ⁇ 9) of pure ergosterol (Ref 45480, Sigma) were deposited in parallel.
  • the migration was carried out in a hexane: ether: formic acid buffer in the proportions 70: 30: 1.
  • the plate was air dried and then sprayed uniformly with a 50:50 solution of pure orthophosphoric acid and saturated copper sulfate. After drying, the plate was heated at 180 ° C for 8 to 10 min.
  • the amounts of sterols were determined by comparison with the samples constituting the calibration range, using a densitometer (model CAMAG TLC Scanner 3 "Scanner 3_160813” S / N 160813 (1.14.28), E. Merck KGaA ) which analyzes the plate at the wavelength of 325 nm.
  • Ergosterol is largely in this fraction. It can be established that it represents more than 80%. Confirmation that this particular compound is indeed ergosterol was established by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis, as follows.
  • GC-MS gas chromatography-mass spectrometry
  • Preparative TLC was performed from 100 ⁇ of the unsaponifiable neutral lipid fraction obtained for the culture condition expressing the plant defensin AhPDF1 .1 b, in the presence of 20 mM of zinc in the culture medium. After migration, the plaque was scraped at the spot identified as ergosterol. The product was extracted from the silica with chloroform. After filtration to completely remove the silica particles, the chloroform was evaporated and the extract was redissolved in hexane before being injected into gas chromatography coupled with a mass spectrometer.
  • the chromatogram obtained is shown in FIG. 4 (total ion abundance over the m / z 50-450 range). A predominantly elongated peak is observed after 15.34 min, which corresponds to the expected retention time for ergosterol.
  • the mass spectrum determined for this peak unambiguously indicates that it is ergosterol, as shown in FIG. 5, on which a coincidence of the mass spectra (A) of the peak at 15.34 is observed. min and (B) pure ergosterol.
  • RNA was then extracted using the TRIzol® method described in the publication by Chomczynski and Sacchi, 1987. Briefly, the cells were ground by intense shaking in the presence of 0.3 mm glass beads in Trizol at 4 ° C for 15 min. Chloroform was added at 1/5 volume. After centrifugation for 15 min at 9000 x g, the supernatant was recovered and isopropanol was added at 50% of the supernatant volume. After 10 min of incubation at -20 ° C. and then 10 min of centrifugation at 9000 ⁇ g, the pellet was recovered and rinsed twice with 75% ethanol and then taken up in 150 ⁇ l of water.
  • RNA 100 ⁇ g of total RNA was then purified using the RNeasy kit (Qiagen). DNA was removed using a DNAse directly on the kit column. The RNA was eluted in 30 ⁇ l of water.
  • RNA 100 ng of purified RNA was labeled with cyanin3-dCTP using the Agilent Technologies' Quick Amp Labeling One-color Kit.
  • the labeled RNAs were hybridized on an Agilent Standard Yeast V2 g-Gene Expression Microarray (Agilent technologies) 8-15 karray yeast DNA chip for 17 h at 65 ° C. After rinsing, the slides were read on a GenePix® 4000B scanner.
  • EXAMPLE 2 - Defensin AhPDFI .4 and Excess Zinc A strain of Saccharomyces cerevisiae was modified to express the plant defensin of Arabidopsis halleri AhPDFI .4 (nucleotide sequence SEQ ID NO: 3, amino acid sequence SEQ ID NO: 4 this defensin has a CSa type motif and a gamma-core loop, and has 38% amino acid identity with AhPDFI .1 b), then grown in the presence of an excess of zinc (20 mM), according to the present invention, following the same protocol as that described in Example 1 above.
  • the strains thus modified were cultured in the presence of an excess of zinc (20 mM), according to the present invention, according to the same protocol as that described in Example 1 above.
  • the culture, in the same culture medium containing an excess of zinc (20 mM), of a strain of Saccharomyces cerevisiae modified to express defensin AhPDFI .1 b was also performed.
  • the lyophilized samples were subjected to a saponification step before extraction and analysis. For this, a few tens of mg of sample were added with 400 ⁇ l of a methanolic solution of 10% (w / v) KOH, 0.2 ml of 0.1 mm diameter microbeads and 6 mg of 7-Dihydrocholesterol (7-DHC) used as an internal standard. The mixture was then incubated at 85 ° C for 2 hours with stirring. After cooling to room temperature, 300 ⁇ l of water was added. The samples were extracted three times with 700 ⁇ l of hexane. Hexanic phases containing unsaponifiable lipids were pooled and dried and then taken up in 200 ⁇ l of chloroform.
  • a Shimatzu GC 2010 Plus gas chromatograph equipped with an automatic injector, a Zebron® ZB-5HT Inferno® capillary column and a flame ionization detector, was used to determine ergosterol, a reference a commercial ergosterol calibration range (Sigma, purity> 95%) and an internal standard (7-DHC).
  • the injected volume was 0.2 ⁇ with a division ratio of 1/25.
  • the temperature of the injector and detector was 310 ° C. That of the oven was varied from 270 ° C to 310 ° C in 10 min, then maintained for 10 min at 310 ° C.
  • the yields of ergosterol production by yeasts expressed in ⁇ 9 per g of yeast dry weight (g / gMS), were determined for each of the culture conditions. The results are shown in Table 4 below.
  • the yeasts which express the defensins TaDEF and MsDEF exhibit an increase in ergosterol content by a factor greater than 3 and greater than 5 respectively, compared to yeasts that do not express defensin.
  • TaDEF and MsDEF defensins also allow, like AhPDFI .1b, the overproduction of ergosterol by the yeasts.
  • EXAMPLE 4 - Defensin AhPDFI .1b and Excess Cadmium A strain of Saccharomyces cerevisiae was modified to express the plant defensin of Arabidopsis thaliana AhPDFI. b, then cultured in the presence of an excess of cadmium (10 or 20 ⁇ ) according to the same protocol as that described in Example 1 above.
  • the defensin AhPDFI .1 b is thus capable of inducing an increase in ergosterol production when an excess of cadmium is introduced into the medium.
  • ERG2 mutant (genotype BY4741, Mat3 his1A1, leu2A0, met15A0, ura3A0, YMR202w :: kanMX4), available from the EUROSCARF resource center (http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/ about.html), accession number Y00788.
  • ERG3 gene BY4741, MATA, his3A1, leu2A0, met15A0, ura3A0, YLR056w :: kanMX4
  • EUROSCARF resource center http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/ about.html
  • mutant NCP1 mutant W303-1 B, MATalpha, Ieu2-3.1 12 trp1 -1 can1 -100 ura3-1 ade2-1 his3-1 1, YHR042w :: TRP1.
  • mutant NCP1 mutant W303-1 B, MATalpha, Ieu2-3.1 12 trp1 -1 can1 -100 ura3-1 ade2-1 his3-1 1, YHR042w :: TRP1.
  • the sterol biosynthesis pathway is blocked to allow the accumulation of squalene, by inhibition of the enzymatic activity associated with the NCP1 gene.
  • Each of these mutants was modified to express the plant defensin of Arabidopsis /?
  • the coding sequence of the defensin AhPDFI .1b was introduced into one or other of the plasmids proAct1 in108Kan and BNRr-108-3'-5'-HSP-CaMV, under the control respectively of the constitutive promoters of actin of rice and inducible from a soybean Heat Shock Protein (HSP).
  • HSP soybean Heat Shock Protein
  • the plasmids were integrated into the genomic loci 108 of the Physcomitrella patens moss by genetic transformation, as described in Schaefer and Zryd, 1997.
  • the clones were selected in the presence of kanamycin in the medium (selection marker).
  • the clones are cultured on the culture medium named PPNH 4 , enriched with 4 mM zinc: Ca (N0 3 ) 2 3.3 mM, MgSO 4 1 m M, FeS0 4 0.5 m M, KP0 4 pH 7 0.2 mM, 0.3 mM ammonium tartrate, H 3 B0 3 10 ⁇ M, MnCl 2 15 ⁇ M, CuSO 4 0.2 ⁇ M, ZnSO 4 2 ⁇ , Kl 0.2 ⁇ , CoCl 2 0.2 ⁇ , Na 2 MoO 4 0.1 ⁇ , agar 7 g / L.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de production d'un composé d'intérêt de la voie de biosynthèse des stérols chez un organisme eucaryote ou dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols chez cet organisme eucaryote, en particulier d'un stérol. Ce procédé comporte une étape de culture in vitro de cellules dudit organisme eucaryote modifiées pour exprimer ou surexprimer une défensine, dans un milieu de culture adapté au développement de ces cellules et contenant au moins un élément choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, à une concentration supérieure ou égale à la concentration en ledit élément qui est nécessaire pour induire la surproduction dudit composé d'intérêt par lesdites cellules.

Description

PROCÉDÉ DE PRODUCTION D'UN COMPOSÉ DE LA VOIE DE
BIOSYNTHÈSE DES STÉROLS CHEZ UN ORGANISME EUCARYOTE
La présente invention s'inscrit dans le domaine du contrôle de l'expression des voies métaboliques chez les organismes eucaryotes. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de production d'un composé d'intérêt synthétisé par un organisme eucaryote dans la voie de biosynthèse des stérols, ou dérivé d'un composé synthétisé par un organisme eucaryote dans cette voie de biosynthèse des stérols. La présente invention concerne également des cellules eucaryotes recombinantes particulièrement adaptées à la mise en œuvre d'un tel procédé, ainsi que l'utilisation de cellules de levures recombinantes pour la production d'un composé d'intérêt de la voie de biosynthèse des stérols ou dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols.
L'ingénierie du métabolisme des organismes constitue un domaine des biotechnologies en développement croissant. Le contrôle des voies métaboliques permet en effet notamment de produire ou surproduire des composés d'intérêt, de moduler les caractéristiques cellulaires, d'augmenter les performances de procédés mettant en œuvre ces organismes, etc.
En particulier, de nombreux travaux ont été menés pour accroître le rendement de la voie de biosynthèse des stérols dans différents types d'organismes, notamment chez les levures, par diverses stratégies telles que la surexpression de gènes impliqués dans cette voie de biosynthèse et/ou l'optimisation des conditions de fermentation. De tels travaux sont notamment décrits dans la publication de Wriessnegger et al., 2013. Un objectif majeur de tels travaux est l'accroissement du rendement de production par les levures d'un stérol particulier, l'ergostérol, qui s'avère être un produit économiquement important, notamment car il constitue un précurseur de la vitamine D2 et de la cortisone.
Les procédés proposés par l'art antérieur aux fins d'augmenter le rendement de production des stérols par les levures, ou par d'autres organismes, présentent cependant des inconvénients, notamment une complexité de mise en œuvre, un coût élevé, un niveau de pureté insuffisant du composé cible produit et/ou un niveau de production insuffisant de ce composé cible. La présente invention vise à remédier aux inconvénients des procédés d'activation de la voie de biosynthèse des stérols proposés par l'art antérieur, notamment aux inconvénients exposés ci-avant, en proposant un procédé alternatif pour l'activation de cette voie de biosynthèse chez un organisme eucaryote, qui soit simple et peu coûteux à mettre en œuvre, et qui permette de surproduire, avec un rendement élevé, un composé d'intérêt produit par cet organisme dans la voie de biosynthèse des stérols, ou un composé d'intérêt dérivé d'un composé produit par cet organisme eucaryote dans la voie de biosynthèse des stérols.
On entend dans la présente description, par composé d'intérêt dérivé d'un composé produit par un organisme eucaryote dans la voie de biosynthèse des stérols, un composé obtenu par biotransformation dudit composé produit dans la voie de biosynthèse des stérols par une enzyme ou une pluralité d'enzymes exprimée(s) par ledit organisme eucaryote, que ce soit de manière native ou suite à modification(s) dudit organisme eucaryote. A l'origine de l'invention, il a été découvert par les présents inventeurs dans le cadre d'un projet à visée toute autre, que, de manière tout à fait surprenante, la culture de cellules eucaryotes, en particulier de levures, génétiquement modifiées pour exprimer, ou surexprimer, une défensine, notamment une défensine d'origine végétale, en présence d'un excès de certains éléments dans le milieu de culture, conduit à une modification importante du métabolisme cellulaire, résultant notamment en la surproduction de lipides et plus particulièrement de stérols. Les présents inventeurs ont ainsi découvert que de telles conditions de culture cellulaire induisent l'expression de la grande majorité des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des stérols. Chez la levure, il a notamment été établi par les présents inventeurs que les cellules exprimant une défensine végétale codée par un gène de la famille des Plant Defensin type 1 , soumises à un excès de zinc dans le milieu de culture cellulaire, par exemple à une concentration de zinc dans ce milieu de culture d'environ 20 mM, accumulent une quantité importante de stérols. La fraction insaponifiable des lipides extractibles à l'hexane, c'est-à-dire des lipides neutres, est alors constituée à plus de 80 % de stérols. Une telle accumulation est notamment associée à une activation des gènes ERG3, ERG25, ERG27, ERG8 et MVD1 , ainsi que des gènes ERG1 , ERG2, ERG9, ERG10, ERG13, ERG20, ERG24 et ERG26 de la levure impliqués dans la voie de biosynthèse de l'ergostérol, de même que du gène UPC2, qui est un activateur de cette voie. La voie de biosynthèse des stérols chez la levure est notamment partiellement décrite dans les publications de Burg et al., 201 1 , et Shobayashi et al., 2005.
Ainsi, il est proposé selon la présente invention un procédé de production d'un composé d'intérêt de la voie de biosynthèse des stérols chez un organisme eucaryote, c'est-à-dire d'un composé synthétisé par cet organisme eucaryote dans la voie de biosynthèse des stérols, ou d'un composé dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols chez ledit organisme eucaryote, par activation de la voie de biosynthèse des stérols chez ledit organisme eucaryote. Ce procédé comporte une étape de culture in vitro de cellules de cet organisme exprimant une défensine, notamment modifiées pour exprimer ou surexprimer une défensine, dans un milieu de culture adapté à leur développement et contenant au moins un élément choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium. Cet élément est présent en excès dans le milieu de culture, c'est-à-dire, selon la présente invention, à une concentration supérieure ou égale à la concentration en ledit élément qui est nécessaire pour induire la surproduction dudit composé d'intérêt, en particulier dudit composé de la voie de biosynthèse des stérols, par lesdites cellules. On entend, par surproduction, la production, par lesdites cellules, d'une quantité dudit composé d'intérêt, en particulier dudit composé de la voie de biosynthèse des stérols, au moins 2 fois supérieure à la quantité produite par lesdites cellules dans des conditions de culture identiques, lorsque le milieu de culture contient ledit élément à la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale desdites cellules.
Pour chaque élément considéré, choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, la concentration minimale dans le milieu de culture nécessaire à la croissance optimale des cellules dépend non seulement de l'élément en lui-même, mais également de l'organisme eucaryote considéré, ainsi que de la composition générale du milieu de culture et, plus généralement, des conditions de culture. Il est du ressort de l'homme du métier, pour chaque situation donnée, de déterminer quelle est cette concentration minimale, à partir de ses connaissances générales. Il peut notamment à cet effet mettre en œuvre l'une des méthodes développées par l'art antérieur pour l'optimisation de la composition des milieux de culture.
Par exemple, pour chaque élément considéré, la concentration minimale à apporter dans le milieu de culture pour répondre aux besoins métaboliques et assurer la croissance optimale des cellules peut être déterminée par la méthode dite « puise and shift », qui est l'une des méthodes les plus efficaces proposées par l'art antérieur. Selon cette méthode, la concentration minimale en un élément donné est déterminée lors d'une culture menée en chémostat. La valeur initiale de concentration testée est généralement obtenue par analyse élémentaire de la biomasse étudiée. Cette méthode a été initialement décrite par Kuhn et al., 1979. A titre d'exemple, il a été décrit dans la publication de Medaglia et Panke, 2010, l'utilisation de cette méthode pour optimiser un milieu de culture de Staphylococcus galinarum.
A titre d'illustrations, la concentration minimale en zinc d'un milieu synthétique commercial tel que le Yeast Nitrogen Base (DIFCO), nécessaire à la croissance optimale de la levure Saccharomyces cerevisiae (pour 10 g/L de glucose, soit une biomasse finale de 0,1 à 5 g/L selon les conditions de culture) est de 2,5 μΜ.
Pour certains des éléments parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale des cellules peut être nulle, c'est-à-dire que le milieu de culture doit en être dépourvu pour assurer la croissance optimale, ou même parfois la croissance tout court, des cellules. C'est le cas par exemple pour le métal de transition cadmium.
Il entre également dans les compétences de l'homme du métier de déterminer, pour chaque élément considéré, choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, la concentration en ledit élément nécessaire pour permettre de déclencher la surproduction du composé d'intérêt, en particulier dudit composé de la voie de biosynthèse des stérols, par les cellules eucaryotes, exprimant la défensine, c'est-à-dire, selon l'invention, pour permettre que la quantité du composé d'intérêt, en particulier dudit composé de la voie de biosynthèse des stérols, produite par les cellules soit au moins 2 fois supérieure à la quantité de ce composé produite par les mêmes cellules dans des conditions de culture identiques, à la différence près que le milieu de culture contient l'élément considéré à la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale des cellules. Par conditions de culture, on entend la quantité de biomasse en culture, la composition du milieu de culture, la durée et la température de l'étape de culture, etc.
Cette concentration en ledit élément permettant le déclenchement chez les cellules eucaryotes de la réponse métabolique correspondant à la surexpression de la voie de biosynthèse des stérols, en présence de défensine, peut par exemple être déterminée par une méthode d'analyse de l'effet de différentes concentrations en ledit élément : soit sur l'expression des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des stérols par comparaison du transcriptome de cellules cultivées d'une part sur milieu contenant ledit élément à la concentration minimale, et d'autre part sur milieu enrichi en ledit élément ; soit sur l'augmentation de la concentration en stérols ou en métabolites associés de façon stœchiométrique à la concentration en stérols, par comparaison de la composition de cellules cultivées d'une part sur milieu contenant ledit élément à la concentration minimale, et d'autre part sur milieu enrichi en ledit élément.
La détermination peut être effectuée par la méthode des « puise and shift » décrite ci-avant. Elle peut également être réalisée de manière plus simple, par exemple en conduisant en parallèle des cultures batch de la souche produisant la défensine dans des milieux contenant des concentrations croissantes en ledit élément, à partir de la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale des cellules.
Le milieu de culture mis en œuvre selon l'invention comporte en outre les substances nécessaires à la croissance des cellules et à la biosynthèse des stérols. Ce milieu peut aussi bien être liquide que solide. Les conditions de culture, et notamment la température de culture, sont dépendantes de l'organisme eucaryote particulier considéré, et leur définition entre dans les compétences de l'homme du métier.
Le métal de transition présent dans le milieu de culture peut notamment être le zinc, le cadmium, le nickel, le cobalt ou le cuivre.
Il peut autrement être choisi parmi le scandium, le titane, le vanadium, le chrome, le manganèse, le fer, l'yttrium, le zirconium, le niobium, le molybdène, le technétium, le ruthénium, le rhodium, le palladium, l'argent, le lanthane, l'hafnium, le tantale, le tungstène, le rhénium, l'osmium, l'iridium, le platine, l'or et le mercure.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers du procédé selon l'invention, le métal de transition présent dans le milieu de culture est choisi parmi les métaux de transition de la colonne 10, de la colonne 1 1 ou de la colonne 12 de la classification périodique des éléments.
Le milieu de culture peut contenir, en tant qu'élément en excès, un seul élément choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, ou une pluralité de tels éléments.
Les défensines sont bien connues en elles-mêmes. Ce sont de petites protéines cationiques synthétisées par les invertébrés, les vertébrés, les plantes et les champignons, qui sont impliquées dans le système de défense immunitaire innée (Ganz et al., 1995 ; Boman, 1998). Plusieurs activités biologiques des défensines ont été décrites dans la littérature, notamment des activités antibactériennes et antifongiques (Ganz et al., 1995 ; Lay et al., 2005), ainsi que la capacité de certaines défensines à conférer la tolérance au zinc aux plantes et aux levures (Mirouze et al., 2006 ; Shahzad et al., 2013).
Les défensines végétales, en particulier, sont riches en cystéines et présentent une structure tridimensionnelle globulaire stabilisée par quatre ponts disulfure. Elles partagent un motif caractéristique, le motif CSa , qui est composé d'une hélice a et de deux ou trois feuillets β antiparallèles stabilisés par trois ou quatre ponts disulfure, et/ou une boucle dite gamma-core, caractérisée par un motif GXC-X3-9-C, pouvant être située entre les deuxième et troisième feuillets β (Cornet et al., 1995 ; Lay et al., 2005 ; Van der Weerden et al., 2013a, 2013b ; Munoz et al., 2014).
Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, les cellules eucaryotes soumises à l'étape de culture sont modifiées pour exprimer ou surexprimer une défensine d'origine végétale. Selon la présente invention, les cellules eucaryotes soumises à l'étape de culture sont de préférence modifiées pour exprimer ou surexprimer une défensine :
- d'origine végétale codée par un gène de la famille des Plant Defensin type 1 (PDF1 ), par exemple la défensine AhPDF1 .1 b à' Arabidopsis halleri, de séquence d'acides aminés SEQ ID No:2 (numéros d'accession GenBank : HF545648 pour la séquence nucléotidique et CCN97877 pour la séquence protéique ; Shahzad et al., 2013). Cette défensine avait été initialement nommée AhPDF1 .1 (Mirouze et al., 2006 ; numéros d'accession GenBank : AY961376 pour la séquence nucléotidique et AAY27736 pour la séquence protéique) ;
- et/ou présentant une structure tridimensionnelle comportant un motif de type CScc et/ou une boucle gamma-core, d'origine végétale ou autre. L'homme du métier saura aisément identifier, parmi les défensines existantes, celles qui présentent un tel motif de type CScc et/ou une telle boucle gamma- core, à partir des données publiées dans la littérature, ou par comparaison, par modélisation moléculaire, par exemple avec le logiciel PyMol, de leur structure avec la structure de la défensine de radis RsAFPI (numéro d'accession PDB : 1 AYJ) décrite dans les publications précitées ;
- et/ou présentant au moins 30 % d'identité en amino acides avec une défensine d'origine végétale codée par un gène de la famille des Plant
Defensin type 1 , en particulier avec la défensine AhPDF1 .1 b à'Arabidopsis halleri de séquence SEQ ID No:2.
Le pourcentage d'identité en amino acides entre deux séquences peptidiques peut être déterminé de manière classique en elle-même, en comparant les séquences alignées de manière optimale. Un tel alignement optimal peut notamment être réalisé par des moyens informatiques adaptés à cet effet, par exemple au moyen du logiciel BLAST. Les différences en acides aminés entre la séquence testée et la séquence de référence (défensine d'origine végétale codée par un gène de la famille des Plant Defensin type 1 , par exemple AhPDF1 .1 b) peuvent consister en des délétions, insertions et/ou substitutions d'un ou plusieurs acides aminés, consécutifs ou non.
A titre d'exemples, des défensines présentant une structure tridimensionnelle comportant un motif de type CSa et/ou une boucle gamma- core et/ou au moins 30 % d'identité en amino acides avec une défensine d'origine végétale codée par un gène de la famille des Plant Defensin type 1 , et utilisables dans le cadre de l'invention, sont :
- la défensine AhPDF1 .4 à'Arabidopsis halleri, de séquence d'acides aminés SEQ ID No:4 (numéro d'accession GenBank : CCN97876), et de séquence nucléotidique SEQ ID No:3 (numéro d'accession GenBank : HF545647). Cette défensine possède un motif de type CScc et une boucle gamma-core. Elle présente 38 % d'identité en amino acides avec AhPDFI .1 b ;
- la défensine de drosophile (drosomycine, numéro d'accession GenBank : CAA53267). Cette défensine possède un motif de type CScc et une boucle gamma-core ; - la défensine d'huître (numéro d'accession GenBank : ACQ76274). Cette défensine possède un motif de type CSa et une boucle gamma-core ;
- la défensine végétale du blé tendre Triticum aestivum TaDEF (numéros d'accession GenBank : AB089942 pour la séquence nucléotidique et BAC10287 pour la séquence protéique). Cette défensine possède un motif de type CScc et une boucle gamma-core (VanderWeerden et al., 2013a). Elle présente 33 % d'identité en amino acides avec AhPDF1 .1 b dans la protéine mature ;
- la défensine végétale de la plante Medicago sativa (numéros d'accession GenBank : AY681971 pour la séquence nucléotidique et AAV85436 pour la séquence protéique). Cette défensine possède un motif de type CScc et une boucle gamma-core (Sagaram et al., 201 1 ). Elle présente 29 % d'identité en amino acides avec AhPDFI .1 b dans la protéine mature.
Le procédé selon l'invention, par une dérégulation du métabolisme des cellules de l'organisme eucaryote, plus particulièrement de la voie de biosynthèse des stérols, permet avantageusement d'augmenter le taux de production par les cellules de tout composé d'intérêt synthétisé dans la voie de biosynthèse des stérols. On ne préjugera pas ici du mécanisme donnant lieu à un tel résultat avantageux. Il a cependant été démontré par les présents inventeurs que l'expression d'une défensine dans la cellule combinée à la mise en présence en excès dans le milieu de culture d'au moins un élément choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, active la grande majorité des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des stérols, menant à une production fortement accrue, successivement, de chacun des composés intermédiaires synthétisés dans cette voie, et débouchant sur une accumulation très élevée du composé final.
Un tel procédé est avantageusement simple et peu coûteux à mettre en œuvre, et il permet en particulier d'obtenir un composé d'intérêt avec un niveau de pureté très élevé, ainsi qu'un niveau de production très élevé. En cela, il constitue une voie alternative tout à fait avantageuse pour la production de stérols. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, l'élément choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, est présent dans le milieu de culture à une concentration supérieure ou égale à la concentration en cet élément qui est nécessaire pour induire la production, par les cellules, d'une quantité du composé d'intérêt, en particulier dudit composé de la voie de biosynthèse des stérols, au moins 5 fois, de préférence au moins 10 fois, et par exemple au moins 50 fois, supérieure à la quantité produite par les cellules cultivées dans des conditions de culture identiques, le milieu de culture contenant cependant l'élément à la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale des cellules.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, l'organisme eucaryote est choisi parmi les levures, les champignons, les algues et micro algues, les végétaux et les animaux.
Lorsque l'organisme eucaryote est du type ne produisant pas naturellement de défensine, et notamment pas une défensine particulière telle que définie ci-avant, par exemple lorsque cet organisme est une levure, les cellules dudit organisme soumises à l'étape de culture conformément à la présente invention sont modifiées de sorte à être aptes à produire une telle défensine. Lorsque l'organisme eucaryote est du type produisant naturellement une défensine, par exemple un organisme végétal, les cellules de cet organisme soumises à l'étape de culture conformément à la présente invention peuvent être modifiées de sorte à être aptes à surexprimer une défensine. Cette défensine peut être la défensine qu'ils produisent naturellement ou une autre défensine, notamment une défensine particulière telle que définie ci-avant.
Ainsi, dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, les cellules de l'organisme eucaryote sont des cellules recombinantes dans lesquelles a été introduite une séquence nucléotidique codant pour la défensine à exprimer ou surexprimer. Une telle modification des cellules peut être réalisée par toute méthode classique en elle-même et connue de l'homme du métier, par exemple par transformation de la souche avec un vecteur d'expression approprié comprenant un ou plusieurs gènes codant pour la défensine ou un de ses précurseurs. Chacun de tels gènes peut être placé sous contrôle aussi bien d'un promoteur constitutif, que d'un promoteur inductible.
Les cellules peuvent notamment être des cellules de levure, par exemple de Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris ou Yarrowia lipolytica, génétiquement modifiées pour exprimer une défensine végétale, en particulier une défensine codée par un gène de la famille des PDF1 , par exemple AhPDFI .1 b.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, particulièrement adaptés aux cas où l'organisme eucaryote est une levure, et où l'élément doit être présent dans le milieu de culture pour assurer la croissance des cellules, en particulier lorsque cet élément est le zinc, la concentration dans le milieu de culture de l'élément choisi parmi la liste précitée est au moins égale à 1 mM, de préférence au moins égale à 5 mM, et préférentiellement au moins égale à 10 mM. Cette concentration est notamment comprise entre 15 et 30 mM, par exemple environ égale à 20 mM. Une telle concentration permet avantageusement d'obtenir les plus forts taux d'activation de la voie de biosynthèse des stérols, en particulier lorsque l'élément contenu dans le milieu de culture est le zinc et le milieu de culture est le milieu usuellement mis en œuvre Yeast Nitrogen B Base (DIFCO).
Dans des modes de mise en œuvre différents de l'invention, particulièrement adaptés aux cas où l'élément n'est pas nécessaire à la croissance des cellules, par exemple lorsque cet élément est le cadmium, la concentration dans le milieu de culture de l'élément choisi parmi la liste précitée peut être comprise par exemple entre 10 et 100 μΜ.
Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, le procédé comprend une étape préalable de culture in vitro des cellules dans un milieu de culture adapté au développement des cellules et contenant les éléments précités, c'est-à-dire les métaux de transition, le sélénium et le plomb, à leurs concentrations minimales nécessaires à la croissance des cellules. Cette étape dite de pré-culture peut être réalisée dans le même milieu de culture que l'étape de culture en présence d'un excès d'au moins un desdits éléments, ou dans un milieu différent.
Le procédé selon l'invention permet alors avantageusement de découpler la production de biomasse et la production d'un composé d'intérêt produit dans la voie de biosynthèse des stérols. Il permet en effet alors de produire, dans une étape préalable, une grande quantité de biomasse, puis, dans un second temps, de déclencher l'activation de la voie de biosynthèse des stérols, notamment par simple ajout qu'une quantité plus importante de l'élément dans le milieu de culture, de sorte à produire, en quantités élevées, le composé d'intérêt visé. Le procédé selon l'invention s'exprime ainsi également sous les termes d'un procédé d'augmentation du taux de production, par un organisme eucaryote, d'un composé d'intérêt apte à être synthétisé par cet organisme dans cette voie de biosynthèse, ou dérivé d'un tel composé.
Le procédé selon l'invention comprend de préférence une étape subséquente de collecte des cellules de l'organisme eucaryote ayant accumulé le composé d'intérêt, et, le cas échéant, d'extraction du composé d'intérêt.
L'extraction du composé d'intérêt ayant été produit en quantité importante par les cellules peut être effectuée selon toute technique classique en elle-même, à partir notamment, selon le composé donné, d'un lysat cellulaire ou du surnageant de culture. Cette extraction peut comprendre une étape de purification du composé d'intérêt produit, par exemple par cristallisation ou par une technique de chromatographie telle que la chromatographie d'affinité, la chromatographie liquide haute performance (HPLC), etc. Dans des modes de mise en œuvre particuliers de l'invention, le composé d'intérêt est un composé final de la voie de biosynthèse des stérols chez l'organisme eucaryote considéré, notamment un stérol. Par exemple, lorsque l'organisme est une levure, le composé d'intérêt peut être l'ergostérol.
Autrement, le composé d'intérêt produit peut être un composé intermédiaire de la voie de biosynthèse des stérols.
Les cellules de l'organisme eucaryote soumises à l'étape de culture en présence dudit au moins un élément peuvent alors être des cellules recombinantes qui sont modifiées selon l'invention pour inhiber une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation de ce composé intermédiaire dans la voie de biosynthèse des stérols, notamment pour inhiber l'expression d'un gène codant pour une telle activité enzymatique. Une telle modification des cellules permet de bloquer la voie de biosynthèse des stérols en aval du composé intermédiaire d'intérêt dont la production est souhaitée, afin d'éviter la biotransformation de ce dernier et afin de provoquer par voie de conséquence son accumulation dans les cellules. Cette modification peut être effectuée par toute méthode connue dans le domaine du génie génétique, notamment par mutagénèse.
Autrement, lorsque le composé d'intérêt est un composé intermédiaire de la voie de biosynthèse des stérols, les cellules de l'organisme eucaryote, exprimant ou surexprimant une défensine, peuvent être mises en présence, dans le milieu de culture, d'un réactif présentant un effet d'inhibition d'une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation dudit composé intermédiaire dans la voie de biosynthèse des stérols. Un tel effet d'inhibition peut s'appliquer à différents niveaux dans la voie de biosynthèse des stérols, et est bien documenté dans l'art antérieur, par exemple dans la publication de Burden et al., 1989. Dans la majorité des cas, l'action de ce type d'inhibiteur s'exerce directement sur l'enzyme impliquée, sans que l'expression du gène correspondant soit affectée. Par exemple, la terbinafine est un inhibiteur de la squalène époxidase, dont l'action provoque l'accumulation de squalène dans des levures telles que S. cerevisiae, comme décrit notamment dans la publication de Nowosielski et al., 201 1 . A titre d'exemple, chez la levure, le procédé selon l'invention peut être utilisé pour produire en quantité importante des composés intermédiaires de la voie de biosynthèse des stérols présentant un intérêt chimique et/ou économique particulier, par exemple : le farnésyl-diphosphate (FPP), qui donne accès aux isoprénoïdes et terpènes, dont les caroténoïdes ; le squalène, utilisé par exemple comme adjuvant médical, comme antioxydant ou en cosmétique ; le lanostérol, un composant de la lanoline, utilisable en cosmétique, en pharmacie ou pour le traitement du cuir par exemple.
Lorsque l'organisme eucaryote est une levure, les cellules de l'organisme eucaryote peuvent par exemple être modifiées pour inhiber l'expression d'un gène choisi parmi ERG1 , associé à l'activité enzymatique de biotransformation du squalène ; NCP1 , également associé à l'activité enzymatique de biotransformation du squalène ; ERG1 1 , associé à l'activité enzymatique de biotransformation du lanostérol ;ERG9, associé à l'activité enzymatique de biotransformation du FPP, dans la voie de biosynthèse des stérols ; ERG2, associé à l'activité enzymatique de biotransformation du fécostérol ; ou encore ERG3, associé à l'activité enzymatique de biotransformation de l'épistérol.
Des souches eucaryotes, en particulier de levures, modifiées pour inhiber une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation d'un composé intermédiaire de la voie de biosynthèse des stérols, en un autre composé de la voie de biosynthèse des stérols, ont été développées par des techniques d'ingénierie génétique et décrites par l'art antérieur. A titre d'exemple, un mutant ERG2 et un mutant ERG3, permettant l'accumulation respectivement du fécostérol et de l'épistérol, sont disponibles auprès du Centre de Ressources EUROSCARF (Francfort), sous les numéros d'accession respectivement Y00788 et Y02667.
Dans des variantes de l'invention, le composé d'intérêt est un composé dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols, par exemple dérivé d'un composé final de cette voie, ou dérivé d'un composé intermédiaire de cette voie. Les cellules de l'organisme eucaryote soumises à l'étape de culture en présence dudit au moins un élément sont alors des cellules recombinantes qui sont modifiées pour activer au moins une, voire plusieurs, activité(s) enzymatique(s) impliquée(s) dans la biotransformation dudit composé de la voie de biosynthèse des stérols en ledit composé d'intérêt. L'activation d'une telle activité enzymatique peut notamment être réalisée en modifiant les cellules par introduction d'une séquence nucléotidique codant pour une enzyme présentant ladite activité enzymatique, de sorte à provoquer l'expression de cette enzyme dans les cellules. Autrement, elle peut être réalisée en modifiant les cellules pour provoquer la surexpression d'une enzyme naturellement produite dans les cellules et présentant ladite activité enzymatique.
Le cas échéant, lorsque le composé d'intérêt est un composé dérivé d'un composé intermédiaire de la voie de biosynthèse des stérols, lesdites cellules eucaryotes peuvent être d'une part modifiées pour activer ladite ou lesdites activité(s) enzymatique(s) impliquée(s) dans la biotransformation dudit composé de la voie de biosynthèse des stérols en ledit composé d'intérêt, et d'autre part modifiées pour inhiber une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation dudit composé intermédiaire dans la voie de biosynthèse des stérols, notamment pour inhiber l'expression d'un gène codant pour une telle activité enzymatique, comme décrit ci-avant.
De nombreuses souches eucaryotes, en particulier de levures, modifiées pour activer une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols en un composé d'intérêt autre, distinct de cette voie, ont été développées par des techniques d'ingénierie génétique et décrites par l'art antérieur.
Ainsi, à titre d'exemples non limitatifs de l'invention, les cellules de l'organisme eucaryote soumises à l'étape de culture en présence d'un excès dudit au moins un élément peuvent être des cellules de levure recombinantes modifiées pour activer : - une activité C-méthyltransférase, de sorte à permettre la surproduction par lesdites cellules, à partir d'ergostérol, de 24-éthyl-stérol et de 24-éthylidène-stérol, comme décrit dans la publication de Husselstein et al., 1996 ;
- ou une activité enzymatique d'hydroxylation de l'ergostérol, comme décrit notamment dans le document WO-A-201 1 /067144. Selon un autre exemple, les cellules de l'organisme eucaryote soumises à l'étape de culture en présence d'un excès dudit au moins un élément peuvent être des cellules de levure recombinantes modifiées pour d'une part inhiber une activité A22-désaturase et d'autre part activer des activités A7-réductase et adrénodoxine réductase, de sorte à permettre de surproduire, en présence par ailleurs de défensine et d'un excès de l'élément dans le milieu de culture, de la prégnénolone, ou le cas échéant de la progestérone par activation simultanée d'une activité β-hydroxystéroïde déhydrogénase/isomérase. Des cellules de levure ainsi modifiées, mais n'exprimant toutefois pas de défensine, sont décrites dans la publication de Duport et al., 1998.
Le procédé selon l'invention peut autrement être utilisé pour modifier la composition d'une huile pouvant être extraite à partir d'un organisme eucaryote, par augmentation ou diminution de la proportion d'un composé d'intérêt particulier présent dans cette huile. Il II trouve alors avantageusement application dans le domaine des huiles alimentaires ou industrielles, ou dans celui des biocarburants, qu'il permet notamment d'enrichir en un composé donné.
Un autre aspect de l'invention est l'utilisation combinée de cellules eucaryotes modifiées pour exprimer ou surexprimer une défensine, notamment une défensine telle que décrite ci-avant, et de la présence dans le milieu de culture de ces cellules, en excès, d'un élément choisi parmi les métaux de transition, par exemple le zinc, le cadmium, le nickel, le cobalt et le cuivre, le sélénium et le plomb, pour la production d'un composé d'intérêt de la voie de biosynthèse des stérols chez lesdites cellules eucaryotes, ou dérivé d'un composé de cette voie de biosynthèse. Une telle utilisation vise en particulier la production d'ergostérol, avec un rendement de production avantageusement élevé. Les conditions de culture peuvent répondre à l'une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant.
Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une souche de levure recombinante exprimant une défensine pour la production, avec un rendement accru, d'un composé d'intérêt de la voie de biosynthèse des stérols ou dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols chez la levure.
En particulier, des cellules de cette souche de levure recombinante sont soumises à une étape de culture in vitro, dans un milieu de culture adapté au développement desdites cellules et contenant au moins un élément choisi parmi les métaux de transition, par exemple le zinc, le cadmium, le nickel, le cobalt et le cuivre, le plomb et le sélénium, à une concentration supérieure ou égale à la concentration en ledit élément qui est nécessaire pour induire la surproduction dudit composé d'intérêt, en particulier dudit composé de la voie de biosynthèse des stérols, par lesdites cellules. On entend, par surproduction, la production, par lesdites cellules, d'une quantité dudit composé d'intérêt, en particulier dudit composé de la voie de biosynthèse des stérols, au moins 2 fois supérieure à la quantité produite par lesdites cellules dans des conditions de culture identiques, à la seule différence que le milieu de culture contient ledit élément à la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale desdites cellules.
La défensine peut notamment être une défensine :
- d'origine végétale codée par un gène de la famille des Plant Defensin type 1 , - et/ou présentant une structure tridimensionnelle comportant un motif de type CSa et/ou une boucle gamma-core,
- et/ou présentant au moins 30 % d'identité en amino acides avec la défensine AhPDFI .1 b à' Arabidopsis halleri àe séquence SEQ ID No:2.
Les conditions de culture des cellules peuvent en particulier répondre à l'une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant. Un autre objet de la présente invention est une cellule eucaryote recombinante modifiée pour exprimer ou surexprimer une défensine, en particulier une défensine telle que décrite ci-avant, et modifiée pour inhiber une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation d'un composé intermédiaire de la voie de biosynthèse des stérols dans cette cellule, notamment pour inhiber l'expression d'un gène codant pour une telle activité enzymatique.
Par exemple, cette cellule eucaryote peut être modifiée de sorte à inhiber l'expression d'un gène choisi parmi ERG1 , NCP1 , ERG2, ERG3, ERG1 1 et ERG9.
Une telle inhibition peut être effectuée par toute méthode classique en elle-même pour l'homme du métier. Par exemple, elle peut être effectuée par des techniques de génie génétique, par établissement de mutants dits « Knock-out » par insertion d'un ADN recombinant dans le gène concerné, ou encore par mutagénèse génétique.
Cette cellule eucaryote peut en outre être modifiée plus avant, pour activer une activité enzymatique impliquée dans la transformation de ce composé intermédiaire en un composé d'intérêt.
Selon un autre objet, la présente invention concerne une cellule eucaryote recombinante modifiée pour exprimer ou surexprimer une défensine, en particulier une défensine telle que décrite ci-avant, et modifiée pour activer une activité enzymatique impliquée dans la transformation d'un composé, notamment un composé final, de la voie de biosynthèse des stérols, en un composé d'intérêt distinct de cette voie. De telles cellules selon l'invention peuvent notamment être des cellules de levure, notamment de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris ou Yarrowia lipolytica, exprimant une défensine végétale, en particulier du type codée par un gène de la famille PDF1 , par exemple la défensine AhPDFI .1 b. Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière de l'exemple de mise en œuvre ci-après, fourni à simple titre illustratif et nullement limitatif de l'invention, avec l'appui des figures 1 à 6, dans lesquelles :
- la figure 1 montre la superposition des structures obtenues par modélisation moléculaire, respectivement de la défensine AhPDF1 .1 b et de la défensine de radis de référence RsAFPI ;
- la figure 2 représente la carte du vecteur pYX212 vide ;
- la figure 3 montre une plaque obtenue par chromatographie sur couche mince (CCM) pour les fractions respectivement de lipides neutres insaponifiables (pistes 1 à 4) et d'autres lipides insaponifiables (pistes 5 à 8) extraites des cellules après culture de la souche BY4741 de Saccharomyces cerevisiae exprimant (AhPDF1 .1 b +) ou n'exprimant pas (AhPDF1 .1 b -) la défensine végétale AhPDFI .1 b, en présence de zinc en excès à 20 mM (Zn +) ou de zinc à 2,5 μΜ (Zn -) dans le milieu de culture ; les pistes 9 à 12 correspondant à des dépôts d'ergostérol pur, dans des quantités respectives de 5 μg (piste 9), 10 μg (piste 10), 25 μg (piste 1 1 ) et 50 μg (piste 12) ;
- la figure 4 montre un chromatogramme obtenu par chromatographie en phase gazeuse pour le produit obtenu par CCM préparative à partir de la fraction de lipides neutres insaponifiables extraite des cellules après culture de la souche BY4741 de Saccharomyces cerevisiae exprimant la défensine végétale AhPDFI .1 b, en présence 20 mM de zinc dans le milieu de culture ;
- la figure 5 montre les spectres de masse obtenus pour (A) le pic au temps de rétention de 15,34 min du chromatogramme de la figure 4, (B) l'ergostérol pur ; - et la figure 6 illustre la projection sur la voie de biosynthèse de l'ergostérol chez la levure, des résultats de l'expression différentielle des gènes impliqués dans cette voie de biosynthèse entre les deux conditions suivantes : levure recombinante exprimant la défensine AhPDFI .1 b et soumise à un traitement par le zinc (20 mM), et levure témoin (absence de défensine) cultivée dans les mêmes conditions ; sont encadrés en trait plein les gènes dont la quantité de transcrits est significativement supérieure dans les levures exprimant la défensine, et en traits pointillés le gène dont la quantité de transcrits est significativement inférieure dans les levures exprimant la défensine.
EXEMPLE 1 - Défensine AhPDFI .1 b et excès de zinc
Une souche de Saccharomyces cerevisiae a été modifiée pour exprimer la défensine végétale ô'Arabidopsis halleri AhPDFI .1 b, puis cultivée en présence d'un excès de zinc, conformément à la présente invention, de la manière suivante.
La défensine AhPDFI .1 b ô'Arabidopsis halleri (numéro d'accession GenBank : HF545648, séquence nucléotidique SEQ ID No:1 , séquence d'acides aminés SEQ ID No:2) a tout d'abord fait l'objet d'une étude de modélisation moléculaire (Swiss Model, Geno3D ou PyMol), et sa structure a été superposée à celle de la défensine de radis RsAFPI (séquence d'acides aminés : numéro d'accession GenBank AAA69541 ; séquence nucléotidique : numéro d'accession GenBank U18557), dont il a été largement décrit dans la littérature (Terras et al., 1995) qu'elle présente une structure à motif de type CScc et boucle gamma-core. La représentation obtenue est montrée sur la figure 1 . On y observe une parfaite superposition des deux défensines, démontrant que la défensine AhPDFI .1 b ô'Arabidopsis halleri présente une structure à motif de type CScc et boucle gamma-core.
La séquence codante de la défensine AhPDFI .1 b a été amplifiée par polymérisation par réaction en chaîne (PCR) et clonée dans le vecteur pYX212 (commercialisé par la société Ingenenius), dont la carte est montrée sur la figure 2, au niveau des sites de restriction EcoRI et Xhol.
La séquence codante est sous le contrôle du promoteur constitutif de la triose phosphate isomérase (TPI) de levure et en amont du terminateur de la protéine heat shock HSF1 (YGL073w) de levure. Le plasmide recombinant obtenu, ainsi que le plasmide vide pFL38H porteur du gène HIS3 conférant l'auxotrophie à l'histidine, décrit dans la publication de Talke et al., 2006, ont été introduits dans la souche de levure BY4741 (Mat a, his3A1 , leu2A0, met15A0, ura3A0) en utilisant la méthode de transformation au PEG et au chlorure de lithium (Gietz & Woods, 2002). Une transformation de la souche BY4741 a été réalisée en parallèle avec les plasmides vides pYX212 et pFL38H et sert de témoin négatif.
Les souches recombinantes ont été cultivées à 30 ° C à la densité d'environ 50 UFC/cm2 sur milieu solide (1 ,43 g/l Yeast Nitrogen Base sans acides aminés ni ammonium (Réf. 233520, Difco), 20 g/l glucose, 6,4 g/l NH4N03, 50 mM acide succinique-KOH pH 4,5, méthionine 20 mg/l, leucine 60 mg/l, 20 g/l agarose (Réf. D5, Euromedex)) supplémenté :
- soit par du sulfate de zinc (ZnS04) à la concentration finale de 2,5 μΜ, ce qui correspond à la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale des cellules,
- soit par du sulfate de zinc (ZnS04) à la concentration finale de 20 mM, c'est-à-dire en excès conformément à la présente invention.
Pour chaque expérience, lorsque le diamètre des colonies a atteint 0,48 ± 0,02 mm en moyenne, ce qui correspond à une phase exponentielle de croissance, les levures ont été prélevées, rincées 2 fois dans de l'eau pure, puis lyophilisées.
Les lipides neutres ont été extraits à l'hexane et les lipides restants (polaires) ont été extraits par un mélange de chloroforme/méthanol (2V/1 V) selon le protocole décrit par Lomascolo et al., 1994 . Chacune des fractions lipidiques a ensuite été saponifiée selon la norme AFNOR NFT 60-205 et des échantillons des fractions insaponifiables contenant entre 50 et 100 μg de lipides ont été prélevés.
Les échantillons ont été analysés par Chromatographie en Couche Mince (CCM) sur plaque TLC silica gel (Réf. 60 F 254 de chez E. MERCK KGaA). A titre de témoins, différentes quantités (respectivement 5, 10, 25 et 50 μ9) d'ergostérol pur (Réf. 45480, Sigma) ont été déposées en parallèle. La migration a été effectuée dans un tampon hexane:éther:acide formique dans les proportions 70:30:1 . A la fin de la migration, la plaque a été séchée à l'air puis aspergée uniformément avec une solution 50:50 d'acide orthophosphorique pur et de sulfate de cuivre saturée. Après séchage, la plaque a été chauffée à 180 °C pendant 8 à 10 min. Les quantités de stérols ont été déterminées par comparaison avec les échantillons constituant la gamme d'étalonnage, à l'aide d'un densitomètre (modèle CAMAG TLC Scanner 3 "Scanner3_160813" S/N 160813 (1 .14.28), E. Merck KGaA) qui analyse la plaque à la longueur d'onde de 325 nm.
Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 3. Comme on peut le constater, les cellules exprimant la défensine et cultivées en présence de zinc à 20 mM dans le milieu de culture, et elles seules, conduisent à l'obtention dans la fraction des lipides neutres insaponifiable d'une quantité très importante d'un composé particulier, dont la bande caractéristique peut clairement être identifiée comme correspondant à l'ergostérol, par comparaison avec les pistes contenant l'ergostérol pur, de formule générale (I) :
Figure imgf000023_0001
L'ergostérol est largement majoritaire dans cette fraction. Il peut être établi qu'il en représente plus de 80 %. La confirmation que ce composé particulier est bien l'ergostérol a été établie par analyse par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS), de la manière suivante.
Une CCM préparative a été réalisée à partir de 100 μΙ_ de la fraction de lipides neutres insaponifiables obtenue pour la condition de culture exprimant la défensine végétale AhPDF1 .1 b, en présence de 20 mM de zinc dans le milieu de culture. Après migration, la plaque a été grattée au niveau de la tache identifiée comme correspondant à l'ergostérol. Le produit a été extrait de la silice avec du chloroforme. Après filtration pour éliminer totalement les particules de silice, le chloroforme a été évaporé et l'extrait a été remis en solution dans de l'hexane avant d'être injecté en chromatographie en phase gazeuse couplée avec un spectromètre de masse.
Le chromatogramme obtenu est montré sur la figure 4 (abondance ionique totale sur la gamme m/z 50-450). On y observe un pic largement majoritaire élué après 15,34 min, ce qui correspond au temps de rétention attendu pour l'ergostérol.
De plus, le spectre de masse déterminé pour ce pic indique sans ambiguïté qu'il s'agit d'ergostérol, comme montré par la figure 5, sur laquelle on observe une coïncidence des spectres de masse (A) du pic à 15,34 min et (B) de l'ergostérol pur.
Les rendements de production d'ergostérol par les levures, exprimés en mg par g de masse sèche de levures (mg/gMS), ont par ailleurs été déterminés pour chacune des conditions de culture. Les résultats sont indiqués dans le tableau 1 ci-après.
Figure imgf000024_0001
Tableau 1 - Rendements de production d'ergostérol par les levures en fonction des conditions de transformation / culture Pour la combinaison « 20 mM de zinc - expression de la défensine », le rendement de production d'ergostérol est largement supérieur à celui obtenu pour les autres conditions. Les stérols représentent plus de 12 % en masse par rapport à la masse sèche totale de levures. II a par ailleurs été étudié quels gènes de la voie de biosynthèse des stérols sont affectés par le procédé d'activation selon l'invention.
A cet effet, il a été utilisé une approche transcriptomique.
Les mêmes souches de levure que celles décrites ci-dessus ont été cultivées dans les mêmes conditions que décrites précédemment. Lorsque le diamètre des colonies a atteint 0,48 ± 0,02 mm en moyenne, les levures ont été prélevées et congelées immédiatement dans l'azote liquide.
L'ARN a alors été extrait en utilisant la méthode au TRIzol® décrite dans la publication de Chomczynski et Sacchi, 1987. En bref, les cellules ont été broyées par agitation intense en présence de billes de verre de 0,3 mm dans du Trizol à 4 ° C pendant 15 min. Du chloroforme a été ajouté à raison d'1 /5 du volume. Après centrifugation pendant 15 min à 9000 x g, le surnageant a été récupéré et de l'isopropanol a été ajouté à raison de 50 % du volume de surnageant. Après 10 min d'incubation à -20 ° C puis 10 min de centrifugation à 9000 x g, le culot a été récupéré et rincé deux fois à l'éthanol 75 % puis repris dans 150 μΙ d'eau.
100 μg d'ARN total ont ensuite été purifiés à l'aide du kit RNeasy (Qiagen). L'ADN a été éliminé par utilisation d'une DNAse directement sur la colonne du kit. L'ARN a été élué dans 30 μΙ d'eau.
100 ng d'ARN purifié ont été marqués avec la cyanin3-dCTP en utilisant le kit 'Quick Amp Labelling one-colour kit' d'Agilent technologies. Les ARNs marqués ont été hybridés sur une puce à ADN de levure '8-15 15 karray Agilent standard Yeast V2 g-Gene Expression Microarray' (Agilent technologies) pendant 17 h à 65 ° C. Après rinçage, les lames ont été lues sur un scanner GenePix® 4000B. A partir du fichier de données donnant les intensités d'hybridation pour tous les gènes dans les 4 conditions testées (levures témoin (« Déf - ») et levures exprimant la défensine (« Déf + ») cultivées en présence de zinc à la concentration finale de 2,5 μΜ (« Zn - ») ou de zinc à la concentration finale de zinc de 20 mM (« Zn + »), les résultats obtenus concernant l'expression de tous les gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de l'ergostérol sont donnés dans le tableau 2 ci-après.
Figure imgf000026_0001
Tableau 2 - Expression des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de l'ergostérol en fonction des conditions de transformation / culture (présence (« Déf + ») ou absence (« Déf - ») d'expression de défensine, et présence de zinc à 20 mM (« Zn + ») ou 2,5 μΜ (« Zn - ») dans le milieu de culture) On constate en particulier que l'expression des gènes ERG1 , ERG3, ERG4, ERG7, ERG9, ERG10, ERG1 1 , ERG13, ERG20, ERG24, ERG25, ERG26, ERG27, ERG28, MVD1 est augmentée, parfois fortement, pour la combinaison « expression de la défensine + ajout de zinc en excès (20 mM) dans le milieu de culture », par rapport à la condition « levure normale + ajout de zinc en excès dans le milieu de culture » ; et pour ce qui concerne les gènes ERG3, ERG4, ERG9, ERG25, ERG27 et MVD1 , par rapport à toutes les conditions testées.
Les résultats obtenus ci-dessus sont projetés sur la voie de biosynthèse de l'ergostérol chez la levure, en comparant la condition « expression de défensine / présence de zinc en excès dans le milieu de culture » (« Déf + / Zn +») avec la condition « absence de défensine / présence de zinc en excès dans le milieu de culture » (« Déf - / Zn +»). Le résultat est montré sur la figure 6. Sur cette figure, l'encadrement en pointillés du nom du gène indique une diminution de l'expression du gène dans la levure exprimant la défensine, et l'encadrement en traits pleins indique une augmentation de l'expression du gène dans la levure exprimant la défensine.
EXEMPLE 2 - Défensine AhPDFI .4 et excès de zinc Une souche de Saccharomyces cerevisiae a été modifiée pour exprimer la défensine végétale ô'Arabidopsis halleri AhPDFI .4 (séquence nucléotidique SEQ ID No:3, séquence d'acides aminés SEQ ID No:4 ; cette défensine possède un motif de type CSa et une boucle gamma-core, et présente 38 % d'identité en amino acides avec AhPDFI .1 b), puis cultivée en présence d'un excès de zinc (20 mM), conformément à la présente invention, suivant le même protocole que celui décrit dans l'Exemple 1 ci-avant. A titre comparatif, une culture dans le même milieu de culture contenant du zinc à une concentration bien moindre (2,5 μΜ), qui n'est pas considérée comme un excès au sens de la présente invention, a également été réalisée. Les rendements de production d'ergostérol par les levures, exprimés en mg par g de masse sèche de levures (mg/gMS), ont été déterminés pour chacune des conditions de culture. Les résultats sont indiqués dans le tableau 3 ci-après.
Figure imgf000028_0001
Tableau 3 - Rendements de production d'ergostérol par les levures en fonction des conditions de transformation / culture
Là encore, le rendement de production d'ergostérol est largement augmenté pour la combinaison « excès de zinc dans le milieu de culture - expression de la défensine ».
EXEMPLE 3 - Défensines TaDEF et MsDEFI et excès de zinc
Des souches de Saccharomyces cerevisiae ont été modifiées, suivant la méthode décrite dans l'Exemple 1 ci-avant, pour exprimer, respectivement :
- la défensine végétale du blé tendre Triticum aestivum TaDEF (séquence nucléotidique SEQ ID No:5, numéro d'accession Genbank AB089942 ; séquence d'acides aminés SEQ ID No:6, numéro d'accession Genbank BAC10287 ; cette défensine possède un motif de type CScc et une boucle gamma-core, et présente 33 % d'identité en amino acides avec AhPDFI .1 b dans la protéine mature) ;
- ou la défensine végétale de la plante Medicago sativa MsDEFI (séquence nucléotidique SEQ ID No:7, numéro d'accession Genbank
AY681971 ; séquence d'acides aminés SEQ ID No:8, numéro d'accession Genbank AAV85436 ; cette défensine possède un motif de type CScc et une boucle gamma-core, et présente 29 % d'identité en amino acides avec AhPDFI .1 b dans la protéine mature)
Les souches ainsi modifiées ont été cultivées en présence d'un excès de zinc (20 mM), conformément à la présente invention, suivant le même protocole que celui décrit dans l'Exemple 1 ci-avant. A titre comparatif, la culture, dans le même milieu de culture contenant un excès de zinc (20 mM), d'une souche de Saccharomyces cerevisiae modifiée pour exprimer la défensine AhPDFI .1 b, a également été réalisée.
Pour chaque expérience, lorsque le diamètre des colonies a atteint 0,48 ± 0,02 mm en moyenne, ce qui correspond à une phase exponentielle de croissance, les levures ont été prélevées, rincées 2 fois dans de l'eau pure, puis lyophilisées.
Les échantillons lyophilisés ont été soumis à une étape de saponification avant extraction et analyse. Pour cela, quelques dizaines de mg d'échantillon ont été additionnés de 400 μΙ d'une solution méthanolique de KOH à 10 % (p/v), de 0,2 ml de microbilles de diamètre 0,1 mm et de 6 mg de 7-dihydrocholestérol (7-DHC) utilisé comme standard interne. Le mélange a ensuite été incubé à 85 °C pendant 2 heures sous fate agitation. Après refroidissement à température ambiante, 300 μΙ d'eau ont été ajoutés. Les échantillons ont été extraits trois fois avec 700 μΙ d'hexane. Les phases hexaniques contenant les lipides insaponifiables ont été regroupées et séchées, puis reprises dans 200 μΙ de chloroforme.
Un chromatographe en phase gazeuse Shimatzu GC 2010 Plus, équipé d'un injecteur automatique, d'une colonne capillaire Zebron® ZB-5HT Inferno® et d'un détecteur à ionisation de flamme, a été utilisé pour doser l'ergosterol, en référence à une gamme étalon d'ergostérol commercial (Sigma, pureté > 95%) et à un standard interne (7-DHC). Le volume injecté a été de 0,2 μΙ avec un rapport de division de 1 /25. La température de l'injecteur et du détecteur était de 310 °C. Celle du four a été faite varier de 270 °C à 310 ° C en 10 min, puis maintenue pendant 10 min à 310 ° C. Les rendements de production d'ergostérol par les levures, exprimés en μ9 par g de masse sèche de levures ^g/gMS), ont été déterminés pour chacune des conditions de culture. Les résultats sont indiqués dans le tableau 4 ci-après.
Figure imgf000030_0001
Tableau 4 - Rendements de production d'ergostérol par les levures en fonction de la défensine mise en œuvre (en présence de 20 mM de zinc)
Comme on peut l'observer, en présence d'un excès de zinc (20 mM), les levures qui expriment les défensines TaDEF et MsDEF présentent une augmentation de teneur en ergostérol d'un facteur respectivement supérieur à 3, et supérieur à 5, par rapport aux levures qui n'expriment pas de défensine.
Ces défensines TaDEF et MsDEF permettent elles aussi, tout comme AhPDFI .1 b, la surproduction d'ergostérol par les levures.
EXEMPLE 4 - Défensine AhPDFI .1 b et excès de cadmium Une souche de Saccharomyces cerevisiae a été modifiée pour exprimer la défensine végétale ô'Arabidopsis thaliana AhPDFI . b, puis cultivée en présence d'un excès de cadmium (10 ou 20 μΜ) suivant le même protocole que celui décrit dans l'Exemple 1 ci-avant.
Le protocole de saponification, d'extraction des insaponifiables et l'analyse en GC FID est le même que pour l'Exemple 3 présenté ci-dessus.
Les rendements de production d'ergostérol par les levures, exprimés en μg par g de masse sèche de levures ^g/gMS), ont été déterminés pour chacune des conditions de culture. Les résultats sont indiqués dans le tableau 5 ci-après. Concentration en cadmium (μΜ) Expression de AhPDFI .1 b Rendement ^g/gMS)
10 Pas d'expression 21 ,3
10 Expression 43,7
20 Pas d'expression 35,6
20 Expression 91 ,5
Tableau 5 - Rendements de production d'ergostérol par les levures
On constate que dans des conditions d'expression de la défensine, et en présence de cadmium, la production d'ergostérol est significativement augmentée par rapport aux autres conditions, cet effet étant plus marqué à une concentration de cadmium dans le milieu de culture de 20 μΜ.
La défensine AhPDFI .1 b est ainsi capable d'induire une augmentation de la production d'ergostérol lorsqu'un excès de cadmium est apporté dans le milieu.
EXEMPLE 5 - Surproduction de composés intermédiaires de la voie de biosynthèse des stérols chez la levure
Il a été mis en œuvre les souches de Saccharomyces cerevisiae suivantes :
- mutant ERG2 (génotype BY4741 ; Mat a; his3A1 ; leu2A0; met15A0; ura3A0; YMR202w::kanMX4), disponible auprès du centre de ressources EUROSCARF (http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/about.html), sous le numéro d'accession Y00788. Dans ce mutant la voie de biosynthèse des stérols est bloquée pour permettre l'accumulation de fécostérol, par inhibition de l'activité enzymatique associée au gène ERG2 ; - mutant ERG3 (génotype BY4741 ; Mat a; his3A1 ; leu2A0; met15A0; ura3A0; YLR056w::kanMX4), disponible auprès du centre de ressources EUROSCARF (http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/about.html), sous le numéro d'accession Y02667. Dans ce mutant la voie de biosynthèse des stérols est bloquée pour permettre l'accumulation d'épistérol, par inhibition de l'activité enzymatique associée au gène ERG3 ; - mutant NCP1 (génotype W303-1 B, MATalpha, Ieu2-3,1 12 trp1 -1 can1 -100 ura3-1 ade2-1 his3-1 1 ,15 YHR042w::TRP1 ). Dans ce mutant la voie de biosynthèse des stérols est bloquée pour permettre l'accumulation de squalène, par inhibition de l'activité enzymatique associée au gène NCP1 . Chacun de ces mutants a été modifié pour exprimer la défensine végétale ô'Arabidopsis /?a//er/ Ah PDF1 .1 b, puis cultivé en présence d'un excès de zinc, conformément à la présente invention, selon le protocole indiqué dans l'Exemple 1 ci-avant, pour surproduire le composé d'intérêt intermédiaire de la voie de biosynthèse des stérols associé, c'est-à-dire, respectivement, le fécostérol, l'épistérol et le squalène.
EXEMPLE 6 - Surproduction de composés chez la mousse Physcomitrella patens
La séquence codante de la défensine AhPDFI .1 b a été introduite dans l'un ou l'autre des plasmides proAct1 in108Kan et BNRr-108-3'-5'-HSP-CaMV, sous le contrôle respectivement des promoteurs constitutif d'actine de riz et inductible d'une Heat Shock Protein (HSP) de soja.
Les plasmides ont été intégrés dans le locus 108 du génome de la mousse Physcomitrella patens par transformation génétique, tel que décrit dans la publication de Schaefer et Zryd, 1997.
Les clones ont été sélectionnés en présence de kanamycine dans le milieu (marqueur de sélection).
Pour la surproduction de composés de la voie de biosynthèse des stérols, les clones sont cultivés sur le milieu de culture nommé PPNH4 suivant, enrichi de 4 mM de zinc : Ca(N03)2 3,3 m M, MgS04 1 m M, FeS04 0,5 m M, KP04 pH 7 0,2 mM, tartrate d'ammonium 0,3 mM, H3B03 10 μΜ, MnCI2 15 μΜ, CuS04 0,2 μΜ, ZnS04 2 μΜ, Kl 0,2 μΜ, CoCI2 0,2 μΜ, Na2Mo04 0,1 μΜ, agar 7 g/L. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production d'un composé d'intérêt de la voie de biosynthèse des stérols chez un organisme eucaryote ou dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols chez ledit organisme eucaryote, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de culture in vitro de cellules dudit organisme eucaryote, modifiées pour exprimer ou surexprimer une défensine, dans un milieu de culture adapté au développement desdites cellules et contenant au moins un élément choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, à une concentration supérieure ou égale à la concentration en ledit élément nécessaire pour induire la production, par lesdites cellules, d'une quantité dudit composé d'intérêt au moins 2 fois supérieure à la quantité produite par lesdites cellules dans des conditions de culture identiques, ledit milieu de culture contenant ledit élément à la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale desdites cellules.
2. Procédé selon la revendication 1 , selon lequel la défensine est une défensine :
- d'origine végétale codée par un gène de la famille des Plant Defensin type 1 ,
- présentant une structure tridimensionnelle comportant un motif de type CScc et/ou une boucle gamma-core, - et/ou présentant au moins 30 % d'identité en amino acides avec la défensine AhPDFI .1 b à'Arabidopsis halleri de séquence SEQ ID No:2.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, selon lequel ledit élément est le zinc.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, selon lequel ledit élément est présent dans ledit milieu de culture à une concentration supérieure ou égale à la concentration en ledit élément qui est nécessaire pour induire la production, par lesdites cellules, d'une quantité dudit composé d'intérêt au moins 5 fois, de préférence au moins 10 fois, supérieure à la quantité produite par lesdites cellules dans des conditions de culture identiques, ledit milieu de culture contenant ledit élément à la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale desdites cellules.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, selon lequel ledit organisme eucaryote est choisi parmi les levures, les champignons, les algues et micro algues, les végétaux et les animaux.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, selon lequel les cellules dudit organisme eucaryote sont des cellules recombinantes dans lesquelles a été introduite une séquence nucléotidique codant pour ladite défensine.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant une étape subséquente de collecte des cellules dudit organisme eucaryote ayant accumulé ledit composé d'intérêt, et, le cas échéant, d'extraction dudit composé d'intérêt.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, selon lequel le composé d'intérêt est un composé final de la voie de biosynthèse des stérols.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, selon lequel le composé d'intérêt est un composé intermédiaire de la voie de biosynthèse des stérols, et lesdites cellules dudit organisme eucaryote sont des cellules recombinantes modifiées pour inhiber une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation dudit composé intermédiaire dans la voie de biosynthèse des stérols.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, selon lequel le composé d'intérêt est un composé dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols, et lesdites cellules dudit organisme eucaryote sont des cellules recombinantes modifiées pour activer une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation dudit composé de la voie de biosynthèse des stérols en ledit composé d'intérêt, et, le cas échéant, modifiées pour inhiber une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation d'un composé intermédiaire dans la voie de biosynthèse des stérols.
11. Cellule eucaryote recombinante modifiée pour exprimer ou surexprimer une défensine et modifiée pour inhiber une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation d'un composé intermédiaire de la voie de biosynthèse des stérols dans ladite cellule.
12. Cellule eucaryote recombinante selon la revendication 1 1 , modifiée pour activer une activité enzymatique impliquée dans la transformation dudit composé intermédiaire en un composé d'intérêt.
13. Utilisation d'une souche de levure recombinante modifiée pour exprimer ou surexprimer une défensine, pour la production d'un composé d'intérêt de la voie de biosynthèse des stérols ou dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols chez ladite levure.
14. Utilisation selon la revendication 13, selon laquelle des cellules de ladite souche recombinante sont soumises à une étape de culture in vitro dans un milieu de culture adapté au développement desdites cellules et contenant au moins un élément choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, à une concentration supérieure ou égale à la concentration en ledit élément qui est nécessaire pour induire la production, par lesdites cellules, d'une quantité dudit composé d'intérêt au moins 2 fois supérieure à la quantité produite par lesdites cellules dans des conditions de culture identiques, ledit milieu de culture contenant ledit élément à la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale desdites cellules.
15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 13 à 14, selon laquelle la défensine est une défensine :
- d'origine végétale codée par un gène de la famille des Plant Defensin type 1 ,
- présentant une structure tridimensionnelle comportant un motif de type CScc et/ou une boucle gamma-core,
- et/ou présentant au moins 30 % d'identité en amino acides avec la défensine AhPDFI .1 b à'Arabidopsis halleri de séquence SEQ ID No:2.
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