JP2008532553A

JP2008532553A - 生合成経路の化学的に誘導可能な発現

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Publication number: JP2008532553A
Application number: JP2008502042A
Authority: JP
Inventors: ローラリンクールツ，; オリバーピー．ピープルズ，; クリスティディー．スネル，
Original assignee: メタボリックス，インコーポレイテッド
Priority date: 2005-03-16
Filing date: 2006-03-16
Publication date: 2008-08-21
Also published as: US20130042371A1; US20100196974A1; EP1863916B1; CA2600882A1; WO2006101983A2; US7732680B2; CA2800359A1; BRPI0608637A2; US8742203B2; US20070067869A1; WO2006101983A3; AU2006227634B2; AU2006227634A1; CA2600882C; ATE521710T1; EP1863916A2

Abstract

多酵素生合成経路において酵素をコード化する同義遺伝子の導入方法および構築物が提供される。１つの実施形態において、これらの構築物は、各々が誘導プロモーターの制御下にあり、かつ各々がポリアデニル化シグナルを有する、２またはそれ以上の酵素コード化遺伝子を含有する。これらの構築物は、形質転換植物を生産するために用いられる。これらの植物において、酵素の発現は、化学的誘導剤が適用された時に増加され、導入遺伝子によってコード化された一連の酵素の生合成産物が生成される。１または複数の導入遺伝子から発現されたアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化される１またはそれ以上のプロモーターの制御下にある２またはそれ以上の酵素コード化遺伝子を含有する構築物が用いられてもよい。導入遺伝子はこれら自体が、１またはそれ以上の誘導プロモーターの制御下にあり、化学物質の外部からの適用後にスイッチオンされる。

Description

（発明の分野）
本発明は一般に、多酵素経路の所望の産物の生成を増強するための、生物における代謝経路において２またはそれ以上の酵素をコード化する２またはそれ以上の遺伝子の化学的誘導を得るのに適したベクターもしくは構築物の構成および使用に関する。特に、植物中のポリヒドロキシアルカノエート生合成経路における２またはそれ以上の酵素の化学的誘導発現のためのこのようなベクターもしくは構築物の構成が開示される。これらのベクターもしくは構築物を用いた植物の生産、および多酵素経路の所望の産物の改良された生産も実証される。

（発明の背景）
植物作物は、変性植物油、ポリヒドロキシアルカノエート、アミノ酸、変性リグニン、変性デンプン、および栄養補助製品を包含する一連の代謝産物の生成にとって望ましい宿主である。非常に多くの場合、これらの新しい産物の生成は、酵素活性を有する２またはそれ以上のポリペプチドをコード化する２またはそれ以上の導入遺伝子の発現を必要とする。所望の産物の形成を最大限にするために、植物の成長サイクルの一時点において、２またはそれ以上の導入遺伝子を発現させうることが望ましい。ほかの例では、代謝経路のポリペプチドもしくは産物によって引起こされた植物成長もしくは収率に対する負の衝撃を緩和するため、代謝経路の発現をスイッチオンしうることが望ましい。

バイオプラスチックが緑色植物において経済的かつ持続可能に生成されうる農業システムの開発は、バイオプラスチックのコストを劇的に低減させるのみならず、ＣＯ_２を封鎖する（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）可能性も有する。

ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、植物中に生成しうる生物分解性バイオポリマーの一族である。植物中のＰＨＡ生成の所望の商業目標は、７．５％〜１５％乾燥重量（ｄｗｔ）である（非特許文献１）。現在まで、ＰＨＢは、次の植物種において生成され、成功していた：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ、Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ、およびＺｅａｍａｙｓ（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。しかしながら、３％ｄｗｔ以上のＰＨＢを生成する植物は多くの場合、黄白化性（ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ）表現型を発達させ、および／または完全なサイズが得られない（非特許文献６）。これらの要因は、結果として低い総ポリマー収率を生じ、ＰＨＡの植物ベース生成への主要な障害となる。ＰＨＢ経路における単一遺伝子の発現を制御するために誘導プロモーターを用いて、低総収率の問題を克服しようとする試みが、非誘導植物において高レベルの漏出し易いポリマー生成を生じ、したがって植物は依然として成長が妨げられた（非特許文献７）。
Ｙ．ＰｏｉｒｉｅｒａｎｄＫ．Ｊ．Ｇｒｕｙｓ，Ｂｉｏｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ａ．ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌＥｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；２００２），ｐｐ．４０１−４３５Ｃ．Ｎａｗｒａｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）９１，１２７６０Ｋ．Ｂｏｈｍｅｒｔら、，Ｐｌａｎｔａ（２０００）２１１，８４１Ｋ．Ｌ．Ｈｏｕｍｉｅｌら、Ｐｌａｎｔａ（１９９９）２０９，５４７Ｙ．ＰｏｉｒｉｅｒおよびＫ．Ｊ．Ｇｒｕｙｓ，Ｂｉｏｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ、Ｙ．Ｄｏｉ，Ａ．ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌＥｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；２００２），ｐｐ．４０１−４３５Ｂｏｈｍｅｒｔ，Ｋ．ら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎｔＯｒｇａｎｅｌｌｅｓ．Ｈ．Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｃ．Ｄ．ＣｈａｓｅＥｄｓ．（ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；２００４，ｐｐ．５５９−５８５Ｂｏｈｍｅｒｔら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．（２００２）１２８（４）：１２８２−９０

したがって、作物における代謝経路において２またはそれ以上の酵素活性をコード化する２またはそれ以上の遺伝子の誘導発現のためのベクターもしくは構築物を提供することが、本発明の１つの目的である。

これらのベクターもしくは構築物で植物を形質転換すること、および宿主植物における所望の生成物、例えばバイオポリマー、新規油、変性リグニン、変性デンプン、または栄養補助食品の効率的な形成に必要とされる２またはそれ以上の酵素活性をコード化する２またはそれ以上の導入遺伝子の配位発現を誘導する一方で、経路において酵素、例えば所望の産物の増強された形成につながるものをコード化する導入遺伝子の構成的発現と関連づけることができる有害な影響を制限することが、本発明のさらに１つの目的である。

遺伝子が発現され、代謝中間体の流れが、その経路の産物の生成を増強するのに適した代謝経路を通して導かれるように、化学的誘導剤の葉または根への適用によってこれらの遺伝子を誘導することが、この発明のさらにもう１つの目的である。

所望の産物の生成を増強するため、および植物物質を収穫し、該産物を回収するために、植物成長サイクルの間の最適な時点における葉または根への適用による化学的誘導剤の適用方法を提供することが、この発明のさらに１つの目的である。

（発明の要旨）
多酵素生合成経路において酵素をコード化する同義遺伝子の導入のための方法および構築物が提供される。１つの実施形態において、これらの構築物は、各々が誘導プロモーターの制御下にあり、かつ各々がポリアデニル化シグナルを有する、２またはそれ以上の酵素コード化遺伝子を含有する。これらの構築物は、形質転換植物を生産するために用いられる。これらの植物において、酵素の発現は、化学的誘導剤が適用された時に増加され、これらの導入遺伝子によってコード化された多酵素生合成経路の生合成産物が生成される。

別の実施形態において、この方法は、１または複数の導入遺伝子から発現されたアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化される１またはそれ以上のプロモーターの制御下にある２またはそれ以上の酵素コード化遺伝子を含有する構築物を利用する。導入遺伝子はこれら自体が、１またはそれ以上の誘導プロモーターの制御下にあり、化学物質の外部適用後にスイッチオンされる。アクチベータ分子もしくは複合体を発現する１または複数の導入遺伝子は、多酵素生合成経路において酵素をコード化する同義遺伝子を含有する同じ構築物中に含まれていてもよい。あるいはまた、アクチベータ分子もしくは複合体を発現する１または複数の導入遺伝子は、多酵素生合成経路において酵素をコード化する同義遺伝子を含有する構築物と異なる構築物上にあってもよい。アクチベータ分子は、不活性形態における構成的プロモーターを用いて発現させることができる。この不活性形態は、化学的誘導剤の適用後に活性化形態へ転化される。

生合成経路は、バイオポリマー、例えばポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、脂肪酸を含有する植物油、および栄養補助食品化合物を包含するいくつかの産物を形成しうる。ほかの生合成経路は、トリカルボン酸（「ＴＣＡ」）サイクル、ポリケチド合成経路、カロテノイド合成、解糖、糖新生、デンプン合成、リグニンおよび関連化合物の合成、殺虫剤、殺菌剤、または抗生物質として役立つ小さい分子の生成に関わる経路を包含する。同期的に生合成経路をコード化する遺伝子の転写を活性化するための誘導プロモーターの使用は、その産物の蓄積に最適な時点において所望の最終産物への代謝中間体の流れを結果として生じる。

（発明の詳細な説明）
同義遺伝子の形質転換のための構築物
これらの構築物は、２またはそれ以上の誘導プロモーター、タンパク質をコード化する２またはそれ以上の遺伝子からのコーディング領域、および２またはそれ以上のポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。あるいはまた、これらの構築物は、アクチベータ分子もしくはアクチベータ分子の成分によって活性化される１またはそれ以上のプロモーター、タンパク質をコード化する同義遺伝子からのコーディング領域、および１またはそれ以上のポリアデニル化シグナルを含有してもよい。これらの構築物は、１またはそれ以上の誘導プロモーター、アクチベータ分子もしくはアクチベータ分子の成分をコード化する１またはそれ以上の遺伝子のためのコーディング領域、および１またはそれ以上のポリアデニル化シグナルを含有する構築物とともに用いることができる。これらの構築物はまた、標的配列、例えばプラスチド標的配列をコード化する配列、ミトコンドリア標的配列、ペルオキシソーム標的配列、または組織特異的配列を含んでいてもよい。

１つの実施形態において、生合成経路核酸配列を多重誘導プロモーターの制御下に置く構築物は好ましくは、５’から３’方向において動作可能なように連結されて、２またはそれ以上のエレメントであって、各エレメントが、核酸配列の転写を導く（ｄｉｒｅｃｔ）誘導プロモーター；タンパク質をコード化する核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含有するエレメントを含有する。

別の実施形態において、生合成経路核酸配列を多重誘導プロモーターの制御下に置く構築物は好ましくは、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼタンパク質をコード化する第一核酸配列の転写を導く第一誘導プロモーター；ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼタンパク質をコード化する第一核酸配列；第一３’ポリアデニル化シグナル配列を（５’から３’方向において動作可能なように連結されて）含む第一エレメント；アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼタンパク質をコード化する第二核酸配列の転写を導く第二誘導プロモーター；アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼタンパク質をコード化する第二核酸配列；第二３’ポリアデニル化シグナル配列を（５’から３’方向において動作可能なように連結されて）含む第二エレメント；およびベータ−ケトチオラーゼタンパク質をコード化する第三核酸配列の転写を導く第三誘導プロモーター；ベータ−ケトチオラーゼタンパク質をコード化する第三核酸配列；および第三３’ポリアデニル化シグナル配列を（５’から３’方向において動作可能なように連結されて）含む第三エレメントを含有する。

１つの実施形態において、生合成経路において多重酵素を発現する遺伝子を含有する構築物は（５’から３’方向において動作可能なように連結されて）、２またはそれ以上の核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；タンパク質をコード化する２またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む。あるいはまたこの構築物は（５’から３’方向において動作可能なように連結されて）、２またはそれ以上のエレメントであって、各エレメントが、核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；タンパク質をコード化する核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含有するエレメントを含有してもよい。

これらの構築物は、アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を（５’から３’方向において動作可能なように連結されて）含有する構築物とともに用いられてもよい。あるいはまたこの構築物は、２またはそれ以上のエレメントであって、各エレメントが、アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を（５’から３’方向において動作可能なように連結されて）含有してもよい。

別の実施形態において、構築物は、２またはそれ以上のエレメントであって、各エレメントの少なくとも１つが、アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を５’から３’方向において動作可能なように連結されて含み；該エレメントの少なくとも１つが、２またはそれ以上の核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；各々タンパク質をコード化する２またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を５’から３’方向において動作可能なように連結されて含むエレメントを含有する。

あるいはまた、この構築物は、３またはそれ以上のエレメントであって、該エレメントの少なくとも１つが、アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を５’から３’方向において動作可能なように連結されて含み；該エレメントの少なくとも２つが各々、核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；タンパク質をコード化する核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を５’から３’方向において動作可能なように連結されて含むエレメントを含有する。

植物中の生合成産物の生成は、上記の構築物でこれらの植物を形質転換し、あらゆる数の薬剤（下に詳細に記載されている）で誘導プロモーターを活性化することによって得ることができる。化学薬品は、葉への噴霧および根浸漬を包含するいくつかの方法を用いて植物へ適用することができる。

Ａ．誘導プロモーター、および遺伝子発現の制御
誘導プロモーター系は、該遺伝子の発現およびエフェクターカセットを必要とする。該遺伝子は、誘導プロモーターの制御下に置かれる。エフェクターカセットは、誘導プロモーターの調節に責任があるタンパク質をコード化する遺伝子、典型的には強い構成的プロモーターの制御下に発現される転写リプレッサーもしくはアクチベータからなる（Ｃ．ＧａｔｚａｎｄＩ．Ｌｅｎｋ，ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔＳｃｉ．３：３５２（１９９８））。細菌、酵母、植物、または哺乳類細胞中の発現のためのいくつかの化学的誘導プロモーターが公知であり、入手可能である。

同義遺伝子が適切な形質転換ベクター中に挿入された時に、プロモーターおよび転写終結配列がこの構築物へ添加されてもよい。これらの多くは、商品として入手可能である。例えば、入手可能な多くの植物形質転換ベクターの選択肢がある（ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｔｏＰｌａｎｔｓ（１９９５），Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．ａｎｄＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＮｅｗＹｏｒｋ；“ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓ：ＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｏｔｅｉｎｓ”（１９９６），Ｏｗｅｎ，Ｍ．Ｒ．Ｌ．ａｎｄＰｅｎ，Ｊ．ｅｄｓ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＬｔｄ．ＥｎｇｌａｎｄａｎｄＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ−ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｃｏｕｒｓｅｍａｎｕａｌ（１９９５），Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，Ｋｌｅｓｓｉｇ，Ｄ．Ｆ．，Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ａ．Ｒ．，Ｇｒｕｉｓｓｅｍ，Ｗ．ａｎｄＶａｒｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．ｅｄｓ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。一般に、植物形質転換ベクターは、５’および３’調節配列の転写制御下の１またはそれ以上の該コーディング配列を含む。これは、プロモーター、転写終結および／またはポリアデニル化シグナル、および選択可能なもしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む。５’調節配列の通常の必要条件は、プロモーター、転写開始部位、およびＲＮＡプロセシングシグナルを包含する。

植物に用いられて成功した誘導プロモーター系は、広範囲に概説されている（Ｍ．Ｐａｄｉｄａｍ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＰｌａｎｔＢｉｏｌ．６，１６９（２００３）；Ｒ．Ｗａｎｇら、Ｔｒａｎｓ．Ｒｅｓ．１２，５２９（２００３）；Ｃ．ＧａｔｚａｎｄＩ．Ｌｅｎｋ，ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔＳｃｉ．３：３５２（１９９８））。これらの誘導系は、化学物質、例えばテトラサイクリン、プリスタマイシン、病原体、光、グルココルチコイド、エストロゲン、銅、除草剤毒性緩和剤（ｈｅｒｂｉｃａｉｄｅｓａｆｅｎｅｒ）、エタノール、ＩＰＴＧ（イソ−プロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）、および病原体によって活性化されうる。

好ましい実施形態において、プロモーターは、エクジソンおよびエクジソン類似体によって活性化される。エクジソン誘導プロモーターは、（例えば別の受容体、例えばグルココルチコイド受容体からの）ＤＮＡ結合ドメインへ、およびトランス活性化ドメイン（例えばＶＰ１６トランス活性化ドメイン）へ融合されたエクジソンリガンド結合ドメイン（例えばＨｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、，１９９９ａ）を含有する。エクジソン誘導プロモーターを活性化する作用物質は、エクジソン、非ステロイドエクジソン類似体、例えばビアシルヒドラジン分子テブフェノジド（商業的殺虫剤Ｍｉｍｉｃ（登録商標）の活性成分）、メトキシフェノジド（商業的殺虫剤Ｉｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）の活性成分）、フィトエクジステロイド、例えばムリステロンＡおよびポナステロンＡ、および昆虫ステロイドホルモン２０−ヒドロキシエクジソン（Ｌａｆｏｎｔ，Ｌ．＆Ｄｉｎａｎ，Ｌ．Ｊ．ＩｎｓｅｃｔＳｃｉｅｎｃｅ３：７−９５（２００３））を包含する。光によって活性化されるまで実際に不活性であるケージβ−エクジソンもまた、用いることができる（Ｌｉｎら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ９：１３４７−１３５３（２００２））。

エクジソン誘導プロモーターは、植物、例えば形質転換タバコ（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、ＰｌａｎｔＪ．１９：９７−１０６（１９９９））；トウモロコシ縣濁細胞（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６１：５４６−５５２（１９９９））；形質転換トウモロコシ（Ｕｎｇｅｒら、Ｔｒａｎｓ．Ｒｅｓ．１１：４５５−４６５（２００２））；および形質転換Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｐａｄｉｄａｍら、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎＰｌａｎｔＢｉｏｌ．６：１６９−１７７（２００３）；Ｋｏｏら、ＰｌａｎｔＪ．３７：４３９−４４８（２００４））に用いられて成功であった。

グルココルチコイド誘導プロモーターは、グルココルチコイドリガンドおよびＤＮＡ結合ドメイン、例えばヒトグルココルチコイド受容体からのものを含有する。誘導剤は、ステロイド化合物、例えばデキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、およびプレドニゾンを包含する。これらのプロモーターは、植物、例えば形質転換タバコ（ＡｏｙａｍａａｎｄＣｈｕａ，ＰｌａｎｔＪ．１１：６０５−６１２（１９９７）；Ｂｏｈｎｅｒら、ＰｌａｎｔＪ．１９：８７−９５（１９９９））；Ｇｒｅｍｉｌｌｏｎら、，ＰｌａｎｔＪ．３７：２１８−２２８（２００４））；タバコ縣濁細胞（Ｓｃｈｅｎａら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０４２１−１０４２５（１９９１））；形質転換Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｌｌｏｙｄら、，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６：４３６−４３９（１９９４））；形質転換米（Ｏｕｗｅｒｋｅｒｋら、，Ｐｌａｎｔａ２１３：３７０−３７８（２００１））；形質転換Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（Ｍｏｒｉら、ＰｌａｎｔＪ．２７：７９−８６（２００１））；およびＶｉｒｇｉｎｉａマツ細胞培養物（ＴａｎｇａｎｄＮｅｗｔｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ５５：１４９９−１５０８（２００４））に用いられて成功であった。

エストロゲン誘導プロモーターは、エストロゲン受容体のリガンド結合ドメイン、典型的にはヒトエストロゲン受容体のものを含有する。誘導剤は、β−エストラジオールを包含する。エストロゲン誘導プロモーターは、植物、例えば形質転換Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｚｕｏら、ＰｌａｎｔＪ．２４：２６５−２７３（２０００））；形質転換タバコ（Ｚｕｏら、ＰｌａｎｔＪ．２４：２６５−２７３（２０００））；形質転換Ｎｉｃｏｔｉｎｉａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（Ｇｕｏら、ＰｌａｎｔＪ．３４：３８３−３９２（２００３））；およびトウモロコシ縣濁細胞（Ｂｒｕｃｅら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１２：６５−７９（２０００））に用いられて成功であった。

エタノール誘導プロモーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓのａｌｃレギュロンをベースとする。エタノール誘導プロモーターは、植物、例えば形質転換タバコ（Ｃａｄｄｉｃｋら、，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１７７−１８０（１９９８）；Ｓｗｅｅｔｍａｎら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１２９：９４３−９４８（２００２））、形質転換ジャガイモ（Ｓｗｅｅｔｍａｎら、，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１２９：９４３−９４８（２００２））、形質転換油料種子セイヨウアブラナ（Ｓｗｅｅｔｍａｎら、，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１２９：９４３−９４８（２００２））、形質転換Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｒｏｓｌａｎら、ＰｌａｎｔＪ．２８：２２５−２３５（２００１））に用いられて成功であった。

除草剤毒性緩和剤誘導プロモーターは、トウモロコシＩｎ２−２プロモーターに関与しうる。典型的な誘導剤は、除草剤毒性緩和剤、例えばベンゼンスルホンアミドおよびスルホニルウレア除草剤クロルスルフロンを包含する。除草剤毒性緩和剤誘導プロモーターは、植物に用いられて成功であった（ＤｅＶｅｙｌｄｅｒら、，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３８：５６８−５７７（１９９７））。

銅誘導プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａにおいて銅解毒遺伝子の発現を調節する制御エレメントをベースとする。典型的な誘導剤は、硫酸銅（ＣｕＳＯ_４）である。銅誘導プロモーターは、植物、例えば形質転換タバコ（Ｍｅｔｔら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：４５６７−４５７１（１９９３））に用いられて成功であった。

テトラサイクリン誘導プロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ．からのテトラサイクリン抵抗オペロンのエレメントからなることがある。これらのプロモーターは、アクチベータまたはリプレッサーとして、および二重制御を得るためにほかの誘導系と組み合わせて用いることができる。例えばｔｅｔ誘導リプレッサー系は、厳密に制御されたオン／オフスイッチを得るために、グルココルチコイド誘導系と組み合わされてもよい（Ｂｏｈｎｅｒら、，ＰｌａｎｔＪ．１９：８７−９５（１９９９））。このテトラサイクリン応答プロモーター／テトラサイクリン制御トランスアクチベータ（ｔＴＡ）系は、当業界において周知である（ＧｏｓｓｅｎＭａｎｄＢｕｊａｒｄＨＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９：５５４７−５５５１（１９９２）；Ａｄａｍｓら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５（６）；１０２８−１０３６（１９９９））。テトラサイクリン誘導プロモーターは、植物、例えば形質転換タバコ（Ｂｏｈｎｅｒら、，ＰｌａｎｔＪ．１９：８７−９５（１９９９））およびタバコプロトプラスト（ＧａｔｚａｎｄＱｕａｉｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：１３９４−１３９７（１９８８））に用いられて成功であった。

プリスタマイシン−誘導プロモーターは、ＰＩＰタンパク質、すなわちＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのプリスタマイシンオペロンのリプレッサーからなる転写アクチベータ（ＰＩＴ）をベースとする。誘導剤は、ストレプトグラミン抗生物質プリスタマイシンを包含する。プリスタマイシン誘導プロモーターは、植物、例えばタバコ縣濁細胞に用いられて成功であった（Ｆｒｅｙら、，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７４：１５４−１６３（２００１））。

病原体誘導プロモーターは、ジャガイモからのＰｒｐｌ−ａプロモーターに関与しうる。誘発剤は、病原体攻撃を包含するが、これらのプロモーターは、化学物質、例えばベノチアジアゾール（ＢＴＨ）およびサリチル酸に応答する。病原体誘導プロモーターは、植物、例えばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよびタバコに用いられて成功であった（Ｂｏｈｍｅｒｔら、，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１２８：１２８２−１２９０（２００２））。

イソ−プロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃリプレッサーの合成非加水分解型誘導物質である。研究は、ＩＰＴＧが、ｌａｃリプレッサー／オペレーター系によって制御された宿主細胞遺伝子の発現を誘導するために細胞中に用いうることを実証した（Ｗｉｌｄｅら、，ＥＭＢＯＪ．１１，１２５１−１２５９（１９９２）；Ｉｔｚｈａｋｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：２５８−２６５（１９９７））。

これらのプロモーターの誘導は、誘導剤の安定性および／または取り込みを増加させるか、または誘導プロモーターのリガンド結合ドメインのための誘導剤の親和性を増加させることによって、誘導剤の効率を高めて最適化することができる。誘導剤の構造の化学的修飾および／または誘導剤を含有する溶液の配合は、これらの目標を達成するために用いることができるであろう。

これらの誘導プロモーターは、この系の誘導性を改良するために、リガンドおよび／またはＤＮＡ結合ドメインおよび／または最小プロモーターを増強するために遺伝子シャッフル技術を通して最適化することができるであろう。

植物プロモーターは、異なる植物組織または細胞小器官における導入遺伝子の発現を制御するために選択することができる。これらの方法のすべてについては、当業者に公知である（Ｇａｓｓｅｒ＆Ｆｒａｌｅｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２９３−９９（１９８９））。導入遺伝子の５’末端は、プラスチドまたはほかの細胞以下の細胞小器官標的ペプチド、例えば導入遺伝子とインフレーム連結されたプラスチド標的シグナルをコード化する配列を含むように作り変えられてもよい。

Ｂ．生合成経路における酵素
多酵素生合成経路において酵素をコード化する同義遺伝子の導入のための方法および構築物が提供される。

１つの実施形態において、これらの構築物は、各々が生合成経路中の異なるタンパク質をコード化する、同義遺伝子配列の発現を駆動する誘導プロモーターを含有する。これらの構築物は、この調節に責任があるタンパク質をコード化する遺伝子からなるエフェクターカセットを含有する。この遺伝子は、ポリアデニル化シグナルを有し、典型的には、強い構成的または組織特異的プロモーターの制御下に置かれる。これらの構築物は、各々が誘導プロモーターの制御下にあり、かつ各々がポリアデニル化シグナルを有する、２またはそれ以上の、例えば２〜１２、好ましくは２〜８、より好ましくは２〜７酵素コード化遺伝子を含有し、形質転換生物を生成するために用いられる。これらの生物において、酵素の発現は、化学的誘導剤が適用された時に増加され、導入遺伝子によってコード化された一連の酵素の産物が生成される。一例としてＰＨＢ生合成経路を用いたこのような構築物の図解が、図１に示されている。

好ましい実施形態において、導入遺伝子の産物は、バイオポリマー、例えばポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、所望の工業的または栄養的プロフィールを有する脂肪酸を含む植物油、または栄養補助食品化合物の生成のために必要とされる酵素およびほかの因子である。

この産物がＰＨＡである場合、これは３−ヒドロキシブチレートのホモポリマーもしくはコポリマーであってもよい。この場合、導入遺伝子は、ベータ−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢ（「短鎖」）シンターゼ、ＰＨＡ（「長鎖」）シンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、デヒドラターゼ、イソメラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、脂肪酸合成酵素、および脂肪酸ベータ−酸化酵素から選択される酵素をコード化しうる。有用な遺伝子は、当業界において周知であり、例えばＳｎｅｌｌａｎｄＰｅｏｐｌｅｓＭｅｔａｂ．Ｅｎｇ．４：２９−４０（２００２）およびＢｏｈｍｅｒｔら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎｔＯｒｇａｎｅｌｌｅｓ．Ｈ．Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｃ．Ｄ．ＣｈａｓｅＥｄｓ．（ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；２００４，ｐｐ．５５９−５８５）によって開示され、図２および３において概略が示されている。

ＰＨＡ合成の例は、中鎖長基質特異性を有するシンターゼ、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓからのｐｈａＣ１（第ＷＯ９１／００９１７号；Ｈｕｉｓｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２１９１−２１９８（１９９１））もしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｔｉｍｍ，Ａ．＆Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：１５−３０（１９９２））、短鎖長特異性を有するＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓからのシンターゼ（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．＆Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−１５３０３（１９８９））、または２つのサブユニットシンターゼ、例えばｐｈａＥおよびｐｈａＣによってコード化されたＴｈｉｏｃａｐｓａｐｆｅｎｎｉｇｉｉからのシンターゼ（米国特許第６，０１１，１４４号）を包含する。ほかの有用なＰＨＡシンターゼ遺伝子が、例えばＡｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖｉａｅ（Ｆｕｋｕｉ＆Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−３０（１９９７），Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ（米国特許第５，８４９，８９４号）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ（Ｐｉｅｐｅｒ＆Ｓｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９６（１）：７３−８０（１９９２）），およびＮｏｃａｒｄｉａｃｏｒａｌｌｉｎａ（Ｈａｌｌら、，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６８７−９１（１９９８））から単離されている。３−ヒドロキシブチレートおよびより長鎖長（６〜１４炭素原子）のヒドロキシ酸のコポリマーを生成するのに有用な幅広い基質特異性を有するＰＨＡシンターゼもまた、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．Ａ３３（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：９０１−９０９（１９９５））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．６１−３（Ｋａｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４５：３６３−３７０（１９９６））から単離されている。

様々なＰＨＡシンターゼ遺伝子、およびＰＨＡ生合成において有用な追加の代謝工程をコード化する遺伝子が、ＭａｄｉｓｏｎａｎｄＨｕｉｓｍａｎ，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ６３：２１−５３（１９９９）によって記載されている。

ベータ−酸化のアルファサブユニットは、ヒドラターゼおよびデヒドロゲナーゼ活性を最小限に有する多機能酵素に属する（図２）。このサブユニットはまた、エピメラーゼおよびΔ３−シス、Δ２−トランスイソメラーゼ活性も有することがある。ベータ−酸化のアルファサブユニットの例は、Ｅ．ｃｏｌｉからのＦａｄＢ（ＤｉＲｕｓｓｏ，Ｃ．Ｃ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０，１７２，６４５９−６４６８）、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉからのＦａｏＡ（Ｓａｔｏ，Ｓ．，Ｈａｙａｓｈｉ，ら、，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２，１１１，８−１５）、およびβ−酸化の多機能αサブユニットへの相同体を含むＥ．ｃｏｌｉオープンリーディングフレームｆ７１４（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ＃１７８８６８２）である。β−酸化のβサブユニットは、そのパートナーのαサブユニットと多機能酵素錯体を形成しうるポリペプチドのことを言う。このβサブユニットは、チオラーゼ活性を有する（図２）。βサブユニットの例は、Ｅ．ｃｏｌｉからのＦａｄＡ（ＤｉＲｕｓｓｏ，Ｃ．Ｃ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６４５９−６４６８（１９９０））、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉからのＦａｏＢ（Ｓａｔｏ，Ｓ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．，Ｉｍａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｏｚｅｋｉ，Ｙ．，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ａ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１１：８−１５（１９９２））、およびβ−酸化のαサブユニットへの相同体を含むＥ．ｃｏｌｉオープンリーディングフレームｆ４３６（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＥ０００３２２；遺伝子ｂ２３４２）である。

レダクターゼとは、β−ケトアシルＣｏＡをＲ−３−ＯＨ−アシルＣｏＡへ還元しうる酵素、例えばＣｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍからのＮＡＤＨ依存性レダクターゼ（Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌ，Ｍ．，＆Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：１３５−１５０（１９９２））、ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓからのＮＡＤＰＨ依存性レダクターゼ（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．＆Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９３−１５２９７（１９８９））、ＺｏｏｇｌｏｅａｒａｍｉｇｅｒａからのＮＡＤＰＨレダクターゼ（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．＆Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ３：３４９−３５７（１９８９））、またはＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍからのＮＡＤＰＨレダクターゼ（米国特許第６，８３５，８２０号）のことを言う。

ベータ−ケトチオラーゼとは、アセチルＣｏＡおよびアシルＣｏＡのβ−ケトアシルＣｏＡへの転化であって、可逆性である反応を触媒しうる酵素のことを言う（図２）。このようなチオラーゼの一例は、ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｕｓからのＰｈａＡ（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｏ．Ｐ．＆Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９３−１５２９７（１９８９））、およびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓからのＢｋｔＢ（Ｓｌａｔｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（８）：１９７９−８７（１９９８））である。アシルＣｏＡオキシダーゼとは、飽和アシルＣｏＡをΔ２不飽和アシルＣｏＡへ転化しうる酵素のことを言う（図２）。アシルＣｏＡオキシダーゼの例は、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＰＯＸ１（Ｄｍｏｃｈｏｗｓｋａ，ら、Ｇｅｎｅ，１９９０，８８，２４７−２５２）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａからのＡＣＸ１（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＡＦ０５７０４４）である。カタラーゼとは、過酸化水素を水素および酸素へ転化しうる酵素のことを言う。カタラーゼの例は、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａからのＫａｔＢ（Ｂｒｏｗｎ，ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：６５３６−６５４４（１９９５））およびＥ．ｃｏｌｉからのＫａｔＧ（Ｔｒｉｇｇｓ−Ｒａｉｎｅ，Ｂ．Ｌ．＆Ｌｏｅｗｅｎ，Ｐ．Ｃ．Ｇｅｎｅ５２：１２１−１２８（１９８７））である。

導入遺伝子コード化酵素の産物が変性油である場合、これらの導入遺伝子は、チオエステラーゼ、デルタ−９−デサチュラーゼ、オメガ−３−デサチュラーゼ、オメガ−６−デサチュラーゼ、脂肪酸エロンガーゼ、ヒドロキシラーゼ、および／またはトリアシル−グリセロール生合成酵素から選択される酵素をコード化しうる。これらの酵素は、米国特許第６，１４０，４８６号；米国特許第５，９５５，６５０号；米国特許第６，４３３，２５０号；米国特許第６，０５１，７５４号；米国特許第６，６３５，４５１号；Ｓｉｎｇｈら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０９：１４９８（１９９５）；Ｔａｎｇら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１９：３６４（１９９９）；およびＭａｄｉａｎｄＰｒｕｓｋｙＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１２１：１０５７（１９９９））を包含する、いくつかの引例に開示されている。植物油産物は、工業用途のための改良された脂肪酸組成物、例えば高ヒドロキシ酸含量、高オレイン酸含量、またはより高いかまたはより低い不飽和脂肪酸含量を有していてもよい。菜種油のラウリン酸含量を増すための遺伝子および系は、Ｋｎｕｔｚｏｎら、（１９９９，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１２０．７３９−７４６）によって記載されており、図４に示されている。植物油産物が栄養特性を増強してしまっている場合、これは減少した不飽和脂肪酸含量、例えば高オレイン酸またはラウリン酸含量、または向上したレベルの長鎖多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を有しうる。油料種子中のＰＵＦＡのレベルを高めるための遺伝子および系は、Ｑｉら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２２：７３９−７４５（２００４）によって記載され、図５に概要が示されている。新しい油料種子作物の生産のための追加の代謝エンジニアリング戦略は、Ｄｒｅｘｌｅｒら、ＪＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ１６０：７７９−８０２（２００３）によって概説されている。

導入遺伝子コード化酵素の産物はまた、栄養補助食品化合物、例えばβ−カロチン（プロビタミンＡ）であってもよい。形質転換米においてβ−カロチンを生成するための遺伝子および系は、Ｙｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８７：３０３−３０５（２０００）によって記載され、図６に概要が示されている。誘導発現カセット中の導入遺伝子は、図６の反応１〜５から選択される酵素活性をコード化しうる。

Ｃ．標的配列
多重酵素反応をコード化する導入遺伝子は、ネイティブ多酵素錯体、例えば微生物脂肪酸酸化錯体、またはアミノ酸経路酵素活性をコード化する二機能酵素、例えばトレオニン生成に関与するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉホモセリンデヒドロゲナーゼ−アスパルトキナーゼをコード化しうる。多機能酵素をコード化するこのような遺伝子の多くの例が文献中に存在する。ほかの例では、導入遺伝子は、遺伝子融合技術を通して多機能酵素をコード化するように構成されてもよい。このような技術において、異なる遺伝子のコーディング配列は、個々の遺伝子の活性を有する単一タンパク質をコード化する単一遺伝子を得るために、リンカー配列をともなって、またはこれらをともなわずに融合される。このような合成融合遺伝子／酵素の組み合わせは、分子進化テクノロジーを用いて、さらに最適化することができる。

別の実施形態において、多酵素生合成経路において酵素をコード化する同義遺伝子を含有する構築物は、１または複数の導入遺伝子から発現されたアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化される１またはそれ以上のプロモーターの制御下に置かれる。これらの導入遺伝子は、１またはそれ以上の誘導プロモーターの制御下にあり、化学物質の外部適用後にスイッチオンされる。この状況において、形質転換生物は、アクチベータ分子もしくはアクチベータ分子の１成分の発現を増加させる化学的誘導剤で処理される。この分子はついで、代謝産物の生成に最適な時に多酵素活性をコード化する導入遺伝子の発現を増加させうる。

両方の実施形態において、誘導は理想的には、所望産物のレベルを向上させるために植物の成長サイクルにおける一時点において実施される。好ましくは化学的誘導剤は、葉への噴霧として適用される（Ｔｏｍｉｎａｃｋ，ＪＴｏｘｉｃｏｌＣｌｉｎＴｏｘｉｃｏｌ．３８（２）：１２９−３５（２０００））。ただし根浸漬は、有用な代替方法である（Ｈｏｌｔら、Ｐｌａｎｔａ．１９６（２）：２９５−３０２（１９９５））。代謝産物は、植物のあらゆる部分、例えば葉、茎、花、種子、またはこれらのあらゆる組み合わせにおいて生成されうる。

異種ヌクレオチド配列はさらに、発現されることになる酵素をコード化する領域内に、標的配列を含む１またはそれ以上のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。「標的」配列は、酵素の一部として、タンパク質を特定の細胞区画へ導き、その結果としてこのタンパク質の局部化または区画化を生じるアミノ酸配列もしくはモチーフをコード化するヌクレオチド配列である。タンパク質における標的アミノ酸配列の存在は典型的には、細胞小器官を横断して細胞小器官内部中へ入る、標的されたタンパク質のすべてまたは一部の転座を結果として生じる。あるいはまたこれは、標的されたタンパク質を、細胞小器官膜中に埋め込まれたままにするように導くことができる。「標的」配列または標的タンパク質の領域は、隣接アミノ酸または一群の非隣接アミノ酸のストリングを含んでいてもよい。標的配列は、標的されたタンパク質を、植物細胞小器官、例えば核、ミクロボディー（例えばペルオキシソーム、またはこれの特殊化バージョン、例えばグリオキシソーム）、小胞体、エンドソーム、液胞、原形質膜、細胞壁、ミトコンドリア、葉緑体、またはプラスチドへ導くように選択することができる。

葉緑体標的配列は、タンパク質を葉緑体またはプラスチド、例えばアルファルファリブロース−ビホスフェートカルボキシラーゼの小さいサブユニットのトランジットペプチドへ標的することができるあらゆるペプチド配列である（Ｋｈｏｕｄｉら、，Ｇｅｎｅ１９９７，１９７，３４３−３５１）。ペルオキシソーム標的配列は、Ｎ−末端であれ、内部であれ、またはＣ−末端であれ、タンパク質をペルオキシソームへ標的することができるあらゆるペプチド配列、例えば植物Ｃ−末端標的トリペプチドＳＫＬのことを言う（Ｂａｎｊｏｋｏ，Ａ．＆Ｔｒｅｌｅａｓｅ，Ｒ．Ｎ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１９９５，１０７，１２０１−１２０８；Ｔ．Ｐ．Ｗａｌｌａｃｅら、，“ＰｌａｎｔＯｒｇａｎｅｌｌｕｌａｒＴａｒｇｅｔｉｎｇＳｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｒ．Ｃｒｏｙ，ＢＩＯＳＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＬｉｍｉｔｅｄ（１９９３）ｐｐ．２８７−２８８。そして植物中のペルオキシソーム標的は、Ｍ．Ｖｏｌｏｋｉｔａ，ＴｈｅＰｌａｎｔＪ．，３６１−３６６（１９９１）に示されている）。

Ｄ．マーカー遺伝子
植物における使用のための選択可能マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子ｎｐｔＩＩ（米国特許第５，０３４，３２２号、米国特許第５，５３０，１９６号）、ハイグロマイシン抵抗遺伝子（米国特許第５，６６８，２９８号）、およびホスフィノトリシンへの抵抗性をコード化するバー遺伝子（米国特許第５，２７６，２６８号）を包含する。第ＥＰ０５３０１２９Ａ１号は、成長培地へ添加された不活性化合物を活性化する酵素をコード化する導入遺伝子を発現することによって、形質転換植物を、非形質転換株よりも早く成長させることができる正の選択系について記載している。米国特許第５，７６７，３７８号は、形質転換植物の正の選択のためのマンノースもしくはキシロースの使用について記載している。スクリーニング可能なマーカー遺伝子は、ベータ−グルクロニダーゼ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、，１９８７，ＥＭＢＯＪ．６：３９０１−３９０７；米国特許第５，２６８，４６３号）およびネイティブまたは修飾グリーン蛍光タンパク質遺伝子（Ｃｕｂｉｔｔら、，１９９５，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ．２０：４４８−４５５；Ｐａｎら、，１９９６，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１２：８９３−９００）を包含する。これらのマーカーのいくつかは、特徴、例えば除草剤抵抗性を該植物中に導入するという追加の利点を有し、インプット側に追加の農業価値を与える。

Ｅ．転写終結配列
転写の極端３’末端において、ポリアデニル化シグナルは作り変えることができる。ポリアデニル化シグナルとは、サイトソル、例えばノパリンシンターゼの３’領域へのｍＲＮＡの輸出に先立つ、核中のｍＲＮＡのポリアデニル化を結果として生じうるあらゆる配列のことを言う（Ｂｅｖａｎ，Ｍ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｃｈｉｌｔｏｎ，Ｍ．Ｄ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８３，１１，３６９−３８５）。

ＩＩ．構築物の使用方法
Ａ．形質転換
本明細書に記載された方法において有用なＤＮＡ構築物は、導入遺伝子を植物中へ導入しうる形質転換ベクターを包含する。本明細書において用いられているように、「形質転換（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」とは、異種ヌクレオチド配列を含有する核酸断片が導入されている生物のことを言う。形質転換生物中の導入遺伝子は好ましくは安定であり、遺伝性である。異種核酸断片は、宿主ゲノム中に統合されてもよく、統合されなくてもよい。

いくつかの植物形質転換ベクターの選択肢が利用可能である。これは、“ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｔｏＰｌａｎｔｓ”（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、，ｅｄｓ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＮｅｗＹｏｒｋ（１９９５）；“ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓ：ＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｏｔｅｉｎｓ”（Ｏｗｅｎら、，ｅｄｓ．）ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＬｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９６）；および“ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ”（Ｍａｌｉｇａら、ｅｄｓ．）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９５）に記載されているものを包含する。植物形質転換ベクターは一般に、５’および３’調節配列の転写制御下に１またはそれ以上の該コーディング配列を含む。これは、プロモーター、転写終結および／またはポリアデニル化シグナル、および選択可能もしくはスクリーニング可能マーカー遺伝子を包含する。単一転写からの２またはそれ以上のポリペプチドの発現のために、追加のＲＮＡプロセシングシグナルおよびリボザイム配列は、この構築物へ作り変えることができる（米国特許第５，５１９，１６４号）。この研究方法は、多重導入遺伝子を単一座に配置するという利点を有する。このことは、その後の植物育種努力において有利である。追加の研究方法は、相同組換えによって植物プラスチド染色体を特異的に形質転換するためにベクターを用いることである（米国特許第５，５４５，８１８号）。この例では、プラスチドゲノムの原核生物の性質を利用し、いくつかの導入遺伝子をオペロンとして挿入することが可能である。

これらのベクターを用いた適切な農作物宿主の形質転換は、多様な方法および植物組織を用いて達成することができる。本明細書に開示された方法において有用な代表的植物は、ｎａｐｕｓ、ｒａｐｐａ，ｓｐ．ｃａｒｉｎａｔａ、およびｊｕｎｃｅａを包含するアブラナ属；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ；トウモロコシ；大豆；綿の実；ヒマワリ；ヤシ；ココナツ；サフラワー；ピーナッツ；Ｓｉｎａｐｉｓａｌｂａを包含するカラシナ；サトウキビおよび亜麻を包含する。バイオマスとして収穫された作物、例えばサイレージコーン、アルファルファ、スイッチグラス、サトウモロコシ、またはタバコもまた、本明細書に開示された方法の場合に有用である。これらのベクターを用いた形質転換にとって代表的な組織は、プロトプラスト、細胞、カルス組織、リーフディスク、花粉、および分裂組織（ｍｅｒｉｓｔｅｍ）を包含する。代表的な形質転換手順は、アグロバクテリウム仲介形質転換、パーティクルガン（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール仲介プロトプラスト形質転換、リポソーム仲介形質転換、およびシリコン繊維−仲介形質転換を包含する（米国特許第５，４６４，７６５号；“ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｔｏＰｌａｎｔｓ”（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、，ｅｄｓ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＮｅｗＹｏｒｋ（１９９５）；“ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓ：ＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｏｔｅｉｎｓ”（Ｏｗｅｎら、，ｅｄｓ．）ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＬｔｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９６）；および“ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ”（Ｍａｌｉｇａら、ｅｄｓ．）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９５））。

大豆は、いくつかの報告されている手順によって形質転換することができる（米国特許第５，０１５，５８０号；米国特許第５，０１５，９４４号；米国特許第５，０２４，９４４号；米国特許第５，３２２，７８３号；米国特許第５，４１６，０１１号；米国特許第５，１６９，７７０号）。

形質転換トウモロコシ植物の生産のために、いくつかの形質転換手順が報告されている。これは、花粉形質転換（米国特許第５，６２９，１８３号）、シリコン繊維−仲介形質転換（米国特許第５，４６４，７６５号）、プロトプラストのエレクトロポレーション（米国特許第５，２３１，０１９号；米国特許第５，４７２，８６９号；米国特許第５，３８４，２５３号）、遺伝子ガン（米国特許第５，５３８，８７７号；米国特許第５，５３８，８８０号）、およびアグロバクテリウム仲介形質転換（第ＥＰ０６０４６６２Ａ１号；第ＷＯ９４／００９７７号）を包含する。アグロバクテリウム仲介手順が特に好ましいが、それは、形質転換構築物の単一統合事象が、その後の植物育種を非常に容易にするこの手順を用いて、より容易に得られるからである。綿は、パーティクルボンバードメントによって形質転換することができる（米国特許第５，００４，８６３号；米国特許第５，１５９，１３５号）。ヒマワリは、パーティクルボンバードメントとアグロバクテリウム感染との組み合わせを用いて形質転換することができる（第ＥＰ０４８６２３３Ａ２号；米国特許第５，０３０，５７２号）。亜麻は、パーティクルボンバードメントまたはアグロバクテリウム仲介形質転換のどちらかによって形質転換することができる。スイッチグラスは、パーティクルガンまたはアグロバクテリウム仲介方法のどちらかを用いて形質転換することができる（Ｒｉｃｈａｒｄｓら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．２０：４８−５４（２００１）；Ｓｏｍｌｅｖａら、ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ４２：２０８０−２０８７（２００２））。サトウキビ形質転換方法もまた記載されている（Ｆｒａｎｋｓ＆ＢｉｒｃｈＡｕｓｔ．Ｊ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１８，４７１−４８０（１９９１）；ＰＣＴ第ＷＯ２００２／０３７９５１号）。

本発明の実施において有用なリコンビナーゼテクノロジーは、ｃｒｅ−ｌｏｘ、ＦＬＰ／ＦＲＴ、およびＧｉｎ系を包含する。これらのテクノロジーが、本明細書に記載された目的のために利用されうる方法は、例えば（米国特許第５，５２７，６９５号；ＤａｌｅＡｎｄＯｗ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０５５８−１０５６２；Ｍｅｄｂｅｒｒｙら、，１９９５，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３：４８５−４９０）に記載されている。

上に記載された方法のいずれか１つによる形質転換の後、次の手順は、導入遺伝子を発現する形質転換植物を得るために用いることができる：選択的媒質上で形質転換された植物細胞を選択する；差別化された植物を生産するために形質転換された植物細胞を再生する；所望の組織および細胞位置において所望レベルの１または複数の所望ポリペプチドを生成する導入遺伝子を発現する形質転換植物を選択する。

Ｂ．生合成産物の生成
多重酵素の発現は、例えば栄養性アミノ酸のレベルを増加させるため（Ｆａｌｃｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：５７７（１９９５））、リグニン代謝を修飾するため（Ｂａｕｃｈｅｒら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：３０５−３５０（２００３））、油組成物を修飾するため（Ｄｒｅｘｌｅｒら、Ｊ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１６０：７７９−８０２（２００３））、デンプンを修飾するため、またはポリヒドロキシアルカノエートポリマーを生成するため（ＨｕｉｓｍａｎｎａｎｄＭａｄｉｓｏｎ，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌａｎｄＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：２１−５３（１９９９）；およびその中の参考文献）、植物の代謝の改変のために有用である。好ましい実施形態において、導入遺伝子の産物は、バイオポリマー、例えばポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、所望の工業的または栄養的プロフィールを有する脂肪酸を含有する植物油、または栄養補助食品化合物である。

ＰＨＡバイオポリマーの生成
ＰＨＡバイオポリマーの生成のための植物の修飾は、どのようにしてこれらの構築物を用いることができるかの好ましい一例である。ＰＨＡバイオポリマーは、異なるモノマー組成および広い範囲の物理的性質を有する広い種類のポリエステルを包含する（ＭａｄｉｓｏｎａｎｄＨｕｉｓｍａｎｎ，１９９９；Ｄｕｄｅｓｈら、Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２５：１５０３−１５５５（２０００））。短鎖、中鎖、ならびに短鎖および中鎖長ＰＨＡのコポリマーは、ポリマーが蓄積されることになる細胞小器官において、ＰＨＡシンターゼの基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡを生成するために、植物の自然代謝を操作することによって植物中に生成することができる。これは多くの場合、適切な細胞小器官標的シグナルが付着された、２またはそれ以上の組換えタンパク質の発現を必要とする。これらのタンパク質は、単一形質転換事象を介して植物中に導入された単一構築物から同調的に（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ）発現させることができる。一般にＰＨＡは、１またはそれ以上のモノマー単位の重合（例えば酵素重合）によって形成される。このようなモノマー単位の例は、例えば３−ヒドロキシブチレート、グリコール酸、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシノナノエート、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシドデカノエート、３−ヒドロキシドデセノエート、３−ヒドロキシテトラデカノエート、３−ヒドロキシヘキサデカノエート、３−ヒドロキシオクタデカノエート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、および６−ヒドロキシヘキサノエートを包含する。

いくつかの実施形態において、このＰＨＡは、化学式−ＯＣＲ_１Ｒ_２（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｎＣＯ−を有する少なくとも１つのモノマー単位を有する。ｎはゼロまたは整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０、１１、１２、１３、１４、１５など）である。Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、およびＲ_４の各々は、水素原子、飽和炭化水素基、または不飽和炭化水素基である。Ｒ_１は、Ｒ_２、Ｒ_３、およびＲ_４の各々と同一または異なる。Ｒ_２は、Ｒ_１、Ｒ_３、およびＲ_４の各々と同一または異なる。Ｒ_３は、Ｒ_２、Ｒ_１、およびＲ_４の各々と同一または異なり、Ｒ_４は、Ｒ_２、Ｒ_３、およびＲ_１の各々と同一または異なる。

いくつかの実施形態において、このＰＨＡは、ホモポリマーである。このようなホモポリマーの例は、ポリ−４−ヒドロキシブチレート、ポリ−４−ヒドロキシバレレート、ポリ−３−ヒドロキシプロピオネート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート、ポリ−３−ヒドロキシヘキサノエート、ポリ−３−ヒドロキシヘプタノエート、ポリ−３−ヒドロキシオクタノエート、ポリ−３−ヒドロキシデカノエート、およびポリ−３−ヒドロキシドデカノエートを包含する。いくつかの実施形態において、このＰＨＡは、２またはそれ以上の異なるモノマー単位を含有するコポリマーである。このようなコポリマーの例は、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシバレレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−６−ヒドロキシヘキサノエート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘプタノエート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシオクタノエート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシデカノエート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシドデカノエート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシオクタノエート−ｃｏ−３−ヒドロキシデカノエート、ポリ−３−ヒドロキシデカノエート−ｃｏ−３−ヒドロキシオクタノエート、およびポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシオクタデカノエートを包含する。

このＰＨＡは、少なくとも約５００ダルトン（例えば少なくとも約１０，０００ダルトン、少なくとも約５０，０００ダルトン）および／または約２，０００，０００ダルトン未満（例えば約１，０００，０００ダルトン未満、約８００，０００ダルトン未満）のポリスチレン当量重量平均分子量を有してもよい。本明細書において用いられているように、重量平均分子量は、ＰＨＡサンプルのための溶離液および希釈剤の両方として、例えばクロロホルムを用いて、ゲル透過クロマトグラフィーによって決定される。分子量を決定するための較正曲線は、ポリスチレン分子量標準を用いて発生させることができる。

このＰＨＡがポリ−３−ヒドロキシブチレートコポリマー（例えばポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート、および／またはポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシオクタノエート−ｃｏ−３−ヒドロキシデカノエート−ｃｏ−３−ヒドロキシドデカノエート）であるいくつかの実施形態において、これらのモノマー単位の大部分は、３−ヒドロキシブチレート（例えばこれらのモノマー単位の少なくとも約５０％が、３−ヒドロキシブチレートであり、これらのモノマー単位の少なくとも約６０％が、３−ヒドロキシブチレートである）である。

細菌において、各ＰＨＡモノマーは、特異的経路によって生成される。短い懸垂基ＰＨＡの場合、３つの酵素が関与している。すなわち、ベータ−キトチオラーゼ（図２、反応８）、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（図２、反応９）、およびＰＨＡシンターゼ（図２、反応１０）である。短鎖長ＰＨＡシンターゼは典型的には、４−ヒドロキシおよび５−ヒドロキシ酸の両方の単位を包含するＣ_３−Ｃ_５ヒドロキシ酸モノマーの重合を可能にする。この生合成経路は、いくつかの細菌、例えばＲａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｌａｔｕｓ、Ｚｏｏｇｌｏｅａｒａｍｉｇｅｒａなどに見られる（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｌ．Ｌ．＆Ｈｕｉｓｍａｎ，Ｇ．Ｗ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ１９９９，６３，２１−５３）。短鎖長ＰＨＡ合成を促進するための活性は、単一形質転換事象を介して宿主植物中に導入することができる。必要であれば、これらの酵素をコード化する遺伝子は、成熟タンパク質を、この細胞の特定区画へスプライシングした後に標的するペプチド標的シグナルをコード化するＤＮＡ配列へ融合させることができる。

中鎖長懸垂基ＰＨＡは、多くの異なるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌によって生成される。ヒドロキシアシル−コエンザイムＡモノマー単位は、脂肪酸ベータ−酸化（図２）および脂肪酸生合成経路（図３）が起源であってもよい。これらのモノマー単位はついで、より大きいＣ_６−Ｃ_１４モノマー単位に有利に働く基質特異性を有するＰＨＡシンターゼによってポリマーへ転化される（図２、反応７；図３、反応５；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｌ．Ｌ．＆Ｈｕｉｓｍａｎ，Ｇ．Ｗ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ１９９９，６３，２１−５３）。脂肪酸ベータ−酸化経路からの中鎖長ＰＨＡ合成を促進する活性は、図２、反応１−７に記載された酵素から選択される、単一形質転換事象を介して宿主植物中に導入することができる。必要であれば、これらの酵素をコード化する遺伝子は、タンパク質を、この細胞特定の区画へ標的するペプチド標的シグナルをコード化するＤＮＡ配列へ融合させることができる。

ＰＨＡ合成と脂肪酸生合成との間の酵素連結は、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａの両方において報告されている（図３、反応１）。脂肪酸生合成からの炭素の転換（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ）に責任があると考えられている酵素をコード化する遺伝子座は、ｐｈａＧと命名された（Ｒｅｈｍら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，２７３，２４０４４−２４０５１；第ＷＯ９８／０６８５４号；米国特許第５，７５０，８４８号；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｎ．，Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ａ．，Ｒｅｈｍ，Ｂ．Ｈ．Ａ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，２０００，１８４，２５３−２５９）。米国特許第６，５８６，６５８号は、脂肪酸生合成経路からＰＨＡを生成するのに有用な追加遺伝子について記載している。脂肪酸生合成経路からの中鎖長ＰＨＡ合成を促進するための活性は、これらの酵素が、図３、反応１−３に記載されたものから選択される構築物での単一形質転換事象を介して宿主植物中に導入することができる。必要であれば、これらの酵素をコード化する遺伝子は、成熟タンパク質を、この細胞、例えばプラスチドの特定区画へ標的するペプチド標的シグナルをコード化するＤＮＡ配列へ融合させることができる。

短鎖および中鎖長の両方の懸垂基からなるコポリマーもまた、広い基質特異性を有するＰＨＡシンターゼを有する細菌中に生成することができる（図２、反応１１；図３、反応５）。例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．Ａ３３（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５，４２，９０１−９０９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．６１−３（Ｋａｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６，４５，３６３−３７０）、およびＴｈｉｏｃａｐｓａｐｆｅｎｎｉｇｉｉ（米国特許第６，０１１，１４４号）はすべて、短鎖および中鎖長モノマー単位のコポリマーを生成すると報告されているＰＨＡシンターゼを有する。短鎖および中鎖長の両方の懸垂基のコポリマーの形成を促進するための活性は、単一形質転換事象を介して宿主植物中に導入することができ、脂肪酸分解経路（図２）については反応１〜１１、および図３の脂肪酸生合成経路については反応１〜８を触媒するポリペプチドをコード化することができる。必要であれば、これらのポリペプチドをコード化する遺伝子は、成熟タンパク質を、この細胞、例えばプラスチドの特定区画へ標的するペプチド標的シグナルをコード化するＤＮＡ配列へ融合させることができる。

３−ヒドロキシバレレートの組み込みのための追加経路は、ＧｒｕｙｓらによるＰＣＴ第ＷＯ９８／００５５７号によって記載されている。４−ヒドロキシブチレートの組み込みのための経路は、ＤｅｎｎｉｓおよびＶａｌｅｎｔｉｎによるＰＣＴ第ＷＯ９８／３６０７８号およびＨｕｉｓｍａｎらによるＰＣＴ第ＷＯ９９／１４３１３号において詳しく記載されている。

工業的規模での植物からのＰＨＡの生成に先立って、農業的価値の作物中のポリマー生成は、最適化されるべきである。農業的価値のいくつかの作物における予備研究が実施された（概論については、次のもの参照：Ｂｏｈｍｅｒｔら、，２００４ＭｅｔａｂｏｌｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＰｌａｓｔｉｄｓａｓＢｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎｔＯｒｇａｎｅｌｌｅｓ，Ｈ．ＤａｎｉｅｌｌａｎｄＣ．Ｄ．Ｃｈａｓｅ，Ｅｄｉｔｏｒｓ．ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．ｐ．５５９−５８５）。これは、トウモロコシにおけるＰＨＢ生成（Ｐｏｉｒｉｅｒ＆Ｇｒｕｙｓ，２００２，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ａ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ｅｄｉｔｏｒ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＨＣＶｅｒｌａｇＧｍｂＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ．ｐ．４０１−４３５）、ならびに形質転換キャノーラおよび大豆種子におけるＰＨＢ生成（Ｇｒｕｙｓら、，ＰＣＴ第ＷＯ９８／００５５７号）を包含する。これらの研究において、観察されたポリマーのレベルは、ポリマーの経済的生成には低すぎた。農業的価値の作物におけるＰＨＡ生成の最適化は、所望の組成を有するポリマーへの高収率経路が得られるまで、多重酵素、標的シグナル、および生成部位のスクリーニングを利用する。これは、同義遺伝子が、単一形質転換事象中に挿入されるならば、単純化することができるタスクである。多遺伝子発現構築物の作製は、形質転換植物を農業的に有用なものにするのに必要とされる、伝統的な育種方法論の複雑さを減少させるのに有用である。

本発明は、次の非限定例を参照してさらに理解されるであろう。

実施例１：プラスミドの構成
ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、形質転換、およびプラスミド精製を包含するすべてのＤＮＡ操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９））によって記載されているような標準的手順を用いて実施された。

ｐＵＣ１８−Ｃ４ＰＰＤＫ−ＡＡＡ−ＲＢＳは、３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーター（Ｃｈｉｕら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：３２５（１９９６））、エンドウマメからのルビスコ（ｒｕｂｉｓｃｏ）の小さいサブユニットおよび成熟タンパク質の第一２４ａａのシグナルペプチドをコード化するＤＮＡ（Ｃｏｒｕｚｚｉら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２５８（３）：１３９９−１４０２（１９８３））、所望の導入遺伝子の融合を可能にするＸｂａＩ制限部位、およびノパリンシンターゼ遺伝子の３’ターミネーターを含有する３つのａａリンカーをコード化するＤＮＡ（Ｂｅｖａｎら、，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１（２）：３６９−３９５（１９８３））を含有する。このプラスミドは、次の多工程手順を用いて構成された。オリゴヌクレオチドＢａｍＸｂａＮｏｔ−ＡおよびＢａｍＸｂａＮｏｔ−Ｂはアニーリングされ、既にＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化されてしまったプラスミドｐＵＣ１８−３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫｓＧＦＰｎｏｓ（Ｃｈｉｕら、Ｂｉｏｌ．６：３２５（１９９６））中にライゲーションされた。その結果として生じたプラスミドは、ｐＵＣ１８−３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫ−ＢＸＮＰ−ｎｏｓと命名された。ルビスコ葉緑体標的シグナルおよび成熟タンパク質の第一２４ａａは、プライマーＰＥＡＴＳＣおよびＰＥＡＴＳＲを用いて、ＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＰｒｏｇｒｅｓｓ＃９の拡張された若い緑葉から得られたゲノムＤＮＡから増幅された。その結果生じた０．３４ｋｂｐ断片は、プラスミドｐＵＣ１８−３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫ−Ｐ．ｔ．ｓ．ｎｏｓを形成するｐＵＣ１８−３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫ−ＢＸＮＰ−ｎｏｓのＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位中へクローンされた。エンドウマメ標的シグナルからイントロンを除去するために、プラスミドｐＵＣ１８−３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫ−Ｐ．ｔ．ｓ．ｎｏｓは、ＳｐｈＩおよびＭｆｅＩで消化された。リンカーＰ．ｔ．ｓ．ｎｏイントロンＡおよびＰ．ｔ．ｓ．ｎｏイントロンＢはアニーリングされ、ｐＵＣ１８−３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫ−Ｐ．ｔ．ｓ．ｎｏｓのＳｐｈＩおよびＭｆｅＩ部位中にライゲーションされ、ｐＵＣ１８−Ｃ４ＰＰＤＫ−ｒｂｃｓ−ｎｏｓが作製された。プラスミドｐＵＣ１８−Ｃ４ＰＰＤＫ−ｒｂｃｓ−ｎｏｓからのシグナル配列の出発部位は、プラスミドｐＵＣ−Ｃ４ＰＰＤＫ−ＡＡＡ−ＲＢＳ−ｎｏｓを形成するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、現存するＴＣＣＡＴＧＧ配列をＡＡＡＡＴＧＧへ変更することによって、植物発現のために最適化された。

ｐＣＡＭ（ＲＢＣＳ−リンク）は、ｐＣＡＭＢＩＡ２３００バイナリーベクター（ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｔｏＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に由来し、プラスミドｐＵＣ１８−Ｃ４ＰＰＤＫ−ＡＡＡ−ＲＢＳについて既に記載されたプロモーター、シグナル配列、およびターミネーター断片を含有する。プラスミドｐＣＡＭ（ＲＢＣＳ−リンク）は、次の多工程手順を用いて構成された。二本鎖合成リンカー１および２は、それぞれオリゴヌクレオチド１Ａおよび１Ｂ、およびオリゴヌクレオチド２Ａおよび２Ｂをアニーリングすることによって作製された。プロモーター、シグナル配列、およびターミネーターは、ユニークＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位を用いて、プラスミドｐＵＣ−Ｃ４ＰＰＤＫ−ＡＡＡ−ＲＢＳ−ｎｏｓから切除された。その結果として生じた１．１ｋｂｐ断片は、リンカー１および２へアニーリングされ、５’末端においてＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＰａｃＩ、ＸｈｏＩ制限部位によって、および３’ 末端においてＥｃｏＲＩ、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ、ＡｖｒＩＩ、およびＳａｃＩ部位によってフランキングされたプロモーター、シグナル配列、およびターミネーター断片が作製された。この断片は、植物形質転換ベクターｐＣＡＭＢＩＡ２３００のＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位中へクローンされて、ｐＣＡＭ（ＲＢＣＳ−リンク）が作製された。

ｐＣＡＭ（Ａ）は、プライマーＡＢ−ＦおよびＡ−Ｒを用いて、ｐＡｅＴ１０（ＰｅｏｐｌｅｓａｎｄＳｉｎｓｋｅｙ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２６４（２６）：１５２９３−７．（１９８９））からｐｈａＡ遺伝子を増幅することによって作製された。その結果として生じた断片は、ｐＣＡＭ（ＲＢＣＳ−リンク）のＸｂａＩおよびＰｓｔＩ部位中へクローンされ、ｐｈａＡ遺伝子を有するエンドウマメ標的シグナルの翻訳融合を生じた。

ｐＣＡＭ（Ｂ）は、プライマーＢ−ＦおよびＡＢ−Ｒを用いて、ｐＡｅＴ１０（ＰｅｏｐｌｅｓａｎｄＳｉｎｓｋｅｙ，ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２６）：１５２９３−７（１９８９））からｐｈａＢ遺伝子を増幅し、ｐＣＡＭ（Ａ）について既に記載された手順を用いて、ＤＮＡ断片をｐＣＡＭ（ＲＢＣＳ−リンク）中にクローンすることによって作製された。

ｐＣＡＭ（Ｃ）は、プライマーＣ−ＦおよびＣ−Ｒを用いて、ハイブリッドＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ／Ｚｏｏｇｌｏｅａｒａｍｉｇｅｒａシンターゼ（米国特許第６，３１６，２６２号）を含有するｐＣＭＹＳ１０６、すなわちｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、，Ｇｅｎｅ３３：１０３−１１９（１９８５））ベースのプラスミドからシンターゼ遺伝子を増幅することによって作製された。ＰＣＲ産物は、ＸｂａＩおよびＮｓｉＩで消化された。その結果として生じた断片は、ｐＣＡＭ（ＲＢＣＳ−リンク）のＸｂａＩおよびＰｓｔＩ部位の和合性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）付着性末端中へクローンされ、ｐＣＡＭ（Ｃ）が作製された。

ｐＣＡＭ（Ｃ＋Ａ＋Ｂ）は、２工程プロセスを用いて構成された。ｐＣＡＭ（Ａ＋Ｂ）は、５’ＢｓｔＢＩおよび３’ＡｖｒＩＩ部位を用いてｐＣＡＭ（Ａ）からｐｈａＡカセットを除去し、ＢｓｔＢＩ部位を平滑化し、その結果生じた挿入断片を、ｐＣＡＭ（Ｂ）のＡｖｒＩＩおよび平滑化されたＡｓｃＩ部位中にクローンすることによって作製された。ｐＣＡＭ（Ｃ＋Ａ＋Ｂ）は、５’ＢｓｔＢＩおよび３’ＡｖｒＩＩ部位を用いてｐＣＡＭ（Ａ＋Ｂ）からｐｈａＡおよびｐｈａＢカセットを除去し、ＢｓｔＢＩ部位を平滑化し、この挿入断片を、ｐＣＡＭ（Ｃ）のＡｖｒＩＩおよび平滑化されたＡｓｃＩ部位中にクローンすることによって作製された。この構成的ＰＨＢ発現ベクターは、ＣＡＢと呼ばれる。

ｐＮＥＢ（ｇｒｅＡ） − ３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーター、プラスチド標的シグナル、チオラーゼ遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含む構成的チオラーゼ発現カセットは、ＡｓｃＩおよびＰｍｅＩ消化物を用いて、ｐＣＡＭ（Ａ）から除去された（Ｋｏｕｒｔｚら、，ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：４３５−４４７（２００５））。その結果として生じた断片は、ｐＮＥＢ１９３（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）のＡｓｃＩおよびＰｍｅＩ部位中にクローンされ、ｐＮＥＢ（Ａ）が作製された。グルココルチコイド誘導最小プロモーター６ｇｒｅ−６０３５ＳＣａＭＶは、ＨｉｎｄＩＩＩおよび平滑化されたＮｃｏＩ消化物を用いて、ｐＢＬ２２１．９ＧＲＥ６（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、ＰｌａｎｔＪ．１９：９７−１０６（１９９９））から除去された。その結果生じた断片は、ｐＮＥＢ１９３のＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローンされ、ｐＮＥＢ（ｇｒｅＭＰ）が作製された。ｐＮＥＢ（Ａ）の構成的３５ＳＣ４ＰＰＤＫプロモーターは、ＳｅａｍｌｅｓｓＣｌｏｎｉｎｇ（商標）技術（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、ｐＮＥＢ（ｇｒｅＭＰ）の誘導プロモーターと交換された。誘導最小プロモーターは、プライマー

を用いて、ユニーク３’および５’Ｅａｍ１１０４Ｉ制限部位を含有するような方法で、ｐＮＥＢ（ｇｒｅＭＰ）から増幅された。

は、ベクターバックボーン、プラスチド標的シグナル、チオラーゼ遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含むが、３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫ構成的プロモーターを含まない、ｐＮＥＢ（Ａ）ほぼ全体を、結果として生じる断片が、ユニーク３’および５’Ｅａｍ１１０４Ｉ制限部位によってフランキングされるような方法でＰＣＲするために用いられた。ＰＣＲ反応は、本質的に製造業者によって推奨されているように実施された。その結果として生じたＰＣＲ産物は、Ｅａｍ１１０４Ｉで消化され、ライゲーションされて、ｐＮＥＢ（ｇｒｅＡ）を生成した。正確な産物は、誘導最小プロモーター中に配置されているが、構成的プロモーター中には存在しないＢａｍＨＩ部位についてスクリーニングすることによって同定された。

ｐＣＡＭ（ｇｒｅＡ）、ｐＣＡＭ（ｇｒｅＢ）、およびｐＣＡＭ（ｇｒｅＣ） − ｐＮＥＢ（ｇｒｅＡ）が、ＢｓｔＢＩおよびＸｂａＩで切断され、ＧＲＥ−６０ＭＰ−ＴＳ断片を生じた。これは、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）、カリフラワーモザイクウイルス（−６０ＭＰ）からの最小３５Ｓプロモーター、およびＲＢＣＳ標的シグナル（ＴＳ）を含有する。ｐＣＡＭ（Ａ）、ｐＣＡＭ（Ｂ）、またはｐＣＡＭ（Ｃ）の構成的プロモーターおよび標的シグナル（Ｋｏｕｒｔｚら、，ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：４３５−４４７（２００５））は、ＢｓｔＢＩおよびＸｂａＩ消化物を介して除去された。その結果として生じたベクターは、ＧＲＥ−６０ＭＰ−ＴＳ断片へライゲーションされ、ｐＣＡＭ（ｇｒｅＡ）、ｐＣＡＭ（ｇｒｅＢ）、およびｐＣＡＭ（ｇｒｅＣ）を生成した。

ｐＣＡＭ（ＣｇｒｅＡＢ） − 最小誘導プロモーター、シグナル配列、およびチオラーゼｐｈｂＡ遺伝子を含有する誘導チオラーゼカセット、すなわちｇｒｅＡは、ＢｓｔＢＩおよびＡｖｒＩＩ消化物で、ｐＣＡＭ（ｇｒｅＡ）から除去された。ＢｓｔＢＩ部位が平滑化され、その結果生じたスティッキー平滑断片は、ｐＣＡＭ（Ｃ）のＡｖｒＩＩおよび平滑化されたＡｓｃＩ部位中にクローンされ、ｐＣＡＭ（ＣｇｒｅＡ）を生成した。同じ手順を用いて、構成的レダクターゼカセットがｐＣＡＭ（ｇｒｅＡ）へ添加されて、ｐＣＡＭ（ＣｇｒｅＡＢ）、ｐＣＡＭ（Ｃ）、およびｐＣＡＭ（Ｂ）を生成した。

ｐＵＣ１８−Ｃ４ＰＰＤＫ−ＡＡＡ−ＲＢＳは、３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーター（Ｃｈｉｕら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：３２５（１９９６））、エンドウマメからのルビスコの小さいサブユニットおよび成熟タンパク質の第一２４ａａのシグナルペプチドをコード化するＤＮＡ（Ｃｏｒｕｚｚｉら、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２５８（３）：１３９９−１４０２（１９８３））、所望の導入遺伝子の融合を可能にするＸｂａＩ制限部位、およびノパリンシンターゼ遺伝子の３’ターミネーターを含有する３つのａａリンカーをコード化するＤＮＡ（Ｂｅｖａｎら、，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１（２）：３６９−８５（１９８３））を含有する。このプラスミドは、次の多工程手順を用いて構成された。オリゴヌクレオチドＢａｍＸｂａＮｏｔ−ＡおよびＢａｍＸｂａＮｏｔ−Ｂはアニーリングされ、既にＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化されてしまったプラスミドｐＵＣ１８−３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫｓＧＦＰｎｏｓ（Ｃｈｉｕら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：３２５（１９９６））中にライゲーションされた。その結果として生じたプラスミドは、ｐＵＣ１８−３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫ−ＢＸＮＰ−ｎｏｓと命名された。ルビスコ葉緑体標的シグナルおよび成熟タンパク質の第一２４ａａは、プライマーＰＥＡＴＳＣおよびＰＥＡＴＳＲを用いて、ＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＰｒｏｇｒｅｓｓ＃９の拡張された若い緑葉から得られたゲノムＤＮＡから増幅された。その結果として生じた０．３４ｋｂｐ断片は、プラスミドｐＵＣ１８−３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫ−Ｐ．ｔ．ｓ．ｎｏｓを形成するｐＵＣ１８−３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫ−ＢＸＮＰ−ｎｏｓのＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位中へクローンされた。エンドウマメ標的シグナルからイントロンを除去するために、プラスミドｐＵＣ１８−３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫ−Ｐ．ｔ．ｓ．ｎｏｓは、ＳｐｈＩおよびＭｆｅＩで消化された。リンカーＰ．ｔ．ｓ．ｎｏイントロンＡおよびＰ．ｔ．ｓ．ｎｏイントロンＢはアニーリングされ、ｐＵＣ１８−３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫ−Ｐ．ｔ．ｓ．ｎｏｓのＳｐｈＩおよびＭｆｅＩ部位中にライゲーションされ、ｐＵＣ１８−Ｃ４ＰＰＤＫ−ｒｂｃｓ−ｎｏｓが作製された。プラスミドｐＵＣ１８−Ｃ４ＰＰＤＫ−ｒｂｃｓ−ｎｏｓからのシグナル配列の出発部位は、プラスミドｐＵＣ−Ｃ４ＰＰＤＫ−ＡＡＡ−ＲＢＳ−ｎｏｓを形成するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、現存するＴＣＣＡＴＧＧ配列をＡＡＡＡＴＧＧへ変更することによって、植物発現のために最適化された。

ｐＣＡＭ（ＡＢ）は、プライマーＡＢ−ＦおよびＡＢ−Ｒを用いて、ｐＴＲＣ（ＡＢ）、すなわちｐｈａＡ−ｐｈａＢ融合を含有するプラスミド（第ＷＯ００／０６７４７号；Ｋｏｕｒｔｚら、ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：４３５−４４７（２００５））からｐｈａＡ−ｐｈａＢ融合を増幅することによって作製された。その結果として生じた断片は、ｐＣＡＭ（ＲＢＣＳ−リンク）のＸｂａＩおよびＰｓｔＩ部位中へクローンされ、ｐｈａＡ−ｐｈａＢ遺伝子を有するエンドウマメ標的シグナルの翻訳融合を生じた。

ｐＣＡＭ（Ａ）は、プライマーＡＢ−ＦおよびＡ−Ｒを用いて、ｐＡｅＴ１０（ＰｅｏｐｌｅｓａｎｄＳｉｎｓｋｅｙ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２６４（２６）：１５２９３−７．（１９８９））からｐｈａＡ遺伝子を増幅することによって作製された。その結果として生じた断片は、ｐＣＡＭ（ＡＢ）について既に記載された手順を用いて、ｐＣＡＭ（ＲＢＣＳ−リンク）中へクローンされた。

ｐＣＡＭ（Ｂ）は、プライマーＢ−ＦおよびＡＢ−Ｒを用いて、ｐＡｅＴ１０（ＰｅｏｐｌｅｓａｎｄＳｉｎｓｋｅｙ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２６４（２６）：１５２９３−７．（１９８９））からｐｈａＢ遺伝子を増幅し、このＤＮＡ断片を、ｐＣＡＭ（ＡＢ）について既に記載された手順を用いて、ｐＣＡＭ（ＲＢＣＳ−リンク）中へクローンすることによって作製された。

ｐＣＡＭ（Ｃ）は、プライマーＣ−ＦおよびＣ−Ｒを用いて、ｐＣＭＹＳ１０６からシンターゼ遺伝子を増幅すること（Ｋｏｕｒｔｚら、，（２００５）ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：４３５−４４７）によって作製された。このＰＣＲ産物は、ＸｂａＩおよびＮｓｉＩで消化された。その結果として生じた断片は、ｐＣＡＭ（ＲＢＣＳ−リンク）のＸｂａＩおよびＰｓｔＩ部位の和合性付着性末端中へクローンされ、ｐＣＡＭ（Ｃ）が作製された。

ｐＣＡＭ（Ｃ＋ＡＢ）は、５’ＢｓｔＢＩおよび３’ＡｖｒＩＩ部位を用いて、ｐＣＡＭ（ＡＢ）からｐｈａＡ−ｐｈａＢカセットを除去することによって作製された。ＢｓｔＢＩ部位は、平滑化され、その結果として生じたＤＮＡ断片は、ｐＣＡＭ（Ｃ）のＡｖｒＩＩおよび平滑化されたＡｓｃＩ部位中にクローンされた。

ｐＣＡＭ（Ｃ＋Ａ＋Ｂ）は、２工程プロセスを用いて構成された。ｐＣＡＭ（Ａ＋Ｂ）は、５’ＢｓｔＢＩおよび３’ＡｖｒＩＩ部位を用いて、ｐＣＡＭ（Ａ）からｐｈａＡカセットを除去し、ＢｓｔＢＩ部位を平滑化し、その結果生じた挿入断片を、ｐＣＡＭ（Ｂ）のＡｖｒＩＩおよび平滑化されたＡｓｃＩ部位中にクローンすることによって作製された。ｐＣＡＭ（Ｃ＋Ａ＋Ｂ）は、５’ＢｓｔＢＩおよび３’ＡｖｒＩＩ部位を用いてｐＣＡＭ（Ａ＋Ｂ）からｐｈａＡおよびｐｈａＢカセットを除去し、ＢｓｔＢＩ部位を平滑化し、この挿入断片を、ｐＣＡＭ（Ｃ）のＡｖｒＩＩおよび平滑化されたＡｓｃＩ部位中にクローンすることによって作製された。

ｐＣＡＭ（ｇｒｅＣｇｒｅＡｇｒｅＢ） − 最小誘導プロモーター、シグナル配列、およびチオラーゼｐｈｂＡ遺伝子を含有する誘導チオラーゼカセット、すなわちｇｒｅＡは、ＢｓｔＢＩおよびＡｖｒＩＩ消化物でｐＣＡＭ（ｇｒｅＡ）から除去された。ＢｓｔＢＩ部位が平滑化され、その結果生じたスティッキー平滑断片は、ｐＣＡＭ（ｇｒｅＣ）のＡｖｒＩＩおよび平滑化されたＡｓｃＩ部位中にクローンされ、ｐＣＡＭ（ｇｒｅＣｇｒｅＡ）を生成した。同じ手順を用いて、誘導リダクターゼカセットがｐＣＡＭ（ｇｒｅＣｇｒｅＡ）へ添加されて、ｐＣＡＭ（ｇｒｅＣｇｒｅＡｇｒｅＢ）を生成した。

ｐＮＥＢ（ｅ３５Ｓｇｒｖｈｎｏｓ）．グルココルチコイドＤＮＡ結合ドメイン、ＶＰ１６トランス活性化ドメイン、およびＨｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓエクジソン受容体を含有するキメラエクジソン受容体が、ｐＭＦ６ＧＲＶＰ１６ＨＥｃＲ、すなわちｐＭＦ６（Ｇｏｆｆら、，（１９９０））ＥＭＢＯＪ９：２５１７−２５２２）、すなわちＭａｒｔｉｎｅｚおよびその共同研究者によって記載されたｐＧＲＶＨＥｃＲプラスミドの誘導体（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、（１９９９ｂ）ＰｌａｎｔＪ１９：９７−１０６））を含有するイントロンから、ＢａｍＨＩ消化物を用いて除去された。その結果として生じた断片は、ｐＮＥＢ１９３のＢａｍＨＩ部位中にクローンされ、ｐＮＥＢ（ｇｒｖｈ）を生成した。カリフラワーモザイクウイルス（ｅ３５ＳＣａＭＶ）プロモーターからの二重増強３５Ｓプロモーターは、ＮｃｏＩおよび平滑化されたＢｓｔＸＩ消化物を用いて、ｐＣＡＭ２３００（ＣＡＭＢＩＡ、Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から除去された。その結果として生じた断片は、ｐＮＥＢ（ｇｒｖｈ）のＥｃｏＲＶおよびＮｃｏＩ部位中にクローンされ、ｐＮＥＢ（ｅ３５Ｓｇｒｖｈ）が作製された。このベクターの３’ＡｓｃＩ部位は、ＡｓｃＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩＫｌｅｎｏｗ断片で平滑化し、ついでこのベクターをＴ４ＤＮＡリガーゼで再ライゲーションすることによって除去され、ｐＮＥＢ（ｅ３５ＳｇｒｖｈΔＡｓｃＩ）が作製された。ノパリンシンターゼ遺伝子の３’ＵＴＲは、オリゴヌクレオチドｎｏｓＦ

を用いて、ＰＣＲを介してｐＭＦ６ＧＲＶＰ１６ＨＥｃＲから除去された。これらのプライマーは、ｎｏｓ断片へ、５’ＰａｃＩ部位および３’ＡｓｃＩ、ＡｖｒＩＩ、およびＸｂａＩ部位を導入する。その結果として生じたＰＣＲ産物は、ｐＮＥＢ（ｅ３５ＳｇｒｖｈΔＡｓｃＩ）のＰａｃＩおよびＸｂａＩ部位中にクローンされ、ｐＮＥＢ（ｅ３５Ｓｇｒｖｈ）が作製された。

ｐＣＡＭ（ＣｇｒｅＡＢｇｒｖｈ）およびｐＣＡＭ（ｇｒｅＣｇｒｅＡｇｒｅＢｇｒｖｈ）．キメラエクジソン受容体、構成的プロモーター、およびポリアデニル化配列を含有するエフェクターカセットが、ＡｖｒＩＩおよび平滑化されたＳｐｅＩ消化物を介して、ｐＮＥＢ（３５Ｓ−ｇｒｖｈ−ｎｏｓ）から除去された。その結果として生じた断片は、ｐＣＡＭ（ＣｇｒｅＡＢ）およびｐＣＡＭ（ｇｒｅＣｇｒｅＡｇｒｅＢ）のＡｖｒＩＩおよび平滑化されたＡｓｃＩ部位中にクローンされ、ｐＣＡＭ（ＣｇｒｅＡＢｇｒｖｈ）およびｐＣＡＭ（ｇｒｅＣｇｒｅＡｇｒｅＢｇｒｖｈ）を生成した。

実施例２：植物形質転換および誘導
完全ＰＨＢ生成経路に必要とされる遺伝子、β−ケトチオラーゼ（チオラーゼ）、ＮＡＤＰＨ−アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（レダクターゼ）、およびＰＨＡシンターゼ（シンターゼ）は個々に、最小^３５Ｓエクジソン誘導プロモーターの制御下に置かれ、プラスチド標的シグナルへ融合され、キメラエクジソン受容体を含有するｐＣＡＭＢＩＡ（ＣｅｎｔｒｅｆｏｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｔｏＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）ベースの多遺伝子プラスミド中にクローンされた（Ａ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｃ．Ｓｐａｒｋｓ，Ｃ．Ａ．Ｈａｒｔ，Ｊ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｉ．Ｊｅｐｓｏｎ，ＰｌａｎｔＪ．１９：９７（１９９９））。この３遺伝子誘導構築物は、３Ｉと呼ばれる。１Ｉと呼ばれる単一遺伝子誘導構築物は、誘導プロモーターの制御下のチオラーゼ遺伝子を含有していたが、３Ｉ構築物とは異なって、これは、構成的３５Ｓ−Ｃ４ＰＰＤＫプロモーターの制御下のレダクターゼおよびシンターゼ遺伝子を発現した（Ｗ．Ｃｈｉｕら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：３２５（１９９６））。

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの形質転換は、次のようにＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ（Ｓ．Ｊ．Ｃｌｏｕｇｈ，Ａ．Ｆ．Ｂｅｎｔ，ＰｌａｎｔＪ．１６：７３５（１９９８））に記載されているように実施された：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株ＧＶ３１０１／ｐＭＰ９０のエレクトロコンピテント細胞（ＫｏｎｃｚａｎｄＳｃｈｅｌｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２０４：３８３−３９６（１９８６））が、プラスミドＤＮＡで形質転換され、単一コロニーが、ゲンタマイシンおよびカナマイシンを含有するＬＢプレート上で単離された。ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＣｏｌｕｍｂｉａＣｏｌ−０（ＬｅｈｌｅＳｅｅｄｓ，ＲｏｕｎｄＲｏｃｋ，ＴＸ）が、土壌中で、２０℃、７０％湿度、および１６時間の光、８時間の暗サイクルで成長させられた。植物は、ＣｌｏｕｇｈａｎｄＢｅｎｔＰｌａｎｔＪ．１６：７３５（１９９８）によって記載されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ仲介フローラルディップ手順を用いて形質転換された。成熟長角果からの種子が収穫され、滅菌され、１／２×ＭｕｒａｓｈｉｇｅＭｉｎｉｍａｌＯｒｇａｎｉｃｓＭｅｄｉｕｍ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、０．７％寒天、１×ＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する選択プレート上に広げられた。プレートは２日間４℃でインキュベーションされ、２０℃、７０％湿度、１６時間の光、８時間の暗サイクルへ移された。７日後、グリーンカナマイシン抵抗性苗木が、土壌へ移され、植物の分析の準備が整うまで、同じ成長条件でインキュベーションされた。

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物は、日常的な成長条件下に完全サイズに達するまで成長させられた。約３０日で成熟に達した時、これらの植物は、根浸漬または葉への適用を介した誘導剤での処理に付された。用いられた誘導剤は、テブフェノジド、Ｍｉｍｉｃ（登録商標）、およびＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）を含む。商業用殺虫剤であるＭｉｍｉｃ（登録商標）およびＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）（ＵＡＰＴｉｍｂｅｒｌａｎｄ（Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌ，ＡＲ）およびＰｏｌｉｎａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐｏｕｎｄｓ（Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＭＡ）から入手しうる）が、誘導剤として用いられたが、それは、これらの各々の活性成分であるテブフェノジドおよびメトキシフェノジドが、非ステロイドエクジソン類似体であるからである。根浸漬は、この誘導剤を、１／４×Ｈｏａｇｌａｎｄｓ肥料溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中の所望の濃度へ希釈する工程、および結果として生じた溶液１０ｍＬを、各Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の土壌へ直接適用する工程をともなった。葉への適用の間、植物はまず、１／４×Ｈｏａｇｌａｎｄｓ肥料溶液で給水された。希釈された誘導剤はついで、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の葉へ、葉の表面が飽和され、浸漬されるまで、直接噴霧された。誘導剤の根浸漬および葉への適用は、３週間の間、１週間に２回、これらの植物の種子ができる（ｓｅｔｓｅｅｄ）まで繰り返された。

実施例３：植物ＰＨＢ分析および抽出
ナイルブルー染色での蛍光顕微鏡法が、既に記載されているように（Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：５２０−５２３（１９９２））、いくつかの修正をともなって実施された。葉の組織が、剃刀の刃でできるだけ薄くスライスされ、０．１ＭＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ８中の３％パラホルムアルデヒド（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）中に３時間固定された。固定サンプルは水で洗浄され、既に濾過された１％ナイルブルー（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液で、５分間室温において染色された。サンプルは、水で洗浄され、８％酢酸で脱染された。サンプルは、さらに２回水で洗浄された。サンプルは、次のフィルターセット：エキサイター、ＨＱ５４５／３０；ビームスプリッター、Ｑ５７０１ｐ；エミッターＤ５９０／２０（ＣｈｒｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，Ｖｔ）を用いて、ＺｅｉｓｓＨＢＯ１００蛍光アタッチメントおよび２０×Ｐｈ−１レンズを備えたＺｅｉｓｓＡｘｉｏｌａｂ光顕微鏡での蛍光顕微鏡法によって観察された。画像は、ＫｏｄａｋＥｌｉｔｅＣｈｒｏｍｅ１００フィルムを用いて、ＺｅｉｓｓＭＣ８０ＤＸ顕微鏡カメラで記録された。

植物ポリマー分析は、本質的にＫｏｕｒｔｚら（Ｋｏｕｒｔｚら、，ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：４３５−４４７（２００５））に記載されているように、次の修正をともなって実施された。植物材料の予洗浄をともなう最初の工程は、乾燥植物材料が、ブタノール分解（ｂｕｔａｎｏｌｙｓｉｓ）、および不純物の水での抽出によって誘導体化される前に省略された。その結果として生じた有機相は、ＤＢ−２２５ＭＳカラムおよびガードを備えた選択されるイオンモニターモードにおいてＡｇｉｌｅｎｔ５９７３ＧＣ／ＭＳを用いたガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリーによって分析された。ブチル−３−ヒドロキシブチレートエステルの選択されるイオンは、８７、８９、および４３．１原子質量単位であった。

ＰＨＢ抽出については、誘導Ｔ_４３ＩＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が、０．５ｍＭＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）の葉への適用のために処理された。組織が収穫され、標準的非水性プロトコルを用いてＰＨＢ抽出に先立って乾燥された。

実施例４：処理済みおよび未処理Ｔ_１１Ｉおよび３ＩＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物におけるＰＨＢ収率
それぞれ１Ｉ構築物で形質転換された、発生後（ｏｌｄ）３０日の８６の成熟第一世代Ｔ_１形質転換植物、および３Ｉ構築物で形質転換された発生後３０日の１０８の成熟Ｔ_１形質転換植物の全体が、０．５ｍＭＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）の葉への適用で処理されるか、または未処理のままにされた。

３遺伝子誘導構築物３Ｉを発現する植物は、誘導剤での処理の時、１０％ｄｗｔまでのＰＨＢを蓄積した。興味深いことに、最高のＰＨＢ−生成処理済み３Ｉ植物は、誘導の間に葉の黄白化を発生させたが、この表現型は、未処理植物においては観察されなかった。未処理３Ｉ植物は、０．３７％ｄｗｔ超のＰＨＢ蓄積ができず、平均してこれらは、同じ構築物を発現する処理済み植物よりも６ファクター小さい％ｄｗｔのＰＨＢを生成した（表Ｉ）。

これに対して、１Ｉ構築物で形質転換された植物は、高レベルのＰＨＢを蓄積することができず、誘導剤の存在下または不存在下に、０．０３９％ｄｗｔ未満のＰＨＢを生成した（表Ｉ）。この結果は意外であったが、その理由は、１Ｉ構築物の誘導チオラーゼカセットが、３Ｉ植物中の高レベルのＰＨＢの生成に参加したからである。これに加えて、１Ｉ構築物の構成的レダクターゼおよびシンターゼカセットは、構成的チオラーゼの存在下に、構成的Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物中の１１．５％ｄｗｔＰＨＢの生成を触媒することが既に証明されている。追加の２３５Ｔ_１１Ｉ植物をスクリーニングすることによる１Ｉ構築物のさらなる分析は、誘導剤テブフェノジドの葉への適用の存在下および不存在下に、それぞれ２．５％および２．６％ｄｗｔＰＨＢを生成しうる植物を同定した。この構築物が非誘導的にＰＨＢ生成を促進する能力は、最良のＴ_１１Ｉ植物の７２Ｔ_２子孫の分析を通して確認された。処理済みおよび未処理Ｔ_２１Ｉ植物は、それぞれ誘導剤の存在下および不存在下に、平均して４．２±２．５％および４．７±１．４％ｄｗｔＰＨＢを蓄積した。集合的にはこれらの結果は、最適な誘導ＰＨＢ生成が、ＰＨＢ生成経路の遺伝子のすべてが同時に誘導されるのでなければ発生しないことを実証している。

表Ｉ．処理済みおよび未処理Ｔ_１１Ｉおよび３ＩＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物におけるＰＨＢ収率
処理済み植物が、０．５ｍＭＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）の葉への適用に付された。平均および標準誤差が示されている。

実施例５：０．１ｍＭＭｉｍｉｃ（登録商標）で根浸漬されるか、または未処理のままにされたＴ_２３Ｉ植物の若い組織におけるＰＨＢ生成の増加
３Ｉ植物は、０．１ｍＭＭｉｍｉｃ（登録商標）で根浸漬を介して処理された。これは、根を通してエクジステロイド同化作用を推進すると考えられている技術である（Ｅ．Ｕｎｇｅｒら、，Ｔｒａｎｓ．Ｒｅｓ．１１，４５５（２００２）；Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，１０４２１（１９９１））。この研究のために選択される植物は、３Ｉ植物７、１１、および１２のＴ_２子孫を包含する。これらのＴ_１３Ｉ植物は、１ｍＭＭｉｍｉｃ（登録商標）で噴霧された時、約２％ｄｗｔＰＨＢを蓄積することが証明された。

Ｔ_２植物表現型の分析は、未処理株７植物が、１８日間にわたって青々と健康なままであることを明らかにした。これに対して、根浸漬された株７植物の若葉は、高レベルのＰＨＢを構成的に生成する植物の総葉組織の特徴である、成長が妨げられた（ｓｔｕｎｔｅｄ）黄白化性（ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ）表現型を示した（Ｋ．Ｂｏｈｍｅｒｔら、，Ｐｌａｎｔａ２１１，８４１（２０００））。処理済み誘導植物によって示されたこの表現型は、青々と健康な通常サイズの植物が、異常に小さい黄色い葉を発生させたので、Ｍｉｍｉｃ（登録商標）の最初の適用の１２日以内に容易に目に見えるようになった。同様な結果が、株１１および株１２植物について得られた。表現型におけるこの変化は、直接、Ｍｉｍｉｃ（登録商標）およびその成分への負の反応のせいであるとされたわけではなかった。それは、エンプティーベクターｐＣＡＭ２３００で形質転換された対照植物が、Ｍｉｍｉｃ（登録商標）での根浸漬の間、青々と健康なままであったからである。それに加えて、構成的ＰＨＢ生成対照植物（ＣＡＢ）は、処理の間黄白化性のままであり、より古い葉の組織の割には若い葉を生成し、未処理ＣＡＢ植物と同様な表現型を示した。集合的にはこれらのデータは、Ｍｉｍｉｃ（登録商標）での根浸漬が、ＰＨＢ生成に必要とされる遺伝子の発現を誘導すること、およびその結果として生じたＰＨＢ生成急増が、異常に小さい黄白化性葉の生成のきっかけとなることを示している。

定量的ＧＣ／ＭＳ分析が、上記のようにこれらの植物に対して実施された。未処理株７、１１、および１２植物は、２％ｄｗｔ未満のＰＨＢを含有していたが、同じ株からの処理済み植物は、若葉において１４％ｄｗｔ以上のＰＨＢを蓄積した（表ＩＩ）。平均して、Ｔ_２３Ｉ株７植物の若い組織において観察された％ｄｗｔＰＨＢは、同じ株からの未処理植物の若い組織において検出されたものよりファクター１２だけ大きかった。同様な結果が、Ｔ_２３Ｉ株１１および１２植物で得られた。これらは、未処理の若い組織に対して、若い処理済み葉において、ファクター１４だけＰＨＢ蓄積の増加を示した。個々の株７植物からのポリマー含量の調査は、若葉のＰＨＢ含量が、根浸漬の２１日後、ファクター３７だけ増加したことを明らかにした（表ＩＩＩ）。ポリマー生成のファクター１７９および３１６の増加は、それぞれ株１１および１２からの若い処理済み組織において記録された（表ＩＩＩ）。平均して、処理済みＴ_２株７、１１、および１２植物からの若い組織は、同じ植物からのより古い組織よりも、それぞれファクター１．７、２．８、および２．０だけより多く蓄積した（表ＩＩ）。例えば最良のＴ_２株１１植物は、処理済み若葉において１４％ｄｗｔ以上のＰＨＢを蓄積したが、より古い組織においては７．０％ｄｗｔのみのＰＨＢを蓄積した（表ＩＩ）。

表ＩＩ．０．１ｍＭＭｉｍｉｃ（登録商標）で根浸漬されたか、または未処理のままにされたＴ_２３Ｉ植物から収穫された若葉および古葉のＰＨＢ含量
最良の植物のＰＨＢ収率が示されている。１０サンプルのＰＨＢ含量についての平均および標準誤差が示されている。

表ＩＩＩ．０．１ｍＭＭｉｍｉｃ（登録商標）で根浸漬されたか、または未処理のままにされたＴ_２３Ｉ植物の若い組織におけるＰＨＢ生成の増加

実施例６：漸増濃度のＭｉｍｉｃ（登録商標）およびＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）での根浸漬または葉への適用に付されたＴ_３３Ｉ植物におけるＰＨＢ収率
最良のＴ_２３Ｉ植物、株７−３２、７−３９、１１−１０６、１１−１０８、１２−１１３、および１２−１１９の子孫が、漸増濃度のＭｉｍｉｃ（登録商標）での根浸漬に付された。ポリマー生成は、わずか０．０１ｍＭのＭｉｍｉｃ（登録商標）の添加によって誘導されたが、ＰＨＢ生成は、０．１ｍＭ（株７−３２、７−３９、１１−１０６）または１．０ｍＭ（株１１−１０８、１２−１１３、および１２−１１９）Ｍｉｍｉｃ（登録商標）のどちらかでの処理によって増強された（図７Ａ）。例えば株１１−１０８は、誘導剤の不存在下でＰＨＢの生成ができなかったが、それぞれ０．０１ｍＭおよび１ｍＭＭｉｍｉｃ（登録商標）で処理された時、平均して１．９４±０．４４および３．１３±０．３８％ｄｗｔＰＨＢを蓄積した。誘導剤の不存在下での株７−３２および７−３９における低レベルのポリマーの蓄積は、これらの株が漏出し易いことを示唆している。

同様な結果が、Ｉｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）での根浸漬実験において得られた。低レベルのＰＨＢが、０．０１ｍＭのＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）での処理の時に生成されたが、増強されたＰＨＢ収率は、０．１ｍＭ（株１１−１０６）、０．５ｍＭ（株１２−１１９）、および１．０ｍＭ（株７−３２）Ｉｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）で得られた（図７Ｂ）。例えば株１２−１１９植物の平均ＰＨＢ含量は、未処理植物における０．４３±０．１７％ｄｗｔＰＨＢから、それぞれ０．１ｍＭおよび０．５０ｍＭのＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）で浸漬された植物における２．１２±０．６０および４．０２±０．８２％ｄｗｔＰＨＢへ増加した。すべての例で、Ｉｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）で根浸漬された植物におけるポリマー生成は、Ｍｉｍｉｃ（登録商標）処理された植物で観察されたものを超えた（図７Ａ〜Ｂ）。この発見は、メトキシフェノジドのより高い予測された水溶解性とともに、Ｉｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）の葉への適用が、Ｉｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）およびＭｉｍｉｃ（登録商標）の根浸漬技術で観察されたものよりも高いレベルのＰＨＢを誘導しうることを示している。

Ｔ_３３Ｉ植物株７−３２、１１−１０６、および１２−１１９は、０〜１．０ｍＭのＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）の葉への適用で処理された。０．５ｍＭのＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）の適用は、植物株７−３２および１１−１０６において最高のポリマー収率を誘導するのに十分であったが、植物株１２−１１９において最良のＰＨＢ収率を誘導するのに、１．０ｍＭのＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）が必要とされた（図７Ｃ）。例えば株７−３２植物の平均ＰＨＢ含量は、未処理植物における１．６５±０．２３％ｄｗｔＰＨＢから、それぞれ０．１ｍＭおよび０．５ｍＭのＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）で噴霧された植物における２．５９±０．４１および７．５７±２．６０％ｄｗｔＰＨＢへ増加した。３Ｉ−７−３２−５と呼ばれる最良のＴ_３植物は、０．５ｍＭのＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）で噴霧された時、全体で１１．５％ｄｗｔＰＨＢを蓄積した。全体として、Ｉｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）の葉への適用で処理された植物は、Ｍｉｍｉｃ（登録商標）またはＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）のどちらかで根浸漬された植物よりも多くのＰＨＢを蓄積した（図７Ａ〜Ｃ）。この３Ｉ−７−３２−５植物は、その親の明白な成長が妨げられた黄白化性若葉表現型を示さず、比較的通常サイズの黄白化性の若い葉および中程度の成長年齢の葉においてＰＨＢを蓄積するように見えた。より古い葉は、優勢的に緑色のままにとどまったが、ＰＨＢ生成のいくつかの黄白化特徴を示した。

集合的にこれらの結果は、誘導剤濃度、組成、および送達方法の最適化と組み合わされた、多重世代を通した植物の注意深い選択が、結果として総ポリマー収率の増加を生じうることを明らかにしている。これに加えて、これらの結果は、ＰＨＢ生成に関わる全体の経路が、商業用殺虫剤の葉への適用によって誘導されうることを確認している。

ＰＨＢ生合成経路を示している。この経路において、アセチル−ＣｏＡは、β−ケトチオラーゼによってアセトアセチル−ＣｏＡへ転化される。アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼは、アセトアセチル−ＣｏＡをβ−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへ転化する。ＰＨＡシンターゼは、β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡをＰＨＢへ転化する。ＰＨＢ生合成経路の３つの遺伝子すべてが誘導プロモーターの制御下に置かれている、植物発現ベクターが示されている。これらの遺伝子は、３’ＵＴＲによってフランキング（ｆｌａｎｋ）されている。このベクターはまた、３’ＵＴＲによってフランキングされた構成的プロモーターの制御下のエフェクター遺伝子も含有する。この同義遺伝子ベクターはまた、構成的プロモーターの制御下にあり、かつ３’ＵＴＲによってフランキングされた選択可能なマーカーも含有する。脂肪酸分解（脂肪酸ベータ酸化としても公知である）経路からの短鎖および中鎖長ＰＨＡ生成へのルートを示している。脂肪酸分解からのＰＨＡ合成を促進するための活性は、次のものから選択することができる：アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（反応１ａ）、アシルＣｏＡオキシダーゼ（反応１ｂ）、カタラーゼ（反応２）、ベータ−酸化のアルファサブユニット（反応３、４、５）、ベータ−酸化のベータサブユニット（反応６）、中鎖長基質特異性を有するＰＨＡシンターゼ（反応７）、ベータ−ケトチオラーゼ（反応８）、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ依存性レダクターゼ（反応９）、短鎖長特異性を有するＰＨＡシンターゼ（反応１０）、および短鎖および中鎖長の両方の基質を組み込んでいるＰＨＡシンターゼ（反応１１）。選択される活性は、１または複数の適切な遺伝的構築物の形質転換によって宿主植物中に生成することができる。脂肪酸生合成からの中鎖長ＰＨＡ生成の経路の概略図である。脂肪酸生合成からのＰＨＡ合成を促進するための活性は、次のものから選択することができる：３−ヒドロキシアシル−アシルキャリヤータンパク質コエンザイムＡトランスフェラーゼ（反応１）、チオエステラーゼ（反応２）、アシルＣｏＡシンテターゼ（反応３）、ＣｏＡトランスフェラーゼ（反応４）、中鎖長シンターゼ（反応５）、ベータ−ケトチオラーゼ（反応６）、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ依存性レダクターゼ（反応７）、および短鎖および中鎖長の両方の基質を組み込んでいるＰＨＡシンターゼ（反応８）。選択される活性は、１または複数の適切な遺伝的構築物の形質転換によって宿主植物中に生成することができる。高ラウレート含有油料種子の生成の概略経路である。油中の増加したラウレート含量を促進するための活性は、次のものから選択することができる：１２：０−アシル−キャリヤータンパク質チオエステラーゼ（反応１）、および１２：０−コエンザイムＡの方を好むリゾホスファチチン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｔｉｃ）酸アシルトランスフェラーゼ（反応２）。選択される活性は、１または複数の適切な遺伝的構築物の形質転換によって宿主植物中に生成することができる。植物中の非常に長い鎖の多不飽和脂肪酸の生成の経路を示している。植物中のこれらの脂肪酸の合成を促進するための活性は、次のものから選択することができる：Δ^９−エロンガーゼ（反応１）、Δ^８−デサチュラーゼ（反応２）、Δ^５−エロンガーゼ（反応３）、Δ^６−デサチュラーゼ（反応４）、およびΔ^６−エロンガーゼ（反応５）。選択される活性は、１または複数の適切な遺伝的構築物の形質転換によって宿主植物中に生成することができる。形質転換植物におけるβ−カロチン（プロビタミンＡ）生成の概略経路である。内生植物中間体ゲラニルゲラニルジホスゲートからβ−カロチン形成を促進するための活性は、次のものから選択することができる：フィトエンシンターゼ（反応１）、フィトエンをリコペンへ転化しうるカロチンデサチュラーゼ（反応２）、フィトエンデサチュラーゼ（反応３）、ζ−カロチンデサチュラーゼ（反応４）、およびリコペンβ−シクラーゼ（反応５）。選択される活性は、１または複数の適切な遺伝的構築物の形質転換によって宿主植物中に生成することができる。漸増濃度のＭｉｍｉｃ（登録商標）およびＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）での根浸漬または葉への適用に付された第三世代（Ｔ_３）３Ｉ植物におけるＰＨＢ収率を示している。４つのサンプルについての平均および標準誤差が示されている。（Ａ）様々な濃度のＭｉｍｉｃ（登録商標）で根浸漬されたＴ_３３Ｉ植物におけるＰＨＢ収率。漸増濃度のＭｉｍｉｃ（登録商標）およびＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）での根浸漬または葉への適用に付された第三世代（Ｔ_３）３Ｉ植物におけるＰＨＢ収率を示している。４つのサンプルについての平均および標準誤差が示されている。（Ｂ）様々な濃度のＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）で根浸漬されたＴ_３３Ｉ植物におけるＰＨＢ収率。漸増濃度のＭｉｍｉｃ（登録商標）およびＩｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）での根浸漬または葉への適用に付された第三世代（Ｔ_３）３Ｉ植物におけるＰＨＢ収率を示している。４つのサンプルについての平均および標準誤差が示されている。（Ｃ）Ｉｎｔｒｅｐｉｄ（登録商標）の葉への適用で処理されたＴ_３３Ｉ植物におけるＰＨＢ収率。

Claims

２またはそれ以上のエレメントを含む生合成経路における酵素の発現のための組換えベクターであって、各エレメントが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；タンパク質をコード化する核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む組換えベクター。
各エレメント中の前記誘導プロモーターが、テトラサイクリン誘導、プリスタマイシン誘導、病原体誘導、グルココルチコイド誘導、エストロゲン誘導、銅誘導、除草剤毒性緩和剤誘導、エタノール誘導、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド誘導、病原体誘導、およびエクジソン誘導プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載の組換えベクター。
前記プロモーターが、エクジソン、テブフェノジド、メトキシフェノジド、ムリステロンＡ、ポナステロンＡ、昆虫ステロイドホルモン２０−ヒドロキシエクジソン、およびケージβ−エクジソンからなる群から選択される化合物によって活性化されるエクジソン誘導プロモーターである、請求項２に記載の組換えベクター。
各エレメント中の前記プロモーターが、同じプロモーターである、請求項１に記載の組換えベクター。
各エレメント中の前記プロモーターが、異なるプロモーターである、請求項１に記載の組換えベクター。
前記２またはそれ以上のエレメントが、ベータ−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、デヒドラターゼ、イソメラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、脂肪酸合成酵素、および脂肪酸ベータ−酸化酵素からなる群から選択されるタンパク質をコード化する核酸配列を含有する、請求項１に記載の組換えベクター。
前記２またはそれ以上のエレメントが、チオエステラーゼ、デルタ−９−デサチュラーゼ、オメガ−３−デサチュラーゼ、オメガ−６−デサチュラーゼ、脂肪酸エロンガーゼ、ヒドロキシラーゼ、およびトリアシル−グリセロール生合成酵素からなる群から選択されるタンパク質をコード化する核酸配列を含有する、請求項１に記載の組換えベクター。
生合成経路における酵素の発現のための組換えベクターであって、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：２またはそれ以上の核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；各々タンパク質をコード化する２またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む組換えベクター。
２またはそれ以上のエレメントを含む生合成経路における酵素の発現のための組換えベクターであって、各エレメントが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；タンパク質をコード化する核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む組換えベクター。
前記核酸配列が、ベータ−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、デヒドラターゼ、イソメラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、脂肪酸合成酵素、および脂肪酸ベータ−酸化酵素からなる群から選択されるタンパク質をコード化する、請求項８または９に記載の組換えベクター。
前記核酸配列が、チオエステラーゼ、デルタ−９−デサチュラーゼ、オメガ−３−デサチュラーゼ、オメガ−６−デサチュラーゼ、脂肪酸エロンガーゼ、ヒドロキシラーゼ、およびトリアシル−グリセロール生合成酵素からなる群から選択されるタンパク質をコード化する、請求項８または９に記載の組換えベクター。
前記プロモーターが、テトラサイクリン応答性プロモーターである、請求項８または９に記載の組換えベクター。
２またはそれ以上のエレメントを含む生合成経路における酵素の発現のための組換えベクターであって、該エレメントの少なくとも１つが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含み；該エレメントの少なくとも１つが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：２またはそれ以上の核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；各々がタンパク質をコード化する２またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む組換えベクター。
３またはそれ以上のエレメントを含む生合成経路における酵素の発現のための組換えベクターであって、該エレメントの少なくとも１つが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含み；該エレメントの少なくとも２つが各々、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；タンパク質をコード化する核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む組換えベクター。
前記誘導プロモーターは、テトラサイクリン誘導、プリスタマイシン誘導、病原体誘導、グルココルチコイド誘導、エストロゲン誘導、銅誘導、除草剤毒性緩和剤誘導、エタノール誘導、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド誘導、病原体誘導、およびエクジソン誘導プロモーターからなる群から選択され；前記アクチベータ分子もしくは複合体は、テトラサイクリン制御されたトランスアクチベータであり；前記アクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーターは、テトラサイクリン応答性プロモーターである、請求項１３または１４に記載の組換えベクター。
前記核酸配列によってコード化されたタンパク質は、ベータ−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、デヒドラターゼ、イソメラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、脂肪酸合成酵素、および脂肪酸ベータ−酸化酵素からなる群から選択される、請求項１３または１４に記載の組換えベクター。
前記核酸配列によってコード化されたタンパク質は、チオエステラーゼ、デルタ−９−デサチュラーゼ、オメガ−３−デサチュラーゼ、オメガ−６−デサチュラーゼ、脂肪酸エロンガーゼ、ヒドロキシラーゼ、およびトリアシル−グリセロール生合成酵素からなる群から選択される、請求項１３または１４に記載の組換えベクター。
植物における発現のための、請求項８、９、１３、または１４のいずれか１項記載のベクター。
２またはそれ以上のエレメントを含む形質転換植物細胞であって、各エレメントが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて；：核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；タンパク質をコード化する核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む形質転換植物細胞。
各エレメント中の前記誘導プロモーターは、テトラサイクリン誘導、プリスタマイシン誘導、病原体誘導、グルココルチコイド誘導、エストロゲン誘導、銅誘導、除草剤毒性緩和剤誘導、エタノール誘導、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド誘導、病原体誘導、およびエクジソン誘導プロモーターからなる群から選択される、請求項１８に記載の形質転換植物細胞。
前記プロモーターは、エクジソン、テブフェノジド、メトキシフェノジド、ムリステロンＡ、ポナステロンＡ、昆虫ステロイドホルモン２０−ヒドロキシエクジソン、およびケージβ−エクジソンからなる群から選択される化合物によって活性化されるエクジソン誘導プロモーターである、請求項２０に記載の形質転換植物細胞。
各エレメント中の前記プロモーターが、同じプロモーターである、請求項１９に記載の形質転換植物細胞。
前記プロモーターが、エクジソン誘導プロモーターである、請求項１９に記載の形質転換植物細胞。
各エレメント中の前記プロモーターが、異なっている、請求項１９に記載の形質転換植物細胞。
前記２またはそれ以上のエレメントが、ベータ−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、デヒドラターゼ、イソメラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、脂肪酸合成酵素、および脂肪酸ベータ−酸化酵素からなる群から選択される酵素をコード化する核酸配列を含有する、請求項１９に記載の形質転換植物細胞。
前記２またはそれ以上のエレメントが、チオエステラーゼ、デルタ−９−デサチュラーゼ、オメガ−３−デサチュラーゼ、オメガ−６−デサチュラーゼ、脂肪酸エロンガーゼ、ヒドロキシラーゼ、およびトリアシル−グリセロール生合成酵素からなる群から選択される酵素をコード化する核酸配列を含有する、請求項１９に記載の形質転換植物細胞。
生合成経路における酵素の発現のための組換えベクターを含む形質転換植物細胞であって、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：２またはそれ以上の核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；各々タンパク質をコード化する２またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む形質転換植物細胞。
２つ以上のエレメントを含む生合成経路における酵素の発現のための組換えベクターを含む形質転換植物細胞であって、各エレメントが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；タンパク質をコード化する核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む形質転換植物細胞。
前記核酸配列は、ベータ−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、デヒドラターゼ、イソメラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、脂肪酸合成酵素、および脂肪酸ベータ−酸化酵素からなる群から選択されるタンパク質をコード化する、請求項２７または２８に記載の形質転換植物細胞。
前記核酸配列は、チオエステラーゼ、デルタ−９−デサチュラーゼ、オメガ−３−デサチュラーゼ、オメガ−６−デサチュラーゼ、脂肪酸エロンガーゼ、ヒドロキシラーゼ、およびトリアシル−グリセロール生合成酵素からなる群から選択されるタンパク質をコード化する、請求項２７または２８に記載の形質転換植物細胞。
前記プロモーターが、テトラサイクリン応答性プロモーターである、請求項２７または２８に記載の形質転換植物細胞。
２またはそれ以上のエレメントを含む生合成経路における酵素の発現のための組換えベクターを含む形質転換植物細胞であって、該エレメントの少なくとも１つが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含み；該エレメントの少なくとも１つが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：２またはそれ以上の核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；各々タンパク質をコード化する２またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む形質転換植物細胞。
３またはそれ以上のエレメントを含む生合成経路における酵素の発現のための組換えベクターを含む形質転換植物細胞であって、該エレメントの少なくとも１つが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含み；該エレメントの少なくとも２つが各々、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；タンパク質をコード化する核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む形質転換植物細胞。
前記誘導プロモーターが、テトラサイクリン誘導、プリスタマイシン誘導、病原体誘導、グルココルチコイド誘導、エストロゲン誘導、銅誘導、除草剤毒性緩和剤誘導、エタノール誘導、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド誘導、病原体誘導、およびエクジソン誘導プロモーターからなる群から選択され；前記アクチベータ分子もしくは複合体は、テトラサイクリン制御されたトランスアクチベータであり；該アクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーターは、テトラサイクリン応答性プロモーターである、請求項３２または３３に記載の形質転換植物細胞。
前記核酸配列によってコード化されたタンパク質が、ベータ−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、デヒドラターゼ、イソメラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、脂肪酸合成酵素、および脂肪酸ベータ−酸化酵素からなる群から選択される、請求項３２または３３に記載の形質転換植物細胞。
前記核酸配列によってコード化されたタンパク質が、チオエステラーゼ、デルタ−９−デサチュラーゼ、オメガ−３−デサチュラーゼ、オメガ−６−デサチュラーゼ、脂肪酸エロンガーゼ、ヒドロキシラーゼ、およびトリアシル−グリセロール生合成酵素からなる群から選択される、請求項３２または３３に記載の形質転換植物細胞。
植物において生合成産物を生成するための方法であって、
ａ）２またはそれ以上のエレメントを含む組換えベクターを植物中に導入する工程であって、各エレメントが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；タンパク質をコード化する核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む、工程、ならびに
ｂ）該誘導プロモーターを誘導剤で活性化する工程、
を含む方法。
各エレメント中の前記誘導プロモーターが、テトラサイクリン誘導、プリスタマイシン誘導、病原体誘導、グルココルチコイド誘導、エストロゲン誘導、銅誘導、除草剤毒性緩和剤誘導、エタノール誘導、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド誘導、病原体誘導、およびエクジソン誘導プロモーターからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
前記誘導プロモーターが、エクジソン、テブフェノジド、メトキシフェノジド、ムリステロンＡ、ポナステロンＡ、昆虫ステロイドホルモン２０−ヒドロキシエクジソン、およびケージβ−エクジソンからなる群から選択される化合物によって活性化されるエクジソン誘導プロモーターである、請求項３８に記載の方法。
各エレメント中の前記プロモーターが、同じプロモーターである、請求項３７に記載の方法。
各エレメント中の前記プロモーターが、異なるプロモーターである、請求項３７に記載の方法。
前記誘導プロモーターは、葉への噴霧または根浸漬を介する化学物質によって活性化される、請求項３７に記載の方法。
前記生合成産物が、ポリヒドロキシアルカノエートであり、前記２またはそれ以上のエレメントは、ベータ−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、デヒドラターゼ、イソメラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、脂肪酸合成酵素、および脂肪酸ベータ−酸化酵素からなる群から選択されるタンパク質をコード化する核酸配列を含有する、請求項３７に記載の方法。
前記生合成産物が、変性油であり、前記２またはそれ以上のエレメントは、チオエステラーゼ、デルタ−９−デサチュラーゼ、オメガ−３−デサチュラーゼ、オメガ−６−デサチュラーゼ、脂肪酸エロンガーゼ、ヒドロキシラーゼ、およびトリアシル−グリセロール生合成酵素からなる群から選択されるタンパク質をコード化する核酸配列を含有する、請求項３７に記載の方法。
植物において生合成産物を生成するための方法であって、
ａ）２またはそれ以上の組換えベクターを植物中に導入する工程であって、少なくとも１つの組換えベクターが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含み；少なくとも１つの組換えベクターが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：２またはそれ以上の核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；各々タンパク質をコード化する２またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む、工程、ならびに
ｂ）該誘導プロモーターを誘導剤で活性化する工程、
を含む方法。
植物において生合成産物を生成するための方法であって、
ａ）２またはそれ以上の組換えベクターを植物中に導入する工程であって、少なくとも１つの組換えベクターが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含み；少なくとも１つの組換えベクターが、２またはそれ以上のエレメントを含み、各エレメントが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；タンパク質をコード化する核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む、工程、ならびに
ｂ）該誘導プロモーターを誘導剤で活性化する工程、
を含む方法。
植物において生合成産物を生成するための方法であって、
ａ）２またはそれ以上のエレメントを含む単一組換えベクターを植物中に導入する工程であって、該エレメントの少なくとも１つが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含み；該エレメントの少なくとも１つが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：２またはそれ以上の核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；各々タンパク質をコード化する２またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む、工程、ならびに
ｂ）該誘導プロモーターを誘導剤で活性化する工程、
を含む方法。
植物において生合成産物を生成するための方法であって、
ａ）３またはそれ以上のエレメントを含む単一組換えベクターを植物中に導入する工程であって、該エレメントの少なくとも１つが、５’から３’方向において動作可能なように連結されて：アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列の転写を導く誘導プロモーター；アクチベータ分子もしくは複合体をコード化する１またはそれ以上の核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含み；該エレメントの少なくとも２つが、各々５’から３’方向において動作可能なように連結されて：核酸配列の転写を導くアクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーター；タンパク質をコード化する核酸配列；および３’ポリアデニル化シグナル配列を含む、工程、ならびに
ｂ）該誘導プロモーターを誘導剤で活性化する工程、
を含む方法。
前記生合成産物は、ポリヒドロキシアルカノエートであり、前記核酸配列によってコード化されたタンパク質は、ベータ−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、デヒドラターゼ、イソメラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、脂肪酸合成酵素、および脂肪酸ベータ−酸化酵素からなる群から選択される、請求項４５〜４８のいずれか１項記載の方法。
前記生合成産物は、変性油であり、前記核酸配列によってコード化されたタンパク質は、チオエステラーゼ、デルタ−９−デサチュラーゼ、オメガ−３−デサチュラーゼ、オメガ−６−デサチュラーゼ、脂肪酸エロンガーゼ、ヒドロキシラーゼ、およびトリアシル−グリセロール生合成酵素からなる群から選択される、請求項４５〜４８のいずれか１項記載の方法。
前記誘導プロモーターが、テトラサイクリン誘導、プリスタマイシン誘導、病原体誘導、グルココルチコイド誘導、エストロゲン誘導、銅誘導、除草剤毒性緩和剤誘導、エタノール誘導、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド誘導、病原体誘導、およびエクジソン誘導プロモーターからなる群から選択され；前記アクチベータ分子もしくは複合体が、テトラサイクリン制御されたトランスアクチベータであり；該アクチベータ分子もしくは複合体によって活性化されるプロモーターが、テトラサイクリン応答性プロモーター、プリスタマイシン誘導プロモーターからなる群から選択される、請求項４５〜４８のいずれか１項記載の方法。
前記核酸配列によってコード化されたタンパク質は、ベータ−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、トレオニンデヒドラターゼ、デヒドラターゼ、イソメラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡシンテターゼ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、脂肪酸合成酵素、および脂肪酸ベータ−酸化酵素からなる群から選択される、請求項４５〜４７のいずれか１項記載の方法。
前記核酸配列によってコード化されたタンパク質は、チオエステラーゼ、デルタ−９−デサチュラーゼ、オメガ−３−デサチュラーゼ、オメガ−６−デサチュラーゼ、脂肪酸エロンガーゼ、ヒドロキシラーゼ、およびトリアシル−グリセロール生合成酵素からなる群から選択される、請求項４５〜４８のいずれか１項記載の方法。
前記誘導プロモーターは、葉への噴霧または根浸漬を介する化学物質によって活性化される、請求項４５〜４８のいずれか１項記載の方法。