CN116875524B - 一种在微生物中调控多基因表达的方法及其应用 - Google Patents
一种在微生物中调控多基因表达的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体公开一种调控多基因表达的微生物、一种表达载体、一种启动子、一种在微生物中调控多基因表达的方法及其应用，所述调控多基因表达的方法使用多种诱导表达系统，多种诱导表达系统包括多种诱导剂、多种响应诱导剂的调控蛋白和多种与响应诱导剂的调控蛋白作用的启动子及其控制的产物合成基因。通过改变每个诱导剂的浓度，可以改变每个基因的表达强度，通过这一方法，可以实现在微生物中控制每个基因的表达强度，实现精确的基因表达强度控制和快速的高产菌株构建，有利于在微生物合成代谢产物时平衡代谢流，提高生物合成的产量，该方法对于生物合成与“绿色制造”有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及微生物基因工程技术领域，尤其涉及一种在微生物中用多种诱导表达系统调控多基因表达的方法及其应用。
背景技术
生物合成为人类的生产生活带来了各类产品，具有广阔的前景(Ko et al.,2020)。生物合成一般在微生物内进行，生物合成需要酶的参与，酶由生物合成途径相关基因编码。一般来说，生物合成需要多步酶促反应才能将底物转化为目标产物，也就是说，催化生物合成的酶不止一个，上一步酶促反应的产物是下一步酶促反应的底物，然而，由于每步酶促反应所使用的酶的催化效率不同，所以如果将生物合成途径相关基因用相同强度表达，即为各步酶促反应提供相同数量的酶，则会导致催化效率高的酶的产物无法完全被催化效率低的酶利用，进而导致中间产物在细胞内积累，细胞出现代谢流不平衡的问题。中间产物会抑制反应速率，且有毒性的中间产物还会对细胞生长产生影响，此外，不合理的基因表达强度也会造成酶的过量表达，带来物质能量浪费，甚至影响细菌生长，最终降低目标产物的产量(Farmer and Liao, 2000; Jung et al., 2021; Kent and Dixon, 2020; Liet al., 2022; Pitera et al., 2007)。
如果能够分别调控每一个参与生物合成基因的表达强度，使其以特定的强度表达，则可以获得一种更优化的基因表达方案，将每一步酶促反应的产物在下一步酶促反应中完全转化，以减少中间产物的积累，平衡细胞在进行生物合成时的代谢流，提高合成产物的产量(Meyer et al., 2019)。为实现这一目标，需要在进行生物合成的底盘细胞中开发可以分别调控多个基因表达强度的方法。
诱导表达系统可以用于调控基因的表达强度，从工作原理上，诱导表达系统可分为抑制型诱导表达系统和激活型诱导表达系统，二者都依赖于化学信号（诱导剂）、调控蛋白及其对应的诱导型启动子实现基因表达调控。具体来说，在激活型诱导表达系统中，调控蛋白是激活蛋白，在不加入诱导剂的情况下，调控蛋白结合在诱导型启动子上但无法招募RNA聚合酶，基因转录关闭，而在加入诱导剂的情况下，诱导剂与调控蛋白结合，调控蛋白发生构象变化，使RNA聚合酶与启动子结合，基因转录开启；在抑制型诱导表达系统中，调控蛋白是阻遏蛋白，在不加入诱导剂的情况下，调控蛋白与诱导型启动子结合，对RNA聚合酶形成空间位阻，基因转录关闭，而在加入诱导剂的情况下，诱导剂与调控蛋白结合，调控蛋白发生构象变化，离开启动子区，使RNA聚合酶与启动子结合，基因转录开启。在诱导表达系统中，基因的表达强度由诱导剂浓度控制，在一定范围内，诱导剂浓度越高，基因表达强度越强（Li et al., 2022）。
因此，需要一种综合多种诱导表达系统分别调控每一个参与生物合成基因的表达强度，使其以特定的强度表达，获得一种优化的基因表达方案。
发明内容
本发明公开一种在微生物中调控多基因表达的方法，使用多种诱导表达系统，其中包括多种诱导剂、多种响应诱导剂的调控蛋白和多种与调控蛋白作用的启动子及其控制的具有生物学功能的基因。通过通过改变每个诱导剂的浓度，可以改变每个基因的表达强度，实现精确的基因表达强度控制和快速的高产菌株构建。具体的，
本发明的第一方面，提供了一种调控多基因表达的微生物，所述的微生物包括表达载体，所述的表达载体包含与调控蛋白作用的启动子、编码调控蛋白的核苷酸序列以及产物合成基因。
优选的，所述的编码调控蛋白的核苷酸序列与产物合成基因可以在一个表达载体上或两个表达载体上，所述的表达载体的拷贝数可以是一个、两个或两个以上。
优选的，所述的调控蛋白选自响应阿拉伯糖的调控蛋白AraC、响应OHC14（N-（3-羟基-十四酰基）-高丝氨酸内酯）的调控蛋白CinR、响应枯茗酸的调控蛋白CymR、响应水杨酸钠的调控蛋白NahR、响应香草酸的调控蛋白VanR、响应无水四环素的调控蛋白TetR、响应OC6（N-（3-氧-己酰基）-高丝氨酸内酯）的调控蛋白LuxR、响应柚皮素的调控蛋白TtgR、响应DAPG（2,4-二乙酰基间苯三酚）的调控蛋白PhlF和与以上调控蛋白功能相同的蛋白中的一种或两种以上。
进一步优选的，所述的调控蛋白AraC包含SEQ ID No.1或者包含与SEQ ID No.1具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白CinR包含SEQ ID No.2或者包含与SEQ ID No.2具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白CymR包含SEQ ID No.3或者包含与SEQ ID No.3具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白NahR包含SEQ ID No.4或者包含与SEQ ID No.4具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白VanR包含SEQ ID No.5或者包含与SEQ ID No.5具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白TetR包含SEQ ID No.6或者包含与SEQ ID No.6具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白LuxR包含SEQ ID No.7或者包含与SEQ ID No.7具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白TtgR包含SEQ ID No.8或者包含与SEQ ID No.8具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白PhlF包含SEQ ID No.9或者包含与SEQ ID No.9具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
优选的，所述的与调控蛋白作用的启动子为诱导型启动子，所述的诱导型启动子包含调控蛋白的结合位点。
优选的，所述的诱导型启动子可以选自现有技术中常规的诱导型启动子，只要该诱导型启动子包含调控蛋白的结合位点，且具有诱导型启动子的活性。进一步优选的，所述的诱导型启动子选自带有调控蛋白AraC结合位点的启动子PBAD_NNNN、带有调控蛋白CinR结合位点的启动子PCin_NNNN、带有调控蛋白CymR结合位点的启动子PCym_NNNN、带有调控蛋白NahR结合位点的启动子PSal_NNNN、带有调控蛋白VanR结合位点的启动子PVan_NNNN、带有调控蛋白TetR结合位点的启动子PTet_NNNN、带有调控蛋白LuxR结合位点的启动子PLux_NNNN、带有调控蛋白TtgR结合位点的启动子PTtg_NNNN、带有调控蛋白PhlF结合位点的启动子PPhlF_NNNN中的一种或两种以上。
进一步优选的，所述的启动子PBAD_NNNN包含SEQ ID No.20或者包含与SEQ ID No.20具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PBAD_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.38-41任一所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.38
TAACAAAAGTGTCTATAA
SEQ ID NO.39
ACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATG
SEQ ID NO.40
TAGCATTTTTATCCAT
SEQ ID NO.41
TAGCGGATCCTA
所述的启动子PCin_NNNN包含SEQ ID No.21或者包含与SEQ ID No.21具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PCin_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.42
GGGGGGGCCTATCTGAGGGAA
所述的启动子PCym_NNNN包含SEQ ID No.22或者包含与SEQ ID No.22具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PCym_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.43
AACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTATTAT
所述的启动子PSal_NNNN包含SEQ ID No.23或者包含与SEQ ID No.23具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PSal_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.44
CGCAATATTCATGTTGATGATTTATTATATA
所述的启动子PVan_NNNN包含SEQ ID No.24或者包含与SEQ ID No.24具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PVan_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.45
ATTGGATCCAAT
所述的启动子PTet_NNNN包含SEQ ID No.25或者包含与SEQ ID No.25具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PTet_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.46
TCCCTATCAGTGATAGAGA
所述的启动子PLux_NNNN包含SEQ ID No.26或者包含与SEQ ID No.26具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PLux_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.47所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.47
ACCTGTAGGATCGTACAGGT
所述的启动子PTtg_NNNN包含SEQ ID No.27或者包含与SEQ ID No.27具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PTtg_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.48
TATTTACAAACAACCATGAATGTAAGTA
所述的启动子PPhlF_NNNN包含SEQ ID No.28或者包含与SEQ ID No.28具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PPhlF_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.49
ATGATACGAAACGTACCGTATCGTTAAGGT
优选的，SEQ ID No.20-28中的N可以是A、T、C、G中的任一种。
优选的，所述的诱导型启动子选自PBAD或其突变体、PCin或其突变体、PCym或其突变体、PSal或其突变体、PVan或其突变体、PTet或其突变体、PLux或其突变体、PTtg或其突变体、PPhlF或其突变体中的一种或两种以上。
进一步优选的，所述的突变体包括至少一个碱基的突变，更优选的，所述的突变体包括原始启动子-10区前4个碱基中至少一个碱基的突变，所述的4个碱基可以是A、T、C、G的任意组合。
进一步优选的，所述的启动子PBAD包含SEQ ID No.11所示核苷酸序列。
所述的启动子PCin包含SEQ ID No.12所示核苷酸序列。
所述的启动子PCym包含SEQ ID No.13所示核苷酸序列。
所述的启动子PSal包含SEQ ID No.14所示核苷酸序列。
所述的启动子PVan包含SEQ ID No.15所示核苷酸序列。
所述的启动子PTet包含SEQ ID No.16所示核苷酸序列。
所述的启动子PLux包含SEQ ID No.17所示核苷酸序列。
所述的启动子PTtg包含SEQ ID No.18所示核苷酸序列。
所述的启动子PPhlF包含SEQ ID No.19所示核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的突变体包括SEQ ID No.29-37任一或两个以上所示核苷酸序列。
优选的，所述的微生物为真核微生物和/或原核微生物。所述的原核微生物包括但不限于大肠杆菌、罗氏真养杆菌（Ralstonia eutropha）、芽孢杆菌、谷棒菌、巨大产碱杆菌、假单胞菌属（Pseudomonas entomophila）、气生单胞菌属或嗜盐菌中的任一种。所述的真核微生物包括但不限于酵母、真菌或者藻类中的任一种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的微生物选自罗氏真养杆菌（Ralstonia eutropha）、假单胞菌属、嗜盐单胞菌属（Halomonas spp.）。
所述的嗜盐菌为嗜盐单胞菌属。在本发明的一个具体实施方式中，所述嗜盐菌包括但不限于嗜盐单胞菌，包括但不限于Halomonas bluephagenesis TD01 CGMCC. No.4353、Halomonas campaniensis LS21 CGMCC No. 6593 和Halomonas aydingkolgenesis M1 CGMCC No. 19880。
优选的，所述的产物包含胞内产物、分泌到胞外的酶、与细胞形态相关的蛋白或与细胞内基因调控相关的蛋白或RNA。
优选的，所述的产物包含PHA、四氢嘧啶、氨基酸、肌醇、1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、1，5-戊二胺、5-氨基乙酰丙酸、脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶、核酸酶、微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB、细胞分裂调控因子MinCD、乳糖操纵子遏制蛋白LacI、四环素操纵子阻遏蛋白TetR、CRISPRi/CRISPRa中使用的sgRNA或番茄红素中的一种或两种以上。
在一个具体实施方式中，所述的氨基酸为精氨酸。
优选的，所述的PHA选自3-羟基丁酸均聚物PHB，3-羟基丁酸和4-羟基丁酸二元共聚物P3HB4HB，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基戊酸三元共聚物PHBV4HB，3-羟基丁酸和3-羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3-羟基丙酸的均聚物或共聚物，所述的3-羟基丙酸的均聚物为P3HP，所述的3-羟基丙酸的共聚物为P(3HB-co-3HP)或PHBHP。
所述的产物还包含胞外各种小分子产物和/或胞外各种水解酶。
优选的，所述的番茄红素对应产物合成基因包含dxs，crtE、crtI、crtB、idi和dxs。
优选的，所述的PHA对应产物合成基因包含phaA、phaB和phaC。
优选的，所述的四氢嘧啶对应产物合成基因包含ectA、ectB和ectC。
优选的，所述的精氨酸对应产物合成基因包含gdh、argJ、argB、argC、argD、argF、argG、argH和pgl。
优选的，所述的微生物在培养过程中加入诱导剂，诱导剂与调控蛋白结合，调控蛋白发生构象变化，使RNA聚合酶与启动子结合，基因转录开启；若不加入诱导剂或者加入中和或者抑制诱导剂的物质，调控蛋白结合在诱导型启动子上但无法招募RNA聚合酶，基因转录关闭。基因表达的强度与诱导剂的浓度成正比，通过改变每个诱导剂的浓度，可以改变每个基因的表达强度。
优选的，所述的诱导剂包括阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG中的一种或两种以上。
优选的，所述的表达载体能够在微生物中复制、转录及翻译。因此，其还包含常规的其他表达元件，例如终止子、酶切位点等等。
优选的，所述的表达载体为质粒。
本发明的第二方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体包含至少一种诱导表达系统。
优选的，所述的诱导表达系统包括诱导剂、调控蛋白和与调控蛋白作用的启动子。
优选的，所述的诱导表达系统包括选自阿拉伯糖诱导表达系统、N-（3-羟基-十四酰基）-高丝氨酸内酯（OHC14）诱导表达系统、枯茗酸诱导表达系统、水杨酸钠诱导表达系统、香草酸诱导表达系统、无水四环素诱导表达系统、N-（3-氧-己酰基）-高丝氨酸内酯（OC6）诱导表达系统、柚皮素诱导表达系统和2,4-二乙酰基间苯三酚（DAPG）诱导表达系统中的一种或两种以上。
优选的，所述的阿拉伯糖诱导表达系统包括诱导剂阿拉伯糖、调控蛋白AraC和与调控蛋白作用的启动子PBAD_NNNN。
优选的，所述的OHC14诱导表达系统表达系统包括诱导剂OHC14、调控蛋白CinR和与调控蛋白作用的启动子PCin_NNNN。
优选的，所述的枯茗酸诱导表达系统表达系统包括诱导剂枯茗酸、调控蛋白CymR和与调控蛋白作用的启动子PCym_NNNN。
优选的，所述的水杨酸钠诱导表达系统表达系统包括诱导剂水杨酸钠、调控蛋白NahR和与调控蛋白作用的启动子PSal_NNNN。
优选的，所述的香草酸诱导表达系统表达系统包括诱导剂香草酸、调控蛋白VanR和与调控蛋白作用的启动子PVan_NNNN。
优选的，所述的无水四环素诱导表达系统表达系统包括诱导剂无水四环素、调控蛋白TetR和与调控蛋白作用的启动子PTet_NNNN。
优选的，所述的OC6诱导表达系统表达系统包括诱导剂OC6、调控蛋白LuxR和与调控蛋白作用的启动子PLux_NNNN。
优选的，所述的柚皮素诱导表达系统表达系统包括诱导剂柚皮素、调控蛋白TtgR和与调控蛋白作用的启动子PTtg_NNNN。
优选的，所述的DAPG诱导表达系统表达系统包括诱导剂DAPG、调控蛋白PhlF和与调控蛋白作用的启动子PPhlF_NNNN。
进一步优选的，所述的调控蛋白AraC包含SEQ ID No.1或者包含与SEQ ID No.1具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白CinR包含SEQ ID No.2或者包含与SEQ ID No.2具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白CymR包含SEQ ID No.3或者包含与SEQ ID No.3具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白NahR包含SEQ ID No.4或者包含与SEQ ID No.4具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白VanR包含SEQ ID No.5或者包含与SEQ ID No.5具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白TetR包含SEQ ID No.6或者包含与SEQ ID No.6具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白LuxR包含SEQ ID No.7或者包含与SEQ ID No.7具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白TtgR包含SEQ ID No.8或者包含与SEQ ID No.8具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
所述的调控蛋白PhlF包含SEQ ID No.9或者包含与SEQ ID No.9具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的氨基酸序列。
进一步优选的，所述的启动子PBAD_NNNN包含SEQ ID No.20或者包含与SEQ ID No.20具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PBAD_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.38-41任一所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.38
TAACAAAAGTGTCTATAA
SEQ ID NO.39
ACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATG
SEQ ID NO.40
TAGCATTTTTATCCAT
SEQ ID NO.41
TAGCGGATCCTA
所述的启动子PCin_NNNN包含SEQ ID No.21或者包含与SEQ ID No.21具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PCin_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.42
GGGGGGGCCTATCTGAGGGAA
所述的启动子PCym_NNNN包含SEQ ID No.22或者包含与SEQ ID No.22具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PCym_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.43
AACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTATTAT
所述的启动子PSal_NNNN包含SEQ ID No.23或者包含与SEQ ID No.23具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PSal_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.44
CGCAATATTCATGTTGATGATTTATTATATA
所述的启动子PVan_NNNN包含SEQ ID No.24或者包含与SEQ ID No.24具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PVan_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.45
ATTGGATCCAAT
所述的启动子PTet_NNNN包含SEQ ID No.25或者包含与SEQ ID No.25具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PTet_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.46
TCCCTATCAGTGATAGAGA
所述的启动子PLux_NNNN包含SEQ ID No.26或者包含与SEQ ID No.26具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PLux_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.47所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.47
ACCTGTAGGATCGTACAGGT
所述的启动子PTtg_NNNN包含SEQ ID No.27或者包含与SEQ ID No.27具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PTtg_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.48
TATTTACAAACAACCATGAATGTAAGTA
所述的启动子PPhlF_NNNN包含SEQ ID No.28或者包含与SEQ ID No.28具有80%以上同源性且具有相同或相似的活性的核苷酸序列。
所述的启动子PPhlF_NNNN中的调控蛋白的结合位点包含SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.49
ATGATACGAAACGTACCGTATCGTTAAGGT
其中，SEQ ID No.20-28中的N可以是A、T、C、G中的任一种。
更选的，所述的启动子PBAD_NNNN包含PBAD或其突变体，更进一步优选的，所述的启动子PBAD包含SEQ ID No.11所示核苷酸序列。
所述的启动子PCin_NNNN包含PCin或其突变体，更进一步优选的，所述的启动子PCin包含SEQ ID No.12所示核苷酸序列。
所述的启动子PCym_NNNN包含PCym或其突变体，更进一步优选的，所述的启动子PCym包含SEQ ID No.13所示核苷酸序列。
所述的启动子PSal_NNNN包含PSal或其突变体，更进一步优选的，所述的启动子PSal包含SEQ ID No.14所示核苷酸序列。
所述的启动子PVan_NNNN包含PVan或其突变体，更进一步优选的，所述的启动子PVan包含SEQ ID No.15所示核苷酸序列。
所述的启动子PTet_NNNN包含PTet或其突变体，更进一步优选的，所述的启动子PTet包含SEQ ID No.16所示核苷酸序列。
所述的启动子PLux_NNNN包含PLux或其突变体，更进一步优选的，所述的启动子PLux包含SEQ ID No.17所示核苷酸序列。
所述的启动子PTtg_NNNN包含PTtg或其突变体，更进一步优选的，所述的启动子PTtg包含SEQ ID No.18所示核苷酸序列。
所述的启动子PPhlF_NNNN包含PPhlF或其突变体，更进一步优选的，所述的启动子PPhlF包含SEQ ID No.19所示核苷酸序列。
其中，所述的突变体包括至少一个碱基的突变，优选的，所述的突变体包括原始启动子-10区前4个碱基中至少一个碱基的突变，所述的4个碱基可以是A、T、C、G的任意组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的突变体包括SEQ ID No.29-37任一或两个以上所示核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的诱导表达系统包括以下组合：
1）香草酸、OC6、OHC14、阿拉伯糖和水杨酸钠诱导表达系统；
2）无水四环素、枯茗酸和DAPG诱导表达系统；
3）柚皮素、阿拉伯糖和OHC14诱导表达系统；
4）阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG诱导表达系统；或，
5）水杨酸钠、OHC14和阿拉伯糖诱导表达系统。
优选的，所述的表达载体还包括产物合成基因。
优选的，所述的产物包含胞内产物、分泌到胞外的酶、与细胞形态相关的蛋白或与细胞内基因调控相关的蛋白或RNA。
优选的，所述的产物包含PHA、四氢嘧啶、氨基酸、肌醇、1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、1，5-戊二胺、5-氨基乙酰丙酸、脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶、核酸酶、微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB、细胞分裂调控因子MinCD、乳糖操纵子遏制蛋白LacI、四环素操纵子阻遏蛋白TetR、CRISPRi/CRISPRa中使用的sgRNA或番茄红素中的一种或两种以上。
在一个具体实施方式中，所述的氨基酸为精氨酸。
优选的，所述的PHA选自3-羟基丁酸均聚物PHB，3-羟基丁酸和4-羟基丁酸二元共聚物P3HB4HB，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基戊酸三元共聚物PHBV4HB，3-羟基丁酸和3-羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3-羟基丙酸的均聚物或共聚物，所述的3-羟基丙酸的均聚物为P3HP，所述的3-羟基丙酸的共聚物为P(3HB-co-3HP)或PHBHP。
所述的产物还包含胞外各种小分子产物和/或胞外各种水解酶。
优选的，所述的产物合成基因包含dxs，crtE、crtI、crtB、idi、dxs、phaA、phaB、phaC、ectA、ectB、ectC、gdh、argJ、argB、argC、argD、argF、argG、argH和pgl中的一种或两种以上。
所述的表达载体能够在宿主细胞中复制、转录及翻译。因此，其还包含常规的其他表达元件，例如终止子、酶切位点等等。
优选的，所述的表达载体可以为原核表达载体或真核表达载体，优选为原核表达载体。
优选的，所述的表达载体为质粒。
本发明的第三方面，提供了一种在微生物中调控多基因表达的方法，所述的方法包括向微生物中导入上述的表达载体进行培养，或者，所述的方法包括培养上述的微生物。
优选的，所述的方法还包括加入诱导剂，进一步优选的，所述的诱导剂包括阿拉伯糖、N-（3-羟基-十四酰基）-高丝氨酸内酯（OHC14）、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、N-（3-氧-己酰基）-高丝氨酸内酯（OC6）、柚皮素和2,4-二乙酰基间苯三酚（DAPG）中的一种或两种以上。
优选的，所述的基因表达强度与加入诱导剂的浓度成正比。
优选的，所述的调控包括在培养过程中加入诱导剂，诱导剂与调控蛋白结合，调控蛋白发生构象变化，使RNA聚合酶与启动子结合，基因转录开启；若不加入诱导剂或者加入中和或者抑制诱导剂的物质，调控蛋白结合在诱导型启动子上但无法招募RNA聚合酶，基因转录关闭。基因表达的强度与诱导剂的浓度成正比，通过改变每个诱导剂的浓度，可以改变每个基因的表达强度。
优选的，所述的微生物为真核微生物和/或原核微生物。所述的原核微生物包括但不限于大肠杆菌、罗氏真养杆菌（Ralstonia eutropha）、芽孢杆菌、谷棒菌、巨大产碱杆菌、假单胞菌属（Pseudomonas entomophila）、气生单胞菌属或嗜盐菌中的任一种。所述的真核微生物包括但不限于酵母、真菌或者藻类中的任一种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的微生物选自罗氏真养杆菌（Ralstonia eutropha）、假单胞菌属、嗜盐单胞菌属（Halomonas spp.）。
所述的嗜盐菌为嗜盐单胞菌属。在本发明的一个具体实施方式中，所述嗜盐菌包括但不限于嗜盐单胞菌，包括但不限于Halomonas bluephagenesis TD01 CGMCC. No.4353、Halomonas campaniensis LS21 CGMCC No. 6593 和Halomonas aydingkolgenesis M1 CGMCC No. 19880。
优选的，所述表达载体将启动子整合至微生物染色体基因组中或者所述表达载体游离在微生物中。
本发明的第四方面，提供了一种生产产物的方法，所述的方法包括向微生物中导入上述的表达载体进行培养，或者，所述的方法包括培养上述的微生物。
优选的，所述的方法还包括加入诱导剂，进一步优选的，所述的诱导剂包括阿拉伯糖、N-（3-羟基-十四酰基）-高丝氨酸内酯（OHC14）、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、N-（3-氧-己酰基）-高丝氨酸内酯（OC6）、柚皮素和2,4-二乙酰基间苯三酚（DAPG）中的一种或两种以上。
优选的，所述的基因表达强度与加入诱导剂的浓度成正比。
优选的，所述的调控包括在培养过程中加入诱导剂，诱导剂与调控蛋白结合，调控蛋白发生构象变化，使RNA聚合酶与启动子结合，基因转录开启；若不加入诱导剂或者加入中和或者抑制诱导剂的物质，调控蛋白结合在诱导型启动子上但无法招募RNA聚合酶，基因转录关闭。基因表达的强度与诱导剂的浓度成正比，通过改变每个诱导剂的浓度，可以改变每个基因的表达强度。
优选的，所述的微生物为真核微生物和/或原核微生物。所述的原核微生物包括但不限于大肠杆菌、罗氏真养杆菌（Ralstonia eutropha）、芽孢杆菌、谷棒菌、巨大产碱杆菌、假单胞菌属（Pseudomonas entomophila）、气生单胞菌属或嗜盐菌中的任一种。所述的真核微生物包括但不限于酵母、真菌或者藻类中的任一种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的微生物选自罗氏真养杆菌（Ralstonia eutropha）、假单胞菌属、嗜盐单胞菌属（Halomonas spp.）。
所述的嗜盐菌为嗜盐单胞菌属。在本发明的一个具体实施方式中，所述嗜盐菌包括但不限于嗜盐单胞菌，包括但不限于Halomonas bluephagenesis TD01 CGMCC. No.4353、Halomonas campaniensis LS21 CGMCC No. 6593 和Halomonas aydingkolgenesis M1 CGMCC No. 19880。
本发明的第五方面，提供了一种启动子，所述的启动子与调控蛋白作用，所述的启动子包含PBAD的突变体、PCin的突变体、PCym的突变体、PSal的突变体、PVan的突变体、PTet的突变体、PLux的突变体、PTtg的突变体或PPhlF的突变体中的一种或两种以上的组合。进一步优选的，所述的突变体包括至少一个碱基的突变，更优选的，所述的突变体包括原始启动子-10区前4个碱基中至少一个碱基的突变，所述的4个碱基可以是A、T、C、G的任意组合。
进一步优选的，所述的启动子PBAD包含SEQ ID No.11所示核苷酸序列。
所述的启动子PCin包含SEQ ID No.12所示核苷酸序列。
所述的启动子PCym包含SEQ ID No.13所示核苷酸序列。
所述的启动子PSal包含SEQ ID No.14所示核苷酸序列。
所述的启动子PVan包含SEQ ID No.15所示核苷酸序列。
所述的启动子PTet包含SEQ ID No.16所示核苷酸序列。
所述的启动子PLux包含SEQ ID No.17所示核苷酸序列。
所述的启动子PTtg包含SEQ ID No.18所示核苷酸序列。
所述的启动子PPhlF包含SEQ ID No.19所示核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的突变体包括SEQ ID No.29-37任一或两个以上所示核苷酸序列。
本发明的第六方面，提供了一种上述的微生物的制备方法，所述的制备方法包括将上述的表达载体或上述的启动子导入微生物中。
优选的，所述的微生物为真核微生物和/或原核微生物。所述的原核微生物包括但不限于大肠杆菌、罗氏真养杆菌（Ralstonia eutropha）、芽孢杆菌、谷棒菌、巨大产碱杆菌、假单胞菌属（Pseudomonas entomophila）、气生单胞菌属或嗜盐菌中的任一种。所述的真核微生物包括但不限于酵母、真菌或者藻类中的任一种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的微生物选自罗氏真养杆菌（Ralstonia eutropha）、假单胞菌属、嗜盐单胞菌属（Halomonas spp.）。
所述的嗜盐菌为嗜盐单胞菌属。在本发明的一个具体实施方式中，所述嗜盐菌包括但不限于嗜盐单胞菌，包括但不限于Halomonas bluephagenesis TD01 CGMCC. No.4353、Halomonas campaniensis LS21 CGMCC No. 6593 和Halomonas aydingkolgenesis M1 CGMCC No. 19880。
优选的，所述表达载体将启动子整合至微生物染色体基因组中或者所述表达载体游离在微生物中。
本发明的第七方面，提供了一种表达载体或细胞，所述的表达载体或细胞包含上述启动子。
本发明的第八方面，提供了上述的表达载体、上述的启动子、上述的细胞、上述的微生物、上述的在微生物中调控多基因表达的方法和/或上述的生产产物的方法在基因编辑或产物合成中的应用。
优选的，所述的产物包含胞内产物、分泌到胞外的酶、与细胞形态相关的蛋白或与细胞内基因调控相关的蛋白或RNA。
优选的，所述的产物包含PHA、四氢嘧啶、氨基酸、肌醇、1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、1，5-戊二胺、5-氨基乙酰丙酸、脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶、核酸酶、微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB、细胞分裂调控因子MinCD、乳糖操纵子遏制蛋白LacI、四环素操纵子阻遏蛋白TetR、CRISPRi/CRISPRa中使用的sgRNA或番茄红素中的一种或两种以上。在一个具体实施方式中，所述的氨基酸为精氨酸。
优选的，所述的PHA选自3-羟基丁酸均聚物PHB，3-羟基丁酸和4-羟基丁酸二元共聚物P3HB4HB，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基戊酸三元共聚物PHBV4HB，3-羟基丁酸和3-羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3-羟基丙酸的均聚物或共聚物，所述的3-羟基丙酸的均聚物为P3HP，所述的3-羟基丙酸的共聚物为P(3HB-co-3HP)或PHBHP。
所述的产物还包含胞外各种小分子产物和/或胞外各种水解酶。
本发明的第九方面，提供了一种生产PHA的方法，所述的方法包括培养上述的微生物，或者，向微生物中导入上述的表达载体进行培养。
优选的，所述的微生物为向假单胞菌P. entomophila LACR或盐单胞菌H. campaniensis LSR中导入包含phaA、phaB和phaC基因的上述表达载体。
优选的，所述的方法包括加入诱导剂，进一步优选的，所述的诱导剂包括阿拉伯糖、N-（3-羟基-十四酰基）-高丝氨酸内酯（OHC14）、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、N-（3-氧-己酰基）-高丝氨酸内酯（OC6）、柚皮素和2,4-二乙酰基间苯三酚（DAPG）中的一种或两种以上。
优选的，所述的方法包括使用水杨酸钠、OHC14和阿拉伯糖诱导表达系统，或者，无水四环素、枯茗酸和DAPG诱导表达系统。
优选的，所述的方法包括调整诱导剂的浓度。
本发明的第十方面，提供了一种生产番茄红素的方法，所述的方法包括培养上述的微生物，或者，向微生物中导入上述的表达载体进行培养。
优选的，所述的微生物为向盐单胞菌H. bluephagenesis TDR中导入包含crtE、crtI、crtB、idi和dxs基因的上述表达载体。
优选的，所述的方法包括加入诱导剂，进一步优选的，所述的诱导剂包括阿拉伯糖、N-（3-羟基-十四酰基）-高丝氨酸内酯（OHC14）、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、N-（3-氧-己酰基）-高丝氨酸内酯（OC6）、柚皮素和2,4-二乙酰基间苯三酚（DAPG）中的一种或两种以上。
优选的，所述的方法包括使用香草酸、OC6、OHC14、阿拉伯糖和水杨酸钠诱导表达系统。
优选的，所述的方法包括调整诱导剂的浓度。
本发明的第十一方面，提供了一种生产四氢嘧啶的方法，所述的方法包括培养上述的微生物，或者，向微生物中导入上述的表达载体进行培养。
优选的，所述的微生物为向盐单胞菌H. aydingkolgenesis MR中导入包含ectA、ectB和ectC基因的上述表达载体。
优选的，所述的方法包括加入诱导剂，进一步优选的，所述的诱导剂包括阿拉伯糖、N-（3-羟基-十四酰基）-高丝氨酸内酯（OHC14）、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、N-（3-氧-己酰基）-高丝氨酸内酯（OC6）、柚皮素和2,4-二乙酰基间苯三酚（DAPG）中的一种或两种以上。
优选的，所述的方法包括使用柚皮素、阿拉伯糖和OHC14诱导表达系统。
优选的，所述的方法包括调整诱导剂的浓度。
本发明的第十二方面，提供了一种生产精氨酸的方法，所述的方法包括培养上述的微生物，或者，向微生物中导入上述的表达载体进行培养。
优选的，所述的微生物为罗氏真氧杆菌R. eutrophaHR中导入包含gdh、argJ、argB、argC、argD、argF、argG、argH和pgl基因的上述表达载体。
优选的，所述的方法包括加入诱导剂，进一步优选的，所述的诱导剂包括阿拉伯糖、N-（3-羟基-十四酰基）-高丝氨酸内酯（OHC14）、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、N-（3-氧-己酰基）-高丝氨酸内酯（OC6）、柚皮素和2,4-二乙酰基间苯三酚（DAPG）中的一种或两种以上。
优选的，所述的方法包括使用阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素、DAPG诱导表达系统。
优选的，所述的方法包括调整诱导剂的浓度。本发明中H. bluephagenesis TDR、H. campaniensis LSR、H. aydingkolgenesis MR、P. entomophilaLACR和R. eutropha HR分别为将阿拉伯糖诱导表达系统的调控蛋白编码基因araC、OHC14诱导表达系统的调控蛋白编码基因cinR、枯茗酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因cymR、水杨酸钠诱导表达系统的调控蛋白编码基因nahR、香草酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因vanR、无水四环素诱导表达系统的调控蛋白编码基因tetR、OC6诱导表达系统的调控蛋白编码基因luxR、柚皮素诱导表达系统的调控蛋白编码基因ttgR和DAPG诱导表达系统的调控蛋白编码基因phlF分别插入H. bluephagenesisTD01、H. campaniensis LS21、H. aydingkolgenesis M1、P. entomophila LAC32和R. eutropha H16基因组，构建的重组型微生物。
本发明所述的“PHA”为均聚PHA和/或共聚PHA。优选的，所述的PHA选自3-羟基丁酸（3HB）均聚物PHB，3-羟基丁酸（3HB）和4-羟基丁酸(4HB)二元共聚物P3HB4HB，3-羟基丁酸（3HB）、4-羟基丁酸(4HB)和3-羟基戊酸三元共聚物P(3HB-co-4HB-co-3HV)，3-羟基丁酸（3HB）和3-羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3-羟基丙酸（3HP）的均聚物或共聚物，优选的，所述的3-羟基丙酸（3HP）的均聚物为P3HP，优选的，所述的3-羟基丙酸（3HP）的共聚物为P(3HB-co-3HP)或PHBHP。在本发明的一个具体实施方式中，所述的PHA选自3-羟基丁酸均聚物PHB，3-羟基丁酸和4-羟基丁酸二元共聚物P3HB4HB，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基戊酸三元共聚物PHBV4HB，3-羟基丁酸和3-羟基己酸二元共聚物PHBHHx，3-羟基丙酸的均聚物或共聚物，所述的3-羟基丙酸的均聚物为P3HP，所述的3-羟基丙酸的共聚物为P(3HB-co-3HP)或PHBHP。
本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
本发明术语“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1．本发明中所用到的微生物
（1）盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01 CGMCC. No. 4353
发明人通过筛选得到的一株耐盐、耐碱、天然生产PHB的革兰氏阴性嗜盐细菌，该细菌天然可积累较高含量的聚羟基脂肪酸，具有优良的工业化生产应用前景。记载于“TanDan, Wu Qiong, Chen Jinchun and Chen Guo-Qiang. EngineeringHalomonas TD01 forLow Cost Production of Polyhydroxyalkanoates.Metabolic Engineering 26 （2014）34–47”一文，公众可从发明人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
（2）盐单胞菌Halomonas campaniensis LS21 CGMCC No. 6593
参见文献Haitao Yue, Chen Ling, Tao Yang, Xiangbin Chen, Yuling Chen,Haiteng Deng, Qiong Wu, Jinchun Chen and Guo-Qiang Chen. A seawater-basedopen and continuous process for polyhydroxyalkanoates production byrecombinantHalomonas campaniensis LS21 grown in mixed substrates.Biotechnology for Biofuelsc 7 （2014）108。
（3）盐单胞菌Halomonas aydingkolgenesis M1 CGMCC No. 19880
（4）假单胞菌Pseudomonas entomophilaLAC32
参见文献Mengyi Li, Xiangbin Chenb, Xuemei Che, Haoqian Zhang, Lin-Ping Wu, Hetong Du, Guo-Qiang Chen.EngineeringPseudomonas entomophilaforsynthesis of copolymers with defined fractions of 3-hydroxybutyrate andmedium-chain-length 3-hydroxyalkanoates. Metabolic Engineering 52 （2019） 253–262。
（5）罗氏真氧杆菌Ralstonia eutropha H16
参见文献Beom So Kim, Seung Chul Lee, Sang Yup Lee, Ho Nam Chang, YongKeun Chang, and Seong Ihl Woo Production of poly(3-hydroxybutyric acid) byfed-batch culture ofAlcaligenes eutrophuswith glucose concentration control.Biotechnology and Bioengineering 43 （1994）892–898。
2．培养基配方
（1）LB培养基：含5 g/L酵母提取物（英国OXID公司，产品目录号LP0021），10 g/L蛋白胨（英国OXID公司，产品目录号LP0042），10 g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。60LB培养基为LB培养基含有60 g/L NaCl，其余成分和制备条件与LB培养基相同。
（2）60MM培养基含：60 g/L NaCl，1 g/L酵母提取物（英国OXID公司，产品目录号LP0021），30 g/L葡萄糖，0.5 g/L 尿素，0.2 g/L MgSO4，9.65 g/L Na2HPO4·12H2O，1.5 g/L KH2PO4，0.05 g/L柠檬酸铁铵，0.02 g/L CaCl2，0.1 g/L ZnSO4·7H2O，0.03 g/L MnCl2·4H2O，0.3 g/L H3BO3，0.2 g/L CoCl2·6H2O，0.01 g/L CuSO4·5H2O，0.02 g/L NiCl2·6H2O，0.03 g/L NaMoO4·2H2O，其余为水。
3．pSEVA321质粒
欧洲标准系列质粒，含有氯霉素抗性基因，具体序列信息记载于“Silva-RochaRafael, Martínez-García Esteban, Calles Belén等. The Standard European VectorArchitecture （SEVA）: a coherent platform for the analysis and deployment ofcomplex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research 41 （2013） D666–D675”一文，公众可从发明人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
4．调控蛋白与sfGFP
调控蛋白AraC、CinR、CymR、NahR、VanR、TetR、LuxR、TtgR和PhlF的编码基因araC、cinR、cymR、nahR、vanR、tetR、luxR、ttgR和phlF来源于文献，具体序列信息记载于“Escherichia coli“Marionette” strains with 12 highly optimized small-moleculesensors. Nature Chemical Biology 15 （2019） 196–204”一文，AraC的蛋白序列为：SEQID No.1（MAEAQNDPLLPGYSFNAHLVAGLTPIEANGYLDFFIDRPLGMKGYILNLTIRGQGVVKNQGREFVCRPGDILLFPPGEIHHYGRHPEAREWYHQWVYFRPRAYWHEWLNWPSIFANTGFFRPDEAHQPHFSDFFGQIINAGQGEGRYSELLAINLLEQLLLRRMLAINGSLHPPMDNRVREACQYISDHLADSNFDIASVAQHVCLSPSRLSHLFRQQLGISVLSWREDQRISQAKLLLSTTRMPIATVGRNVGFDDQLYFSRVFKKCTGASPSEFRAGLEEKVNDVAVKLS）、CinR的蛋白序列为：SEQ ID No.2（MIENTYSEKFESAFEQIKAAANVDAAIRILQAEYNLDFVTYHLAQTIASKIDSPFVRTTYPDAWVSRYLLNCYVKVDPIIKQGFERQLPFDWSEVEPTPEAYAMLVDAQKHGIDDNGYSIPVADKAQRRALLSLNAHIPADEWTELVRRCRNEWIEIAHLIHRKAVYELHGENDPVPALSPREIECLHWTALGKDYKDISVILGISEHTTRDYLKTARFRLGCTTISAAASRAVQLRIINPYRIRMTRRNW）、CymR的蛋白序列为：SEQ IDNo.3（MSPKRRTQAERAMETQGKLIAAALGVLREKGYAGFRIADVPGAAGVSRGAQSHHFPTKLELLLATFEWLYEQITERSRARLAKLKPEDDVIQQMLDDAAEFFLDDDFSIGLDLIVAADRDPALREGIQRTVERNRFVVEDMWLGVLVSRGLSRDDAEDILWLIFNSVRGLVVRSLWQKDKERFERVRNSTLEIARERYAKFKR）、NahR的蛋白序列为：SEQ ID No.4（MELRDLDLNLLVVFNQLLVDRRVSVTAENLGLTQPAVSNALKRLRTSLQDPLFVRTHQGMEPTPYAAHLAEHVTSAMHALRNALQHHESFDPLTSERTFTLAMTDIGEIYFMPRLMDALAHQAPNCVISTVRDSSMSLMQALQNGTVDLAVGLLPNLQTGFFQRRLLQNHYVCLCRKDHPVTREPLTLERFCSYGHVRVIAAGTGHGEVDTYMTRVGIRRDIRLEVPHFAAVGHILQRTDLLATVPICLADCCVEPFGLSALPHPVVLPEIAINMFWHAKYHKDLANIWLRQLMFDLFTD）、VanR的蛋白序列为：SEQ ID No.5（MDMPRIKPGQRVMMALRKMIASGEIKSGERIAEIPTAAALGVSRMPVRIALRSLEQEGLVVRLGARGYAARGVSSDQIRDAIEVRGVLEGFAARRLAERGMTAETHARFVVLIAEGEALFAAGRLNGEDLDRYAAYNQAFHDTLVSAAGNGAVESALARNGFEPFAAAGALALDLMDLSAEYEHLLAAHRQHQAVLDAVSCGDAEGAERIMRDHALAAIRNAKVFEAAASAGAPLGAAWSIRAD）、TetR的蛋白序列为：SEQID No.6（MSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGS）、LuxR的蛋白序列为：SEQ ID No.7（MKNINADDTYRIINKIKACRSNNDINQCLSDMTKMVHCEYYLLAIIYPHSMVKSDISILDNYPKKWRQYYDDANLIKYDPIVDYSNSNHSPINWNIFENNAVNKKSPNVIKEAKTSGLITGFSFPIHTANNGFGMLSFAHSEKDNYIDSLFLHACMNIPLIVPSLVDNYRKINIANNKSNNDLTKREKECLAWACEGKSSWDISKILGCSERTVTFHLTNAQMKLNTTNRCQSISKAILTGAIDCPYFKN）、TtgR的蛋白序列为：SEQ ID No.8（MVRRTKEEAQETRAQIIEAAERAFYKRGVARTTLADIAELAGVTRGAIYWHFNNKAELVQALLDSLHETHDHLARASESEDEVDPLGCMRKLLLQVFNELVLDARTRRINEILHHKCEFTDDMCEIRQQHQSAVLDCHKGITLTLANVVRRGQLPGELDAERAAVAMFAYVDGLIRRWLLLPDSVDLLGDVEKWVDTGLDMLRLSPALRK）、PhlF的蛋白序列为：SEQ IDNo.9（MARTPSRSSIGSLRSPHTHKAILTSTIEILKECGYSGLSIESVARRAGASKPTIYRWWTNKAALIAEVYENESEQVRKFPDLGSFKADLDFLLRNLWKVWRETICGEAFRCVIAEAQLDPATLTQLKDQFMERRREMPKKLVENAISNGELPKDTNRELLLDMIFGFCWYRLLTEQLTVEQDIEEFTFLLINGVCPGTQR）； sfGFP全称为“superfold green fluorescent protein”，蛋白序列为：SEQ ID No.10（MRKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK），是在细菌中适用的绿色荧光蛋白，其编码基因为sfgfp。
5．质粒的接合转化方法
（1）将制备的质粒转入大肠杆菌S17-1，得到重组大肠杆菌；
（2）将大肠杆菌和底盘微生物置于20LB固体培养基上共培养（37℃，8h），然后挑菌苔，涂布于含25 mg/L氯霉素的60LB固体培养基上，37℃培养48h；
（3）完成步骤（2）后，挑取单菌落，在含25 mg/L氯霉素的60LB固体培养基上划线，37℃培养过夜。
6．用流式细胞仪测量绿色荧光蛋白（sfGFP）荧光强度的方法
（1）向深孔板每孔加入1 ml含有25 mg/L氯霉素的LB培养基或60LB培养基，分别挑取少量携带质粒的H. bluephagenesis、P. entomophila或R. eutropha加入培养基中，37℃，1000 rpm，振荡12 h；
（2）向含有25 mg/L氯霉素的LB培养基或60LB培养基中加入所需用量的诱导剂，振荡混匀后取1 mL加入深孔板中，取2 μL培养12 h的菌液转接到该培养基中，37℃，1000rpm，振荡12 h；
（3）取2 μL菌液到250 μL PBS缓冲液中，用流式细胞仪（美国BD bioscience 公司，型号LSRFortessa4）测试荧光强度，流式细胞仪激发光设置为488 nm，荧光分析信号通过FITC、FSC（前向散射）和SSC（侧散射）通道捕获，流速为0.5 μL/s，每个样品至少记录50,000个细胞。
本发明涉及的调控蛋白和诱导型启动子如表1所示。
表1、诱导表达系统用到的调控蛋白和诱导型启动子的英文缩写和中文名
实施例一：开发微生物适用的多种诱导表达系统并用其对应的诱导剂控制基因表达
制备质粒PBAD-sfgfp-araC+araE(阿拉伯糖转运蛋白编码基因)、PCin-sfgfp-cinR、PCym-sfgfp-cymR、PSal-sfgfp-nahR、PVan-sfgfp-vanR、PTet-sfgfp-tetR、PLux-sfgfp-luxR、PTtg-sfgfp-ttgR和PPhlF-sfgfp-phlF，质粒为环形质粒，以pSEVA321为骨架。
PBAD是受AraC调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.11（AGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCAAACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACCCG）。
PCin是受CinR调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.12（CCCTTTGTGCGTCCAAACGGACGCACGGCGCTCTAAAGCGGGTCGCGATCTTTCAGATTCGCTCCTCGCGCTTTCAGTCTTTGTTTTGGCGCATGTCGTTATCGCAAAACCGCTGCACACTTTTGCGCGACATGCTCTGATCCCCCTCATCTGGGGGGGCCTATCTGAGGGAATTTCCGATCCGGCTCGCCTGAACCATTCTGCTTTCCACGAACTTGAAAACGCT）。
PCym是受CymR调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.13（AACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTATTATGGAAAATTTTTCTGTATAATAGATTCAACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTATTAT）。
PSal是受NahR调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.14（GGGGCCTCGCTTGGGTTATTGCTGGTGCCCGGCCGGGCGCAATATTCATGTTGATGATTTATTATATATCGAGTGGTGTATTTATTTATATTGTTTGCTCCGTTACCGTTATTAAC）。
PVan是受VanR调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.15（ATTGGATCCAATTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTACCATTGGATCCAAT）。
PTet是受TetR调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.16（TTTTCAGCAGGACGCACTGACCTCCCTATCAGTGATAGAGATTGACATCCCTATCAGTGATAGAGATACTGAGCAC）。
PLux是受LuxR调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.17（ACCTGTAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTTTGTTACTTTCGAATAAA）。
PTtg是受TtgR调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.18（CACCCAGCAGTATTTACAAACAACCATGAATGTAAGTATATTCCTTAGCAA）。
PPhlF是受PhlF调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.19（GATTCGTTACCAATTGACATGATACGAAACGTACCGTATCGTTAAGGTTACTAGAG）。
将制备的质粒分别导入盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01、盐单胞菌Halomonas campaniensis LS21、盐单胞菌Halomonas aydingkolgenesis M1、假单胞菌Pseudomonas entomophila LAC32和罗氏真氧杆菌Ralstonia eutropha H16，得到重组型H. bluephagenesis TD01、H. campaniensis LS21、H. aydingkolgenesis M1、P. entomophila LAC32和R. eutropha H16。
在上述重组型H. bluephagenesis TD01、H. campaniensis LS21、H. aydingkolgenesis M1、P. entomophila LAC32和R. eutropha H16中，分别用阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG诱导sfgfp基因的表达，用前述检测方法检测重组型H. bluephagenesis TD01、H. campaniensis LS21、H. aydingkolgenesis M1、P. entomophila LAC32和R. eutropha H16表达sfgfp的效果，结果显示，与不加入诱导剂相比，在诱导剂的作用下，基因的表达强度提高，以重组型H. bluephagenesis TD01为例，结果如表2所示。
表2、建立多种诱导表达系统及其在诱导作用下的基因表达强度
实施例二：构建重组型微生物，将调控蛋白编码基因插入微生物基因组
将阿拉伯糖转运蛋白编码基因araE、阿拉伯糖诱导表达系统的调控蛋白编码基因araC、OHC14诱导表达系统的调控蛋白编码基因cinR、枯茗酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因cymR、水杨酸钠诱导表达系统的调控蛋白编码基因nahR、香草酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因vanR、无水四环素诱导表达系统的调控蛋白编码基因tetR、OC6诱导表达系统的调控蛋白编码基因luxR、柚皮素诱导表达系统的调控蛋白编码基因ttgR和DAPG诱导表达系统的调控蛋白编码基因phlF分别插入H. bluephagenesis TD01、H. campaniensis LS21、H. aydingkolgenesis M1、P. entomophila LAC32和R. eutropha H16基因组，构建重组型微生物，将其命名为H. bluephagenesis TDR、H. campaniensis LSR、H. aydingkolgenesis MR、P. entomophila LACR和R. eutropha HR，琼脂糖凝胶电泳检测和DNA测序证明基因插入成功。
实施例三：在重组型微生物中用多种诱导表达系统及其对应的诱导剂控制基因表达
制备质粒PBAD-sfgfp、PCin-sfgfp、PCym-sfgfp、PSal-sfgfp、PVan-sfgfp、PTet-sfgfp、PLux-sfgfp、PTtg-sfgfp和PPhlF-sfgfp，质粒为环形质粒，以pSEVA321为骨架。
PBAD是受AraC调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.11。
PCin是受CinR调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.12。
PCym是受CymR调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.13。
PSal是受NahR调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.14。
PVan是受VanR调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.15。
PTet是受TetR调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.16。
PLux是受LuxR调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.17。
PTtg是受TtgR调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.18。
PPhlF是受PhlF调控的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.19。
将制备的质粒分别导入H. bluephagenesis TDR、H. campaniensis LSR、H. aydingkolgenesis MR、P. entomophila LACR和R. eutropha HR，得到重组型H. bluephagenesis TDR、H. campaniensis LSR、H. aydingkolgenesis MR、P. entomophila LACR和R. eutropha HR。
在上述重组型H. bluephagenesis TDR、H. campaniensis LSR、H. aydingkolgenesis MR、P. entomophila LACR和R. eutropha HR中，分别用阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG诱导sfgfp基因的表达，用前述检测方法检测重组型H. bluephagenesis TDR、H. campaniensis LSR、H. aydingkolgenesis MR、P. entomophila LACR和R. eutropha HR表达sfgfp的效果，结果显示，与不加入诱导剂相比，在诱导剂的作用下，基因的表达强度提高，以重组型H. bluephagenesis TDR为例，结果如表3所示。
表3、在将调控蛋白编码基因插入基因组后的多种诱导表达系统及其在诱导作用下的基因表达强度
制备质粒PBAD_NNNN-sfgfp、PCin_NNNN-sfgfp、PCym_NNNN-sfgfp、PSal_NNNN-sfgfp、PVan_NNNN-sfgfp、PTet_NNNN-sfgfp、PLux_NNNN-sfgfp、PTtg_NNNN-sfgfp和PPhlF_NNNN-sfgfp，质粒为环形质粒，以pSEVA321为骨架。
PBAD_NNNN是受AraC调控的启动子，包括PBAD和PBAD的基础上将-10区前的四个碱基替换成任意核苷酸的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.20（AGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCAAACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCANNNNTCTACTGTTTCTCCATACCCG）。
PCin_NNNN是受CinR调控的启动子，包括PCin和PCin的基础上将-10区前的四个碱基替换成任意核苷酸的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.21（CCCTTTGTGCGTCCAAACGGACGCACGGCGCTCTAAAGCGGGTCGCGATCTTTCAGATTCGCTCCTCGCGCTTTCAGTCTTTGTTTTGGCGCATGTCGTTATCGCAAAACCGCTGCACACTTTTGCGCGACATGCTCTGATCCCCCTCATCTGGGGGGGCCTATCTGAGGGAATTTCCGATCCGGCTCGCCTNNNNCATTCTGCTTTCCACGAACTTGAAAACGCT）。
PCym_NNNN是受CymR调控的启动子，包括PCym和PCym的基础上将-10区前的四个碱基替换成任意核苷酸的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.22（AACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTATTATGGAAAATTTTNNNNTATAATAGATTCAACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTATTAT）。
PSal_NNNN是受NahR调控的启动子，包括PSal和PSal的基础上将-10区前的四个碱基替换成任意核苷酸的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.23（GGGGCCTCGCTTGGGTTATTGCTGGTGCCCGGCCGGGCGCAATATTCATGTTGATGATTTATTATATATCGAGTGGTGTATTTATTTATATTGTTTGCTNNNNTACCGTTATTAAC）。
PVan_NNNN是受VanR调控的启动子，包括PVan和PVan的基础上将-10区前的四个碱基替换成任意核苷酸的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.24（ATTGGATCCAATTGACAGCTAGCTCAGTCCNNNNTACCATTGGATCCAAT）。
PTet_NNNN是受TetR调控的启动子，包括PTet和PTet的基础上将-10区前的四个碱基替换成任意核苷酸的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.25（TTTTCAGCAGGACGCACTGACCTCCCTATCAGTGATAGAGATTGACATCCCTATCAGTGANNNNGATACTGAGCAC）。
PLux_NNNN是受LuxR调控的启动子，包括PLux和PLux的基础上将-10区前的四个碱基替换成任意核苷酸的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.26（ACCTGTAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTNNNNTACTTTCGAATAAA）。
PTtg_NNNN是受TtgR调控的启动子，包括PTtg和PTtg的基础上将-10区前的四个碱基替换成任意核苷酸的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.27（CACCCAGCAGTATTTACAAACAACCATGAATGNNNNTATATTCCTTAGCAA）。
PPhlF_NNNN是受PhlF调控的启动子，包括PPhlF和PPhlF的基础上将-10区前的四个碱基替换成任意核苷酸的启动子，表达sfgfp基因，序列为SEQ ID No.28（GATTCGTTACCAATTGACATGATACGAAACGTNNNNTATCGTTAAGGTTACTAGAG）。
将制备的质粒分别导入H. bluephagenesisTDR、H. campaniensisLSR、H. aydingkolgenesisMR、P. entomophilaLACR和R. eutrophaHR，得到重组型H. bluephagenesisTDR、H. campaniensisLSR、H. aydingkolgenesisMR、P. entomophilaLACR和R. eutrophaHR。
在上述重组型H. bluephagenesis TDR、H. campaniensis LSR、H. aydingkolgenesis MR、P. entomophila LACR和R. eutropha HR中，分别用阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG诱导sfgfp基因的表达，用前述检测方法检测重组型H. bluephagenesis TDR、H. campaniensis LSR、H. aydingkolgenesis MR、P. entomophila LACR和R. eutropha HR表达sfgfp的效果，结果显示，与不加入诱导剂相比，在诱导剂的作用下，基因的表达强度提高，不同的启动子核心区间隔序列不同的启动子有不同的表达强度，以重组型H. bluephagenesis TDR为例，结果如表4所示。
表4、在将调控蛋白编码基因插入基因组后的启动子核心区间隔序列改变的多种诱导表达系统及其在诱导作用下的基因表达强度
实施例五：用多种诱导表达系统控制Halomonas bluephagenesis合成番茄红素
制备质粒pPVan-crtE-PLux_CTGT-crtI-PCin_GAAC-crtB-PBAD_ACAC-idi-PSal-dxs，该质粒为环形质粒，以pSEVA321为骨架。PVan（DNA序列为：SEQ ID No.15）表达crtE、PLux_CTGT（DNA序列为：SEQ ID No.29）表达crtI、PCin_GAAC（DNA序列为：SEQ ID No.30）表达crtB、PBAD_ACAC（DNA序列为：SEQ ID No.31）表达idi、PSal（DNA序列为：SEQ ID No.14）表达dxs，crtE、crtI、crtB、idi和dxs是与番茄红素合成相关的基因。
SEQ ID No.29
ACCTGTAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTCTGTTACTTTCGAATAAA
SEQ ID No.30
CCCTTTGTGCGTCCAAACGGACGCACGGCGCTCTAAAGCGGGTCGCGATCTTTCAGATTCGCTCCTCGCGCTTTCAGTCTTTGTTTTGGCGCATGTCGTTATCGCAAAACCGCTGCACACTTTTGCGCGACATGCTCTGATCCCCCTCATCTGGGGGGGCCTATCTGAGGGAATTTCCGATCCGGCTCGCCTGAACCATTCTGCTTTCCACGAACTTGAAAACGCT
SEQ ID No.31
AGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCAAACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACACTCTACTGTTTCTCCATACCCG
将制备的质粒导入盐单胞菌H. bluephagenesis TDR，得到重组型H. bluephagenesis TDR。将上述重组型H. bluephagenesis TDR接种至60LB培养基中，培养12h后转接到新鲜60LB培养基，接种量为1%，继续培养10 h后，将5 μL菌液接种至1 mL 60LB培养基中，进行深孔板培养实验，转速为1000 rpm，培养时间为24 h，在接种菌液的同时分别加入五种组合的不同浓度诱导剂，诱导crtE、crtI、crtB、idi和dxs基因的表达。
诱导剂组合一：10-4M 香草酸、10-9M OC6、10-8M OHC14、10-4M 阿拉伯糖和10-7M 水杨酸钠。
诱导剂组合二：10-7M 香草酸、10-6M OC6、10-6M OHC14、10-3M 阿拉伯糖和10-8M 水杨酸钠。
诱导剂组合三： 10-6M 香草酸、10-8M OC6、10-7M OHC14、10-2M 阿拉伯糖和10-9M水杨酸钠。
培养结束后，用丙酮萃取细胞中的番茄红素，并进行472 nm吸光值分析，根据标准曲线计算番茄红素的产量，结果显示，在五种不同类型、不同浓度诱导剂的诱导下，细胞合成番茄红素，并且在不同诱导剂组合中，番茄红素的产量不同，番茄红素的产量与诱导剂组合密切相关，如表5所示。
表5、三种诱导剂浓度组合诱导下番茄红素的产量
实施例六：用多种诱导表达系统控制Halomonas campaniensis合成PHB
制备质粒pPTet-phaA-PCym_GCTG-phaB-PPhlF-phaC，该质粒为环形质粒，以pSEVA321为骨架。PTet（DNA序列为：SEQ ID No.16）表达phaA、PCym_GCTG（DNA序列为：SEQ ID No.32）表达phaB、PPhlF（DNA序列为：SEQ ID No.19）表达phaC，phaA、phaB和phaC是与PHB合成相关的基因。
SEQ ID No.32
AACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTATTATGGAAAATTTTGCTGTATAATAGATTCAACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTATTAT
将制备的质粒导入盐单胞菌H. campaniensis LSR，得到重组型H. campaniensis LSR。将上述重组型H. campaniensis LSR接种至60LB培养基中，培养12 h后转接到新鲜60LB培养基，接种量为1%，继续培养10 h后，将2.5 μL菌液接种至50 mL 60MM培养基中，进行摇瓶培养实验，转速为200 rpm，培养时间为48 h，在接种菌液的同时分别加入三种组合的不同浓度诱导剂，诱导phaA、phaB和phaC基因的表达。
诱导剂组合一：5×10-9M 无水四环素、5×10-6M 枯茗酸和10-6M DAPG。
诱导剂组合二：10-8M 无水四环素、10-4M 枯茗酸和10-4M DAPG。
诱导剂组合三：5×10-8M 无水四环素、10-5M 枯茗酸和10-5M DAPG。
培养结束后，对细菌进行离心、冷冻干燥、称重、酯化反应和气相色谱分析，结果显示，在三种同类型、不同浓度诱导剂的诱导下，细胞合成PHB，并且在不同诱导剂组合中，细胞干重和PHB含量不同，细胞干重和PHB含量与诱导剂组合密切相关，如表6所示。
表6、三种诱导剂浓度组合诱导下的细胞干重及PHB含量
实施例七：用多种诱导表达系统控制Halomonas aydingkolgenesis合成四氢嘧啶
制备质粒pPTtg-ectA-PBAD_TTGC-ectB-PCin-ectC，该质粒为环形质粒，以pSEVA321为骨架。PTet（DNA序列为：SEQ ID No.16）表达ectA、PBAD_TTGC（DNA序列为：SEQ ID No.33）表达ectB、PPhlF（DNA序列为：SEQ ID No.19）表达ectC，ectA、ectB和ectC是与四氢嘧啶合成相关的基因。
SEQ ID No.33
AGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCAAACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCATTGCTCTACTGTTTCTCCATACCCG
将制备的质粒导入盐单胞菌H. aydingkolgenesis MR，得到重组型H. aydingkolgenesis MR。将上述重组型H. aydingkolgenesis MR接种至60LB培养基中，培养12 h后转接到新鲜60LB培养基，接种量为1%，继续培养10 h后，将2.5 μL菌液接种至50 mL60MM培养基中，进行摇瓶培养实验，转速为200 rpm，培养时间为48 h，在接种菌液的同时分别加入三种组合的不同浓度诱导剂，诱导ectA、ectB和ectC基因的表达。
诱导剂组合一：10-9M 柚皮素、10-9M 阿拉伯糖和10-9M OHC14。
诱导剂组合二：10-3M 柚皮素、10-4M 阿拉伯糖和10-6M OHC14。
诱导剂组合三：10-5M 柚皮素、10-3M 阿拉伯糖和10-5M OHC14。
培养结束后，对细菌进行破壁和离心，取离心后的上清液进行液相色谱分析，并根据标准曲线计算四氢嘧啶的产量，结果显示，在三种同类型、不同浓度诱导剂的诱导下，细胞合成四氢嘧啶，并且在不同诱导剂组合中，四氢嘧啶产量不同，四氢嘧啶产量与诱导剂组合密切相关，如表7所示。
表7、三种诱导剂浓度组合诱导下的四氢嘧啶产量
实施例八：用多种诱导表达系统控制Ralstonia eutropha合成精氨酸
PBAD_GGCG-gdh-PCin_GCCC-argJ-PCym_AGGA-argB-PSal-argC-PVan-argD-PTet-argF-PLux_GGTG-argG-PTtg-argH-PPhlF-pgl，该质粒为环形质粒，以pSEVA321为骨架。PBAD_GGCG（DNA序列为：SEQ ID No.34）表达gdh、PCin_GCCC（DNA序列为：SEQ ID No.35）表达argJ、PCym_AGGA（DNA序列为：SEQ ID No.36）表达argB、PSal表达argC（DNA序列为：SEQ ID No.14）、PVan表达argD（DNA序列为：SEQ ID No.15）、PTet表达argF（DNA序列为：SEQ ID No.16）、PLux_GGTG表达argG（DNA序列为：SEQ ID No.37）、PTtg表达argH（DNA序列为：SEQ ID No.18）、PPhlF表达pgl（DNA序列为：SEQ ID No.19），gdh、argJ、argB、argC、argD、argF、argG、argH和pgl是与精氨酸合成相关的基因。
SEQ ID No.34
AGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCAAACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAGGCGTCTACTGTTTCTCCATACCCG
SEQ ID No.35
CCCTTTGTGCGTCCAAACGGACGCACGGCGCTCTAAAGCGGGTCGCGATCTTTCAGATTCGCTCCTCGCGCTTTCAGTCTTTGTTTTGGCGCATGTCGTTATCGCAAAACCGCTGCACACTTTTGCGCGACATGCTCTGATCCCCCTCATCTGGGGGGGCCTATCTGAGGGAATTTCCGATCCGGCTCGCCTGCCCCATTCTGCTTTCCACGAACTTGAAAACGCT
SEQ ID No.36
AACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTATTATGGAAAATTTTAGGATATAATAGATTCAACAAACAGACAATCTGGTCTGTTTGTATTAT
SEQ ID No.37
ACCTGTAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTGGTGTACTTTCGAATAAA
将制备的质粒导入罗氏真氧杆菌R. eutropha HR，得到重组型R. eutropha HR。将上述重组型R. eutropha HR接种至LB培养基中，培养12 h后转接到新鲜LB培养基，接种量为1%，继续培养10 h后，将2.5 μL菌液接种至50 mL LB培养基中，进行摇瓶培养实验，转速为200 rpm，培养时间为48 h，在接种菌液的同时分别加入九种组合的不同浓度诱导剂，诱导gdh、argJ、argB、argC、argD、argF、argG、argH和pgl基因的表达。
诱导剂组合一：10-6M阿拉伯糖、10-9M OHC14、10-3M枯茗酸、5×10-4M水杨酸钠、10- 4M香草酸、5×10-6M无水四环素、10-9M OC6、10-3M柚皮素、10-3M DAPG。
诱导剂组合二：10-4M阿拉伯糖、10-8M OHC14、10-5M枯茗酸、10-6M水杨酸钠、10-7M香草酸、10-6M无水四环素、10-8M OC6、10-4M柚皮素、10-5M DAPG。
诱导剂组合三：10-3M阿拉伯糖、10-6M OHC14、10-4M枯茗酸、10-5M水杨酸钠、10-5M香草酸、10-7M无水四环素、10-6M OC6、10-5M柚皮素、10-5M DAPG。
培养结束后，对细菌进行离心，取离心后的上清液进行液相色谱分析，并根据标准曲线计算精氨酸的产量，结果显示，在九种不同类型、不同浓度诱导剂的诱导下，细胞合成精氨酸，并且在不同诱导剂组合中，精氨酸的产量不同，精氨酸的产量与诱导剂组合密切相关，如表8所示。
表8、三种诱导剂浓度组合诱导下的精氨酸产量
实施例九：用多种诱导表达系统控制Pseudomonas entomophila合成PHB
制备质粒pPSal-phaA-PCin-phaB-PBAD-phaB，该质粒为环形质粒，以pSEVA321为骨架。PSal（DNA序列为：SEQ ID No.14）表达phaA、PCin（DNA序列为：SEQ ID No.12）表达phaB、PBAD（DNA序列为：SEQ ID No.11）表达phaC，phaA、phaB和phaC是与PHB合成相关的基因。
将制备的质粒导入假单胞菌P. entomophila LACR，得到重组型P. entomophila LACR。将上述重组型P. entomophila LACR接种至LB培养基中，培养12 h后转接到新鲜LB培养基，接种量为1%，继续培养10 h后，将2.5 μL菌液接种至50 mL MM培养基中，进行摇瓶培养实验，转速为200 rpm，培养时间为48 h，在接种菌液的同时分别加入三种组合的不同浓度诱导剂，诱导phaA、phaB和phaC基因的表达。
诱导剂组合一：5×10-4M 水杨酸钠、10-7M OHC14和10-8M 阿拉伯糖。
诱导剂组合二：10-7M 水杨酸钠、10-5M OHC14和10-6M 阿拉伯糖。
诱导剂组合三：10-6M 水杨酸钠、10-6M OHC14和10-5M 阿拉伯糖。
培养结束后，对细菌进行离心、冷冻干燥、称重、酯化反应和气相色谱分析，结果显示，在三种同类型、不同浓度诱导剂的诱导下，细胞合成PHB，并且在不同诱导剂组合中，细胞干重和PHB含量不同，细胞干重和PHB含量与诱导剂组合密切相关，如表9所示。
表9、三种诱导剂浓度组合诱导下的细胞干重及PHB含量
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (57)
1.一种调控多基因表达的微生物，其特征在于，所述的微生物包括将编码调控蛋白的核苷酸序列插入微生物基因组中，所述的微生物包括表达载体，所述的表达载体包含与对应的调控蛋白作用的启动子以及产物合成基因，所述的与对应的调控蛋白作用的启动子为诱导型启动子，所述的诱导型启动子包含调控蛋白的结合位点，所述的调控蛋白选自AraC、CinR、CymR、NahR、VanR、TetR、LuxR、TtgR或PhlF中的一种或两种以上，所述的微生物选自罗氏真养杆菌（Ralstonia eutropha）、假单胞菌属（Pseudomonas）或嗜盐单胞菌属（Halomonas），所述的假单胞菌属（Pseudomonas）为Pseudomonas entomophila，所述的诱导型启动子选自带有调控蛋白AraC结合位点的启动子PBAD_NNNN、带有调控蛋白CinR结合位点的启动子PCin_NNNN、带有调控蛋白CymR结合位点的启动子PCym_NNNN、带有调控蛋白NahR结合位点的启动子PSal_NNNN、带有调控蛋白VanR结合位点的启动子PVan_NNNN、带有调控蛋白TetR结合位点的启动子PTet_NNNN、带有调控蛋白LuxR结合位点的启动子PLux_NNNN、带有调控蛋白TtgR结合位点的启动子PTtg_NNNN、带有调控蛋白PhlF结合位点的启动子PPhlF_NNNN中的一种或两种以上，所述的启动子PBAD_NNNN的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示，其中，NNNN为ACAC、TTGC、GGCG或ACTC；或，所述的启动子PCin_NNNN的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，其中，NNNN为GAAC或GCCC；或，所述的启动子PCym_NNNN的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，其中，NNNN为GCTG、AGGA或TCTG；或，所述的启动子PSal_NNNN的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；或，所述的启动子PVan_NNNN的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；或，所述的启动子PTet_NNNN的核苷酸序列如SEQID No.16所示；或，所述的启动子PLux_NNNN的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示，其中，NNNN为CTGT、GGTG或TTGT；或，所述的启动子PTtg_NNNN的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；或，所述的启动子PPhlF_NNNN的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，
所述的诱导型启动子包括以下启动子中的至少一种：PBAD_NNNN，NNNN为ACAC、TTGC或GGCG；PCin_NNNN，NNNN为GCCC；PCym_NNNN，NNNN为GCTG或AGGA；PLux_NNNN，NNNN为CTGT或GGTG；
所述的调控蛋白AraC的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述的调控蛋白CinR的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述的调控蛋白CymR的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述的调控蛋白NahR的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；所述的调控蛋白VanR的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；所述的调控蛋白TetR的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述的调控蛋白LuxR的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；所述的调控蛋白TtgR的氨基酸序列如SEQ IDNo.8所示；所述的调控蛋白PhlF的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述的嗜盐单胞菌属（Halomonas）包括Halomonas bluephagenesis、Halomonas campaniensis和Halomonas aydingkolgenesis中的任一种。
3.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述的产物包含胞内产物、分泌到胞外的酶、与细胞形态相关的蛋白或与细胞内基因调控相关的蛋白或RNA。
4.根据权利要求3所述的微生物，其特征在于，所述的产物包含PHA、四氢嘧啶、氨基酸、肌醇、1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、1，5-戊二胺、5-氨基乙酰丙酸、脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶、核酸酶、微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB、细胞分裂调控因子MinCD、乳糖操纵子遏制蛋白LacI、四环素操纵子阻遏蛋白TetR或番茄红素中的一种或两种以上。
5.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述的产物合成基因包含dxs，crtE、crtI、crtB、idi、dxs、phaA、phaB、phaC、ectA、ectB、ectC、gdh、argJ、argB、argC、argD、argF、argG、argH和pgl中的一种或两种以上。
6.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述的微生物在培养过程中加入诱导剂，所述的诱导剂包括阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG中的一种或两种以上。
7.根据权利要求1-6任一所述的微生物，其特征在于，所述调控多基因表达使用多种诱导表达系统，所述的诱导表达系统包括诱导剂、调控蛋白和与调控蛋白作用的启动子。
8.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，阿拉伯糖诱导表达系统包括诱导剂阿拉伯糖、调控蛋白AraC和与调控蛋白作用的启动子PBAD_NNNN。
9.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，OHC14诱导表达系统表达系统包括诱导剂OHC14、调控蛋白CinR和与调控蛋白作用的启动子PCin_NNNN。
10.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，枯茗酸诱导表达系统表达系统包括诱导剂枯茗酸、调控蛋白CymR和与调控蛋白作用的启动子PCym_NNNN。
11.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，水杨酸钠诱导表达系统表达系统包括诱导剂水杨酸钠、调控蛋白NahR和与调控蛋白作用的启动子PSal_NNNN。
12.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，香草酸诱导表达系统表达系统包括诱导剂香草酸、调控蛋白VanR和与调控蛋白作用的启动子PVan_NNNN。
13.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，无水四环素诱导表达系统表达系统包括诱导剂无水四环素、调控蛋白TetR和与调控蛋白作用的启动子PTet_NNNN。
14.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，OC6诱导表达系统表达系统包括诱导剂OC6、调控蛋白LuxR和与调控蛋白作用的启动子PLux_NNNN。
15.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，柚皮素诱导表达系统表达系统包括诱导剂柚皮素、调控蛋白TtgR和与调控蛋白作用的启动子PTtg_NNNN。
16.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，DAPG诱导表达系统表达系统包括诱导剂DAPG、调控蛋白PhlF和与调控蛋白作用的启动子PPhlF_NNNN。
17.根据权利要求8-16任一所述的微生物，其特征在于，所述的诱导表达系统包括以下组合：
1）香草酸、OC6、OHC14、阿拉伯糖和水杨酸钠诱导表达系统；
2）无水四环素、枯茗酸和DAPG诱导表达系统；
3）柚皮素、阿拉伯糖和OHC14诱导表达系统；
4）阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG诱导表达系统；或，
5）水杨酸钠、OHC14和阿拉伯糖诱导表达系统。
18.一种在微生物中调控多基因表达的方法，其特征在于，所述的方法包括培养权利要求1-17任一所述的微生物。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括加入诱导剂，所述的诱导剂包括阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG中的一种或两种以上。
20.根据权利要求18-19任一所述的方法，其特征在于，所述调控多基因表达使用多种诱导表达系统，所述的诱导表达系统包括诱导剂、调控蛋白和与调控蛋白作用的启动子。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，阿拉伯糖诱导表达系统包括诱导剂阿拉伯糖、调控蛋白AraC和与调控蛋白作用的启动子PBAD_NNNN。
22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，OHC14诱导表达系统表达系统包括诱导剂OHC14、调控蛋白CinR和与调控蛋白作用的启动子PCin_NNNN。
23.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，枯茗酸诱导表达系统表达系统包括诱导剂枯茗酸、调控蛋白CymR和与调控蛋白作用的启动子PCym_NNNN。
24.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，水杨酸钠诱导表达系统表达系统包括诱导剂水杨酸钠、调控蛋白NahR和与调控蛋白作用的启动子PSal_NNNN。
25.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，香草酸诱导表达系统表达系统包括诱导剂香草酸、调控蛋白VanR和与调控蛋白作用的启动子PVan_NNNN。
26.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，无水四环素诱导表达系统表达系统包括诱导剂无水四环素、调控蛋白TetR和与调控蛋白作用的启动子PTet_NNNN。
27.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，OC6诱导表达系统表达系统包括诱导剂OC6、调控蛋白LuxR和与调控蛋白作用的启动子PLux_NNNN。
28.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，柚皮素诱导表达系统表达系统包括诱导剂柚皮素、调控蛋白TtgR和与调控蛋白作用的启动子PTtg_NNNN。
29.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，DAPG诱导表达系统表达系统包括诱导剂DAPG、调控蛋白PhlF和与调控蛋白作用的启动子PPhlF_NNNN。
30.根据权利要求21-29任一所述的方法，其特征在于，所述的诱导表达系统包括以下组合：
1）香草酸、OC6、OHC14、阿拉伯糖和水杨酸钠诱导表达系统；
2）无水四环素、枯茗酸和DAPG诱导表达系统；
3）柚皮素、阿拉伯糖和OHC14诱导表达系统；
4）阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG诱导表达系统；或，
5）水杨酸钠、OHC14和阿拉伯糖诱导表达系统。
31.一种生产产物的方法，其特征在于，所述的方法包括培养权利要求1-16任一所述的微生物。
32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括加入诱导剂，所述的诱导剂包括阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG中的一种或两种以上。
33.根据权利要求31-32任一所述的方法，其特征在于，所述调控多基因表达使用多种诱导表达系统，所述的诱导表达系统包括诱导剂、调控蛋白和与调控蛋白作用的启动子。
34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，阿拉伯糖诱导表达系统包括诱导剂阿拉伯糖、调控蛋白AraC和与调控蛋白作用的启动子PBAD_NNNN。
35.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，OHC14诱导表达系统表达系统包括诱导剂OHC14、调控蛋白CinR和与调控蛋白作用的启动子PCin_NNNN。
36.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，枯茗酸诱导表达系统表达系统包括诱导剂枯茗酸、调控蛋白CymR和与调控蛋白作用的启动子PCym_NNNN。
37.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，水杨酸钠诱导表达系统表达系统包括诱导剂水杨酸钠、调控蛋白NahR和与调控蛋白作用的启动子PSal_NNNN。
38.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，香草酸诱导表达系统表达系统包括诱导剂香草酸、调控蛋白VanR和与调控蛋白作用的启动子PVan_NNNN。
39.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，无水四环素诱导表达系统表达系统包括诱导剂无水四环素、调控蛋白TetR和与调控蛋白作用的启动子PTet_NNNN。
40.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，OC6诱导表达系统表达系统包括诱导剂OC6、调控蛋白LuxR和与调控蛋白作用的启动子PLux_NNNN。
41.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，柚皮素诱导表达系统表达系统包括诱导剂柚皮素、调控蛋白TtgR和与调控蛋白作用的启动子PTtg_NNNN。
42.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，DAPG诱导表达系统表达系统包括诱导剂DAPG、调控蛋白PhlF和与调控蛋白作用的启动子PPhlF_NNNN。
43.根据权利要求34-42任一所述的方法，其特征在于，所述的诱导表达系统包括以下组合：
1）香草酸、OC6、OHC14、阿拉伯糖和水杨酸钠诱导表达系统；
2）无水四环素、枯茗酸和DAPG诱导表达系统；
3）柚皮素、阿拉伯糖和OHC14诱导表达系统；
4）阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素和DAPG诱导表达系统；或，
5）水杨酸钠、OHC14和阿拉伯糖诱导表达系统。
44.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述的产物包含胞内产物、分泌到胞外的酶、与细胞形态相关的蛋白或与细胞内基因调控相关的蛋白或RNA。
45.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，所述的产物包含PHA、四氢嘧啶、氨基酸、肌醇、1,3-丙二醇、3-羟基丙酸、1，5-戊二胺、5-氨基乙酰丙酸、脂肪酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶、葡聚糖酶、果胶酶、磷酯酶、明胶酶、核酸酶、微管蛋白FtsZ、细胞骨架蛋白MreB、细胞分裂调控因子MinCD、乳糖操纵子遏制蛋白LacI、四环素操纵子阻遏蛋白TetR或番茄红素中的一种或两种以上。
46.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述的产物为PHA，所述的微生物为向将阿拉伯糖转运蛋白编码基因araE、阿拉伯糖诱导表达系统的调控蛋白编码基因araC、OHC14诱导表达系统的调控蛋白编码基因cinR、枯茗酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因cymR、水杨酸钠诱导表达系统的调控蛋白编码基因nahR、香草酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因vanR、无水四环素诱导表达系统的调控蛋白编码基因tetR、OC6诱导表达系统的调控蛋白编码基因luxR、柚皮素诱导表达系统的调控蛋白编码基因ttgR和DAPG诱导表达系统的调控蛋白编码基因phlF插入H. campaniensis LS21或P. entomophila LAC32基因组后获得的菌株中导入包含phaA、phaB和phaC基因的所述表达载体。
47.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，所述的方法包括使用水杨酸钠、OHC14和阿拉伯糖诱导表达系统，或者，无水四环素、枯茗酸和DAPG诱导表达系统。
48.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述的产物为番茄红素，所述的微生物为向将阿拉伯糖转运蛋白编码基因araE、阿拉伯糖诱导表达系统的调控蛋白编码基因araC、OHC14诱导表达系统的调控蛋白编码基因cinR、枯茗酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因cymR、水杨酸钠诱导表达系统的调控蛋白编码基因nahR、香草酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因vanR、无水四环素诱导表达系统的调控蛋白编码基因tetR、OC6诱导表达系统的调控蛋白编码基因luxR、柚皮素诱导表达系统的调控蛋白编码基因ttgR和DAPG诱导表达系统的调控蛋白编码基因phlF插入H. bluephagenesis TD01基因组后获得的菌株中导入包含crtE、crtI、crtB、idi和dxs基因的所述表达载体。
49.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，所述的方法包括使用香草酸、OC6、OHC14、阿拉伯糖和水杨酸钠诱导表达系统。
50.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述的产物为四氢嘧啶，所述的微生物为向将阿拉伯糖转运蛋白编码基因araE、阿拉伯糖诱导表达系统的调控蛋白编码基因araC、OHC14诱导表达系统的调控蛋白编码基因cinR、枯茗酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因cymR、水杨酸钠诱导表达系统的调控蛋白编码基因nahR、香草酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因vanR、无水四环素诱导表达系统的调控蛋白编码基因tetR、OC6诱导表达系统的调控蛋白编码基因luxR、柚皮素诱导表达系统的调控蛋白编码基因ttgR和DAPG诱导表达系统的调控蛋白编码基因phlF插入H. aydingkolgenesis M1基因组后获得的菌株中导入包含ectA、ectB和ectC基因的所述表达载体。
51.根据权利要求50所述的方法，其特征在于，所述的方法包括使用柚皮素、阿拉伯糖和OHC14诱导表达系统。
52.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述的产物为精氨酸，所述的微生物为向将阿拉伯糖转运蛋白编码基因araE、阿拉伯糖诱导表达系统的调控蛋白编码基因araC、OHC14诱导表达系统的调控蛋白编码基因cinR、枯茗酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因cymR、水杨酸钠诱导表达系统的调控蛋白编码基因nahR、香草酸诱导表达系统的调控蛋白编码基因vanR、无水四环素诱导表达系统的调控蛋白编码基因tetR、OC6诱导表达系统的调控蛋白编码基因luxR、柚皮素诱导表达系统的调控蛋白编码基因ttgR和DAPG诱导表达系统的调控蛋白编码基因phlF插入R. eutropha H16基因组后获得的菌株中导入包含gdh、argJ、argB、argC、argD、argF、argG、argH和pgl基因的上述表达载体。
53.根据权利要求52所述的方法，其特征在于，所述的方法包括使用阿拉伯糖、OHC14、枯茗酸、水杨酸钠、香草酸、无水四环素、OC6、柚皮素、DAPG诱导表达系统。
54.一种启动子，其特征在于，所述的启动子与对应的调控蛋白作用，所述的启动子为诱导型启动子，所述的启动子包含对应的调控蛋白的结合位点，所述的调控蛋白选自AraC、CinR、CymR或LuxR中的一种或两种以上，所述的诱导型启动子选自带有调控蛋白AraC结合位点的启动子PBAD_NNNN、带有调控蛋白CinR结合位点的启动子PCin_NNNN、带有调控蛋白CymR结合位点的启动子PCym_NNNN、带有调控蛋白LuxR结合位点的启动子PLux_NNNN中的一种或两种以上，所述的启动子PBAD_NNNN的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示，其中，NNNN为ACAC、TTGC、GGCG、AGAG或GCTT；所述的启动子PCin_NNNN的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，其中，NNNN为GCCC、GGGG、TGGG、TCAT或TTAA；所述的启动子PCym_NNNN的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，其中，NNNN为GCTG、AGGA、GAGA、CCGG或CCAC；所述的启动子PLux_NNNN的核苷酸序列如SEQ IDNo.26所示，其中，NNNN为CTGT、GGTG、GTGG、ATGT或CATG。
55.根据权利要求54所述的启动子，其特征在于，所述的启动子包括SEQ ID No.29、31-37任一所示核苷酸序列。
56.一种表达载体或细胞，其特征在于，所述的表达载体或细胞包含权利要求53-54任一所述的启动子。
57.权利要求1-17任一所述的的微生物、权利要求18-53任一所述的方法、权利要求54-55任一所述的启动子和/或权利要求56所述的表达载体或细胞在基因编辑或产物合成中的应用。
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