CN110283789A - 重组菌株及其应用 - Google Patents

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元英进
丁明珠
王恩旭
刘宇
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Abstract

本发明涉及生物工程领域，特别涉及重组菌株及其应用。本发明利用混菌进行一步发酵优点如下：发酵周期(36h)较工业生产短，培养过程不易染菌比较稳定，同时对于工业生产而言，可以利用原有的发酵罐进行发酵，容易实现工业化。本发明将改造后的Go菌与大小菌的混菌配合，混菌发酵培养，实现由D‑山梨醇到2‑KGA的一步转化。这样通过简化生产工艺以实现对生产成本的降低，同时通过优化发酵条件以保证较高的转化效率及较短的发酵时间。

Description

重组菌株及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别涉及重组菌株及其应用。
背景技术
维生素C(Vitamin C,VC)，又名L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)，是人 体必需的营养物质。作为一种抗氧化剂，在人体的氧化还原代谢反应中起到 重要的调节作用。目前有多种人工合成维生素C的方法，如：串联发酵法、 利用欧文氏菌一步发酵法、Reichstein发明的莱氏化学合成法，以及尹光琳发 明的二步发酵法。
20世纪70年代，中科院北京微生物所的尹光琳等人利用一种混合微生物 发酵体系，将原有莱氏法中的三步化学反应缩短为一步生物反应，以生物氧 化代替化学氧化，既避免了大量易燃、易爆或有毒化学原料的使用，同时也 大大缩短了工艺流程、降低了生产成本，成为现阶段工业生产维生素C最主要 的工艺。此法首先用一步菌氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans,Go) 将D-山梨醇转化为L-山梨糖；然后用二步混菌将L-山梨糖高效地转化为维生 素C的前体2-酮基-L-古龙酸(2-Keto-L-Gulonic acid，2-KGA)；最后再用与 Reichstein法类似的化学法转化为维生素C。其中，第二步所用的混菌体系由两 种菌组成，一种是产酸菌—酮古龙酸杆菌(Ketogulonigenium vulgare,Kv)， 行业内俗称小菌；另一种是伴生菌，行业内俗称大菌，伴生菌的种类较多， 如：蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus,Bc)、巨大芽孢杆菌(Bacil1us megaterium, Bm)、苏芸金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)等。
然而随着维生素C市场竞争日趋激烈，如何降低生产成本，提高维生素C 的收率，是企业能否在激烈的竞争中抢占有利制高点的关键。
现阶段研究对提高VC产量，降低VC生产成本主要有三种方式：一种是对 小菌进行优化改造，使其能够更好是生长产酸；另一种是将小菌产酸的基因 (山梨糖脱氢酶/山梨酮脱氢酶，sdh/sndh)转入一步菌中，使得一步菌能够实 现从D-山梨醇出发的一步发酵；第三种是利用其他微生物进行维生素C的生 产。但是上述三种方式都存在着各自的问题：
第一种对小菌的改造：由于K.vulgare单独培养生长缓慢且容易染菌，不容 易实现工业化生产。同时作为非模式微生物，其遗传背景信息和基因操作手 段均有所局限，对其进行工程化改造的工作大部分还处于初步阶段。
第二种对一步菌的改造：由于副产物途径及PH耐受问题，仍然无法代替 现有二步发酵。同时现阶段的研究结果表明其发酵周期较长，亦严重影响了 工业化的实现。
第三种利用其他微生物生产：合成步骤多，产物收率低是最主要的问题。
综上所述，虽然现有维生素C的生产体系已经很成熟，但是因其两步发酵 而必然导致能耗大，总发酵周期较长，即生产成本较高。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种重组菌株及其应用。本发明将改造后的Go 菌与大菌、小菌配合，混菌发酵培养，实现由D-山梨醇到2-KGA的一步转化。 这样通过简化生产工艺以实现对生产成本的降低，同时通过优化发酵条件以 保证较高的转化效率及较短的发酵时间。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了群体效应引发Go菌自裂解死亡在一步混菌发酵中的应用。
细菌QS系统细菌根据特定信号分子的浓度可以监测周围环境中自身或 其它细菌的数量变化，当信号达到一定的浓度阈值时，能启动菌体中相关基 因的表达来适应环境中的变化，这一调控系统被称为细菌的群体感应调节系 统(QS系统)。
本发明中改造的菌株为Go H24。当体系中同时存在山梨醇和山梨糖时， 一步菌Go优先利用山梨醇作为碳源，当山梨醇被耗尽后，Go则开始消耗山 梨糖。本发明的目的是将Go与原有大小菌配合一步混菌发酵，故Go对山梨 糖的代谢必然会竞争性的与Kv争夺底物，从而降低转化效率。因此本发明决 定对Go菌基因工程改造，利用群体效应(QuorumSensing)以实现Go菌在 高密度条件下自裂解死亡，从而减少与产酸菌的竞争作用以更好的配合大小 菌混菌发酵。
在本发明的一些具体实施方案中，所述Go菌整合有裂解基因。
在本发明的一些具体实施方案中，所述裂解基因选自费氏弧菌(Vibriofischeri)。
本发明还提供了一种重组菌株，包括Go菌中内源启动子tufB、外源基因 luxI、外源基因luxR、启动子luxpR和外源基因ccdB。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株由Go菌中内源启动子 tufB、外源基因luxI、Go菌中内源启动子tufB、外源基因luxR、启动子luxpR 和外源基因ccdB依次连接后整合至载体，转入Go原始菌中，获得所述重组 菌株。优选的，所述载体为pBBR1MCS-5。
本发明还提供了所述重组菌株在发酵生产维生素C前体物质2-KGA中的 应用
本发明还提供了所述重组菌株在发酵生产维生素C中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵为一步混菌发酵。
在本发明的一些具体实施方案中，所述混菌为所述重组菌株与大菌、小 菌的混合菌株；
所述大菌为蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏芸金芽孢杆菌；
所述小菌为Kv菌。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株与大小菌混菌的接种比 例为5:1。其中，MCS活菌数约为2.53*10^10；IRC活菌数约为1.41*10^10； Kv活菌数约为1.5*10^10；MCS的接种量为250ml(OD600＝8.865)；IRC的 接种量为250ml(OD600＝7.395)，大小菌混菌的接种量50ml(OD600＝3.0)。
本发明还提供了一种发酵生产维生素C或其前体物质2-KGA的混合菌 株，包括所述重组菌株和大小菌的混菌。在本发明的一些具体实施方案中， 大小菌的混菌与重组菌株的接种比例为1:5。其中，MCS活菌数约为 2.53*10^10；IRC活菌数约为1.41*10^10；Kv活菌数约为1.5*10^10；MCS 的接种量为250ml(OD600＝8.865)；IRC的接种量为250ml(OD600＝7.395)， 大小菌混菌的接种量50ml。
本发明还提供了一种发酵生产维生素C或其前体物质2-KGA的方法，经 所述重组菌株和大小菌混菌一步混合发酵制得。在本发明的一些具体实施方 案中，重组菌株和大小菌混菌的接种比例为5:1。其中，重组菌株为IRC；MCS 活菌数约为2.53*10^10；IRC活菌数约为1.41*10^10；Kv活菌数约为 1.5*10^10；MCS的接种量为250ml(OD600＝8.865)；IRC的接种量为250ml (OD600＝7.395)，大小菌混菌的接种量50ml。
本发明利用混菌进行一步发酵优点如下：发酵周期(36h)较工业生产短， 培养过程不易染菌比较稳定，同时对于工业生产而言，可以利用原有的发酵 罐进行发酵，容易实现工业化。本发明将改造后的Go菌与大小菌配合，混菌 发酵培养，实现由D-山梨醇到2-KGA的一步转化。这样通过简化生产工艺以 实现对生产成本的降低，同时通过优化发酵条件以保证较高的转化效率及较 短的发酵时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示改造菌株构建示意图；
图2示单菌发酵罐培养活菌数比较图；
图3示单菌发酵罐培养生长状态比较图；
图4示单菌发酵罐培养糖耗比较图；
图5示混菌发酵产酸比较图。
具体实施方式
本发明公开了一种重组菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内 容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对 本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的 方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发 明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。
本发明中改造的菌株为Go H24。当体系中同时存在山梨醇和山梨糖时，一 步菌Go优先利用山梨醇作为碳源，当山梨醇被耗尽后，Go则开始消耗山梨糖。 本发明的目的是将Go与原有大小菌配合一步混菌发酵，故Go对山梨糖的代谢 必然会竞争性的与Kv争夺底物，从而降低转化效率。因此本发明决定对Go菌 基因工程改造，利用群体效应(QuorumSensing)以实现Go菌在高密度条件 下自裂解死亡，从而减少与产酸菌的竞争作用以更好的配合大小菌混菌发酵。
1.改造Go(命名IRC)菌株构建
构建过程：
在麻省理工学院生物砖注册中心获得外源基因luxI(C0061),luxR (C0062)和ccdB(K176003)的基因序列，按照Go菌进行密码子优化，序列 如SEQ ID No.1所示。
IRC全序列：
GGATCCtatcaggtgcctgtcgaagtgcgcgctgagcgccgtcaggccctggcgatccggtggctgatcgatgcctcccgcaagcg cggtgagaacacgatgcaggagcgcctgtccaacgaactgatggacgcggtcaacaatcgtggcgctgctgttaagaagcgcgaagaca cccaccgtatggctgaagctaacaaggcattcagtcactatcgctggtaatcagaacccgctaaagggctttcggcagcatccgggaatctg gatgctggctggaatgaactttcagtcttacccctgtctcgtgggaggcagggttttggagatagacgATGACGATCATGATC AAGAAGTCCGACTTCCTGGCCATCCCGTCCGAAGAATACAAGGGCATCCTGTCCCTG CGCTACCAGGTCTTCAAGCAGCGCCTGGAATGGGACCTGGTCGTCGAAAACAACCT GGAATCCGACGAATACGACAACTCCAACGCCGAATACATCTACGCCTGCGACGACACGGAAAACGTCTCCGGCTGCTGGCGCCTGCTGCCGACGACGGGCGACTACATGCTG AAGTCCGTCTTCCCGGAATAAtactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcg ttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtatcaggtgcctgtcgaagtgcgcgctgagcgccgtcaggccctggcgatccggt ggctgatcgatgcctcccgcaagcgcggtgagaacacgatgcaggagcgcctgtccaacgaactgatggacgcggtcaacaatcgtggc gctgctgttaagaagcgcgaagacacccaccgtatggctgaagctaacaaggcattcagtcactatcgctggtaatcagaacccgctaaag ggctttcggcagcatccgggaatctggatgctggctggaatgaactttcagtcttacccctgtctcgtgggaggcagggttttggagatagac gATGGGCATGAAGGACATCAACGCCGACGACACGTACCGCATCATCAACAAGATCA AGGCCTGCCGCTCCAACAACGACATCAACCAGTGCCTGTCCGACATGACGAAGATG GTCCACTGCGAATACTACCTGCTGGCCATCATCTACCCGCACTCCATGGTCAAGTCC GACATCTCCATCCTGGACAACTACCCGAAGAAGTGGCGCCAGTACTACGACGACGC CAACCTGATCAAGTACGACCCGATCGTCGACTACTCCAACTCCAACCACTCCCCGAT CAACTGGAACATCTTCGAAAACAACGCCGTCAACAAGAAGTCCCCGAACGTCATCA AGGAAGCCAAGACGTCCGGCCTGATCACGGGCTTCTCCTTCCCGATCCACACGGCCA ACAACGGCTTCGGCATGCTGTCCTTCGCCCACTCCGAAAAGGACAACTACATCGACT CCCTGTTCCTGCACGCCTGCATGAACATCCCGCTGATCGTCCCGTCCCTGGTCGACA ACTACCGCAAGATCAACATCGCCAACAACAAGTCCAACAACGACCTGACGAAGCGC GAAAAGGAATGCCTGGCCTGGGCCTGCGAAGGCAAGTCCTCCTGGGACATCTCCAA GATCCTGGGCTGCTCCGAAGTCACGTTCTAAtactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcga aagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagAcctgtaggatcgtacaggtttacgcaagaaaatggtttgt tatagtcgaataaaAcctgtaggatcgtacaggtttacgcaagaaaatggtttgttatagtcgaataaaAcctgtaggatcgtacaggtttac gcaagaaaatggtttgttatagtcgaataaatactagagAaagaggagaaatactagagATGACGATGATCACGGACTC CCTGGCCGTCGTCCTGCAGCGCCGCGACTGGGAAAACCCGGGCGTCACGCAGCTGA ACCGCCTGGCCGCCCACCCGCCGTTCGCCTCCTGGCGCAACTCCGAAGAAGCCCGCACGGACCGCCCGTCCCAGCAGCTGCGCTCCCTGTACGTCCGCCAGTTCAAGGTCTACA CGTACAAGCGCGAATCCCGCTACCGCCTGTTCGTCGACGTCCAGTCCGACATCATCG ACACGCCGGGCCGCCGCATGGTCATCCCGCTGGCCTCCGCCCGCCTGCTGTCCGACA AGGTCTCCCGCGAACTGTACCCGGTCGTCCACATCGGCGACGAATCCTGGCGCATGA TGACGACGGACATGGCCTCCGTCCCGGTCTCCGTCATCGGCGAAGAAGTCGCCGAC CTGTCCCACCGCGAAAACGACATCAAGAACGCCATCAACCTGATGTTCTGGGGCAT CTAATAAtactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaac gctctcTCTAGA
然后将Go菌中内源启动子tufB和从麻省理工学院生物砖注册中心获得的 启动子luxpR按照如图所示的方案连接起来。将完整序列整合到广宿主载体 pBBR1MCS-5上，交由公司合成。最后利用电转化的方法将质粒转入Go菌中， 筛选得到正确的转化子。
2.摇瓶发酵验证
2.1培养基的配置
2.1.1Go菌培养基
D-山梨醇2.0％，玉米浆0.3％，牛肉膏0.3％，酵母浸粉0.3％，尿素0.1％， 蛋白胨1.0％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，CaCO3 0.1％，调节pH6.8-7.0， 121℃灭菌20min。
2.1.2大小菌培养基
L-山梨糖2.0％，玉米浆0.3％，牛肉膏0.3％，酵母浸粉0.3％，尿素0.1％， 蛋白胨1.0％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，CaCO3 0.1％，调节pH6.8-7.0， 121℃灭菌(L-山梨糖单独灭菌，接菌前添加至种子培养基中)20min。
2.2发酵
2.2.1种子培养
一级种子培养，取300μl甘油菌加入50ml种子培养基中，30℃，250rpm摇 床震荡培养24h。
二级种子培养，按10％接种比例，取一级种子5ml接种至50ml种子培养基 中，30℃，250rpm摇床震荡培养24h。
2.2.2摇瓶发酵
按10％接种比例，取二级种子5ml接种至50mlGo培养基中，30℃，250rpm 摇床震荡培养。
3.发酵罐培养比较
3.1发酵培养基
D-山梨醇8.0％，玉米浆1.0％，尿素1.2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，CaCO3 0.1％，调节pH6.8-7.0，121℃灭菌20min。
3.2单菌发酵：
按10％的接种量，将300ml二级种子液接入到5L的发酵罐中(装料系数60％ 装料)。培养温度30℃、搅拌速度500rpm、通气量1.5vvm，pH控制在7.0的条 件下进行发酵。发酵比较改造前后Go菌，比较活菌数(图2)以及生长状态(图 3)随时间变化的趋势。
3.3混菌发酵
按10％的接种量、菌体比例Go：大小菌＝5：1的条件，将共300ml二级种 子液接入到5L的发酵罐中(装料系数60％装料)。初始投入料为4.0％D-山 梨醇，4h后开始流加剩余4％，在培养温度30℃、搅拌速度500rpm、通气量 1.5vvm，pH控制在7.0的条件下进行发酵。分别利用改造前后Go菌与原始大 小菌配合，比较2-KGA随时间变化的趋势(图5)。发酵36h后，原始的混菌 体系转化效率为66.5％，改造的混菌体系转化效率为80.7％，提高了21.4％。
本发明在一步菌Go中构建QS系统，将其应用于VC前体2-KGA的一步混菌 发酵过程。利用改造的Go菌与现有的大小菌配合一步混菌发酵。其中所述氧 化葡萄糖酸杆菌与所述大小菌混菌的接种比例为5:1。其中，大小菌分别为巨 大芽孢杆菌和Kv小菌；MCS活菌数约为2.53*10^10；IRC活菌数约为1.41*10^10；Kv活菌数约为1.5*10^10；MCS的接种量为250ml(OD600＝8.865)； IRC的接种量为250ml(OD600＝7.395)，大小菌混菌的接种量50ml。
本发明中利用混菌进行一步发酵优点如下：发酵周期(36h)较工业生产 短，培养过程不易染菌比较稳定，同时对于工业生产而言，可以利用原有的 发酵罐进行发酵，容易实现工业化。本发明将改造后的Go菌与大小菌配合， 混菌发酵培养，实现由D-山梨醇到2-KGA的一步转化。这样通过简化生产工 艺以实现对生产成本的降低，同时通过优化发酵条件以保证较高的转化效率 及较短的发酵时间。
本发明提供的重组菌株及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
其中，MCS由本实验室提供；大小菌分别为巨大芽孢杆菌和Kv小菌， 均由山东鲁维制药有限公司提供。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1改造Go(命名IRC)菌株构建
在麻省理工学院生物砖注册中心获得外源基因luxI(C0061)，luxR (C0062)和ccdB(K176003)的基因序列，按照Go菌进行密码子优化。然后 将Go菌中内源启动子tufB和从麻省理工学院生物砖注册中心获得的启动子 luxpR按照如图所示的方案连接起来。将完整序列整合到广宿主载体 pBBR1MCS-5上，交由公司合成。最后利用电转化的方法将质粒转入Go菌中， 筛选得到正确的转化子。
实施例2摇瓶发酵验证
Go菌培养基：
D-山梨醇2.0％，玉米浆0.3％，牛肉膏0.3％，酵母浸粉0.3％，尿素0.1％， 蛋白胨1.0％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，CaCO3 0.1％，调节pH6.8-7.0， 121℃灭菌20min。
大小菌培养基：
L-山梨糖2.0％，玉米浆0.3％，牛肉膏0.3％，酵母浸粉0.3％，尿素0.1％， 蛋白胨1.0％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，CaCO3 0.1％，调节pH6.8-7.0， 121℃灭菌(L-山梨糖单独灭菌，接菌前添加至种子培养基中)20min。
发酵：
种子培养：
一级种子培养，取300μl甘油菌加入50ml种子培养基中，30℃，250rpm摇 床震荡培养24h。
二级种子培养，按10％接种比例，取一级种子5ml接种至50ml种子培养基 中，30℃，250rpm摇床震荡培养24h。
摇瓶发酵：
按10％接种比例，取二级种子5ml接种至50ml Go培养基中，30℃，250rpm 摇床震荡培养。
实施例3发酵罐培养比较
发酵培养基
D-山梨醇8.0％，玉米浆1.0％，尿素1.2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，CaCO3 0.1％，调节pH 6.8-7.0，121℃灭菌20min。
单菌发酵：
按10％的接种量，将300ml二级种子液接入到5L的发酵罐中(装料系数60％ 装料)。培养温度30℃、搅拌速度500rpm、通气量1.5vvm，pH控制在7.0的条 件下进行发酵。发酵比较改造前后Go菌，比较活菌数(图2、表1)、生长状 态(图3、表2)和糖耗(图4、表3)。
表1
CFU/mL*10^10 MCS IRC STD MCS IRC
0 0.23 0.19 0 0.014142 0.023094
4 0.53 0.28 4 0.014142 0.02498
8 1.12 1.41 8 0.056569 0.090185
12 1.69 2.13 12 0.098995 0.220303
14 2.04 2.09 14 0.226274 0.210079
16 2.13 2.05 16 0.240416 0.261024
20 2.53 1.89 20 0.014142 0.080829
24 2.53 1.37 24 0.291433 0.150111
28 3.51 0.75 28 0.386954 0.046188
32 3.88 0.25 32 0.2498 0.030551
36 4.77 0.17 36 0.22745 0.041633
表2
表3
Sorbose(ave) MCS IRC STD MCS IRC
0 1.35804 1.353472 0 0.126478 0.186442
4 16.8612 19.05155 4 0.130664 2.11792
8 49.71925 55.81663 8 1.639395 1.672061
12 63.89493 72.24244 12 4.118642 2.800174
14 69.44661 73.78825 14 5.285745 4.344528
16 73.01678 74.39875 16 3.31555 4.192982
20 63.46803 73.94444 20 1.324473 4.267777
24 55.66434 71.82717 24 2.525366 1.835097
28 44.03539 66.59293 28 1.558158 1.409605
32 40.52001 63.86841 32 2.224869 1.442463
36 28.96752 59.96636 36 1.566365 3.321137
混菌发酵：
按10％的接种量、菌体比例Go：大小菌＝5:1(大菌为巨大芽孢杆菌，小菌为 Kv，大小菌以混菌形式一起培养的，其比例保持在1:5～1:40之间)条件，将 共300ml二级种子液接入到5L的发酵罐中(装料系数60％装料)。初始投 入料为4.0％D-山梨醇，4h后开始流加剩余4％，在培养温度30℃、搅拌速度 500rpm、通气量1.5vvm，pH控制在7.0的条件下进行发酵。分别利用改造前 后Go菌与原始大小菌配合，比较2-KGA随时间变化的趋势(图5、表4)。发酵36h后，原始的混菌体系转化效率为66.5％，改造的混菌体系转化效率为 80.7％，提高了21.4％，具有显著差异(P＜0.05)。
表4
ave MCS IRC std MCS IRC
0h 0.142651 0 0h 0.20174 0
4h 0.135851 0.082746 4h 0.192123 0.143321
8h 0.326228 1.378192 8h 0.353987 0.394601
12h 4.957581 3.904122 12h 0.15503 1.491189
22h 23.06371 26.37573 22h 1.584539 1.060473
24h 26.52705 32.26085 24h 1.833305 2.196739
28h 37.14921 48.36203 28h 2.458427 1.857072
32h 49.06072 61.41569 32h 1.626916 2.121326
36h 57.43733 68.8007 36h 1.593662 4.179527
40 57.41165 68.86483 40 1.994993 3.25445
实施例4二步发酵过程与一步发酵过程的比较
表5
注：*示与对照组相比具有显著差异(P＜0.05)；#示与对照组相比具有 极显著差异(P＜0.01)。
由表5结果可知，本发明提供一步发酵方法相比于两步发酵法显著提高 (P＜0.05)了摩尔转化率，显著(P＜0.05)缩短了生产周期。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津大学
<120> 重组菌株及其应用
<130> MP1616354
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2535
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatcctatc aggtgcctgt cgaagtgcgc gctgagcgcc gtcaggccct ggcgatccgg 60
tggctgatcg atgcctcccg caagcgcggt gagaacacga tgcaggagcg cctgtccaac 120
gaactgatgg acgcggtcaa caatcgtggc gctgctgtta agaagcgcga agacacccac 180
cgtatggctg aagctaacaa ggcattcagt cactatcgct ggtaatcaga acccgctaaa 240
gggctttcgg cagcatccgg gaatctggat gctggctgga atgaactttc agtcttaccc 300
ctgtctcgtg ggaggcaggg ttttggagat agacgatgac gatcatgatc aagaagtccg 360
acttcctggc catcccgtcc gaagaataca agggcatcct gtccctgcgc taccaggtct 420
tcaagcagcg cctggaatgg gacctggtcg tcgaaaacaa cctggaatcc gacgaatacg 480
acaactccaa cgccgaatac atctacgcct gcgacgacac ggaaaacgtc tccggctgct 540
ggcgcctgct gccgacgacg ggcgactaca tgctgaagtc cgtcttcccg gaataatact 600
agagccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc 660
tgttgtttgt cggtgaacgc tctctactag agtatcaggt gcctgtcgaa gtgcgcgctg 720
agcgccgtca ggccctggcg atccggtggc tgatcgatgc ctcccgcaag cgcggtgaga 780
acacgatgca ggagcgcctg tccaacgaac tgatggacgc ggtcaacaat cgtggcgctg 840
ctgttaagaa gcgcgaagac acccaccgta tggctgaagc taacaaggca ttcagtcact 900
atcgctggta atcagaaccc gctaaagggc tttcggcagc atccgggaat ctggatgctg 960
gctggaatga actttcagtc ttacccctgt ctcgtgggag gcagggtttt ggagatagac 1020
gatgggcatg aaggacatca acgccgacga cacgtaccgc atcatcaaca agatcaaggc 1080
ctgccgctcc aacaacgaca tcaaccagtg cctgtccgac atgacgaaga tggtccactg 1140
cgaatactac ctgctggcca tcatctaccc gcactccatg gtcaagtccg acatctccat 1200
cctggacaac tacccgaaga agtggcgcca gtactacgac gacgccaacc tgatcaagta 1260
cgacccgatc gtcgactact ccaactccaa ccactccccg atcaactgga acatcttcga 1320
aaacaacgcc gtcaacaaga agtccccgaa cgtcatcaag gaagccaaga cgtccggcct 1380
gatcacgggc ttctccttcc cgatccacac ggccaacaac ggcttcggca tgctgtcctt 1440
cgcccactcc gaaaaggaca actacatcga ctccctgttc ctgcacgcct gcatgaacat 1500
cccgctgatc gtcccgtccc tggtcgacaa ctaccgcaag atcaacatcg ccaacaacaa 1560
gtccaacaac gacctgacga agcgcgaaaa ggaatgcctg gcctgggcct gcgaaggcaa 1620
gtcctcctgg gacatctcca agatcctggg ctgctccgaa gtcacgttct aatactagag 1680
ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 1740
gtttgtcggt gaacgctctc tactagagac ctgtaggatc gtacaggttt acgcaagaaa 1800
atggtttgtt atagtcgaat aaaacctgta ggatcgtaca ggtttacgca agaaaatggt 1860
ttgttatagt cgaataaaac ctgtaggatc gtacaggttt acgcaagaaa atggtttgtt 1920
atagtcgaat aaatactaga gaaagaggag aaatactaga gatgacgatg atcacggact 1980
ccctggccgt cgtcctgcag cgccgcgact gggaaaaccc gggcgtcacg cagctgaacc 2040
gcctggccgc ccacccgccg ttcgcctcct ggcgcaactc cgaagaagcc cgcacggacc 2100
gcccgtccca gcagctgcgc tccctgtacg tccgccagtt caaggtctac acgtacaagc 2160
gcgaatcccg ctaccgcctg ttcgtcgacg tccagtccga catcatcgac acgccgggcc 2220
gccgcatggt catcccgctg gcctccgccc gcctgctgtc cgacaaggtc tcccgcgaac 2280
tgtacccggt cgtccacatc ggcgacgaat cctggcgcat gatgacgacg gacatggcct 2340
ccgtcccggt ctccgtcatc ggcgaagaag tcgccgacct gtcccaccgc gaaaacgaca 2400
tcaagaacgc catcaacctg atgttctggg gcatctaata atactagagc caggcatcaa 2460
ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg 2520
aacgctctct ctaga 2535

Claims (12)

1.群体效应引发Go菌自裂解死亡在一步混菌发酵中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Go菌整合有裂解基因。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述裂解基因选自费氏弧菌(Vibriofischeri)。
4.一种重组菌株，其特征在于，其包括Go菌中内源启动子tufB、外源基因luxI、外源基因luxR、启动子luxpR和外源基因ccdB。
5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，其由Go菌中内源启动子tufB、外源基因luxI、Go菌中内源启动子tufB、外源基因luxR、启动子luxpR和外源基因ccdB依次连接后整合至载体，转入Go原始菌中，获得所述重组菌株。
6.根据权利要求4或5所述的重组菌株在发酵生产维生素C前体物质2-KGA中的应用。
7.根据权利要求4或5所述的重组菌株在发酵生产维生素C中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述发酵为一步混菌发酵。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述混菌为所述重组菌株与大菌、小菌的混合菌株；
所述大菌为蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏芸金芽孢杆菌；
所述小菌为Kv菌。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述大菌与小菌的混菌和所述重组菌株的接种比例为1:5。
11.一种发酵生产维生素C或其前体物质2-KGA的混合菌株，其特征在于，包括大菌、小菌的混菌和如权利要求4或5所述的重组菌株。
12.一种发酵生产维生素C或其前体物质2-KGA的方法，其特征在于，经大菌、小菌的混菌和如权利要求4或5所述的重组菌株一步混合发酵制得。
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