CN105112488A - 2-酮-l-古龙酸的发酵生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及发酵生产领域，特别涉及2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法。本发明利用混合菌株发酵，在一个反应器内实现了从D-山梨醇到2-酮-L-古龙酸的一步转化，能够缩短时间，减少耗能，解放设备和人力资源。相比于二步生产法，是一种新的2-酮-L-古龙酸发酵生产方法。建立了三混合发酵体系，并能有效的获得最终产物；三菌一步发酵获得维生素C前体2-酮-L-古龙酸的新工艺流程。减少了生产步骤，相对缩短了时间。减少了由于灭菌和发酵过程的能耗，提过了设备和人力资源利用率，有效的减少了整体成本。

Description

2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法

技术领域

本发明涉及发酵生产领域，特别涉及2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法。

背景技术

维生素C是维持机体生长和代谢所必须的一种水溶性维生素，目前广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品领域，市场稳定。目前维生素C的主流生产法是二步发酵法，主要指从D-山梨醇开始，经过两步发酵转化为维生素C前体--2-酮-L-古龙酸的过程。第一步，利用氧化葡萄糖酸杆菌将D-山梨醇转化为L-山梨糖，第二步利用生酮古龙酸杆菌及其伴生菌(主要为芽孢杆菌)的混菌体系将L-山梨糖转化为2-酮-L-古龙酸。

二步发酵法生产2-酮-L-古龙酸，需要进行两步发酵过程，即需要两次生产准备，两次配培养基，两次灭菌，两次接菌，两次发酵。时间相对较长，耗能大，占据较多的设备和人力。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法。本发明利用混合菌株发酵，在一个反应器内实现了从D-山梨醇到2-酮-L-古龙酸的一步转化，能够缩短时间，减少耗能，解放设备和人力资源。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法，以山梨醇为原料，将氧化葡萄糖酸杆菌、生酮古龙酸杆菌及其伴生菌混合发酵培养，制得2-酮-L-古龙酸。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的一种2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法中，所述伴生菌为芽孢杆菌。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的一种2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法中，所述伴生菌为巨大芽孢杆菌。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的一种2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法中，包括种子培养和发酵培养。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的一种2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法中，所述种子培养的培养基包括第一种子培养基和第二种子培养基；

所述第一种子培养基包括：玉米浆3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨醇20g/L，pH调至6.7-7.2，121℃，灭菌20min，制成第一种子培养基；固体培养基另加20g/L的琼脂粉；

所述第二种子培养基包括：玉米浆3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨糖20g/L，pH调至6.7-7.2，121℃，灭菌20min，制成第二种子培养基；固体培养基另加20g/L的琼脂粉。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的一种2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法中，所述种子培养包括如下步骤：

步骤1：将活化好的氧化葡萄糖酸杆菌接种于所述第一种子培养基中，经第一培养后，转接所述第一种子培养基，扩大培养，制成第一种子液；

步骤2：将活化好的生酮古龙酸杆菌及其伴生菌接种于所述第一种子培养基中，经第二培养后，转接所述第二种子培养基，扩大培养，制成第二种子液。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的一种2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法中，步骤1中所述第一培养为于30℃，200r/min培养24小时；

步骤1中所述扩大培养为于30℃，200r/min培养24小时；

步骤2中所述第二培养为于30℃，200r/min培养20小时；

步骤2中所述扩大培养为于30℃，200r/min培养12小时。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的一种2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法中，所述发酵培养为将所述第一种子液和第二种子液接种到发酵培养基中，发酵培养，制得2-酮-L-古龙酸。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的一种2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法中，所述发酵培养基包括玉米浆10g/L，尿素12g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨醇80g/L，加消泡剂1ml，pH调至6.7-7.0，121℃，灭菌20min，制成发酵培养基。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的一种2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法中，所述第一种子液中活菌数为3.60×10¹⁰～3.6×10¹¹；以所述发酵培养基的质量为基准，所述第一种子液的接种量为10％；

所述第二种子液中活菌数为6.20×10¹⁰～6.2×10¹¹；以所述发酵培养基的质量为基准，所述第二种子液的接种量为5％；

所述发酵培养为于30℃，500r/min，pH控制7.0，用2.5mol硫酸和5mol氢氧化钠调节pH，通气1.5vvm。

具体的，本发明利用氧化葡萄糖酸杆菌将D-山梨醇转化为L-山梨糖，生酮古龙酸杆菌及其伴生菌(主要为芽孢杆菌)的混菌体系将L-山梨糖转化为2-酮-L-古龙酸的能力。创造性的将三种菌混合培养发酵实现D-山梨醇到2-酮-L-古龙酸的一步转化过程。并通过基因改造菌株获得较高的产量。

(1)种子培养：

玉米浆3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨醇20g/L，pH调至6.7-7.2，121℃，灭菌20min，制成种子培养基1。固体培养基另加20g/L的琼脂粉。

玉米浆3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨糖20g/L，pH调至6.7-7.2，121℃，灭菌20min，制成种子培养基2。固体培养基另加20g/L的琼脂粉。

将在固体平板上活化好的氧化葡萄糖酸杆菌接种于培养基1中，30℃，200r/min培养24小时，转接扩大培养，培养基1，30℃，200r/min培养24小时，制成种子液1。

将固体平板上活化好的生酮古龙酸杆菌及其伴生菌--巨大芽孢杆菌接种于培养基1中，30℃，200r/min培养20小时，转接扩大培养，培养基2，30℃，200r/min培养12小时，制成种子液2。

(2)发酵：

玉米浆10g/L，尿素12g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨醇40-80g/L，加消泡剂1ml，pH调至6.7-7.0，121℃，灭菌20min，制成发酵培养基。

种子液1接种10％，种子液2接种1-5％。发酵参数控制：30℃，500r/min，pH控制7.0，用2.5mol硫酸和5mol氢氧化钠调节pH，通气1.0-1.5vvm。

(3)产物检测：

菌浓度测定：

使用75-6型紫外分光光度计测定培养过程中三菌总的生长曲线，波长采用600nm，即OD600。

底物及产物测定：

高效液相色谱检测，AminexHPX-87H色谱柱，示差检测器。0.5mM硫酸作流动相，柱温65℃，检测器温度50℃。

本发明利用混合菌株发酵，在一个反应器内实现了从D-山梨醇到2-酮-L-古龙酸的一步转化，能够缩短时间，减少耗能，解放设备和人力资源。相比于二步生产法，是一种新的2-酮-L-古龙酸发酵生产方法。

(1)建立了三混合发酵体系，并能有效的获得最终产物

(2)三菌一步发酵获得维生素C前体2-酮-L-古龙酸的新工艺流程。

减少了生产步骤，相对缩短了时间。减少了由于灭菌和发酵过程的能耗，提过了设备和人力资源利用率，有效的减少了整体成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1中标准品的测定结果；

图2示实施例1中最终产物的测定结果；

图3示实施例1中最终产物的测定结果；其中，图3(A)示菌体浓度；图3(B)示三种菌发酵底物的变化；

图4示实施例2中标准品的测定结果；

图5示实施例2中最终产物的测定结果；

图6示实施例2中最终产物的测定结果；其中，图6(A)示菌体浓度；图6(B)示三种菌发酵底物的变化；

图7示实施例3中标准品的测定结果；

图8示实施例3中最终产物的测定结果；

图9示实施例3中最终产物的测定结果；其中，图9(A)示菌体浓度；图9(B)示三种菌发酵底物的变化。

具体实施方式

本发明公开了一种2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法中所用菌株、原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

(1)种子培养：

玉米浆3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨醇20g/L，pH调至6.7-7.2，121℃，灭菌20min，制成种子培养基1。固体培养基另加20g/L的琼脂粉。

玉米浆3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨糖20g/L，pH调至6.7-7.2，121℃，灭菌20min，制成种子培养基2。固体培养基另加20g/L的琼脂粉。

将在固体平板上活化好的氧化葡萄糖酸杆菌接种于培养基1中，30℃，200r/min培养24小时，转接扩大培养，培养基1，30℃，200r/min培养24小时，制成种子液1。种子液1中活菌数为3.60×10¹⁰～3.6×10¹¹。

将固体平板上活化好的生酮古龙酸杆菌及其伴生菌--巨大芽孢杆菌接种于培养基1中，30℃，200r/min培养20小时，转接扩大培养，培养基2，30℃，200r/min培养12小时，制成种子液2。种子液2中活菌数为6.20×10¹⁰～6.2×10¹¹。(2)发酵：

玉米浆10g/L，尿素12g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨醇80g/L，加消泡剂1ml，pH调至6.7-7.0，121℃，灭菌20min，制成发酵培养基。

种子液1接种10％，种子液2接种5％。发酵参数控制：30℃，500r/min，pH控制7.0，用2.5mol硫酸和5mol氢氧化钠调节pH，通气1.5vvm。

(3)产物检测：

菌体浓度测定：

使用75-6型紫外分光光度计测定培养过程中三菌总的生长曲线，波长采用600nm，即OD600。

底物及产物测定：

高效液相色谱检测，AminexHPX-87H色谱柱，示差检测器。0.5mM硫酸作流动相，柱温65℃，检测器温度50℃。

标准品测定如图1所示：

保留时间7.80min山梨醇。

保留时间9.47min山梨糖

保留时间10.56min古龙酸。

最终产物测定见图2：稀释10倍

(4)产量衡算

$A=\frac{B\×V}{C}\×100\%$

A-质量产率。

B-发酵液古龙酸最终浓度，g/L。

V-发酵液最终体积，L。

C-山梨醇投料质量g，本专利实施例中为240g。

(5)实验结果如图3所示：

由图3表明，三菌在发酵罐内能有效混合生长。

三菌都能有效发挥自己的作用：氧化葡萄糖酸杆菌将D-山梨醇转化为L-山梨糖，酮古龙酸杆菌在伴生菌的辅助下快速生长并有效产酸，28h发酵结束，发酵液中古龙酸终浓度为64.54g/L，发酵终体积2.93L。

古龙酸产量较高，按总物料折算，D-山梨醇到2-酮-L-古龙酸质量转化率78.79％。

实施例2

(1)种子培养：

玉米浆3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨醇20g/L，pH调至6.7-7.2，121℃，灭菌20min，制成种子培养基1。固体培养基另加20g/L的琼脂粉。

玉米浆3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨糖20g/L，pH调至6.7-7.2，121℃，灭菌20min，制成种子培养基2。固体培养基另加20g/L的琼脂粉。

将在固体平板上活化好的氧化葡萄糖酸杆菌接种于培养基1中，30℃，200r/min培养24小时，转接扩大培养，培养基1，30℃，200r/min培养24小时，制成种子液1。种子液1中活菌数为3.60×10¹⁰～3.6×10¹¹。

将固体平板上活化好的生酮古龙酸杆菌及其伴生菌--巨大芽孢杆菌接种于培养基1中，30℃，200r/min培养20小时，转接扩大培养，培养基2，30℃，200r/min培养12小时，制成种子液2。种子液2中活菌数为6.20×10¹⁰～6.2×10¹¹。(2)发酵：

玉米浆10g/L，尿素12g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨醇80g/L，加消泡剂1ml，pH调至6.7-7.0，121℃，灭菌20min，制成发酵培养基。

种子液1接种10％，种子液2接种5％。发酵参数控制：30℃，500r/min，pH控制7.0，用2.5mol硫酸和5mol氢氧化钠调节pH，通气1.5vvm。

(3)产物检测：

菌体浓度测定：

使用75-6型紫外分光光度计测定培养过程中三菌总的生长曲线，波长采用600nm，即OD600。

底物及产物测定：

高效液相色谱检测，AminexHPX-87H色谱柱，示差检测器。0.5mM硫酸作流动相，柱温65℃，检测器温度50℃。

标准品测定见图4：

保留时间7.80min山梨醇。

保留时间9.47min山梨糖

保留时间10.56min古龙酸

最终产物测定见图5：稀释10倍。

(4)产量衡算

$A=\frac{B\×V}{C}\×100\%$

A-质量产率。

B-发酵液古龙酸最终浓度，g/L。

V-发酵液最终体积，L。

C-山梨醇投料质量g，本专利实施例中为240g。

(5)实验结果如图6所示：

由图6表明，三菌都能有效发挥自己的作用：氧化葡萄糖酸杆菌将D-山梨醇转化为L-山梨糖，酮古龙酸杆菌在伴生菌的辅助下快速生长并有效产酸，28h发酵结束，发酵液中古龙酸终浓度为75.96g/L，发酵终体积2.88L。

古龙酸产量较高，按总物料折算，D-山梨醇到2-酮-L-古龙酸质量转化率88.97％。

实施例3

(1)种子培养：

玉米浆3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨醇20g/L，pH调至6.7-7.2，121℃，灭菌20min，制成种子培养基1。固体培养基另加20g/L的琼脂粉。

玉米浆3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨糖20g/L，pH调至6.7-7.2，121℃，灭菌20min，制成种子培养基2。固体培养基另加20g/L的琼脂粉。

将在固体平板上活化好的氧化葡萄糖酸杆菌接种于培养基1中，30℃，200r/min培养24小时，转接扩大培养，培养基1，30℃，200r/min培养24小时，制成种子液1。种子液1中活菌数为3.60×10¹⁰～3.6×10¹¹。

将固体平板上活化好的生酮古龙酸杆菌及其伴生菌--巨大芽孢杆菌接种于培养基1中，30℃，200r/min培养20小时，转接扩大培养，培养基2，30℃，200r/min培养12小时，制成种子液2。种子液2中活菌数为6.20×10¹⁰～6.2×10¹¹。(2)发酵：

玉米浆10g/L，尿素12g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨醇40g/L，加消泡剂1ml，pH调至6.7-7.0，121℃，灭菌20min，制成发酵培养基。

发酵第3-6h补40g/L的山梨醇。

种子液1接种8.33％，种子液2接种1.67％。发酵参数控制：30℃，500r/min，pH控制7.0，用2.5mol硫酸和5mol氢氧化钠调节pH，通气1.5vvm。

(3)产物检测：

菌体浓度测定：

使用75-6型紫外分光光度计测定培养过程中三菌总的生长曲线，波长采用600nm，即OD600。

底物及产物测定：

高效液相色谱检测，AminexHPX-87H色谱柱，示差检测器。0.5mM硫酸作流动相，柱温65℃，检测器温度50℃。

标准品测定见图7：

保留时间7.80min山梨醇。

保留时间9.47min山梨糖

保留时间10.56min古龙酸

最终产物测定见图8：稀释5倍

(4)产量衡算

$A=\frac{B\×V}{C}\×100\%$

A-质量产率。

B-发酵液古龙酸最终浓度，g/L。

V-发酵液最终体积，L。

C-山梨醇投料质量g，本专利实施例中为240g。

(5)实验结果如图9所示：

由图9表明，三菌在发酵罐内能有效混合生长。

三菌都能有效发挥自己的作用：氧化葡萄糖酸杆菌将D-山梨醇转化为L-山梨糖，酮古龙酸杆菌在伴生菌的辅助下快速生长并有效产酸，28h发酵结束，发酵液中古龙酸终浓度为62.34g/L，发酵终体积2.77L。

古龙酸产量较高，按总物料折算，D-山梨醇到2-酮-L-古龙酸质量转化率72.79％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种2-酮-L-古龙酸的发酵生产方法，其特征在于，以山梨醇为原料，将氧化葡萄糖酸杆菌、生酮古龙酸杆菌及其伴生菌混合发酵培养，制得2-酮-L-古龙酸。

2.根据权利要求1所述的发酵生产方法，其特征在于，所述伴生菌为芽孢杆菌。

3.根据权利要求1或2所述的发酵生产方法，其特征在于，所述伴生菌为巨大芽孢杆菌。

4.根据权利要求1至3任一项所述的发酵生产方法，其特征在于，包括种子培养和发酵培养。

5.根据权利要求4所述的发酵生产方法，其特征在于，所述种子培养的培养基包括第一种子培养基和第二种子培养基；

所述第一种子培养基包括：玉米浆3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨醇20g/L，pH调至6.7-7.2，121℃，灭菌20min，制成第一种子培养基；固体培养基另加20g/L的琼脂粉；

所述第二种子培养基包括：玉米浆3g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨10g/L，尿素1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨糖20g/L，pH调至6.7-7.2，121℃，灭菌20min，制成第二种子培养基；固体培养基另加20g/L的琼脂粉。

6.根据权利要求5所述的发酵生产方法，其特征在于，所述种子培养包括如下步骤：

步骤1：将活化好的氧化葡萄糖酸杆菌接种于所述第一种子培养基中，经第一培养后，转接所述第一种子培养基，扩大培养，制成第一种子液；

步骤2：将活化好的生酮古龙酸杆菌及其伴生菌接种于所述第一种子培养基中，经第二培养后，转接所述第二种子培养基，扩大培养，制成第二种子液。

7.根据权利要求6所述的发酵生产方法，其特征在于，步骤1中所述第一培养为于30℃，200r/min培养24小时；

步骤1中所述扩大培养为于30℃，200r/min培养24小时；

步骤2中所述第二培养为于30℃，200r/min培养20小时；

步骤2中所述扩大培养为于30℃，200r/min培养12小时。

8.根据权利要求6或7所述的发酵生产方法，其特征在于，所述发酵培养为将所述第一种子液和第二种子液接种到发酵培养基中，发酵培养，制得2-酮-L-古龙酸。

9.根据权利要求8所述的发酵生产方法，其特征在于，所述发酵培养基包括玉米浆10g/L，尿素12g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙1g/L，山梨醇80g/L，加消泡剂1ml，pH调至6.7-7.0，121℃，灭菌20min，制成发酵培养基。

10.根据权利要求6至9任一项所述的发酵生产方法，其特征在于，所述第一种子液中活菌数为3.60×10¹⁰～3.6×10¹¹；以所述发酵培养基的质量为基准，所述第一种子液的接种量为10％；

所述第二种子液中活菌数为6.20×10¹⁰～6.2×10¹¹；以所述发酵培养基的质量为基准，所述第二种子液的接种量为5％；

所述发酵培养为于30℃，500r/min，pH控制7.0，用2.5mol硫酸和5mol氢氧化钠调节pH，通气1.5vvm。