CN104404121A - 一种发酵生产2-酮基-l-古龙酸的方法 - Google Patents
一种发酵生产2-酮基-l-古龙酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104404121A CN104404121A CN201410752557.0A CN201410752557A CN104404121A CN 104404121 A CN104404121 A CN 104404121A CN 201410752557 A CN201410752557 A CN 201410752557A CN 104404121 A CN104404121 A CN 104404121A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- fermentation
- sorbose
- sorbyl alcohol
- kga
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及发酵技术领域，公开了一种发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法。本发明所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法将Go菌与Kv菌混合由D-山梨醇到2-酮基-L-古龙酸的一步转化，简化生产工艺，缩短发酵周期，降低生产成本。同时Go菌与Kv菌混合培养培养容易、不易染菌，比较稳定，且可以利用原有的发酵罐进行发酵，容易实现工业化。进一步的，本发明所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法采用敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌与Kv配合混菌发酵，在一定程度上避免Go菌与Kv菌竞争性的争夺底物山梨糖，提高转化效率。
Description
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产维生素C的方法，尤其是涉及一种发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法及相关发酵菌株。
背景技术
维生素C(Vitamin C,VC)，又名L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)，是人体必需的营养物质。维生素C为抗体及胶原形成，组织修补(包括某些氧化还原作用)，苯丙氨酸、酪氨酸、叶酸的代谢，铁、碳水化合物的利用，脂肪、蛋白质的合成，维持免疫功能，羟化与羟色胺，保持血管的完整，促进非血红素铁吸收等所必需，维生素C作为一种抗氧化剂，在人体的氧化还原代谢反应中起到重要的调节作用。同时维生素C还具备抗自由基、抑制酪胺酸酶的形成，从而达到美白，淡斑的功效。
目前有多种人工合成维生素C的方法，如：串联发酵法、利用欧文氏菌一步发酵法、Reichstein发明的莱氏化学合成法，以及尹光琳二步发酵法。其中尹光琳发明的二步发酵法是20世纪70年代，由中科院北京微生物所的尹光琳等人利用一种混合微生物发酵体系，将原有莱氏法中的三步化学反应缩短为一步生物反应，以生物氧化代替化学氧化，既避免了大量易燃、易爆或有毒化学原料的使用，同时也大大缩短了工艺流程、降低了生产成本，成为现阶段工业生产维生素C最主要的工艺。此法首先用一步菌氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans,Go)将D-山梨醇转化为L-山梨糖；然后用二步混菌将L-山梨糖高效地转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(2-Keto-L-Gulonic acid，2-KGA)；最后再用与Reichstein法类似的化学法转化为维生素C。其中，第二步所用的混菌体系由两种菌组成，一种是产酸菌-酮古龙酸杆菌(Ketogulonigenium vulgare,Kv)，行业内俗称小菌；另一种是伴生菌，行业内俗称大菌，伴生菌的种类较多，如：蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus,Bc)、巨大芽孢杆菌(Bacil1us megaterium,Bm)、苏芸金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)等。
虽然现有维生素C的生产体系已经很成熟，但是因其两步发酵而必然导致能耗大，总发酵周期较长，即生产成本较高。然而随着维生素C市场竞争日趋激烈，如何降低生产成本，提高维生素C的收率，是企业能否在激烈的竞争中抢占有利制高点的关键，故此对现有发酵工艺的优化已成为研究热点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术两步发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸发酵周期长、能耗大、生产成本高的缺陷，提供一种发酵周期短的发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法。采用本发明所述方法发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸，发酵周期短，能耗小，生产成本低。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法，将氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)与酮古龙酸杆菌(Ketogulonigenium vulgare)混合，以山梨醇作为碳源，发酵制备2-酮基-L-古龙酸。
在一些实施方案中，所述氧化葡萄糖酸杆菌与所述酮古龙酸杆菌的混合比例为10:1-1:10。
在一些实施方案中，所述氧化葡萄糖酸杆菌中山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因被敲除。
在一些实施方案中，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为Gene Bank中基因序号为B932_0664、B932_1330、B932_1370、B932_1684、B932_3022、B932_1062、B932_2846、B932_2847、B932_2848、B932_3018、B932_3024、B932_3025、B932_3026的基因中的一种或几种。
在一些实施方案中，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为Gene Bank中基因序号为B932_1330的基因。
在一些实施方案中，所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法中，所述发酵的具体方法为：发酵罐按装料系数60％-80％装发酵培养基；以山梨醇计初始投入料为4％，3h后开始流加剩余4％；在培养温度25℃-33℃、搅拌速度400rpm-600rpm、通气量1.0vvm-1.5vvm条件下发酵20h-50h。
在一些优选实施方案中，所述发酵的具体方法为：发酵罐按装料系数60％装发酵培养基；以山梨醇计初始投入料为4％，3h后开始流加剩余4％；在培养温度30℃、搅拌速度500rpm、通气量1.5vvm条件下发酵28h。
本发明还提供了一种敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌。
在一些实施方案中，所述的氧化葡萄糖酸杆菌中所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为Gene Bank中基因序号为B932_0664、B932_1330、B932_1370、B932_1684、B932_3022、B932_1062、B932_2846、B932_2847、B932_2848、B932_3018、B932_3024、B932_3025、B932_3026的基因中的一种或几种。
在一些实施方案中，所述的氧化葡萄糖酸杆菌中所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为Gene Bank中基因序号为B932_1330的基因。
本发明还提供了所述敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌在发酵生产2-酮基-L-古龙酸中的用途。
与现有技术相比，本发明所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法将Go菌与Kv菌混合由D-山梨醇到2-酮基-L-古龙酸的一步转化，简化生产工艺，缩短发酵周期，降低生产成本。同时Go菌与Kv菌混合培养培养容易、不易染菌，比较稳定，且可以利用原有的发酵罐进行发酵，容易实现工业化。进一步的，本发明所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法采用敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌与Kv配合混菌发酵，在一定程度上避免Go菌与Kv菌竞争性的争夺底物山梨糖，提高转化效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例4NSR单基因缺失菌株验证结果电泳图，其中泳道M为DM2000Marker；泳道NSR为NSR单基因缺失株中的庆大霉素基因片段；泳道Go为对照组；
图2示实施例5单菌摇瓶发酵培养结果图，其中图(A)为以2％山梨醇为碳源的结果图，图(B)为以2％山梨糖为碳源的结果图，各图中横坐标为发酵时间，纵坐标为含量，为NSR单基因缺失菌株培养基中山梨糖含量，为HGO菌株培养基中山梨糖含量，为NSR单基因缺失菌株培养基中山梨醇含量，为HGO菌株培养基中山梨醇含量；
图3示实施例5混菌摇瓶发酵培养产酸图，其中图(A)为以2％山梨醇为碳源的结果图，图(B)为以2％山梨糖为碳源的结果图，各图中横坐标为发酵时间，纵坐标为2-酮基-L-古龙酸产量，为NSR单基因缺失菌株培养基中2-酮基-L-古龙酸产量，为HGO菌株培养基中2-酮基-L-古龙酸产量；
图4示实施例6单菌发酵罐发酵培养结果图，其中图(A)为以8％山梨醇为碳源的结果图，图(B)为以8％山梨糖为碳源的结果图，各图中横坐标为发酵时间，纵坐标为山梨糖含量，为NSR单基因缺失菌株培养基中山梨糖含量，为HGO菌株培养基中山梨糖含量；
图5示实施例6在不同NSR/HGO与Kv混合的比例下发酵罐发酵培养2-酮基-L-古龙酸产量结果图，其中图(A)为NSR/HGO与Kv混合比例为5:1的结果图，图(B)为NSR/HGO与Kv混合比例为1:4的结果图，各图中横坐标为发酵时间，纵坐标为2-酮基-L-古龙酸产量，为NSR单基因缺失菌株培养基中2-酮基-L-古龙酸产量，为HGO菌株培养基中2-酮基-L-古龙酸产量；
图6示实施例7NSR/HGO与Kv混合的比例为5:1，发酵的搅拌速度500rpm发酵28h条件下发酵罐发酵培养2-酮基-L-古龙酸产量结果图，其中图中横坐标为发酵时间，纵坐标为2-酮基-L-古龙酸产量，为NSR单基因缺失菌株培养基中2-酮基-L-古龙酸产量，为HGO菌株培养基中2-酮基-L-古龙酸产量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法，将氧化葡萄糖酸杆菌(Go)与酮古龙酸杆菌(Kv)混合，以山梨醇作为碳源，发酵制备2-酮基-L-古龙酸。
本发明所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法将Go菌与Kv菌混合，以山梨醇作为碳源，混菌发酵培养，实现由D-山梨醇到2-酮基-L-古龙酸的一步转化，简化生产工艺，缩短发酵时间，从而降低生产成本。
其中，在一些实施方案中，所述氧化葡萄糖酸杆菌与所述酮古龙酸杆菌的混合比例为10:1-1:10。
在一些优选实施方案中，所述氧化葡萄糖酸杆菌与所述酮古龙酸杆菌的混合比例为5:1-1:4。
进一步的，在一些具体实施方案中，所述氧化葡萄糖酸杆菌与所述酮古龙酸杆菌的混合比例为5:1。
在一些实施方案中，所述发酵的具体方法为：发酵罐按装料系数60％-80％装发酵培养基；以山梨醇计初始投入料为4％，3h后开始流加剩余4％；在培养温度25℃-33℃、搅拌速度400rpm-600rpm、通气量1.0vvm-1.5vvm条件下发酵20h-50h。
在一些具体实施例中，所述发酵的具体方法为：发酵罐按装料系数60％装发酵培养基；以山梨醇计初始投入料为4％，3h后开始流加剩余4％；在培养温度30℃、搅拌速度450rpm、通气量1.5vvm条件下发酵48h。
在另一些具体实施例中，所述发酵的具体方法为：发酵罐按装料系数60％装发酵培养基；以山梨醇计初始投入料为4％，3h后开始流加剩余4％；在培养温度30℃、搅拌速度500rpm、通气量1.5vvm条件下发酵28h。
在本发明的一些实施例中，所述发酵培养基具体为D-山梨醇8.0％，玉米浆1.0％，尿素1.2％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，CaCO30.1％，余量为水。
当体系中同时存在山梨醇和山梨糖时，Go菌优先利用山梨醇作为碳源，而当山梨糖被耗尽后，Go菌则开始消耗山梨糖。本发明所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法采用Go菌与Kv菌配合一步混菌发酵，Go菌对山梨糖的代谢会竞争性的与Kv菌争夺底物山梨糖，从而降低转化效率。
因此进一步的，在一些优选实施方案中，所述氧化葡萄糖酸杆菌中山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因被敲除。Go菌中山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因被敲除可以更好的配合Kv混菌发酵，一定程度上避免Go菌与Kv菌竞争性的争夺底物山梨糖。
其中，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因如表1所示。
表1山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因表
| Gene Bank基因序号 | 基因编码的蛋白 |
| B932_0664 | FAD-dependent L-sorbose 1-dehydrogenase |
| B932_1330 | NADPH-dependent L-sorbose reductase(NSR) |
| B932_1370 | PTS system transporter subunit IIA |
| B932_1684 | L-sorbose reductase |
| B932_3022 | L-Sorbose Reductase |
| B932_1062 | NADP-dependent sorbitol dehydrogenase |
| B932_2846～2848 | Mannitol/sorbitol ABC transporter |
| B932_3018 | Sorbitol dehydrogenase regulator |
| B932_3024～3026 | Sorbitol dehydrogenase |
在一些优选实施方案中，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为GeneBank中基因序号为B932_0664、B932_1330、B932_1370、B932_1684、B932_3022、B932_1062、B932_2846、B932_2847、B932_2848、B932_3018、B932_3024、B932_3025、B932_3026的基因中的一种或几种。
在本发明的一些实施例中，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为GeneBank中基因序号为B932_1330的基因。该基因编码NADPH依赖型L-山梨糖还原酶(NADPH-dependent L-sorbose reductase，NSR)，简称为NSR基因。
本发明还提供了一种敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌。
在一些优选实施方案中，所述敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌中所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为Gene Bank中基因序号为B932_0664、B932_1330、B932_1370、B932_1684、B932_3022、B932_1062、B932_2846、B932_2847、B932_2848、B932_3018、B932_3024、B932_3025、B932_3026的基因中的一种或几种。
在本发明的一些实施例中，所述敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌中所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为Gene Bank中基因序号为B932_1330的基因，即NSR基因。
本领域技术人员可以按照公知的方法，如同源重组双交换敲除法，对已知的Go菌进行改造，敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因，获得改造后的Go菌。
在本发明的一些实施例中，本发明考察了敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因NSR基因的氧化葡萄糖酸杆菌单菌发酵培养，结果显示与原始菌株HGO相比，NSR单基因缺失菌株能够在一定程度上减少山梨糖的代谢。
在本发明的一些实施例中，本发明采用敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因NSR基因的氧化葡萄糖酸杆菌与Kv菌混合发酵生产2-酮基-L-古龙酸，结果显示混菌发酵后期，相对于原始菌株HGO，采用NSR单基因缺失菌株与Kv菌配合显著提高了2-酮基-L-古龙酸的转化效率。
在本发明的一些实施例中，本发明按照不同的比例将敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因NSR基因的氧化葡萄糖酸杆菌与Kv菌混合发酵生产2-酮基-L-古龙酸，结果显示混菌发酵后期，NSR单基因缺失菌株与Kv菌按5:1的比例混合2-酮基-L-古龙酸的转化效率更高。
因此本发明还提供了所述敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌在发酵生产2-酮基-L-古龙酸中的用途。
与现有技术相比，本发明所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法将Go菌与Kv菌混合由D-山梨醇到2-酮基-L-古龙酸的一步转化，简化生产工艺，缩短发酵周期，降低生产成本。同时Go菌与Kv菌混合培养培养容易、不易染菌，比较稳定，且可以利用原有的发酵罐进行发酵，容易实现工业化。进一步的，本发明所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法采用敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌与Kv配合混菌发酵，在一定程度上避免Go菌与Kv菌竞争性的争夺底物山梨糖，提高转化效率。
为了进一步了解本发明，下面结合实施例，进一步阐述本发明。其中实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。如无特殊说明，本发明所涉及的培养基中的所用原料及试剂均可由市场购得。
实施例1、发酵生产2-酮基-L-古龙酸的培养基的配制
1、Go菌种子培养基：
D-山梨醇2.0％，玉米浆0.3％，牛肉膏0.3％，酵母浸粉0.3％，尿素0.1％，蛋白胨1.0％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，CaCO30.1％，余量为水。调节pH 6.8，121℃灭菌20min。
2、Kv菌种子培养基：
L-山梨糖2.0％，玉米浆0.3％，牛肉膏0.3％，酵母浸粉0.3％，尿素0.1％，蛋白胨1.0％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，CaCO30.1％，余量为水。调节pH 6.8，121℃灭菌(L-山梨糖单独灭菌，接菌前添加至种子培养基中)20min。
3、发酵培养基：
D-山梨醇8.0％，玉米浆1.0％，尿素1.2％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O0.02％，CaCO30.1％，余量为水。调节pH 6.8-7.0，121℃灭菌20min。
实施例2、发酵生产2-酮基-L-古龙酸
1、种子培养
一级种子培养：取300μl甘油菌加入50ml种子培养基中，30℃，250rpm摇床震荡培养24h。
二级种子培养：按10％接种比例，取一级种子5ml接种至50ml种子培养基中，30℃，250rpm摇床震荡培养24h。
2、发酵罐培养
按10％的接种量、菌体比例Go：Kv＝5：1条件，将共300ml二级种子液接入到5L的发酵罐中(装料系数60％装料)。初始投入料为4.0％D-山梨醇，3h后开始流加剩余4％，在培养温度30℃、搅拌速度450rpm、通气量1.5vvm条件下发酵约48h。
实施例3、发酵生产2-酮基-L-古龙酸
1、种子培养
同实施例2。
2、发酵罐培养
按10％的接种量、菌体比例Go：Kv＝5：1条件，将共300ml二级种子液接入到5L的发酵罐中(装料系数60％装料)。初始投入料为4.0％D-山梨醇，3h后开始流加剩余4％，在培养温度30℃、搅拌速度500rpm、通气量1.5vvm条件下发酵28h。
实施例4、敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌的制备
同源重组双交换敲除法敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌
①敲除盒的构建：PCR扩增NSR上下游各约500bp，利用OE PCR依次将上游片段、tufB片段、庆大抗性片段和下游片段连接在一起获得敲除盒；其中所述NSR上游片段、NSR下游片段、tufB片段及庆大抗性片段序列如SEQ IDNo.1-SEQ ID No.4所示。各序列对应关系如表1所示。
表1敲除盒中各序列
| 名称 | 序列 |
| NSR上游片段 | SEQ ID No.1所示 |
| NSR下游片段 | SEQ ID No.2所示 |
| tufB片段 | SEQ ID No.3所示 |
| 庆大抗性片段序列 | SEQ ID No.4所示 |
②电转化：1800V电压，将敲除盒电转化入Go H24菌株(命名为HGO)内，在含有庆大霉素的培养基中培养筛选单菌落进一步通过采用菌落PCR扩增庆大霉素基因(Gen基因)验证，筛选获得正确敲除NSR基因的菌株(菌株命名为NSR)。其中，PCR扩增电泳结果如图1。菌落PCR扩增引物为：
GEN-YZ-F：5’-ATGTTACGCAGCAGCAACGATG-3’
GEN-YZ-R：5’-TTAGGTGGCGGTACTTGGGT-3’
实施例5、敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌的摇瓶发酵培养
①按照实施例1的方法分别以山梨醇、山梨糖为碳源，单菌培养原始菌株HGO与NSR，统计发酵过程中山梨醇或山梨糖含量，结果见图2。
由图2结果可见，在单菌发酵后期，相对与原始菌株HGO，NSR单基因缺失菌株培养基中残糖量分别提高了85.9％、483％。表明与原始菌株HGO相比，NSR单基因缺失菌株缺失株NSR能够在一定程度上减少山梨糖的代谢。
②按照实施例1的方法分别以山梨醇、山梨糖为碳源，分别用NSR、HGO配合Kv一步混菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸，统计2-酮基-L-古龙酸的产量，计算转化效率，结果见图3。
由图3结果可见，混菌发酵后期，相对于原始菌株HGO，NSR单基因缺失菌株的转化效率分别提高了15.6％、24.4％。
实施例6、敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌的发酵罐发酵培养
①按照实施例2的方法分别以山梨醇、山梨糖为碳源，单菌培养原始菌株HGO与NSR，统计发酵过程中山梨糖含量，结果见图4。
由图4结果可见，在单菌发酵后期，相对与原始菌株HGO，NSR单基因缺失菌株培养基中残糖量分别提高了36.6％、83.1％。
②按照实施例2的方法以山梨醇为碳源，分别用NSR、HGO配合Kv，同时分别选择不同的NSR/HGO与Kv混合的比例(5:1和1:4)一步混菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸，统计2-酮基-L-古龙酸的产量，计算转化效率，结果见图5。
由图5结果可见，在NSR/HGO：Kv＝1：4组，NSR与HGO转化率分别为52.8％、48.0％，2-KGA的产量提高10.1％。而NSR/HGO：Kv＝5：1组，NSR单基因缺失菌株与HGO二者转化效率分别为80.2％、71.1％，NSR单基因缺失菌株的转化效率提高了12.8％。表明NSR单基因缺失菌株与Kv混合可以明显提高2-酮基-L-古龙酸的转化效率，同时NSR单基因缺失菌株与Kv按5:1的比例混合转化效率更高。
实施例7、敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌的发酵罐发酵培养
按照实施例3的方法以山梨醇为碳源，分别用NSR、HGO配合Kv，选择NSR/HGO与Kv混合的比例为5:1，一步混菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸，统计2-酮基-L-古龙酸的产量，计算转化效率，结果见图6。
由图6结果可见，NSR单基因缺失菌株与HGO二者转化效率分别为88.1％，80.0％，相比于原始菌株HGO，NSR单基因缺失菌株与Kv配合产酸量提高了10.1％。表明NSR单基因缺失菌株与Kv混合可以明显提高2-酮基-L-古龙酸的转化效率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法，将氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)与酮古龙酸杆菌(Ketogulonigenium vulgare)混合，以山梨醇作为碳源，发酵制备2-酮基-L-古龙酸。
2.根据权利要求1所述的方法，所述氧化葡萄糖酸杆菌与所述酮古龙酸杆菌的混合比例为10:1-1:10。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述氧化葡萄糖酸杆菌中山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因被敲除。
4.根据权利要求3所述的方法，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为Gene Bank中基因序号为B932_0664、B932_1330、B932_1370、B932_1684、B932_3022、B932_1062、B932_2846、B932_2847、B932_2848、B932_3018、B932_3024、B932_3025、B932_3026的基因中的一种或几种。
5.根据权利要求3所述的方法，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为Gene Bank中基因序号为B932_1330的基因。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，所述发酵的具体方法为：发酵罐按装料系数60％-80％装发酵培养基；以山梨醇计初始投入料为4％，3h后开始流加剩余4％；在培养温度25℃-33℃、搅拌速度400rpm-600rpm、通气量1.0vvm-1.5vvm条件下发酵20h-50h。
7.根据权利要求6所述的方法，所述发酵的具体方法为：发酵罐按装料系数60％装发酵培养基；以山梨醇计初始投入料为4％，3h后开始流加剩余4％；在培养温度30℃、搅拌速度500rpm、通气量1.5vvm条件下发酵28h。
8.一种敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌。
9.根据权利要求8所述的氧化葡萄糖酸杆菌，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为Gene Bank中基因序号为B932_0664、B932_1330、B932_1370、B932_1684、B932_3022、B932_1062、B932_2846、B932_2847、B932_2848、B932_3018、B932_3024、B932_3025、B932_3026的基因中的一种或几种。
10.根据权利要求8所述的氧化葡萄糖酸杆菌，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为Gene Bank中基因序号为B932_1330的基因。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410752557.0A CN104404121A (zh) | 2014-12-10 | 2014-12-10 | 一种发酵生产2-酮基-l-古龙酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410752557.0A CN104404121A (zh) | 2014-12-10 | 2014-12-10 | 一种发酵生产2-酮基-l-古龙酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104404121A true CN104404121A (zh) | 2015-03-11 |
Family
ID=52641785
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410752557.0A Pending CN104404121A (zh) | 2014-12-10 | 2014-12-10 | 一种发酵生产2-酮基-l-古龙酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104404121A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105112488A (zh) * | 2015-10-22 | 2015-12-02 | 天津大学 | 2-酮-l-古龙酸的发酵生产方法 |
| CN105368759A (zh) * | 2015-12-25 | 2016-03-02 | 天津大学 | 酮古龙酸杆菌的培养方法 |
| CN105861526A (zh) * | 2016-04-19 | 2016-08-17 | 天津大学 | 一组dna分子及重组载体、重组酮古龙酸杆菌和生产2-酮-l-古龙酸的方法 |
| CN106011043A (zh) * | 2016-08-10 | 2016-10-12 | 天津大学 | 一种酮古龙酸杆菌工程菌株及其制备方法和应用 |
| CN109234350A (zh) * | 2018-11-15 | 2019-01-18 | 江南大学 | 一种发酵生产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法 |
| CN112921049A (zh) * | 2021-02-06 | 2021-06-08 | 石河子大学 | 一种用于生产香草醛的基因片段、酿酒酵母工程菌及其构建方法 |
| CN115029396A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-09-09 | 山东天力药业有限公司 | 一种有效缩短维生素c一步菌发酵反应周期的方法 |
-
2014
- 2014-12-10 CN CN201410752557.0A patent/CN104404121A/zh active Pending
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| B. PETERS ET. AL: "Characterization of membrane-bound dehydrogenases from Gluconobacter oxydans 621H via whole-cell activity assays using multideletion strains", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 * |
| CHRISTINA PRUST ET AL.: "Complete genome sequence of the acetic acid bacterium Gluconobacter oxydans", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》 * |
| J. W. URBANCE ET AL.: "Taxonomic characterization of Ketogulonigenuium vulgare gen. nov., sp. nov. and Ketogulonigenuium robustum sp. nov., which oxidize L-sorbose to 2-keto-L-gulonic acid", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY》 * |
| MASAKO SHINJOH ET AL.: "NADPH-dependent L-sorbose reductase is responsible for L-sorbose assimilation in Gluconobacter suboxydans IFO3291", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 * |
| PETER DE WUFF ET AL.: "Optimized synthesis of L-sorbose by C5-dehydrogenation of D-sorbitol with Gluconobacter oxydans", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105112488A (zh) * | 2015-10-22 | 2015-12-02 | 天津大学 | 2-酮-l-古龙酸的发酵生产方法 |
| CN105368759A (zh) * | 2015-12-25 | 2016-03-02 | 天津大学 | 酮古龙酸杆菌的培养方法 |
| CN105861526A (zh) * | 2016-04-19 | 2016-08-17 | 天津大学 | 一组dna分子及重组载体、重组酮古龙酸杆菌和生产2-酮-l-古龙酸的方法 |
| CN106011043A (zh) * | 2016-08-10 | 2016-10-12 | 天津大学 | 一种酮古龙酸杆菌工程菌株及其制备方法和应用 |
| CN109234350A (zh) * | 2018-11-15 | 2019-01-18 | 江南大学 | 一种发酵生产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法 |
| CN109234350B (zh) * | 2018-11-15 | 2021-06-04 | 江南大学 | 一种发酵生产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法 |
| CN112921049A (zh) * | 2021-02-06 | 2021-06-08 | 石河子大学 | 一种用于生产香草醛的基因片段、酿酒酵母工程菌及其构建方法 |
| CN112921049B (zh) * | 2021-02-06 | 2024-01-23 | 石河子大学 | 一种用于生产香草醛的基因片段、酿酒酵母工程菌及其构建方法 |
| CN115029396A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-09-09 | 山东天力药业有限公司 | 一种有效缩短维生素c一步菌发酵反应周期的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104404121A (zh) | 一种发酵生产2-酮基-l-古龙酸的方法 | |
| Du Preez et al. | A quantitative screening of some xylose-fermenting yeast isolates | |
| CN106675989B (zh) | 一种多粮多微全曲原料酿造山西老陈醋工艺方法 | |
| CN103243002B (zh) | 一种提升小曲白酒品质的方法 | |
| CN102660428A (zh) | 一种淋饭酒母的制备工艺 | |
| JP6942697B2 (ja) | クロストリジウム ベイジェリンキー及びその使用、並びにブタノールの製造方法 | |
| CN104543935A (zh) | 一种多菌种阶梯发酵酱油及其酿造方法 | |
| CN106281862A (zh) | 一种咖啡果皮的加工方法及制得的咖啡果皮发酵酒 | |
| CN104152497A (zh) | 一种多级连续发酵生产丁二酸的方法 | |
| CN1884560B (zh) | 一种发酵生产2,3-丁二醇的方法 | |
| CN107083338A (zh) | 重组菌株及其构建方法与在产菜油甾醇中的应用 | |
| CN110452822A (zh) | 一种利用酒糟发酵酿酒的复合酿酒曲及其酿酒方法 | |
| CN104357529A (zh) | 增强酮古龙酸菌碳代谢水平提高产2-酮基-l-古龙酸能力的方法 | |
| CN102080031B (zh) | 啤酒饮料的生产方法 | |
| CN115161242B (zh) | 定向富集培养梭菌属微生物的方法 | |
| CN106350568A (zh) | 一种复合菌群同步降解纤维素和厌氧发酵生物产氢的方法 | |
| CN110283789A (zh) | 重组菌株及其应用 | |
| CN100491520C (zh) | 在通过气体流获得的还原条件下培养微生物的方法 | |
| CN106479895A (zh) | 一种利用木糖混合营养培养小球藻的方法 | |
| CN101544955B (zh) | 一株克雷伯氏菌及其在微氧发酵产氢中的用途 | |
| CN102409067B (zh) | 一种用于米曲霉菌发酵产曲酸的培养基及其发酵方法 | |
| CN106011043A (zh) | 一种酮古龙酸杆菌工程菌株及其制备方法和应用 | |
| CN103555610B (zh) | 利普司他汀高产毒三素链霉菌及其发酵培养基 | |
| CN106047778B (zh) | 一种发酵食品中异味物质pc的控制方法 | |
| CN104611401A (zh) | 一种提高微生物发酵生产2,3-丁二醇的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150311 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |