CN103045710A - 强化两菌相互作用提高2-酮基-l-古龙酸产量的方法 - Google Patents
强化两菌相互作用提高2-酮基-l-古龙酸产量的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103045710A CN103045710A CN2011103156412A CN201110315641A CN103045710A CN 103045710 A CN103045710 A CN 103045710A CN 2011103156412 A CN2011103156412 A CN 2011103156412A CN 201110315641 A CN201110315641 A CN 201110315641A CN 103045710 A CN103045710 A CN 103045710A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gluconobacter oxydans
- bacillus megaterium
- medium
- evolved
- kga
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,包括如下步骤:(1)固体培养;(2)种子培养,将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中,在28-35℃,200-280r/min摇床振荡培养,以24h-48h为传代周期,以体积比为1%-10%为传代比接入新的种子培养基中,传代100-200天;(3)分纯;(4)发酵;本发明的方法通过混菌进化传代培养数十代后,能明显提高巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌的生长速度和氧化葡糖杆菌产2-酮基-L-古龙酸效率,从而可提高对培养基的利用效率,提高L-山梨糖的转化效率10%-15%。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物领域,涉及一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法。
背景技术
维生素C是机体营养、生长所必需的一种微量水溶性维生素,在抗氧化和维持新陈代谢平衡等方面起着重要的作用。维生素C可以作为药品、保健品、食品添加剂及化妆品营养剂,它的应用范围在扩展,市场稳定。
目前,我国生产维生素C的方法为“二步发酵法”,第一步发酵使用黑醋杆菌将山梨醇转化为L-山梨糖,第二步发酵为混合发酵,将山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)。混合发酵所使用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)混菌发酵,其中,氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)为产酸菌,巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)为伴生菌,若不加入巨大芽孢杆菌而单独使用氧化葡糖杆菌时,生长极端缓慢,产酸效率低,当加入巨大芽孢杆菌,可使氧化葡糖杆菌生长速率提高,产酸量增加,但是,巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)混菌发酵2-酮基-L-古龙酸的转化率尚有可提高的空间。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足,提供一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法。
强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,包括如下步骤:
(1)固体培养:
取存于液氮的10-500μL保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10-500μL保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上,28-35℃,培养24-48小时;
(2)种子培养:
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基,在28-35℃,200-280r/min摇床振荡培养,24h-48h,得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液;
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中,使巨大芽孢杆菌的密度为2×107-2×1010cfu/ml,使氧化葡糖杆菌的密度为2×108-2×1011cfu/ml,在28-35℃,200-280r/min摇床振荡培养,以24h-48h为传代周期,以体积比为1%-10%为传代比接入新的种子培养基中,传代100-200天;
(3)分纯:
将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯,再分别接种于固体培养基上,28-35℃培养24-48小时;再分别转入种子培养基,在28-35℃,200-280r/min摇床振荡培养24h-48h,得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液;
(4)发酵:
将所述进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中,使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×107-2×1010cfu/ml,使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×108-2×1011cfu/ml,在28-35℃,200-280r/min摇床振荡培养72h-96h,获得2-酮基-L-古龙酸或将所述原始巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中,使原始巨大芽孢杆菌的密度为2×107-2×1010cfu/ml,使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×107-2×109cfu/ml,在28-35℃,200-280r/min摇床振荡培养72h-96h,获得2-酮基-L-古龙酸。
固体培养基的制备为:按比例称取L-山梨糖10-50g,玉米浆2-10g,牛肉膏2-10g,酵母浸粉2-10g,尿素0.5-5g,蛋白胨2-12g,琼脂10-50g,KH2PO40.5-5g,MgSO40.1-0.7g,CaCO30.5-5g,加水至1L,调pH为6.5-7.0,121℃灭菌20min,制成固体培养基。
固体培养基的制备优选的是:按比例称取L-山梨糖20g,玉米浆3g,牛肉膏3g,酵母浸粉3g,尿素1g,蛋白胨10g,琼脂20g,KH2PO41g,MgSO40.2g,CaCO31g,加水至1L,调pH为6.8,121℃灭菌20min,制成固体培养基。
种子培养基制备为:按比例称取L-山梨糖10-50g,玉米浆2-10g,牛肉膏2-10g,酵母浸粉2-10g,尿素0.5-5g,蛋白胨2-12g,KH2PO40.5-5g,MgSO40.1-0.7g,CaCO30.5-5g,加水至1L,调pH为6.5-7.0,121℃灭菌20min,制成种子培养基。
种子培养基的制备优选的是:按比例称取L-山梨糖20g,玉米浆3g,牛肉膏3g,酵母浸粉3g,尿素1g,蛋白胨10g,KH2PO41g,MgSO40.2g,CaCO31g,加水至1L,调pH为6.8,121℃灭菌20min,制成种子培养基。
发酵培养基制备为:按比例称取L-山梨糖40-120g,玉米浆10-50g,尿素10-25g,KH2PO40.5-3g,MgSO40.2-1.2g,CaCO30.5-5g加水至1L,调pH为6.5-7.5,121℃灭菌20min,制成发酵培养基。
发酵培养基的制备优选的是:按比例称取L-山梨糖80g,玉米浆20g,尿素12g,KH2PO41g,MgSO40.5g,CaCO31g,加水至1L,调pH为7.0,121℃灭菌20min,制成发酵培养基。
本发明的方法通过混菌进化传代培养数十代后,能明显提高巨大芽孢杆菌(Baclilusmegaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的生长速度和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)产2-酮基-L-古龙酸效率,从而可提高对培养基的利用效率,提高L-山梨糖的转化效率10%-15%。
附图说明
图1为传代过程2-酮基-L-古龙酸转化率变化,图例:◆:2-酮基-L-古龙酸转化率。
图2为传代100天后菌种交叉搭配发酵结果。
图3为传代150天后菌种交叉搭配发酵结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的内容及实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明,但并不用于限制本发明。
本发明所使用的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)保藏编号为CGMCC No.1.110,巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)保藏编号为CGMCC No 1.459,从中国普通微生物菌种保藏管理中心购得。
实施例1
强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,包括如下步骤:
(1)固体培养:
固体培养基的制备为:按比例称取L-山梨糖20g,玉米浆3g,牛肉膏3g,酵母浸粉3g,尿素1g,蛋白胨10g,琼脂20g,KH2PO41g,MgSO40.2g,CaCO31g加水至1L,调pH为6.8,121℃灭菌20min,制成固体培养基;
将存于液氮的150μL保藏于体积浓度为20%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和150μL保藏于体积浓度为20%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上,30℃,培养48小时;
(2)种子培养:
种子培养基制备为:按比例称取L-山梨糖20g,玉米浆3g,牛肉膏3g,酵母浸粉3g,尿素1g,蛋白胨10g,KH2PO41g,MgSO40.2g,CaCO31g加水至1L,调pH为6.8,121℃灭菌20min,制成种子培养基;
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基,在30℃,250r/min摇床振荡培养,48h,得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液;
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中,使巨大芽孢杆菌的密度为2×107cfu/ml,使氧化葡糖杆菌的密度为2×109cfu/ml,在30℃,250r/min摇床振荡培养,以24h为传代周期,以体积比为4%为传代比接入新的种子培养基中,传代100天;
(3)分纯:
将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯,再分别接种于固体培养基上,30℃,培养48小时;再分别转入种子培养基,在30℃,250r/min摇床振荡培养48h,得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液;
(4)发酵:
发酵培养基制备为:按比例称取L-山梨糖80g,玉米浆20g,尿素12g,KH2PO41g,MgSO40.5g,CaCO31g,加水至1L,调pH为7.0,121℃灭菌20min,制成发酵培养基;
将进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中,使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×107cfu/ml,使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×109cfu/ml,在30℃,250r/min摇床振荡培养96h,获得2-酮基-L-古龙酸。
实施例2
强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,包括如下步骤:
步骤(1)、(2)和(3)同实施例1
(4)发酵:
将原始的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中,使原始的巨大芽孢杆菌的密度为2×107cfu/ml,使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×109cfu/ml,在30℃,250r/min摇床振荡培养96h,获得2-酮基-L-古龙酸。
2-酮基-L-古龙酸和L-山梨糖含量测定:
采用高效液相色谱法(HPLC)。
样品制备:取发酵培养不同时间的发酵液1mL于1.5mL离心管中,10000r/min转速离心3min,取上清100μL于1.5mL离心管中,并加入900μL流动相(5mM H2SO4)得到稀释十倍的样品。振荡混匀后,用0.22μm的纤维素微孔滤膜过滤样品,得到待测样品。
高效液相色谱条件:色谱柱:bio-rad HPX-87H,流动相:5mM H2SO4,流速:0.6mL/min,柱温:65℃,示差检测器。
实施例1、2检测结果见图2。
图例:◇:原始氧化葡糖杆菌和原始巨大芽孢杆菌搭配;
□:传代100天氧化葡糖杆菌和传代100天巨大芽孢杆菌搭配;
△:传代100天氧化葡糖杆菌和原始巨大芽孢杆菌搭配;
原始氧化葡糖杆菌与原始巨大芽孢杆菌利用实施例1步骤(4)的发酵条件进行搭配混菌发酵的2-酮基-L-古龙酸产率达到78%;用实施例1的方法传代培养100天的进化了的氧化葡糖杆菌和传代培养100天的进化了的巨大芽孢杆菌搭配混菌发酵的2-酮基-L-古龙酸产率达到91%-92%,它比原始氧化葡糖杆菌与原始巨大芽孢杆菌搭配混菌发酵的2-酮基-L-古龙酸产率提高了13%-14%;
传代培养100天的氧化葡糖杆菌与原始巨大芽孢杆菌搭配的混菌发酵(实施例2)发酵周期和2-酮基-L-古龙酸转化率与传代培养100天的氧化葡糖杆菌和传代培养100天的巨大芽孢杆菌混菌发酵相似。
实施例3
强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,包括如下步骤:
(1)固体培养:
取存于液氮的10μL保藏于体积浓度为30%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10μL保藏于体积浓度为30%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上,35℃,培养24小时;
(2)种子培养:
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基,在35℃,200r/min摇床振荡培养24h,得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液;
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中,使巨大芽孢杆菌的密度为2×107cfu/ml,使氧化葡糖杆菌的密度为2×108cfu/ml,在35℃,200r/min摇床振荡培养,以24h为传代周期,以体积比为2%为传代比接入新的种子培养基中,传代150天;
(3)分纯:
将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯,再分别接种于固体培养基上,35℃培养24小时;再分别转入种子培养基,在35℃,200r/min摇床振荡培养24h,得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液;
(4)发酵:
将所述进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中,使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×107cfu/ml,使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×108cfu/ml,在35℃,200r/min摇床振荡培养96h,获得2-酮基-L-古龙酸。
本实施例所用的培养基:
固体培养基的制备为:按比例称取L-山梨糖10g,玉米浆10g,牛肉膏5g,酵母浸粉2g,尿素5g,蛋白胨5g,琼脂10g,KH2PO45g,MgSO40.5g,CaCO30.5g,加水至1L,调pH为6.5,121℃灭菌20min,制成固体培养基。
种子培养基制备为:按比例称取L-山梨糖10g,玉米浆10g,牛肉膏8g,酵母浸粉2g,尿素5g,蛋白胨2g,KH2PO45g,MgSO40.5g,CaCO30.5g,加水至1L,调pH为6.5,121℃灭菌20min,制成种子培养基。
发酵培养基制备为:按比例称取L-山梨糖40g,玉米浆50g,尿素20g,KH2PO40.5g,MgSO41.2g,CaCO32g加水至1L,调pH为6.5,121℃灭菌20min,制成发酵培养基。
实施例4
强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,包括如下步骤:
步骤(1)、(2)和(3)同实施例3
(4)发酵:
将原始的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中,使原始的巨大芽孢杆菌的密度为2×107cfu/ml,使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×109cfu/ml,在35℃,200r/min摇床振荡培养96h,获得2-酮基-L-古龙酸。
各种培养基分别与实施例3相应的培养基相同。
实施例3、4检测结果见图3。
图例:◇:原始氧化葡糖杆菌和原始巨大芽孢杆菌搭配;□:传代150天氧化葡糖杆菌和传代150天巨大芽孢杆菌搭配;△:传代150天氧化葡糖杆菌和原始巨大芽孢杆菌搭配;○:原始氧化葡糖杆菌和传代150天巨大芽孢杆菌搭配。
原始氧化葡糖杆菌与原始巨大芽孢杆菌利用实施例3步骤(4)的发酵条件进行搭配混菌发酵的2-酮基-L-古龙酸产率达到78%;用实施例3的方法传代培养150天的进化了的氧化葡糖杆菌和传代培养150天的进化了的巨大芽孢杆菌混菌发酵的2-酮基-L-古龙酸产率在发酵末期达到95%,比原始氧化葡糖杆菌和原始巨大芽孢杆菌混菌发酵的2-酮基-L-古龙酸产率混菌提高了17%,发酵周期较原始混菌的发酵周期缩短了9%;传代培养150天的氧化葡糖杆菌和原始巨大芽孢杆菌搭配的混菌体系发酵过程(实施例4)的2-酮基-L-古龙酸转化率比原始混菌提高了16%,发酵周期与传代培养150天的混菌相似。
实施例5
强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,包括如下步骤:
(1)固体培养:
取存于液氮的200μL保藏于体积浓度为15%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和200μL保藏于体积浓度为15%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上,35℃,培养24小时;
(2)种子培养:
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基,在30℃,240r/min摇床振荡培养36h,得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液;
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中,使巨大芽孢杆菌的密度为2×108cfu/ml,使氧化葡糖杆菌的密度为2×1011cfu/ml,在30℃,240r/min摇床振荡培养,以36h为传代周期,以体积比为1%为传代比接入新的种子培养基中,传代200天;
(3)分纯:
将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯,再分别接种于固体培养基上,30℃培养36小时;再分别转入种子培养基,在30℃,240r/min摇床振荡培养36h,得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液;
(4)发酵:
将所述进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中,使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×108cfu/ml,使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×1011cfu/ml,在30℃,240r/min摇床振荡培养96h,获得2-酮基-L-古龙酸。
本实施例所用的各个培养基:
固体培养基的制备为:按比例称取L-山梨糖30g,玉米浆2g,牛肉膏10g,酵母浸粉5g,尿素0.5g,蛋白胨12g,琼脂30g,KH2PO40.5g,MgSO40.7g,CaCO33g,加水至1L,调pH为6.8,121℃灭菌20min,制成固体培养基。
种子培养基制备为:按比例称取L-山梨糖30g,玉米浆2g,牛肉膏10g,酵母浸粉8g,尿素0.5g,蛋白胨8g,KH2PO40.5g,MgSO40.7g,CaCO33g,加水至1L,调pH为6.8,121℃灭菌20min,制成种子培养基。
发酵培养基制备为:按比例称取L-山梨糖80g,玉米浆10g,尿素25g,KH2PO41g,MgSO40.2g,CaCO35g加水至1L,调pH为6.8,121℃灭菌20min,制成发酵培养基。
实施例6
强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,包括如下步骤:
步骤(1)、(2)和(3)同实施例5
(4)发酵:
将原始的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中,使原始的巨大芽孢杆菌的密度为2×108cfu/ml,使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×1011cfu/ml,在30℃,240r/min摇床振荡培养96h,获得2-酮基-L-古龙酸。
实施例7
强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,包括如下步骤:
(1)固体培养:
取存于液氮的500μL保藏于体积浓度为20%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和500μL保藏于体积浓度为20%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上,28℃,培养48小时;
(2)种子培养:
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基,在28℃,280r/min摇床振荡培养48h,得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液;
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中,使巨大芽孢杆菌的密度为2×1010cfu/ml,使氧化葡糖杆菌的密度为2×1011cfu/ml,在28℃,280r/min摇床振荡培养,以48h为传代周期,以体积比为10%为传代比接入新的种子培养基中,传代180天;
(3)分纯:
将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯,再分别接种于固体培养基上,28℃培养48小时;再分别转入种子培养基,在28℃,280r/min摇床振荡培养48h,得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液;
(4)发酵:
将所述进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中,使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×1010cfu/ml,使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×1011cfu/ml,在28℃,280r/min摇床振荡培养72h,获得2-酮基-L-古龙酸。
本实施例所用的各个培养基:
固体培养基的制备为:按比例称取L-山梨糖50g,玉米浆5g,牛肉膏2g,酵母浸粉10g,尿素3g,蛋白胨2g,琼脂50g,KH2PO43g,MgSO40.1g,CaCO35g,加水至1L,调pH为7.0,121℃灭菌20min,制成固体培养基。
种子培养基制备为:按比例称取L-山梨糖50g,玉米浆8g,牛肉膏2g,酵母浸粉10g,尿素3g,蛋白胨12g,KH2PO43g,MgSO40.1g,CaCO30.5-5g,加水至1L,调pH为7.0,121℃灭菌20min,制成种子培养基。
发酵培养基制备为:按比例称取L-山梨糖120g,玉米浆30g,尿素10g,KH2PO43g,MgSO40.5g,CaCO30.5g加水至1L,调pH为7.5,121℃灭菌20min,制成发酵培养基。
实施例8
强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,包括如下步骤:
步骤(1)、(2)和(3)同实施例7
(4)发酵:
将原始的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中,使原始的巨大芽孢杆菌的密度为2×1010cfu/ml,使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×1011cfu/ml,在28℃,280r/min摇床振荡培养72h,获得2-酮基-L-古龙酸。
Claims (7)
1.一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,其特征是包括如下步骤:
(1)固体培养:
取10-500μL保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)和10-500μL保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)分别接种于固体培养基上,28-35℃,培养24-48小时;
(2)种子培养:
将经步骤(1)培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基,在28-35℃,200-280r/min摇床振荡培养,24h-48h,得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液;
将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中,使巨大芽孢杆菌的密度为2×107-2×1010cfu/ml,使氧化葡糖杆菌的密度为2×108-2×1011cfu/ml,在28-35℃,200-280r/min摇床振荡培养,以24h-48h为传代周期,以体积比为1%-10%为传代比接入新的种子培养基中,传代100-200天;
(3)分纯:
将步骤(2)获得的传代培养混菌菌株划线分纯,再分别接种于固体培养基上,28-35℃培养24-48小时;再分别转入种子培养基,在28-35℃,200-280r/min摇床振荡培养24h-48h,得到进化了的巨大芽孢杆菌种子液和进化了的氧化葡糖杆菌种子液;
(4)发酵:
将所述进化了的巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中,使进化了的巨大芽孢杆菌的密度为2×107-2×1010cfu/ml,使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×108-2×1011cfu/ml,在28-35℃,200-280r/min摇床振荡培养72h-96h,获得2-酮基-L-古龙酸或将所述原始巨大芽孢杆菌和进化了的氧化葡糖杆菌接种到发酵培养基中,使原始巨大芽孢杆菌的密度为2×107-2×1010cfu/ml,使进化了的氧化葡糖杆菌的密度为2×107-2×109cfu/ml,在28-35℃,200-280r/min摇床振荡培养72h-96h,获得2-酮基-L-古龙酸。
2.根据权利要求1所述的一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,其特征是所述固体培养基的制备为:按比例称取L-山梨糖10-50g,玉米浆2-10g,牛肉膏2-10g,酵母浸粉2-10g,尿素0.5-5g,蛋白胨2-12g,琼脂10-50g,KH2PO40.5-5g,MgSO40.1-0.7g,CaCO30.5-5g,加水至1L,调pH为6.5-7.0,121℃灭菌20min,制成固体培养基。
3.根据权利要求2所述的一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,其特征是所述固体培养基的制备为:按比例称取L-山梨糖20g,玉米浆3g,牛肉膏3g,酵母浸粉3g,尿素1g,蛋白胨10g,琼脂20g,KH2PO41g,MgSO40.2g,CaCO31g,加水至1L,调pH为6.8,121℃灭菌20min,制成固体培养基。
4.根据权利要求1所述的一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,其特征是所述种子培养基制备为:按比例称取L-山梨糖10-50g,玉米浆2-10g,牛肉膏2-10g,酵母浸粉2-10g,尿素0.5-5g,蛋白胨2-12g,KH2PO40.5-5g,MgSO40.1-0.7g,CaCO30.5-5g,加水至1L,调pH为6.5-7.0,121℃灭菌20min,制成种子培养基。
5.根据权利要求4所述的一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,其特征是所述种子培养基制备为:按比例称取L-山梨糖20g,玉米浆3g,牛肉膏3g,酵母浸粉3g,尿素1g,蛋白胨10g,KH2PO41g,MgSO40.2g,CaCO31g,加水至1L,调pH为6.8,121℃灭菌20min,制成种子培养基。
6.根据权利要求1所述的一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,其特征是所述发酵培养基制备为:按比例称取L-山梨糖40-120g,玉米浆10-50g,尿素10-25g,KH2PO40.5-3g,MgSO40.2-1.2g,CaCO30.5-5g加水至1L,调pH为6.5-7.5,121℃灭菌20min,制成发酵培养基。
7.根据权利要求6所述的一种强化两菌相互作用提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法,其特征是所述发酵培养基制备为:按比例称取L-山梨糖80g,玉米浆20g,尿素12g,KH2PO41g,MgSO40.5g,CaCO31g,加水至1L,调pH为7.0,121℃灭菌20min,制成发酵培养基。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011103156412A CN103045710A (zh) | 2011-10-17 | 2011-10-17 | 强化两菌相互作用提高2-酮基-l-古龙酸产量的方法 |
PCT/CN2012/076310 WO2012174978A1 (zh) | 2011-06-20 | 2012-05-31 | 维生素c二步混菌发酵的菌种改造和过程优化 |
DE112012002557.1T DE112012002557B4 (de) | 2011-06-20 | 2012-05-31 | Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-Gulonsäure |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011103156412A CN103045710A (zh) | 2011-10-17 | 2011-10-17 | 强化两菌相互作用提高2-酮基-l-古龙酸产量的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103045710A true CN103045710A (zh) | 2013-04-17 |
Family
ID=48058570
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2011103156412A Pending CN103045710A (zh) | 2011-06-20 | 2011-10-17 | 强化两菌相互作用提高2-酮基-l-古龙酸产量的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103045710A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105112488A (zh) * | 2015-10-22 | 2015-12-02 | 天津大学 | 2-酮-l-古龙酸的发酵生产方法 |
CN111537638A (zh) * | 2020-05-14 | 2020-08-14 | 上海应用技术大学 | 一种酵母抽提物挥发性成分的提取富集方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101603060A (zh) * | 2009-07-10 | 2009-12-16 | 天津大学 | 提高氧化葡糖杆菌产2-酮-l-古龙酸的方法 |
CN102174634A (zh) * | 2011-03-17 | 2011-09-07 | 天津大学 | 检测维生素c二步发酵中细胞内代谢物变化的方法 |
CN102352403A (zh) * | 2011-10-17 | 2012-02-15 | 天津大学 | 混菌进化传代培养提高2-酮基-l-古龙酸产量的方法 |
WO2012174978A1 (zh) * | 2011-06-20 | 2012-12-27 | 天津大学 | 维生素c二步混菌发酵的菌种改造和过程优化 |
-
2011
- 2011-10-17 CN CN2011103156412A patent/CN103045710A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101603060A (zh) * | 2009-07-10 | 2009-12-16 | 天津大学 | 提高氧化葡糖杆菌产2-酮-l-古龙酸的方法 |
CN102174634A (zh) * | 2011-03-17 | 2011-09-07 | 天津大学 | 检测维生素c二步发酵中细胞内代谢物变化的方法 |
WO2012174978A1 (zh) * | 2011-06-20 | 2012-12-27 | 天津大学 | 维生素c二步混菌发酵的菌种改造和过程优化 |
CN102352403A (zh) * | 2011-10-17 | 2012-02-15 | 天津大学 | 混菌进化传代培养提高2-酮基-l-古龙酸产量的方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
GAO Y. 等: "Comprehensive quality evaluation of corn steep liquor in 2-keto-L-gulonic acid fermentation", 《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》, vol. 59, no. 18, 28 September 2011 (2011-09-28), pages 9845 - 9853 * |
YUAN Y.J. 等: "Integrated proteomic and metabolomic analysis of an artificial microbial community for two-step production of vitamin C", 《PLOS ONE》, vol. 6, no. 10, 7 October 2011 (2011-10-07), pages 26108 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105112488A (zh) * | 2015-10-22 | 2015-12-02 | 天津大学 | 2-酮-l-古龙酸的发酵生产方法 |
CN111537638A (zh) * | 2020-05-14 | 2020-08-14 | 上海应用技术大学 | 一种酵母抽提物挥发性成分的提取富集方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102352403B (zh) | 混菌进化传代培养提高2-酮基-l-古龙酸产量的方法 | |
CN103320362B (zh) | 一株产谷氨酸脱羧酶的菌株及用其生产γ-氨基丁酸的方法 | |
CN101603060B (zh) | 提高氧化葡糖杆菌产2-酮-l-古龙酸的方法 | |
CN103451133A (zh) | 一种环状芽孢杆菌及其在制备阿魏酸脱羧酶中的应用 | |
CN104017853A (zh) | 一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法 | |
CN104830712A (zh) | 一种产高纯度2-酮基-d-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌株 | |
CN103695477B (zh) | 利用维生素c提高多粘类芽孢杆菌2,3-丁二醇产量的方法 | |
CN110093281B (zh) | 桑黄液体深层发酵培养工艺 | |
CN102465166A (zh) | 一种提高2-酮基-l-古龙酸发酵生产强度的方法 | |
CN103045710A (zh) | 强化两菌相互作用提高2-酮基-l-古龙酸产量的方法 | |
CN102816780A (zh) | 山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇abcden的组合基因 | |
CN105002229B (zh) | 一种制备γ-癸内酯的方法 | |
CN102465154A (zh) | 一种提高竹黄菌中竹红菌素产量的方法 | |
CN105087737B (zh) | 一种利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法与应用 | |
CN107739721A (zh) | 产琼胶降解酶的芽孢杆菌Bacillus sp.W2017及其应用 | |
CN103525727A (zh) | 一种应用静息细胞转化1,3-丙二醇为3-羟基丙酸的方法 | |
CN114107105B (zh) | 一种含有水果渣酶解液的发酵培养基及其应用 | |
CN110055231A (zh) | 一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法 | |
CN102605009B (zh) | 提高厌氧发酵产丁二酸强度和浓度的方法 | |
CN103060218B (zh) | 一种苯酚降解菌及其转化吲哚制备靛蓝的方法 | |
CN100389201C (zh) | 一种辅酶q10生产原料的加工方法 | |
CN101092613B (zh) | 从亚油酸异构酶产生菌中提取纯化亚油酸异构酶的方法 | |
CN102559780B (zh) | 用于海绵共生土曲霉发酵制备Terrein的培养基及其制备方法 | |
CN105274166B (zh) | 一种低聚半乳糖联产l-乳酸的方法 | |
CN103849661A (zh) | 一种天然香料γ-癸内酯的发酵方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130417 |