CN101603060B - 提高氧化葡糖杆菌产2-酮-l-古龙酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸的方法，步骤为：(1)种子培养：将斜面的氧化葡糖杆菌接种于种子培养基中，制成种子培养液；(2)发酵：将种子培养液接入发酵培养基中，摇床振荡，发酵培养48～96小时，在所述发酵培养0小时至36小时之间的任意时刻，加入巯基化合物，使巯基终浓度为0.1-30mM。本发明能提高氧化葡糖杆菌生长速度和产2-酮-L-古龙酸效率，达到部分取代伴生菌的伴生效果的目的，从而可以减少伴生菌巨大芽孢杆菌的用量，减少培养基的成本，并可以减少污染。

Description

提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，特别是涉及一种提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸的方法。
背景技术
维生素C是机体营养、生长所必需的一种微量水溶性维生素，在抗氧化和维持新陈代谢平衡等方面起着重要的作用。维生素C可以作为药品、保健品、食品添加剂及化妆品营养剂，它的应用范围在扩展，市场稳定。
目前，我国生产维生素C的方法为“二步发酵法”，第一步发酵使用黑醋杆菌将山梨醇转化为L-山梨糖，第二步发酵为混合发酵，将山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸。混合发酵所使用的混合菌系为巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌混菌发酵，其中，氧化葡糖杆菌为产酸菌，巨大芽孢杆菌为伴生菌，若不加入巨大芽孢杆菌而单独使用氧化葡糖杆菌时，生长极端缓慢，产酸效率低，当加入巨大芽孢杆菌，可使氧化葡糖杆菌生长速率提高，产酸量增加，但是，它的加入可造成发酵培养基中营养成分的浪费，使成本提高，同时，因其在发酵液中的浓度较高，因此，在处理混菌发酵液过程的成本也会大大增加，混菌代谢物成分复杂，后处理困难。对环境造成污染。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸的方法。
本发明的技术方案概述如下：
提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养：
称取：L-山梨糖10-50g，玉米浆2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g，蛋白胨2-10g，KH2PO40.5-5g，MgSO40.1-0.7g，CaCO30.5-5g，加水至1L，调pH为6.5～7.0，121℃灭菌20min，制成种子培养基；
将斜面的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC NO.1.110接种于所述种子培养基中，28-35℃，160-250r/min摇床振荡，培养24-48小时，制成种子培养液；
(2)发酵：
称取：L-山梨糖40-120g，玉米浆10-50g，尿素10-25g，KH2PO40.5-3g，MgSO40.2-1.2g，CaCO31-10g加水至1L，调pH为6.5-7.5，121℃灭菌20min，制成发酵培养基；
将所述种子培养液以体积比为5％-15％的比例，接入所述发酵培养基中，28-35℃，160-250r/min摇床振荡，发酵培养48-96小时，在所述发酵培养0小时至36小时之间的任意时刻，加入巯基化合物，使巯基终浓度为0.1-30mM。
所述巯基化合物为还原型谷胱甘肽，二硫苏糖醇，半胱氨酸或辅酶A。还可以选用其它的无毒的巯基化合物。
步骤(1)优选为：称取：L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，KH2PO41g，MgSO40.2g，CaCO31g加水至1L，调pH为6.8，121℃灭菌20min，制成种子培养基；
将斜面的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC NO.1.110接种于所述种子培养基中，30℃，220r/min摇床振荡，培养36小时，制成种子培养液。
步骤(2)优选为：称取：L-山梨糖80g，玉米浆20g，尿素12g，KH2PO41g，MgSO40.5g，CaCO35g加水至1L，调pH为7.0，121℃灭菌20min，制成发酵培养基；
将所述种子培养液以体积比为10％的比例，接入所述发酵培养基中，30℃，220r/min摇床振荡，发酵培养72小时，在所述发酵培养0小时至36小时之间的任意时刻，加入巯基化合物，使巯基终浓度为3mM。
本发明能明显提高氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC NO.1.110的生长速度和产2-酮-L-古龙酸效率，达到部分取代伴生菌的伴生效果的目的。从而可以减少伴生菌巨大芽孢杆菌的用量，减少培养基的成本，并可以减少巨大芽孢杆菌的菌体，芽孢和代谢物对环境的污染。
本发明揭示了在添加巯基化合物的氧化葡糖杆菌单独培养时，能明显提高生长速度和产2-酮-L-古龙酸效率，达到部分取代伴生菌的目的。针对这一状况，本发明为今后揭示混菌发酵的作用机制提供了一定的提示作用。
附图说明
图1为巯基化合物对氧化葡糖杆菌产酸能力的影响，图例：■：未加入巯基化合物；●：加入GSH 1.0mg/ml；▲：加入DTT 0.5mg/ml；X：加入cys 0.4mg/ml；□：加入CoA2.5mg/ml。
图2为巯基化合物对菌体生物量的影响，图例：■：未加入巯基化合物；●：加入GSH1.0mg/ml；▲：加入DTT 0.5mg/ml；X：加入cys 0.4mg/ml；□：加入CoA2.5mg/ml。
图3为不同浓度GSH对氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸能力的影响。
图4为不同浓度GSH对氧化葡糖杆菌生物量的影响。
图5为1.0mg/ml的GSH对不同起始浓度的氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸能力的影响，图例：■：加入体积比为10％，未加入GSH；●：加入体积比为1％，加入1.0mg/ml GSH；▲：加入体积比为10％，加入1.0mg/ml GSH；X：加入体积比为100％，加入1.0mg/ml GSH。
图6为1.0mg/ml的GSH对不同起始浓度的氧化葡糖杆菌生物量的影响，图例：■：加入体积比为10％，未加入GSH；●：加入体积比为1％，加入1.0mg/ml GSH；▲：加入体积比为10％，加入1.0mg/ml GSH；X：加入体积比为100％，加入1.0mg/ml GSH。
图7不同时间加入1.0mg/ml GSH对氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸能力的影响。图例：■：未加入GSH；●：加入时间为0h；▲：加入时间为3h；X：加入时间为6h；□：加入时间为12h；○：加入时间为24h；△：加入时间为36h。
图8不同时间加入1.0mg/ml GSH对氧化葡糖杆菌生物量的影响。图例：■：未加入GSH；●：加入时间为0h；▲：加入时间为3h；X：加入时间为6h；□：加入时间为12h；○：加入时间为24h；△：加入时间为36h。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明所使用的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)从中国普通微生物菌种保藏管理中心购得，保藏编号为CGMCC NO.1.110。
实施例1
提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养：
称取：L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，KH2PO41g，MgSO40.2g，CaCO31g加水至1L，调pH为6.8，121℃灭菌20min，制成种子培养基；
将斜面的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC NO.1.110接种于所述种子培养基中，30℃，220r/min摇床振荡，培养36小时，制成种子培养液；
(2)发酵：
称取：L-山梨糖80g，玉米浆20g，尿素12g，KH2PO41g，MgSO40.5g，CaCO35g加水至1L，调pH为7.0，121℃灭菌20min，制成发酵培养基；
将所述种子培养液以体积比为10％的比例，接入所述发酵培养基中，30℃，220r/min摇床振荡，发酵培养72小时，在所述发酵培养0小时，加入还原型谷胱甘肽，使其浓度为1mg/ml，使巯基终浓度为3mM。
可以用发酵培养1小时，发酵培养2小时，发酵培养5小时，发酵培养10小时，发酵培养15小时，发酵培养18小时，发酵培养24小时，发酵培养30小时或发酵培养36小时替代本实施例的发酵培养0小时组成新的实施例。
实施例2
提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养：
称取：L-山梨糖10g，玉米浆2g，牛肉膏2g，酵母浸粉2g，尿素0.5g，蛋白胨2g，KH2PO40.5g，MgSO40.1g，CaCO30.5g加水至1L，调pH为7.0，121℃灭菌20min，制成种子培养基；
将斜面的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC NO.1.110接种于所述种子培养基中，28℃，160r/min摇床振荡，培养48小时，制成种子培养液；
(2)发酵：
称取：L-山梨糖40g，玉米浆10g，尿素10g，KH2PO40.5g，MgSO40.2g，CaCO31g加水至1L，调pH为7.5，121℃灭菌20min，制成发酵培养基；
将所述种子培养液以体积比为5％的比例，接入所述发酵培养基中，28℃，160r/min摇床振荡，发酵培养96小时，在所述发酵培养0小时，加入二硫苏糖醇，使巯基终浓度为0.1mM。
可以用发酵培养1小时，发酵培养2小时，发酵培养5小时，发酵培养10小时，发酵培养15小时，发酵培养18小时，发酵培养24小时，发酵培养30小时或发酵培养36小时替代本实施例的发酵培养0小时组成新的实施例。
实施例3
提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养：
称取：L-山梨糖50g，玉米浆10g，牛肉膏10g，酵母浸粉10g，尿素5g，蛋白胨10g，KH2PO45g，MgSO40.7g，CaCO35g加水至1L，调pH为6.5，121℃灭菌20min，制成种子培养基；
将斜面的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC NO.1.110接种于所述种子培养基中，35℃，250r/min摇床振荡，培养24小时，制成种子培养液；
(2)发酵：
称取：L-山梨糖120g，玉米浆50g，尿素25g，KH2PO43g，MgSO41.2g，CaCO310g加水至1L，调pH为6.5，121℃灭菌20min，制成发酵培养基；
将所述种子培养液以体积比为15％的比例，接入所述发酵培养基中，35℃，250r/min摇床振荡，发酵培养48小时，在所述发酵培养36小时，加入半胱氨酸，使巯基终浓度为30mM。
可以用发酵培养0小时，发酵培养1小时，发酵培养2小时，发酵培养5小时，发酵培养10小时，发酵培养15小时，发酵培养18小时，发酵培养24小时或发酵培养30小时替代本实施例的发酵培养36小时组成新的实施例。
实施例4
提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸的方法，包括如下步骤：
(1)种子培养：
称取：L-山梨糖30g，玉米浆4g，牛肉膏2g，酵母浸粉5g，尿素1.5g，蛋白胨7g，KH2PO41g，MgSO40.3g，CaCO32g加水至1L，调pH为6.7，121℃灭菌20min，制成种子培养基；
将斜面的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC NO.1.110接种于所述种子培养基中，30℃，200r/min摇床振荡，培养36小时，制成种子培养液；
(2)发酵：
称取：L-山梨糖60g，玉米浆30g，尿素15g，KH2PO41.5g，MgSO40.5g，CaCO35g加水至1L，调pH为6.8，121℃灭菌20min，制成发酵培养基；
将所述种子培养液以体积比为10％的比例，接入所述发酵培养基中，30℃，200r/min摇床振荡，发酵培养72小时，在所述发酵培养24小时，加入辅酶A，使巯基终浓度为5mM。
可以用在发酵培养0小时，发酵培养1小时，发酵培养2小时，发酵培养5小时，发酵培养10小时，发酵培养15小时，发酵培养18小时，发酵培养30小时或发酵培养36小时替代本实施例的发酵培养24小时组成新的实施例。
实施例5
2-酮基-L-古龙酸和L-山梨糖含量测定方法
采用高效液相色谱法(HPLC)。
样品制备：取培养不同时间的发酵液1mL于1.5mL离心管中，10000r/min转速离心3min，取上清100μL于1.5mL离心管中，并加入900μL流动相(5mM H2SO4)得到稀释十倍的样品。振荡混匀后，用0.22μm的纤维素微孔滤膜过滤样品，得到待测样品。
高效液相色谱条件：色谱柱：bio-rad HPX-87H，流动相：5mM H2SO4，流速：0.6mL/min，柱温：65℃，示差检测器。
实施例6
还原型谷胱甘肽(GSH)，二硫苏糖醇(DTT)，半胱氨酸(cys)和辅酶A(CoA)提高氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC NO.1.110生长速度和产酸效率的测试。
以氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC NO.1.110为目标菌株，测定该菌株在有无巯基化合物添加的情况下的酸产量和生物量变化。
采用实施例1的方法进行种子培养和发酵，用0mg/mlGSH或1mg/mlGSH或0.5mg/mlDTT或0.4mg/ml cys或2.5mg/ml CoA替代实施例1中的1mg/mlGSH，使巯基终浓度为3mM时，进行测试。
测试结果如图1，图2所示，结果显示加入GSH后，发酵72小时后氧化葡糖杆菌发酵液中的2-酮基-古龙酸的浓度为37.75mg/ml，而空白组(未加巯基化合物)酸产量为11.25mg/ml，提高了2.276倍。发酵72小时后氧化葡糖杆菌的生物量为0.81mg/ml，相比于空白组的0.27mg/ml，提高了2倍。加入DTT后，发酵72小时后氧化葡糖杆菌发酵液中的2-酮基-古龙酸的浓度为36.52mg/ml，而空白组酸产2-酮基-古龙酸量为11.25mg/ml，提高了2.246倍。72小时后氧化葡糖杆菌的生物量为0.59mg/ml，相比于空白组的0.27mg/ml，提高了1.18倍。加入cys后，发酵72小时后氧化葡糖杆菌发酵液中的2-酮基-古龙酸的浓度为30.43mg/ml，而空白组酸产2-酮基-古龙酸量为11.25mg/ml，提高了1.704倍。72小时后氧化葡糖杆菌的生物量为0.56mg/ml，相比于空白组的0.27mg/ml，提高了1.078倍。加入CoA后，发酵72小时后氧化葡糖杆菌发酵液中的2-酮基-古龙酸的浓度为35.00mg/ml，而空白组酸产2-酮基-古龙酸量为11.25mg/ml，提高了2.211倍。72小时后氧化葡糖杆菌的生物量为0.87mg/ml，相比于空白组的0.27mg/ml，提高了2.22倍。上述结果表明巯基化合物加入后能大幅度的提高氧化葡糖杆菌的产酸能力和生长速度。
实施例7
加入不同浓度还原型谷胱甘肽(GSH)提高氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC NO.1.110生长速度和产2-酮基-古龙酸效率的测试。
以氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)CGMCC NO.1.110为目标菌株，测定该菌株在添加不同浓度的巯基化合物情况下的2-酮基-古龙酸产量和生物量变化。
采用实施例1的方法进行种子培养和发酵，用0mg/ml GSH，或0.1mg/ml GSH，或0.5mg/ml GSH，或0.8mg/ml GSH，或1.0mg/ml GSH，或2.0mg/ml GSH，或5.0mg/ml GSH替代实施例1中的1.0mg/ml GSH，进行测试。
以氧化葡糖杆菌为目标菌株，测定该菌株加入0.1，0.5，0.8，1.0，2.0，5.0mg/ml GSH后，2-酮基-古龙酸产量和生物量变化。如下图3所示，结果显示随着加入1mg/mlGSH的促进产2-酮基-古龙酸的效果最好，其余含量对氧化葡糖杆菌产2-酮基-古龙酸和生长的促进作用弱于加入1mg/mlGSH的促进效果，上述不同浓度的GSH加入后72小时2-酮基-古龙酸产量依次为18.5，20.13，43.52，48.67，52.35，42.11，34.65mg/ml。如图4所示的生物量提高的趋势与图3中产酸结果相吻合。上述不同浓度的GSH加入后72的生物量依次为0.27，0.27，0.71，0.75，0.81，0.76，0.65mg/ml。
实施例8
加入相同浓度的还原型谷胱甘肽(GSH)对不同接种浓度的氧化葡糖杆菌(CGMCCNO.1.110)提高生长速度和产2-酮基-古龙酸效率的测试。
以氧化葡糖杆菌为目标菌株，测定不同起始浓度的氧化葡糖杆菌产2-酮基-古龙酸能力的影响。
采用实施例1的方法进行种子培养和发酵培养基的制备，接下来：
第一种情况：将所述种子培养液以体积比为10％的比例，接入所述发酵培养基中，30℃，220r/min摇床振荡，发酵培养72小时。
第二种情况：将所述种子培养液以体积比为1％的比例，接入所述发酵培养基中，30℃，220r/min摇床振荡，发酵培养72小时，在所述发酵培养0小时，加入还原型谷胱甘肽1mg/ml，使巯基终浓度为3mM。
第三种情况：将所述种子培养液以体积比为10％的比例，接入所述发酵培养基中，30℃，220r/min摇床振荡，发酵培养72小时，在所述发酵培养0小时，加入还原型谷胱甘肽1mg/ml，使巯基终浓度为3mM。
第四种情况：将所述种子培养液以体积比为100％的比例，接入所述发酵培养基中，30℃，220r/min摇床振荡，发酵培养72小时，在所述发酵培养0小时，加入还原型谷胱甘肽1mg/ml，使巯基终浓度为3mM。
还原型谷胱甘肽(GSH)提高不同浓度氧化葡糖杆菌生长速度和产酸效率的测试。测定1.0mg/ml GSH的对初始菌体浓度不同的的氧化葡糖杆菌的产酸能力和生物量的影响。结果如图5表明，对不同初始浓度的氧化葡糖杆菌，GSH均有促进其产2-酮基-古龙酸的作用，且最终2-酮基-古龙酸产量与初始浓度呈正相关。图6中的生物量变化趋势也表明GSH能够促进各起始浓度的氧化葡糖杆菌生长，其中生物量与初始浓度正相关。
实施例9
在不同发酵时刻加入相同浓度还原型谷胱甘肽(GSH)提高氧化葡糖杆菌CGMCCNO.1.110产2-酮基-古龙酸效率和生长速度的测试。
以氧化葡糖杆菌为目标菌株，测定在不同发酵时刻加入相同浓度还原型谷胱甘肽对氧化葡糖杆菌产酸能力的影响。
采用实施例1的方法进行种子培养和发酵，用未加入GSH或发酵时刻0小时，3小时，6小时，12小时，24小时，36小时替代实施例1中的0时刻加入，进行测试。
测定该菌株以0，3，6，12，24，36小时加入1mg/ml GSH后，2-酮基-古龙酸产量和生物量变化。如图7所示，结果显示随着加入GSH的时间的延长，其对氧化葡糖杆菌产2-酮基-古龙酸和生长的的促进作用依次减弱，24小时加入后对产酸和生长的促进作用几乎消失，不加入GSH和0，3，6，12，24，36小时加入1.0mg/ml GSH的72小时时2-酮基-古龙酸产量依次为11.25，49.48，41.69，36.92，35.05，10.15，10.14mg/ml。图8表明氧化葡糖杆菌的生物量也呈现与产2-酮基-古龙酸量相同的趋势。不加入GSH和0，3，6，12，24，36小时加入1.0mg/ml GSH的72小时时生物量依次为0.27，0.81，0.68，0.56，0.52，0.32，0.32mg/ml。

Claims (4)

1.提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)种子培养：
称取：L-山梨糖10-50g，玉米浆2-10g，牛肉膏2-10g，酵母浸粉2-10g，尿素0.5-5g，蛋白胨2-10g，KH2PO40.5-5g，MgSO40.1-0.7g，CaCO30.5-5g，加水至1L，调pH为6.5～7.0，121℃灭菌20min，制成种子培养基；
将斜面的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC NO.1.110接种于所述种子培养基中，28-35℃，160-250r/min摇床振荡，培养24-48小时，制成种子培养液；
(2)发酵：
称取：L-山梨糖40-120g，玉米浆10-50g，尿素10-25g，KH2PO40.5-3g，MgSO40.2-1.2g，CaCO31-10g加水至1L，调pH为6.5～7.5，121℃灭菌20min，制成发酵培养基；
将所述种子培养液以体积比为5％-15％的比例，接入所述发酵培养基中，28-35℃，160-250r/min摇床振荡，发酵培养48～96小时，在所述发酵培养0小时至36小时之间的任意时刻，加入巯基化合物，使巯基终浓度为0.1-30mM。
2.根据权利要求1所述的提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸的方法，其特征是所述巯基化合物为还原型谷胱甘肽，二硫苏糖醇，半胱氨酸或辅酶A。
3.根据权利要求1所述的提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸的方法，其特征是所述步骤(1)为：称取：L-山梨糖20g，玉米浆3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素1g，蛋白胨10g，KH2PO41g，MgSO40.2g，CaCO31g加水至1L，调pH为6.8，121℃灭菌20min，制成种子培养基；
将斜面的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC NO.1.110接种于所述种子培养基中，30℃，220r/min摇床振荡，培养36小时，制成种子培养液。
4.根据权利要求1所述的提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸的方法，其特征是所述步骤(2)为：称取：L-山梨糖80g，玉米浆20g，尿素12g，KH2PO41g，MgSO40.5g，CaCO35g加水至1L，调pH为7.0，121℃灭菌20min，制成发酵培养基；
将所述种子培养液以体积比为10％的比例，接入所述发酵培养基中，30℃，220r/min摇床振荡，发酵培养72小时，在所述发酵培养0小时至36小时之间的任意时刻，加入巯基化合物，使巯基终浓度为3mM。
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