CN102321698A - 一种促进酮古龙酸菌生长和产酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种促进酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)生长和产酸的方法。通过在酮古龙酸菌培养基中添加营养因子硫辛酸，能够提高酮古龙酸菌的生长速度和产酸能力，从而达到用单菌发酵的方法实现糖酸转化的目的，简化了维生素C的发酵工艺。

Description

一种促进酮古龙酸菌生长和产酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程领域，具体地说，涉及一种通过添加外源营养因子硫辛酸促进酮古龙酸菌生长和产酸的方法。

背景技术

维生素C(vatamin C，VC)是一种水溶性维生素，又名L一抗坏血酸(L-ascorbic acid)，能参与体内多种羟化反应和氧化还原反应，是一类重要的细胞代谢氧化还原化合物，在人体中起着必不可少的生理作用，在医药、食品、饲料、化妆品等诸多领域具有重要而广泛的用途。随着人们生活水平的提高和对VC的需求不断增加，促进了对其生产工艺的研究改进，生物发酵法是工业生产VC的发展方向。

我国VC混合菌发酵法生产工艺处于国际领先地位。该方法的第一步是在生黑醋酸杆菌作用下将D一山梨醇氧化为L-山梨糖，俗称醇糖转化；第二步是在一种混合菌系的作用下将L-山梨糖进一步氧化为2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonicacid，KGA)，俗称糖酸转化，KGA是VC的前体。上述混合菌系包括2种微生物，直接负责山梨糖生物氧化的微生物是普通酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)，俗称小菌。另一种微生物俗称大菌，本身不能转化山梨糖，作为伴生菌起到辅助小菌生长和产酸的作用，生产中常用的有腊状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)等。目前VC生产普遍采用我国首创的混合菌发酵法，小菌为产酸菌，但单独培养生长缓慢，传代困难，且产酸能力很弱，大菌与小菌混合培养可促进小菌其生长及产酸，但大小菌的混菌发酵给工艺控制增加了难度，造成发酵培养基营养成分和能源的浪费，增加了环境污染，提高了生产成本。

通过单菌发酵实现糖酸转化一直是VC发酵工艺追求的目标。如果能够解决小菌单独生长的问题，完全可以直接利用小菌进行单菌发酵。本发明通过对酮古龙酸菌基因组进行生物信息学分析发现，酮古龙酸菌的硫辛酸的合成代谢途径中酶不完整，提示酮古龙酸菌自身不能合成这个营养因子，需要从外界摄取。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高酮古龙酸菌的生长和产酸速度的方法，实现直接利用小菌进行单菌发酵生产VC的目的，简化了VC发酵工艺。

为实现上述目的，本发明将硫辛酸应用到酮古龙酸菌的发酵中，可用于VC发酵。硫辛酸是细菌生长所需B族维生素，作为辅酶或辅基的组成成分，是一种酰基载体，在α-酮酸氧化作用和脱羧作用时行使偶联酰基转移和电子转移的功能，在物质代谢中起重要作用。目前国际上用于VC工业生产使用的酮古龙酸菌均来源于同一祖先菌株，表现为单独生长不良，需要和大菌共培养，从酮古龙酸菌基因组分析，酮古龙酸菌的硫辛酸合成代谢途径不全，因而在培养基中补充这种营养因子将有利于提高酮古龙酸菌的生长和产酸。

本发明方法可以用含有外源营养因子硫辛酸的HJY基础培养基发酵培养酮古龙酸菌，和/或在酮古龙酸菌发酵培养的过程中向培养基中添加外源营养因子硫辛酸，并控制发酵条件和时间在一定范围内。

其中，酮古龙酸菌HJY基础培养基中硫辛酸的终浓度优选为0.01～5.12mg/L，更优选0.64mg/L。本发明的实施例结果表明，当基础培养基中的营养因子硫辛酸终浓度为0.64mg/L时，能够显著提高酮古龙酸菌的生长和产酸速度。

上述发酵条件优选以酮古龙酸菌Y25为发酵生产菌株，28～32℃，150～250r/min振荡培养，优选30℃、200r/min振荡培养。

1L HJY基础培养基的配方为15g山梨糖，3g酵母膏，3g玉米浆，15g蛋白胨，4g尿素，2g葡萄糖，0.2g MgSO₄·12H₂O，4g CaCO₃，5g KH₂PO₄，加dH₂O至1L，pH6.8，110℃高压灭菌25min。

本发明的优选酮古龙酸菌的发酵周期为50～70小时，其生长和产酸的时间均在此范围内，发酵周期优选60小时。

通过检测酮古龙酸菌Y25生长60小时后菌液的OD₆₀₀、菌体干重和产酸量来测定营养因子对酮古龙酸菌生长和产酸的促进效果。

本发明提供的方法在生物发酵法生产VC产业领域具有创新性和很强的实用性，对目前的大小菌混合发酵生成VC法具有很好的改进作用。本发明具有以下优点：(1)在没有大菌伴生的情况下，提高了小菌的生长速度和产酸速度。(2)简化VC生产工艺，且工艺可控。(3)降低能源消耗，节约成本。(4)减少排放，有利于环保。本发明提供的方法可以用于目前发酵法生产VC工业的推广应用。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

1.菌株和质粒酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)Y25和腊样芽孢杆菌L26购自石药维生公司。

2.培养基HJY基础培养基(1L)：15g山梨糖，3g酵母膏，3g玉米浆，15g蛋白胨，4g尿素，2g葡萄糖，0.2g MgSO₄·12H₂O，4g CaCO₃，5g KH₂PO₄，加dH₂O至1L，pH6.8，110℃高压灭菌25min。

3.主要试剂硫辛酸(lipoic acid)购于SIGMA公司。

4.主要溶液硫辛酸溶液：浓度均为0.1mg/mL，蒸馏水溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃存放。

5.硫辛酸对小菌生长的影响

挑取小菌单菌落于5mL HJY培养基，30℃，200r/min培养72h活化，按1％的接种量转接入新鲜的5mL HJY基础培养基中。加入不同量的硫辛酸溶液至终浓度依次为0.00mg/L、0.01mg/L、0.02mg/L、0.04mg/L、0.08mg/L、0.16mg/L、0.32mg/L、0.64mg/L、1.28mg/L、2.56mg/L、5.12mg/L。以未接小菌菌液的HJY基础培养基作为空白对照，以硫辛酸终浓度为0.00mg/L样品作为阴性对照，以按0.2％的接种量接入新鲜的大菌腊样芽孢杆菌L26菌液的样品为阳性对照。每个样品设2个重复，30℃，200r/min培养60h。测定菌液OD₆₀₀吸光值，另外12000rpm离心5min收集3mL菌液菌体，37℃恒温干燥72小时，称量菌体干重。OD₆₀₀和菌体干重反映小菌生长情况(表1)。碘量法滴定测定小菌产酸量来评价小菌产酸情况(表1)。

表1硫辛酸对小菌生长和产酸的促进作用

注：HJY为基础培养基。

表1反映了硫辛酸对小菌生长和产酸的促进作用。由表1菌液OD₆₀₀、菌体干重和产酸测定值可知：与阴性对照相比，在HJY基础培养基中添加不同浓度的硫辛酸可以大幅提高小菌的生长速度和产酸能力。当硫辛酸添加浓度为0.64mg/L时，OD₆₀₀值提高了21.5％，菌体干重值提高了105.94％(扣除空白)，产酸值提高了56.4％；与阳性对照相比，添加硫辛酸后，小菌菌体干重和产酸值效果接近甚至产酸的浓度更高一些，说明硫辛酸对酮古龙酸菌的生长和产酸有促进作用。

Claims (8)

1.硫辛酸在酮古龙酸菌发酵中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述发酵为VC发酵。

3.一种促进酮古龙酸菌生长和产酸的方法，其特征在于，用含有外源营养因子硫辛酸的HJY基础培养基发酵培养酮古龙酸菌，和/或在酮古龙酸菌发酵培养的过程中向基础培养基中添加外源营养因子硫辛酸，控制其生长和产酸的时间。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，HJY基础培养基中硫辛酸的终浓度为0.01～5.12mg/L。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，HJY基础培养基中硫辛酸的终浓度为0.64mg/L。

6.如权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，发酵条件为28～32℃、150～250r/min振荡培养。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，酮古龙酸菌的发酵周期为50～70小时，控制其生长和产酸的时间在此范围内。

8.如权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，1L HJY基础培养基的配方为15g山梨糖，3g酵母膏，3g玉米浆，15g蛋白胨，4g尿素，2g葡萄糖，0.2g MgSO₄·12H₂O，4g CaCO₃，5g KH₂PO₄，加dH₂O至1L，pH6.8，110℃高压灭菌25min。