CN101402988A - 一种添加金属离子促进2-酮基-l-古龙酸高效合成的方法 - Google Patents

Abstract

一种添加金属离子促进2－酮基－L－古龙酸高效合成的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明采用在氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)生产2－KLG的发酵过程中添加适量的金属离子的方法，促进菌体生长以及产酸，达到高效合成2－KLG的目的。在发酵过程中，在培养基中添加Fe³⁺，可使2－KLG积累量达到32.9g/l，菌体浓度达到1.3g/l；在培养基中添加Mg²⁺，可使2－KLG积累量达到37.5g/l，菌体浓度达到4.5g/l；在培养基中添加Mn²⁺，可使2－KLG积累量达到44.0g/l，菌体浓度达到3.1g/l；在培养基中同时添加Fe³⁺、Mg²⁺和Mn²⁺，可使2－KLG积累量达到65.1g/l，菌体浓度达到2.9g/l。利用此方法生产的2－KLG可作为生产维生素C的前体应用于医疗保健领域。

Description

一种添加金属离子促进2-酮基-L-古龙酸高效合成的方法

技术领域

本发明涉及一种添加金属离子促进2-酮基-L-古龙酸(简写为2-KLG)高效合成的方法。通过研究金属离子对G.oxydans L-山梨酮途径中关键酶的影响，达到高效合成2-KLG的目的。属于微生物发酵技术领域。

背景技术

2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)是生产维生素C(Vitamin C，Vc)的重要前体，维生素C是人体必需的营养元素之一，不仅作为重要的医药产品用于多种疾病的治疗，也广泛用于食品、饲料及化妆品中。由国内学者开发的维生素C“二步工艺”是目前维生素C生产方法中应用最广和最具吸引力的工艺，其实质是采用G.oxydans和B.megaterium为生产菌株，催化L-山梨糖为2-KLG。在这一过程中，L-山梨糖脱氢酶(SDH)和L-山梨酮脱氢酶(SNDH)是催化这一转化的关键酶。一定浓度的Fe³⁺、Mg²⁺和Ca²⁺能分别有效提高SDH和SNDH的活性，但Cu²⁺则抑制SNDH活性。培养基中过量的Cu²⁺导致发酵过程中B.megaterium自溶，从而影响G.oxydans发酵生产2-KLG的产量，而添加Mg²⁺和Mn²⁺则能有效抑制这一现象。

发明内容

本发明的目的是提供一种添加金属离子促进2-酮基-L-古龙酸高效合成的方法。利用氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)混合培养生产2-KLG在发酵过程中添加适量的Fe³⁺、Mg²⁺和Mn²⁺，促进菌体生长以及产酸，达到高效合成2-KLG的目的。

本发明的技术方案：一种添加金属离子促进2-酮基-L-古龙酸高效合成的方法，利用氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)为生产菌株，通过在培养基中添加适量的Fe³⁺、Mg²⁺和Mn²⁺中的一种或全部，促进菌体生长以及产酸，高效合成2-酮基-L-古龙酸。

在培养基中添加Fe³⁺至浓度为0.25mmol/L，可使2-KLG积累量达到32.9g/L，菌体浓度达到1.3g/L。

在培养基中添加Mg²⁺至浓度为8.3mmol/L，可使2-KLG积累量达到37.5g/L，菌体浓度达到4.5g/L。

在培养基中添加Mn²⁺至浓度为13.25mmol/L，可使2-KLG积累量达到44.0g/L，菌体浓度达到3.1g/L。

在培养基中同时添加Fe³⁺、Mg²⁺和Mn²⁺，至Fe³⁺浓度为0.21mmol/L、Mg²⁺浓度为4.23mmol/L和Mn²⁺浓度为9.98mmol/L，可使2-KLG积累量达到65.1g/L，菌体浓度达到2.9g/L。

1、菌种

Gluconobacter oxydans(俗称小菌)，Bacillus megaterium(俗称大菌)。

2、培养基

种液培养基：L-山梨糖2.0％(单独灭菌)、酵母膏0.3％、蛋白胨1.0％、牛肉膏0.3％、玉米浆0.15％、尿素0.1％、碳酸钙0.1％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.1％；pH 6.7，121℃灭菌15min。百分数为以g/100mL计，下同。

发酵培养基：L-山梨糖8.0％(单独灭菌)、玉米浆0.5％、尿素1.2％、碳酸钙0.5％、磷酸二氢钾0.1％；pH 7.0，121℃灭菌15min。

3、培养方法

G.oxydans种子培养：750mL三角瓶装液量75mL，吸取0.5mL甘油管菌悬液于三角瓶中，30℃、200r/min振荡培养32h。

B.megaterium种子培养：750mL三角瓶装液量75mL，吸取0.5mL甘油管菌悬液于三角瓶中，30℃、200r/min振荡培养8～9h。

发酵培养：750mL三角瓶装液量75mL，B.megaterium接种量5％(v/v)，30℃、200r/min振荡培养菌体至稳定期，接入G.oxydans种子培养液，接种量为5％(v/v)，继续培养72h。每个样品做3个平行样。

4、2-KLG浓度的测定：改进的碘量法。

取样品2mL于10mL比色管中，加入18mol/L H₂SO₄2mL，100℃条件下水浴30min，洗入500mL的三角瓶，加4～5滴0.1mol/L的淀粉溶液作为指示剂，用0.1mol/L的标准碘液滴定至蓝色为终点。2-KLG的含量(mg/mL)＝7.6916×耗碘量(mL)。

5、菌体干重测定

取10mL发酵液于50mL离心管中，10000r/min离心10min，倾去上清液，1mol/L盐酸洗涤沉淀1次，去离子水洗涤沉淀3次，60℃烘干至恒重后称重。

本发明的有益效果：利用本发明提高G.oxydans中SDH和SNDH的活性同时促进菌体生长，高效合成2-KLG，其中2-KLG的产量从26.9g/L提高到65.1g/L，菌体浓度由1.2g/L提高到2.9g/L。

具体实施方式

实施例1培养基中添加Fe³⁺促进菌体生长和产酸

当培养基中添加Fe³⁺浓度至0.25mmol/L时，2-KLG的产量达到32.9g/L，菌体浓度达到1.3g/L，继续增加Fe³⁺的浓度，2-KLG的产量会逐渐下降，菌体浓度保持不变。

实施例2培养基中添加Mg²⁺促进菌体生长和产酸

当培养基中添加Mg²⁺浓度至8.3mmol/L时，2-KLG的产量达到37.5g/L，菌体浓度达到4.5g/L，继续增加Mg²⁺的浓度，2-KLG的产量会逐渐下降，菌体浓度亦会逐渐下降。

实施例3培养基中添加Mn²⁺促进菌体生长和产酸

当培养基中添加Mn²⁺浓度至13.25mmol/L时，2-KLG的产量达到44.0g/L，菌体浓度达到3.1g/L，继续增加Mn²⁺的浓度，2-KLG的产量会逐渐下降，菌体浓度亦会逐渐下降。

实施例4多元二次方程模型寻找Fe³⁺、Mg²⁺和Mn²⁺的最佳组合

通过建立多元二次方程模型，得到上述三种金属元素的最佳浓度为Fe³⁺0.21mmol/L，Mg²⁺4.23mmol/L和Mn²⁺9.98mmol/L，预测2-KLG的产量为65.1g/L。

实施例5培养基中同时添加Fe³⁺、Mg²⁺和Mn²⁺促进菌体生长和产酸

在培养基中同时添加Fe³⁺、Mg²⁺和Mn²⁺的浓度分别为0.21mmol/L、4.23mmol/L和9.98mmol/L时，2-KLG的产量达到65.1g/L，菌体浓度达到2.9g/L。

Claims (5)

1、一种添加金属离子促进2-酮基-L-古龙酸高效合成的方法，其特征是利用氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)为生产菌株，通过在培养基中添加适量的Fe³⁺、Mg²⁺和Mn²⁺中的一种或全部，促进菌体生长以及产酸，高效合成2-酮基-L-古龙酸。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征是在培养基中添加Fe³⁺至浓度为0.25mmol/L，可使2-KLG积累量达到32.9g/L，菌体浓度达到1.3g/L。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征是在培养基中添加Mg²⁺至浓度为8.3mmol/L，可使2-KLG积累量达到37.5g/L，菌体浓度达到4.5g/L。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征是在培养基中添加Mn²⁺至浓度为13.25mmol/L，可使2-KLG积累量达到44.0g/L，菌体浓度达到3.1g/L。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征是在培养基中同时添加Fe³⁺、Mg²⁺和Mn²⁺，至Fe³⁺浓度为0.21mmol/L、Mg²⁺浓度为4.23mmol/L和Mn²⁺浓度为9.98mmol/L，可使2-KLG积累量达到65.1g/L，菌体浓度达到2.9g/L。