CN111909971A - 一种酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法 - Google Patents

一种酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法，包括以下步骤：比较与混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌发酵产酸相关的基因和与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关的基因，获得参与酸胁迫抑制混菌发酵产酸的关键基因，将获取的关键基因实施提取，随后再次投放至普通的氧化葡萄糖酸杆菌实施单独培养与混合培养同时进行，对获取的基因实施再次提取；本发明通过实验检测表明确定铁离子转运蛋白基因为酸胁迫诱导2‑KLG产量降低密切相关的关键基，且通过本发明的实验方法能够有效的提升铁离子转运蛋白基因为酸胁迫诱导2‑KLG产量降低密切相关的关键基的准确性，进而有力的提升了科学依据保证实验结果的准确性。

Description

一种酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法
技术领域
本发明涉及发酵培养技术领域，特别是涉及一种酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法。
背景技术
维生素C又称抗坏血酸是人体必需的一种维生素和抗氧化剂,我国自行开发并具有自主知识产权的维生素C两步发酵工艺，是目前唯一成功应用于维生素C工业生产的微生物转化法，而在对酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法对管件基因实施验证实验时还存在一定的技术缺陷让外界用户难以信服，故而满足不了现有技术所需。
发明内容
为实现上述目的，本发明采用的一个技术方案是：提供一种酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法，包括以下步骤：S1、首先，将普通的氧化葡萄糖酸杆菌分为两组并实施单独培养与混合培养双重进行，其中培养的时间均相同，S2、然后，将混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌在酸胁迫处理与未借助酸胁迫处理的情况下，利用表达谱芯片技术测定普通氧化葡萄糖酸杆菌在不同培养方式下的基因表达水平，S3、随后，将普通氧化葡萄糖酸杆菌混合培养时的基因表达水平与单独培养时比较，当显著增高以及降低，则鉴定这些基因与混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌发酵产酸密切相关，S4、然后，当酸胁迫处理后，混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌中基因的表达水平较未经处理时显著降低以及增高，则鉴定这些基因与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关，S5、最后，比较与混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌发酵产酸相关的基因和与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关的基因，获得参与酸胁迫抑制混菌发酵产酸的关键基因，将获取的关键基因实施提取，随后再次投放至普通的氧化葡萄糖酸杆菌实施单独培养与混合培养同时进行，对获取的基因实施再次提取。
其中，所述关键基因为铁离子转运基因。
其中，所述普通氧化葡萄糖酸杆菌发酵产酸相关的基因和与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关的基因所培养用的器皿为正四方体的透明玻璃器皿，且透明玻璃器皿体表温度为常温状态。
其中，所述关键基因的投放时间的间隔为每分钟零点一克。
其中，所述关键基因的投放量不大于七克。
其中，所述关键基因在投放时为分散式投放。
其中，所述关键基因的投放时长不大于一小时。
其中，所述普通氧化葡萄糖酸杆菌发酵产酸相关的基因和与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关的基因处于常温状态下的生存环境。
以上方案，通过实验检测表明确定铁离子转运蛋白基因为酸胁迫诱导2-KLG产量降低密切相关的关键基，且通过本发明的实验方法能够有效的提升铁离子转运蛋白基因为酸胁迫诱导2-KLG产量降低密切相关的关键基的准确性，进而有力的提升了科学依据保证实验结果的准确性增强了实验结果的可信度从而有效的弥补了现有技术中的不足。
具体实施方式
在下文中，将参考本发明的各种实施方式。然而，实施方式可以按各种形式实施，而不应被认为限制于本文中提及的结实施方式。而是，提供这些实施方式是为了使得本发明向本领域技术人员完整地传达本发明的保护范围。另外，为了避免混淆本公开的主题，可能没有详细描述或示出己知的功能或结构。
本实施例中，包括以下步骤：首先，将普通的氧化葡萄糖酸杆菌分为两组并实施单独培养与混合培养双重进行，其中培养的时间均相同，然后，将混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌在酸胁迫处理与未借助酸胁迫处理的情况下，利用表达谱芯片技术测定普通氧化葡萄糖酸杆菌在不同培养方式下的基因表达水平，随后，将普通氧化葡萄糖酸杆菌混合培养时的基因表达水平与单独培养时比较，当显著增高以及降低，则鉴定这些基因与混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌发酵产酸密切相关，然后，当酸胁迫处理后，混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌中基因的表达水平较未经处理时显著降低以及增高，则鉴定这些基因与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关，最后，比较与混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌发酵产酸相关的基因和与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关的基因，获得参与酸胁迫抑制混菌发酵产酸的关键基因，所述关键基因为铁离子转运基因，所述关键基因的投放时间的间隔为每分钟零点一克，所述关键基因的投放量不大于七克，所述关键基因在投放时为分散式投放，所述关键基因的投放时长不大于一小时，将获取的关键基因实施提取，随后再次投放至普通的氧化葡萄糖酸杆菌实施单独培养与混合培养同时进行，对获取的基因实施再次提取，所述普通氧化葡萄糖酸杆菌发酵产酸相关的基因和与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关的基因所培养用的器皿为正四方体的透明玻璃器皿，且透明玻璃器皿体表温度为常温状态，所述普通氧化葡萄糖酸杆菌发酵产酸相关的基因和与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关的基因处于常温状态下的生存环境；
本实施例中：菌株的选取为2-KLG发酵菌株为普通氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽胞杆菌组成的混合菌体系，培养基的选取为种子/斜面培养基(g.L-1)：L-山梨糖18，酵母膏2.5，蛋白胨8，牛肉膏2，玉米浆1，尿素0.5，碳酸钙0.5，硫酸镁0.1，磷酸二氢钾0.5，琼脂15(胁迫培养基)，用2mol.L-1NaOH溶液调起始pH为6.6～6.8，120℃灭菌15min，发酵培养基(g.L-1)：L-山梨糖82，玉米浆6,尿素13，碳酸钙6，硫酸镁0.2，磷酸二氢钾0.8，用2mol.L-1NaOH溶液调起始pH为6.6～6.8，120℃灭菌15min，菌株培养分为种子培养：从新鲜斜面上接一环菌入种子培养基(75ml/750ml锥形瓶)，在30℃、200r/min下巨大芽孢杆菌摇瓶培养7h，普通氧化葡萄糖酸杆菌摇瓶培养30h后，以10％接种量(体积分数)接入发酵培养基；摇瓶发酵培养：750ml锥形瓶中发酵培养基体积为75ml，温度30℃，转速200r/min，发酵至对数中期，收集细胞并用细菌保护液(Qiagen)处理后，保存于-80℃用于总RNA抽提；酸胁迫：收集上述混菌发酵和普通氧化葡萄糖酸杆菌单独发酵过程中培养至对数中期的细胞，分别加入2.8ml和0.6ml2mol/LHCl调节发酵液pH至3.8和4.0，胁迫2h，收集细胞并用细菌保护液(Qiagen)处理后，保存于-80℃用于总RNA抽提，总RNA抽提：细菌总RNA抽提按照RNAprotectBacteria Reagent AND RNeasy Mini Kit试剂盒(Qiagen)说明书进行，并用DNase I去除残留DNA，通过测定总RNA在260nm、230nm和280nm处的吸光值，进行定量及纯度检测，并用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳确认RNA的完整性；表达谱芯片分析：表达谱芯片由上海康成生物工程有限公司委托Agilent(Agilent，Santa Clara，CA，USA)依据普通氧化葡萄糖酸杆菌基因组全序列设计合成；芯片杂交：用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP标记mRNAs，委托上海康成生物工程有限公司完成；芯片扫描与数据分析：通过Agilent Scanner获取图像并在10μm条件下进行扫描像素值，图像使用Feature Extraction进行定量分析，得到图像定量和数据标准化处理数据；
本实施例中：在混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌细胞中共有45个膜转运蛋白基因表达量是普通氧化葡萄糖酸杆菌单独培养的2倍或2倍以上，其中包括9个氨基酸转运蛋白基因、13个广谱ABC转运蛋白基因、11个寡肽转运蛋白基因、5个二肽转运蛋白基因、4个硫转运蛋白基因、2个金属离子转运蛋白基因以及1个胆碱/肉毒碱/甜菜碱转运蛋白基因，由以上结果可知，较单独培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌，由巨大芽孢杆菌伴生的普通氧化葡萄糖酸杆菌细胞调动了丰富的转运蛋白基因，将各种营养物质运输至胞内，以弥补自身营养物质代谢的缺失，从而满足自身生长的需要，最终实现2-KLG的大量生产，这可能是巨大芽孢杆菌伴生的普通氧化葡萄糖酸杆菌细胞生长旺盛，而单独培养的普通生酮基古龙酸菌生长微弱的原因之一；
酸胁迫处理后混菌培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌细胞中膜转运蛋白基因表达差异酸胁迫后，在混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌细胞中有19个膜转运蛋白基因上调，其中包括7个氨基酸转运蛋白基因、7个广谱ABC转运蛋白基因、4个寡肽转运蛋白、6个铁离子转运蛋白、2个二肽转运蛋白基因、1个硫胺素转运蛋白基因及1个MscS转运蛋白基因，而在单独培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌中，酸胁迫后上调的膜转运蛋白有22个，其中包括7个氨基酸转运蛋白基因、7个广谱ABC转运蛋白基因、4个寡肽转运蛋白基因、1个金属离子转运蛋白基因、1个铁离子转运蛋白基因、2个二肽转运蛋白基因及1个MscS转运蛋白基因，其中ABCpeptide transporter，permease component、permease protein of ABC transporter(ypch01374)和putative ATP-binding ABC transporter protein(yliA)这三个转运蛋白基因在酸胁迫后的普通氧化葡萄糖酸杆菌细胞中(混菌培养和单独培养)表达量均上升，该结果说明，这三个转运蛋白很可能在普通氧化葡萄糖酸杆菌细胞抵御酸胁迫过程中发挥重要作用，此外，混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌较单独培养，共有15个膜转运蛋白基因下调，其中包括7个铁离子转运蛋白基因、4个广谱ABC转运蛋白、1个生物高聚物转运蛋白基因、1个质子转运蛋白基因和2个二肽透性酶转运蛋白基因，酸胁迫后，由巨大芽孢杆菌伴生的普通氧化葡萄糖酸杆菌细胞有16个膜转运蛋白基因下调，其中包括7个广谱ABC转运蛋白、5个氨基酸转运蛋白、1个铁离子转运蛋白、2个二肽/寡肽转运蛋白基因及1个ABC多药转运蛋白基因，由以上结果可知，酸胁迫对混菌培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌细胞的氨基酸转运蛋白具有显著的抑制作用，从而影响了普通氧化葡萄糖酸杆菌对氨基酸的利用，最终导致细胞生长的抑制及产酸的减少值得注意的是，普通氧化葡萄糖酸杆菌基因组共有20个铁离子转运蛋白基因，而巨大芽孢杆菌伴生后有7个铁离子转运蛋白基因下调，没有铁离子转运蛋白基因上调，这说明，在巨大芽孢杆菌伴生下的普通氧化葡萄糖酸杆菌生长和产酸似乎与铁离子负相关，酸胁迫后的基因芯片结果显示，有6个铁离子转运蛋白基因被诱导过量表达，其中有4个相同基因在混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌中下调，这再次表明，铁离子转运蛋白在巨大芽孢杆菌伴生促进普通氧化葡萄糖酸杆菌生长及产酸的过程中发挥反作用，且与酸胁迫诱导的普通氧化葡萄糖酸杆菌生长的抑制及产酸的减少密切相关在1m3发酵罐中进行，发酵初始培养基中铁离子浓度为1.59mg.L-1，分别添加终浓度为2.38(1.5倍)、3.18(2倍)和7.95mg.L-1(5倍)铁离子，发酵72h，结果表明，随着铁离子浓度的增加，2-KLG产率降低，2-KLG合成受到抑制。
在本发明所提供的几个实施方式中，应该理解到，所揭露的装置和方法，可以通过其它的方式实现。例如，以上所描述的装置实施方式仅仅是示意性的，例如，所述模块或单元的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式，例如多个单元或组件可以结合或者可以集成到另一个系统，或一些特征可以忽略，或不执行。另一点，所显示或讨论的相互之间的耦合或直接耦合或通信连接可以是通过一些接口，装置或单元的间接耦合或通信连接，可以是电性，机械或其它的形式。

Claims (8)

1.一种酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、首先，将普通的氧化葡萄糖酸杆菌分为两组并实施单独培养与混合培养双重进行，其中培养的时间均相同；
S2、然后，将混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌在酸胁迫处理与未借助酸胁迫处理的情况下，利用表达谱芯片技术测定普通氧化葡萄糖酸杆菌在不同培养方式下的基因表达水平；
S3、随后，将普通氧化葡萄糖酸杆菌混合培养时的基因表达水平与单独培养时比较，当显著增高以及降低，则鉴定这些基因与混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌发酵产酸密切相关；
S4、然后，当酸胁迫处理后，混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌中基因的表达水平较未经处理时显著降低以及增高，则鉴定这些基因与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关；
S5、最后，比较与混合培养的普通氧化葡萄糖酸杆菌发酵产酸相关的基因和与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关的基因，获得参与酸胁迫抑制混菌发酵产酸的关键基因，将获取的关键基因实施提取，随后再次投放至普通的氧化葡萄糖酸杆菌实施单独培养与混合培养同时进行，对获取的基因实施再次提取。
2.根据权利要求1所述的一种酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法，其特征在于，所述关键基因为铁离子转运基因。
3.根据权利要求1所述的一种酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法，其特征在于，所述普通氧化葡萄糖酸杆菌发酵产酸相关的基因和与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关的基因所培养用的器皿为正四方体的透明玻璃器皿，且透明玻璃器皿体表温度为常温状态。
4.根据权利要求1所述的一种酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法，其特征在于，所述关键基因的投放时间的间隔为每分钟零点一克。
5.根据权利要求1所述的一种酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法，其特征在于，所述关键基因的投放量不大于七克。
6.根据权利要求1所述的一种酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法，其特征在于，所述关键基因在投放时为分散式投放。
7.根据权利要求1所述的一种酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法，其特征在于，所述关键基因的投放时长不大于一小时。
8.根据权利要求1所述的一种酸胁迫减弱发酵产酸能力基因的混合发酵培养方法，其特征在于，所述普通氧化葡萄糖酸杆菌发酵产酸相关的基因和与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关的基因处于常温状态下的生存环境。
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