CN102286614B - 调控酸胁迫抑制维生素c发酵菌株产酸的基因 - Google Patents

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调控酸胁迫抑制维生素C发酵菌株产酸的基因，属于发酵制备维生素C的基础研究及生物工程技术领域。确定生产菌株中调控酸胁迫诱导2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)产量降低的关键基因有助于制定出针对性强的代谢工程策略。本发明利用表达谱芯片技术分析了维生素C混菌发酵体系中产酸菌的基因表达情况，尤其是膜转运蛋白基因。与单独培养相比，混菌培养的普通生酮基古龙酸菌中共有45个膜转运蛋白基因上调，15个膜转运蛋白基因下调。值得注意的是，这其中有7个铁离子转运蛋白基因被抑制表达。酸胁迫后，铁离子转运蛋白基因却过量表达。发酵时添加铁离子抑制混菌发酵产酸。以上结果表明，铁离子转运蛋白在酸胁迫诱导混菌发酵生产2-KLG产量降低的过程中发挥反作用。

Description

调控酸胁迫抑制维生素C发酵菌株产酸的基因
技术领域
本发明属于发酵制备维生素C的基础研究及生物工程技术领域，涉及酸胁迫过程中发酵菌株细胞内调控维生素C产量降低的关键基因。
背景技术
维生素C，又称抗坏血酸，是人体必需的一种维生素和抗氧化剂。
我国自行开发并具有自主知识产权的维生素C两步发酵工艺，是目前唯一成功应用于维生素C工业生产的微生物转化法。维生素C的“二步发酵”工艺如下：第一步是将D-山梨醇氧化为L-山梨糖，俗称醇糖转化，第二步是将L-山梨糖进一步氧化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)，俗称糖酸转化。其中第二步是在由普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare，俗称小菌)和巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium，俗称大菌)组成的混合菌系的作用下完成的：普通生酮基古龙酸菌为产酸菌，负责将L-山梨糖转变为2-KLG，其单独培养时生长微弱，产酸较少；巨大芽孢杆菌为伴生菌，不直接参与L-山梨糖向2-KLG的转化，但能在混菌体系中显著促进普通生酮基古龙酸菌生长和2-KLG的积累。
酸胁迫是二步发酵法生产维生素C过程中经常遭遇的逆境条件，影响维生素C产量的稳定性。维生素C的混菌发酵过程的最适pH为6.7～7.0，在实际生产中，为了维持培养液中pH处于该最适pH范围内，通常在培养液中流加一定的中和剂，如NaOH、CaCO3等。然而，中和剂的流加一方面导致发酵液中渗透压升高，使微生物遭遇高渗胁迫；另一方面引入的Na+等金属离子增加后续提取工艺的复杂度和成本。由此看来，若能够提高发酵菌株对低pH的耐受力，从而实现发酵菌株在较低pH环境下发酵产酸，是具有重要的实际意义的。代谢工程技术是目前获得具有理想性状工业微生物的重要手段。然而，不了解微生物对逆境条件的响应机制，就不能制定出合理有针对性的代谢工程策略。因此，确定生产菌株中调控酸胁迫诱导2-KLG产量降低的关键基因是首先要解决的关键问题。
发明内容
本发明提供了一种检测混合培养微生物基因表达水平的方法，该方法不需要混合培养的微生物的分离纯化。该方法利用基因芯片技术实现混合培养微生物的基因表达水平的特异性检测，其中目的微生物特异的表达谱芯片通过利用目的微生物基因组序列设计的特异性探针制成。该方法包括将经特定条件处理和未经处理的混合培养的微生物进行总RNA的抽提纯化，反转录成cDNA并进行荧光标记后，与目的微生物的表达谱芯片进行杂交，最后根据不同处理的微生物样本的杂交信号的强弱即可获得目的微生物中受处理条件影响的基因表达水平的变化差异。
本发明提供了一种用于筛选混合发酵培养的目的微生物中涉及环境因子减弱其发酵能力的基因的方法，以及提供了通过该方法获得的关键基因。本发明中目的微生物单独培养发酵产酸能力微弱，但混合培养发酵产酸能力旺盛。该方法包括在目的微生物单独培养与混合培养，以及混合培养的微生物经环境因子处理和未经处理的情况下，测定目的微生物在不同培养条件下的基因表达水平。目的微生物混合培养时基因表达水平较单独培养时显著地增高或者降低，则鉴定这些基因与混合培养的目的微生物发酵产酸密切相关。若在环境因子处理后混合培养的目的微生物中这些基因的表达水平较未经处理时显著降低或者增高，则鉴定这些基因与环境因子减弱混菌发酵产酸密切相关。比较与混合培养的目的微生物发酵产酸密切相关的基因和与环境因子减弱混菌发酵产酸密切相关的基因，获得参与环境因子抑制混菌发酵产酸的关键基因。基因的表达水平利用表达谱芯片技术测定。
本发明涉及膜转运蛋白基因的在酸胁迫处理前后的表达差异，与酸胁迫诱导2-KLG产量降低密切相关的关键基因为铁离子转运蛋白基因。本发明人实验室已经完成了普通生酮基古龙酸菌的全基因组测序以及基因组注释工作，结果表明普通生酮基古龙酸菌的膜转运系统异常发达：该菌基因组共有3060个基因，其中膜转运蛋白基因有361个，占总基因组的11％。另外，通过基因组测序结果发现，普通生酮基古龙酸菌缺失部分营养代谢途径，如糖酵解、氨基酸和维生素代谢途径。而转运蛋白具有转运离子、氨基酸、核苷酸、多糖、多肽、甚至蛋白质的生理功能。亦有许多研究表明，各种膜转运蛋白亦是微生物抵御各种胁迫的重要组分。本发明中确定与酸胁迫诱导2-KLG产量降低密切相关的关键基因为铁离子转运蛋白基因。
具体实施方式
1.菌株
本专利所用2-KLG发酵菌株为普通生酮基古龙酸菌(Ketoguloncigenium vulgare)和巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)组成的混合菌体系。
2.培养基
种子/斜面培养基(g.L-1)：L-山梨糖20，酵母膏3，蛋白胨10，牛肉膏3，玉米浆1.5，尿素1，碳酸钙1，硫酸镁0.2，磷酸二氢钾1，琼脂20(胁迫培养基)。用2mol.L-1NaOH溶液调起始pH为6.7～7.0，121℃灭菌15min。
发酵培养基(g.L-1)：L-山梨糖80，玉米浆5，尿素12，碳酸钙5，硫酸镁0.1，磷酸二氢钾1。用2mol.L-1NaOH溶液调起始pH为6.7～7.0，121℃灭菌15min。
3.菌株培养
(1)种子培养
从新鲜斜面上接一环菌入种子培养基(75ml/750ml锥形瓶)，在30℃、200r/min下巨大芽孢杆菌摇瓶培养8h，普通生酮基古龙酸菌摇瓶培养32h后，以10％接种量(体积分数)接入发酵培养基。
(2)摇瓶发酵培养
750ml锥形瓶中发酵培养基体积为75ml，温度30℃，转速200r/min，发酵至对数中期，收集细胞并用细菌保护液(Qiagen)处理后，保存于-80℃用于总RNA抽提。
(3)酸胁迫
收集上述混菌发酵和普通生酮基古龙酸菌单独发酵过程中培养至对数中期的细胞，分别加入2.8ml和0.6ml2mol/L HCl调节发酵液pH至4.0和4.5，胁迫2h，收集细胞并用细菌保护液(Qiagen)处理后，保存于-80℃用于总RNA抽提。
4.总RNA抽提
细菌总RNA抽提按照RNAprotect Bacteria Reagent AND RNeasy Mini Kit试剂盒(Qiagen)说明书进行，并用DNase I去除残留DNA。通过测定总RNA在260nm、230nm和280nm处的吸光值，进行定量及纯度检测，并用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳确认RNA的完整性。
5.表达谱芯片分析
(1)芯片合成
表达谱芯片由上海康成生物工程有限公司委托Agilent(Agilent，Santa Clara，CA，USA)依据普通生酮基古龙酸菌基因组全序列设计合成。
(2)芯片杂交
用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP标记mRNAs，委托上海康成生物工程有限公司完成。
(3)芯片扫描与数据分析
通过Agilent Scanner获取图像并在10μm条件下进行扫描像素值。图像使用FeatureExtraction进行定量分析，得到图像定量和数据标准化处理数据。
实施例1在混合培养和单独培养的普通生酮基古龙酸菌中膜转运蛋白基因的表达差异
表1混菌培养和单独培养的普通生酮基古龙酸菌中膜转运蛋白基因的表达差异
Figure GSB00001087529800031
Figure GSB00001087529800041
Figure GSB00001087529800051
如表1所示，在混合培养的普通生酮基古龙酸菌细胞中共有45个膜转运蛋白基因表达量是普通生酮基古龙酸菌单独培养的2倍或2倍以上，其中包括9个氨基酸转运蛋白基因、13个广谱ABC转运蛋白基因、11个寡肽转运蛋白基因、5个二肽转运蛋白基因、4个硫转运蛋白基因、2个金属离子转运蛋白基因以及1个胆碱/肉毒碱/甜菜碱转运蛋白基因(表2)。由以上结果可知，较单独培养的普通生酮基古龙酸菌，由巨大芽孢杆菌伴生的普通生酮基古龙酸菌细胞调动了丰富的转运蛋白基因，将各种营养物质运输至胞内，以弥补自身营养物质代谢的缺失，从而满足自身生长的需要，最终实现2-KLG的大量生产。这可能是巨大芽孢杆菌伴生的普通生酮基古龙酸菌细胞生长旺盛，而单独培养的普通生酮基古龙酸菌生长微弱的原因之一。
实施例2酸胁迫处理对混合培养和单独培养的普通生酮基古龙酸菌魔转运蛋白基因表达的影响
表2酸胁迫处理后混菌培养的普通生酮基古龙酸菌细胞中膜转运蛋白基因表达差异
Figure GSB00001087529800052
Figure GSB00001087529800071
表3酸胁迫处理后单独培养的普通生酮基古龙酸菌细胞中膜转运蛋白基因的表达差异
Figure GSB00001087529800072
酸胁迫后，在混合培养的普通生酮基古龙酸菌细胞中有19个膜转运蛋白基因上调，其中包括7个氨基酸转运蛋白基因、7个广谱ABC转运蛋白基因、4个寡肽转运蛋白、6个铁离子转运蛋白、2个二肽转运蛋白基因、1个硫胺素转运蛋白基因及1个MscS转运蛋白基因(表4)。而在单独培养的普通生酮基古龙酸菌中，酸胁迫后上调的膜转运蛋白有22个，其中包括7个氨基酸转运蛋白基因、7个广谱ABC转运蛋白基因、4个寡肽转运蛋白基因、1个金属离子转运蛋白基因、1个铁离子转运蛋白基因、2个二肽转运蛋白基因及1个MscS转运蛋白基因(表4)。其中ABC peptide transporter，permease component、permease protein of ABC transporter(ypch01374)和putative ATP-binding ABC transporter protein(yliA)这三个转运蛋白基因在酸胁迫后的普通生酮基古龙酸菌细胞中(混菌培养和单独培养)表达量均上升(表2和表3)，该结果说明，这三个转运蛋白很可能在普通生酮基古龙酸菌细胞抵御酸胁迫过程中发挥重要作用。
此外，混合培养的普通生酮基古龙酸菌较单独培养，共有15个膜转运蛋白基因下调，其中包括7个铁离子转运蛋白基因、4个广谱ABC转运蛋白、1个生物高聚物转运蛋白基因、1个质子转运蛋白基因和2个二肽透性酶转运蛋白基因(表4)。酸胁迫后，由巨大芽孢杆菌伴生的普通生酮基古龙酸菌细胞有16个膜转运蛋白基因下调，其中包括7个广谱ABC转运蛋白、5个氨基酸转运蛋白、1个铁离子转运蛋白、2个二肽/寡肽转运蛋白基因及1个ABC多药转运蛋白基因(表4)。由以上结果可知，酸胁迫对混菌培养的普通生酮基古龙酸菌细胞的氨基酸转运蛋白具有显著的抑制作用，从而影响了普通生酮基古龙酸菌对氨基酸的利用，最终导致细胞生长的抑制及产酸的减少。
表4膜转运蛋白基因表达差异分类
Figure GSB00001087529800082
Figure GSB00001087529800091
值得注意的是，普通生酮基古龙酸菌基因组共有20个铁离子转运蛋白基因，而巨大芽孢杆菌伴生后有7个铁离子转运蛋白基因下调，没有铁离子转运蛋白基因上调(表5)。这说明，在巨大芽孢杆菌伴生下的普通生酮基古龙酸菌生长和产酸似乎与铁离子负相关。酸胁迫后的基因芯片结果显示，有6个铁离子转运蛋白基因被诱导过量表达，其中有4个相同基因在混合培养的普通生酮基古龙酸菌中下调(表2和表3)。这再次表明，铁离子转运蛋白在巨大芽孢杆菌伴生促进普通生酮基古龙酸菌生长及产酸的过程中发挥反作用，且与酸胁迫诱导的普通生酮基古龙酸菌生长的抑制及产酸的减少密切相关。
表5铁离子转运蛋白基因表达差异
Figure GSB00001087529800092
表6表达谱芯片结果验证(混合培养较单独培养)
Figure GSB00001087529800093
表7表达谱芯片结果验证(混合培养酸胁迫较未酸胁迫)
Figure GSB00001087529800094
Figure GSB00001087529800101
分别选取混菌培养的K.vulgare及其经酸胁迫后的上调蛋白，利用荧光定量PCR，验证表达谱芯片结果的可靠性。荧光定量PCR实验结果表明，cysA，bztA，yusC，appC，FepG，yliA的基因表达差异与基因芯片结果基本一致(表6和表7)，表明基因芯片结果是可信的。
实施例3添加铁离子抑制混菌发酵产酸
在1m3发酵罐中进行，发酵初始培养基中铁离子浓度为1.59mg.L-1，分别添加终浓度为2.38(1.5倍)、3.18(2倍)和7.95mg.L-1(5倍)铁离子，发酵72h。结果表明，随着铁离子浓度的增加，2-KLG产率降低，2-KLG合成受到抑制。

Claims (2)

1.一种用于筛选混合发酵培养的目的微生物中涉及酸胁迫减弱其发酵产酸能力的基因的方法，包括：
(1)普通生酮基古龙酸菌的单独培养与混合培养；
(2)混合培养的普通生酮基古龙酸菌在酸胁迫处理与未处理的情况下，利用表达谱芯片技术测定普通生酮基古龙酸菌在不同培养方式下的基因表达水平；
(3)普通生酮基古龙酸菌混合培养时基因表达水平较单独培养时显著地增高或者降低，则鉴定这些基因与混合培养的普通生酮基古龙酸菌发酵产酸密切相关；
(4)若在酸胁迫处理后，混合培养的普通生酮基古龙酸菌中基因的表达水平较未经处理时显著降低或者增高，则鉴定这些基因与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关；
(5)比较与混合培养的普通生酮基古龙酸菌发酵产酸相关的基因和与酸胁迫减弱混菌发酵产酸相关的基因，获得参与酸胁迫抑制混菌发酵产酸的关键基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于获得与酸胁迫抑制混菌发酵产酸的关键基因为铁离子转运基因。
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