CN104745717A - 海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异的检测方法 - Google Patents

海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异的检测方法 Download PDF

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汤凯
林颖芳
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Abstract

海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异的检测方法，涉及分子检测。所述海洋黄杆菌为(Gramella flavus)JLT2011，保藏编号：CGMCC No.1.12375。检测方法：1)菌株高通量检测基因芯片设计；2)将海洋黄杆菌培养后提取核糖核酸，将荧光素标记到样品核糖核酸的3’末端，杂交后的芯片在经过清洗后使用芯片扫描仪扫描，根据杂交结果分析海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异，具体方法如下：海洋黄杆菌RNA的提取、定量和质检过柱纯化后的RNA用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检；对海洋黄杆菌RNA进行荧光标记；杂交与清洗；芯片扫描；芯片图像的采集和数据分析；差异基因筛选。

Description

海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异的检测方法
技术领域
本发明涉及分子检测领域，尤其是涉及一种海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异的检测方法。
背景技术
海洋是生命的摇篮。海洋生物中有着数量极大的微型生物，这些微型生物是海洋生物量的主宰者，它们小则影响局部资源环境，大则影响全球变化。在海洋微型生物中有一个重要的科Flavobacteriaceae，是Bacteroidetes(拟杆菌门)即CFB(Cytophaga–Flexibacter–Bacteroidetes)类群的一个分支。CFB类群在代谢浮游植物有机质方面起着重要的作用，CFB这类细菌形态多样，一般具有较强的运动性和粘附性，能附着在大颗粒物质上生存，可以降解一般细菌难以利用的大分子有机质，从而削弱了基于浮游植物的生物泵过程，促进海洋微型生物碳泵的过程。利用先进的基因芯片分子技术进一步研究海洋的CFB类群中的黄杆菌在海洋生态系统中的意义起着重要的作用。
本申请人在中国专利CN104388361A中公开一株产果胶酶的海洋细菌及其应用，产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus)JLT2011，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.1.12375。产果胶酶的海洋细菌(Gramella flavus)JLT2011可在制备果胶酶中应用。果胶酶的制备方法如下：1)将菌株涂布于2216E培养基平板上，纯化后，接入种子培养基RO中，摇床培养至对数生长期，得种子液；2)将种子液转接发酵培养基，再摇床培养，得发酵液；3)将发酵液离心得上清液，即为果胶酶液。经试验，在培养48h后，发酵液的果胶酶的酶活力可以达到130～154U/ml，具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋黄杆菌。
本发明的另一目的在于提供海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异的检测方法。
所述海洋黄杆菌为(Gramella flavus)JLT2011，已于2014年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.1.12375。
所述海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异的检测方法，包括以下步骤：
1)菌株高通量检测基因芯片设计；
在步骤1)中，所述菌株高通量检测基因芯片设计的具体方法可为：利用Agilent eArray进行编码基因的特异性探针设计，以海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011的编码基因为扩增靶标，常规合成所有涉及到的寡核苷酸序列；
2)将海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011培养后提取核糖核酸(RNA)，将荧光素标记到样品核糖核酸的3’末端，杂交后的芯片在经过清洗后使用芯片扫描仪扫描，根据杂交结果分析海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011在不同培养体系基因表达差异，具体方法如下：
(1)海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011RNA的提取、定量和质检过柱纯化后的RNA用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检；
RNA纯度：A260/280≥1.80，符合表达谱芯片实验要求；
RNA总量：总量≥1μg，满足表达谱芯片实验要求；
RNA完整性：经甲醛变性胶电泳检测，RNA样品电泳条带清晰，28S∶18S rRNA条带亮度大于或接近2∶1，质量符合表达谱芯片实验要求；
(2)对海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011RNA进行荧光标记(晶芯扩增标记试剂盒)
a)反转录合成1st-strand cDNA：以TotalRNA或mRNA起始，含有T7启动子序列的T7Oligo(dT)Primer为引物，使用CbcScript酶合成1st-strand cDNA；
b)合成2nd-strand cDNA：用RNase H将杂合链中的RNA切成短片段，DNA Polymerase以RNA短片段为引物延伸，合成2nd-strand cDNA，并纯化双链cDNA；
c)体外转录合成cRNA：以cDNA为模板，利用T7Enzyme Mix合成cRNA；然后用RNA Clean-up Kit(MN)纯化；
d)随机引物反转录：取5ug cRNA，用CbcScriptⅡ酶，Random Prime进行反转录，反转录产物用PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化；
e)cDNA用KLENOW酶标记：取反转录产物，以Random Primer为引物进行KLENOW酶标记标记产物用PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化，纯化后抽干；(Cy5-dCTP or Cy3-dCTP(GE Healthcare Cat.No.PA 55021/PA53021)；
(3)杂交与清洗：标记的DNA溶于杂交液中，于45℃杂交过夜，杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗5min，而后在0.2×SSC中室温洗5min，玻片甩干后即可用于扫描；所述杂交液为2X GEx Hyb Buffer(HI-RPM)，25％甲酰胺；
(4)芯片扫描：芯片用Agilent G2565CA Microarray Scanner进行扫描，得到杂交图片；
(5)芯片图像的采集和数据分析：荧光信号值提取：采用Feature Extraction图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号；
(6)差异基因筛选：将原始数据输入到GeneSpringGX软件中，采用percentile shift方法对信号值进行归一化处理，然后用Absolute Fold change≥2，同时Flag标记为Detected的标准进行差异基因筛选。
本发明基因芯片结合核酸杂交的特异性，囊括了细菌的全部基因序列，可以检测海洋细菌在不同培养体系基因表达差异。
本发明比较海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011在不同的培养体系下，利用基因芯片寻找细菌基因表达差异，探索与海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011利用浮游植物多糖差异及分子机制。
采用的方法是：用海洋细菌设计的特定基因芯片对海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011在不同的培养体系，分为对照组和实验组,其中Glucose为对照组,Xylan,Pectin为实验组,进行差异基因表达分析，并获得以下结果：
基因芯片检测分析发现，如实验组Pectin样本比对照组Glucose样本有差异表达基因948个，其中308个基因显著上调，640个基因显著下调(差异均在2倍以上)；如实验组Pectin样本对比实验组Xylan其中478个基因显著上调，956个基因显著下调(差异均在2倍以上)；如实验组Xylan样本比对照组Glucose样本有差异表达基因948个，其中750个基因显著上调，484个基因显著下调(差异均在2倍以上)，说明不同浮游植物多糖碳源基因表达存在显著差异。
根据菌株高通量检测基因芯片设计，通过以下步骤实现：
利用Agilent eArray进行编码基因的特异性探针设计，以海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011的编码基因为扩增靶标，常规合成所有涉及到的寡核苷酸序列，所设计的细菌有3684条探针。
寡核苷酸探针基于喷墨打印的方式进行原位合成制备基因芯片。基因芯片可用于海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异。
本发明基因芯片的使用方法是，将海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011按不同的实验条件培养后提取核糖核酸(RNA)。在经过一序列质检、纯化、去磷酸化后，将荧光素标记到样品核糖核酸的3’末端。杂交后的芯片在经过清洗后使用芯片扫描仪扫描，根据杂交结果分析细菌在不同培养体系基因表达差异。
基因芯片结合核酸杂交的特异性，囊括了细菌的全部基因序列，可以检测海洋细菌在不同培养体系基因表达差异。
本发明利用Agilent eArray进行编码基因的特异性探针设计，以海洋黄杆菌(Gramella  flavus)JLT2011的编码基因为扩增靶标，常规合成所有涉及到的寡核苷酸序列。寡核苷酸探针基于喷墨打印的方式进行原位合成制备基因芯片。基因芯片可用于海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异。
附图说明
图1为Agilent G2565CA Microarray Scanner扫描的杂交图片。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
1、菌株高通量检测基因芯片设计：利用Agilent eArray进行编码基因的特异性探针设计，以海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011的编码基因为扩增靶标，常规合成所有涉及到的寡核苷酸序列；
2、将本专利中的细菌按不同的实验条件培养后提取核糖核酸(RNA)。在经过一序列质检、纯化、去磷酸化后，将荧光素标记到样品核糖核酸的3’末端。杂交后的芯片在经过清洗后使用芯片扫描仪扫描，根据杂交结果分析细菌在不同培养体系基因表达差异。具体通过以下步骤实现：
(1)海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011RNA的提取、定量和质检过柱纯化后的RNA用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检。
RNA纯度：A260/280≥1.80，符合表达谱芯片实验要求。
RNA总量：总量≥1μg，满足表达谱芯片实验要求。
RNA完整性：经甲醛变性胶电泳检测，RNA样品电泳条带清晰，28S∶18S rRNA条带
亮度大于或接近2∶1，质量符合表达谱芯片实验要求。
(2)对海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011RNA进行荧光标记(晶芯扩增标记试剂盒)
a)反转录合成1st-strand cDNA：以TotalRNA或mRNA起始，含有T7启动子序列的T7Oligo(dT)Primer为引物，使用CbcScript酶合成1st-strand cDNA。
b)合成2nd-strand cDNA：用RNase H将杂合链中的RNA切成短片段，DNA Polymerase以RNA短片段为引物延伸，合成2nd-strand cDNA，并纯化双链cDNA。
c)体外转录合成cRNA：以cDNA为模板，利用T7Enzyme Mix合成cRNA；然后用RNA Clean-up Kit(MN)纯化。
d)随机引物反转录：取5ug cRNA，用CbcScriptⅡ酶，Random Prime进行反转录，反转录 产物用PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化。
e)cDNA用KLENOW酶标记：取上述反转录产物，以Random Primer为引物进行KLENOW酶标记标记产物用PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化，纯化后抽干。(Cy5-dCTP or Cy3-dCTP(GE Healthcare Cat.No.PA 55021/PA53021)。
(3)杂交与清洗：标记的DNA溶于杂交液中(2X GEx Hyb Buffer(HI-RPM),25％甲酰胺)，于45℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗5min，而后在0.2×SSC中室温洗5min。玻片甩干后即可用于扫描。
(4)芯片扫描：芯片用Agilent G2565CA Microarray Scanner进行扫描，得到杂交图片。
(5)芯片图像的采集和数据分析：荧光信号值提取:采用Feature Extraction图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号。
(6)差异基因筛选:将原始数据输入到GeneSpringGX软件中，采用percentile shift方法对信号值进行归一化处理。然后用Absolute Fold change≥2，同时Flag标记为Detected的标准进行差异基因筛选。
Agilent G2565CA Microarray Scanner扫描的杂交图片参见图1。在图1中，a～g代表Pectin,Xylan,Glucose,其中Pectin和Xylan是3组平行，Glucose是2组平行。
本发明基因芯片结合核酸杂交的特异性，囊括了细菌的全部基因序列，可以检测海洋细菌在不同培养体系基因表达差异。
为了比较海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011在不同的培养体系下，利用基因芯片寻找细菌基因表达差异，探索与海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011利用浮游植物多糖差异及分子机制，采用以下方法：
用海洋细菌设计的特定基因芯片对海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011在不同的培养体系，分为对照组和实验组,其中Glucose为对照组,Xylan,Pectin为实验组,进行差异基因表达分析。
结果：基因芯片检测分析发现,如实验组Pectin样本比对照组Glucose样本有差异表达基因948个，其中308个基因显著上调，640个基因显著下调(差异均在2倍以上)；如实验组Pectin样本对比实验组Xylan其中478个基因显著上调，956个基因显著下调(差异均在2倍以上)；如实验组Xylan样本比对照组Glucose样本有差异表达基因948个，其中750个基因显著上调，484个基因显著下调(差异均在2倍以上)。说明不同浮游植物多糖碳源基因表达存在显著差异。

Claims (2)

1.海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1)菌株高通量检测基因芯片设计；
2)将海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011培养后提取核糖核酸(RNA)，将荧光素标记到样品核糖核酸的3’末端，杂交后的芯片在经过清洗后使用芯片扫描仪扫描，根据杂交结果分析海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011在不同培养体系基因表达差异，具体方法如下：
(1)海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011 RNA的提取、定量和质检过柱纯化后的RNA用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检；
RNA纯度：A260/280≥1.80，符合表达谱芯片实验要求；
RNA总量：总量≥1μg，满足表达谱芯片实验要求；
RNA完整性：经甲醛变性胶电泳检测，RNA样品电泳条带清晰，28S∶18S rRNA条带亮度大于或接近2∶1，质量符合表达谱芯片实验要求；
(2)对海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011 RNA进行荧光标记(cRNA扩增标记试剂盒)
a)反转录合成1st-strand cDNA：以TotalRNA或mRNA起始，含有T7启动子序列的T7Oligo(dT)Primer为引物，使用CbcScript酶合成1st-strand cDNA；
b)合成2nd-strand cDNA：用RNase H将杂合链中的RNA切成短片段，DNA Polymerase以RNA短片段为引物延伸，合成2nd-strand cDNA，并纯化双链cDNA；
c)体外转录合成cRNA：以cDNA为模板，利用T7 Enzyme Mix合成cRNA；然后用RNA Clean-up Kit(MN)纯化；
d)随机引物反转录：取5ug cRNA，用CbcScriptⅡ酶，Random Prime进行反转录，反转录产物用PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化；
e)cDNA用KLENOW酶标记：取反转录产物，以Random Primer为引物进行KLENOW酶标记标记产物用PCR NucleoSpinExtract II Kit(MN)纯化，纯化后抽干；(Cy5-dCTP orCy3-dCTP(GE Healthcare Cat.No.PA 55021/PA53021)；
(3)杂交与清洗：标记的DNA溶于杂交液中，于45℃杂交过夜，杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗5min，而后在0.2×SSC中室温洗5min，玻片甩干后即可用于扫描；所述杂交液为2X GEx Hyb Buffer(HI-RPM)，25％甲酰胺；
(4)芯片扫描：芯片用Agilent G2565CA Microarray Scanner进行扫描，得到杂交图片；
(5)芯片图像的采集和数据分析：荧光信号值提取：采用Feature Extraction图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号；
(6)差异基因筛选：将原始数据输入到GeneSpringGX软件中，采用percentile shift方法对信号值进行归一化处理，然后用Absolute Fold change≥2，同时Flag标记为Detected的标准进行差异基因筛选。
2.如权利要求1所述海洋黄杆菌在不同培养体系基因表达差异的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述菌株高通量检测基因芯片设计的具体方法为：利用Agilent eArray进行编码基因的特异性探针设计，以海洋黄杆菌(Gramella flavus)JLT2011的编码基因为扩增靶标，常规合成所有涉及到的寡核苷酸序列。
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