CN101671715A - 一种稀土元素强化2-酮基-l-古龙酸高效生产的方法 - Google Patents

Abstract

一种稀土元素强化2－酮基－L－古龙酸高效生产的方法，属于优化维生素C发酵过程技术领域。本发明利用酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)混合菌系为生产菌株，通过在培养基中添加铈离子Ce³⁺，或添加镧离子La³⁺，促进2－酮基－L－古龙酸(2KGA)的生产和山梨糖的消耗，实现2－酮基－L－古龙酸高效生产。添加5mmol/L的铈离子，2KGA的产量由对照例的67.0g/L提高到72.1g/L，发酵周期缩短12h左右，平均山梨糖消耗速率和2KGA生成速率分别提高23.5％、27.1％；添加7mmol/L的镧离子，2KGA的产量提高到75.7g/L，发酵周期缩短12h左右，糖酸转化率从83.1％提高到91.6％，平均山梨糖消耗速率和2KGA生成速率分别提高22.8％、35.3％。

Description

一种稀土元素强化2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法

技术领域

一种稀土元素强化2-酮基-L-古龙酸(2KGA)高效生产的方法，涉及优化维生素C发酵过程技术领域。

背景技术

维生素C(Vitamin C，以下简称VC)又名L-抗坏血酸，是一种人体必需的水溶性氨基酸，具有广泛的生理作用和理化性质，因此在医药、食品以及饲料等领域均有重要用途。同时，VC也是维生素类药物中发展最快、产量最大、用途最广的品种。目前我国生产VC主要采用“二步发酵法”，该方法属于L-山梨糖途径，其特点为第二步发酵由酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare，通称“小菌”)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，通称“大菌”)等伴生菌混合发酵将L-山梨糖转化成VC前体2-酮基-L-古龙酸(2KGA)。

稀土元素又称稀土金属，包含钪Sc、钇Y及镧系中的镧La、铈Ce、镨Pr、钕Nd、钷Pm、钐Sm、铕Eu、钆Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、铒Er、铥Tm、镱Yb、镥Lu，共17种元素，它们具有独特的理化性质。大量研究表明，稀土元素对机体细胞的一些物质代谢过程和酶的活性有促进或抑制作用，但研究以稀土元素强化2-酮基-L-古龙酸(2KGA)高效发酵生产的少见报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种稀土元素强化2-酮基-L-古龙酸(2KGA)高效生产的方法，利用酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)发酵生产2KGA，在发酵过程中添加适量的稀土离子，促进2KGA的生产和山梨糖的消耗，达到2-酮基-L-古龙酸高效生产的目的。

本发明的技术方案：一种稀土元素强化2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，利用酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare、小菌)与巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium、大菌)混合菌系为生产菌株，发酵生产2-酮基-L-古龙酸，通过在培养基中添加铈离子Ce³⁺浓度至5mmol/L，或添加镧离子La³⁺浓度至7mmol/L，促进2-酮基-L-古龙酸的生产和山梨糖的消耗，实现2-酮基-L-古龙酸高效生产。

具体方法为：

添加铈离子(Ce³⁺)浓度至5mmol/L，2KGA的产量最终达到72.1g/L，发酵周期缩短12h左右，平均山梨糖消耗速率和2KGA生成速率分别提高23.5％、27.1％；

或添加镧离子(La³⁺)浓度至7mmol/L，2KGA的产量最终达到75.7g/L，发酵周期缩短12h左右，糖酸转化率从83.1％提高到91.6％，平均山梨糖消耗速率和2KGA生成速率分别提高22.8％、35.3％。

1、菌株

酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare，小菌)DSM 4205及巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，大菌)ATCC 21916，由江苏江山制药有限公司(江苏靖江)提供。

2、培养基

种子培养基(重量％)：L-山梨糖2.0(单独灭菌)、酵母膏0.3、蛋白胨1.0、牛肉膏0.3、玉米浆0.15、尿素0.1、CaCO₃0.1(单独灭菌)、MgSO₄·7H₂O 0.02、KH₂PO₄ 0.1；pH 6.7-7.0，121℃灭菌15min。

发酵培养基(重量％)：L-山梨糖8.0(单独灭菌)、玉米浆0.5、尿素1.2、CaCO₃ 0.5(单独灭菌)、MgSO₄·7H₂O 0.01、KH₂PO₄ 0.1；pH 6.7-7.0，121℃灭菌15min。

3、大菌与小菌混合菌系的培养

用接种环挑取新鲜平板上小菌单菌落两环，再挑取大菌单菌落一环，于无菌水中制成混菌悬液，取混菌悬液涂斜面，30℃培养48h；取斜面混合菌接种于种子培养液75mL/750mL三角瓶中。30℃、200rpm下培养18h，即制成大小菌混合菌系，接入甘油管中进行保藏。

4、摇瓶培养：

将30℃、200rpm下培养18h的种子以10％的接种量转接入发酵培养基于30℃、200rpm条件下培养72h，按实验要求添加不同浓度的镧离子(La³⁺)或铈离子(Ce³⁺)。

菌体浓度的测定：取一定量的发酵液，加适量盐酸溶解发酵液中的碳酸钙，加入去离子水将其稀释10倍，摇匀，用UV 7500型可见分光光度计，于660nm处比色测OD值。

2-酮基-L-古龙酸和山梨糖的测定：高效液相色谱(HPLC)

仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、视差折光检测器和工作站)，色谱条件：

色谱柱：Aminex HPX-87H columns(300mm×7.8mm)

流动相：1.1mL浓硫酸稀释到4L

流速：0.5mL/min

柱温：35℃

进样量：5μL

视差折光检测器波长：210nm

样品制备：发酵液在12000rpm下离心5min，取适量上清液，用超纯水稀释10倍，经0.45μm滤膜过滤后，滤液供液相色谱分析用。

本发明的有益效果：利用本发明能强化2-酮基-L-古龙酸的发酵生产。2-酮基L-古龙酸的产量最高能从67.0g/L提高到75.7g/L，缩短发酵周期12h左右，糖酸转化率从83.1％提高到91.6％，平均山梨糖消耗速率和2KGA生成速率分别提高22.8％、35.3％。本发明的稀土元素强化发酵高效生产的方法对其它发酵产品的生产具有一定的指导意义。

附图说明

图1添加5mmol/L铈离子(Ce³⁺)时对2KGA发酵的影响。

图2添加7mmol/L镧离子(La³⁺)时对2KGA发酵的影响。

具体实施方式

对照实施例：本发明所用的菌种为酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)混合菌系。从冷冻甘油管中取混菌保藏培养物0.4mL接入种子培养基(75mL/750mL摇瓶)，30℃，200rpm培养18h。再以10％的接种量接入发酵培养基(75mL/750mL摇瓶)，30℃，200rpm培养72h。此发酵条件下，最终2KGA和山梨糖浓度分别为67.0g·L^-1，10.7g·L^-1。

实施例1：在发酵培养基中添加铈离子(Ce³⁺)浓度达到5mmol/L时，如图1，发酵60h后2KGA和L-山梨糖浓度就分别达到了72.1g·^L-1，8.4g·L^-1，平均山梨糖消耗速率和2KGA生成速率分别比对照组提高了23.5％、27.1％。继续提高培养基中铈离子(Ce³⁺)浓度时，2KGA的产量则会有所下降。

实施例2：在发酵培养基中添加镧离子(La³⁺)浓度达到7mmol/L时，如图2，发酵60h后2KGA和L-山梨糖浓度就分别达到了75.7g·L^-1，8.9g·L^-1，糖酸转化率从83.1％提高到91.6％，平均山梨糖消耗速率和2KGA生成速率分别提高了22.8％、35.3％。继续提高培养基中镧离子(La³⁺)浓度时，2KGA的产量则会有所下降。

Claims (1)

1、一种稀土元素强化2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征是利用酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)混合菌系为生产菌株，发酵生产2-酮基-L-古龙酸，通过在培养基中添加铈离子Ce³⁺浓度至5mmol/L，或添加镧离子La³⁺浓度至7mmol/L，促进2-酮基-L-古龙酸的生产和山梨糖的消耗，实现2-酮基-L-古龙酸高效生产。

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