CN101948891B - 发酵萎缩芽孢杆菌制备Bacillamide C的培养基及其制备及应用方法 - Google Patents
发酵萎缩芽孢杆菌制备Bacillamide C的培养基及其制备及应用方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种细菌培养技术领域的发酵萎缩芽孢杆菌制备Bacillamide C的培养基及其制备及应用方法，该培养基的组分及含量为：3.64g/L玉米淀粉、6.0g/L胰蛋白胨、6.29g/L碳酸钙、4.0g/L大豆蛋白胨、0.10g/L半胱氨酸和0.02g/L色氨酸，溶剂为人工海水。本发明不仅能满足摇瓶实验的需要，亦能满足发酵罐发酵大量制备Bacillamide C的要求。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种细菌培养技术领域的培养基及其制备，具体是一种发酵萎缩芽孢杆菌制备Bacillamide C的培养基及其制备及应用方法。
背景技术
与陆地生物相比，海洋生物生活于高盐、高压、低温、稀营养等条件严苛的环境中。为求生存，很多海洋生物在长期的进化过程中产生一些结构独特的化学物质。从海洋生物中已发现多种活性物质，包括抗肿瘤化合物、肿瘤促进剂、抗炎症/过敏化合物、抗菌、抗病毒化合物、生物毒素、抗寄生虫化合物、多不饱和脂肪酸等，其中相当部分生物活性物质是陆地生物所没有的。这些海洋生物活性物质具有种类繁多、结构特异复杂等特点。在众多海洋生物中，海绵是目前发现活性物质最丰富的海洋生物之一，人们对海绵活性物质寄予极大的希望，但海绵体内的活性物质含量很低，捕捞海绵资源有限，药源的供给不足使得海绵药物开发明显滞后。为寻找稳定可靠的药源，进行大规模生产，开展相关海绵共附生微生物的研究是迫切而重要的工作。
经过对现有技术的检索发现，于璐璐等(Lu-Lu Yu et al.，Helvetica Chimica Acta2009；92：607-611)从来自中国南海的贪婪倔海绵萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus C89菌液的乙酸乙酯萃取物中，分离到一种结构较新的化合物Bacillamide C。Bacillamides家族化合物及其衍生物已被证实对多环旋沟藻、蓝藻和微藻有不同程度的抑制作用。藻类引起的赤潮和水华对生态、经济和人类健康的威胁日益严重，因而该家族作为潜在的抑藻剂有很高的研究价值和应用价值。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述缺点，提供一种发酵萎缩芽孢杆菌制备Bacillamide C的培养基及其制备及应用方法，不仅能满足摇瓶实验的需要，亦能满足发酵罐发酵大量制备Bacillamide C的要求。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种用于萎缩芽孢杆菌的培养基，其组分及含量为：3.64g/L玉米淀粉、6.0g/L胰蛋白胨、6.29g/L碳酸钙、4.0g/L大豆蛋白胨、0.10g/L半胱氨酸和0.02g/L色氨酸，溶剂为人工海水。
所述的人工海水的组份及含量为：26.518g/L的NaCl、2.447g/L的MgCl2、3.305g/L的 MgSO4、1.141g/L的CaCl2、0.725g/L的KCl、0.202g/L的NaHCO3以及0.083g/L的NaBr，溶剂为Millpore超纯水，该人工海水的pH 7.0-7.2。
本发明涉及上述用于萎缩芽孢杆菌培养基的制备方法，包括以下步骤：
第一步、配制人工海水：分别将NaCl、MgCl2、MgSO4、CaCl2、KCl、NaHCO3以及NaBr溶解于超纯水中后进一步混合。
第二步、在人工海水中加入玉米淀粉并加热煮沸糊化，然后依次加入胰蛋白胨、大豆蛋白胨和碳酸钙并搅拌溶解，然后进行高温杀菌得到培养基。
所述的搅拌溶解过程中不断补充纯水补足玉米淀粉蒸煮过程中失去的水分。
所述的高温杀菌是指在121℃环境下灭菌20分钟。
本发明涉及上述培养基的应用方法，通过将半胱氨酸和色氨酸溶解于人工海水中配成混合氨基酸溶液并采用过滤膜进行过滤，然后将所述培养基对发酵萎缩芽孢杆菌进行发酵培养，在发酵培养过程中添加过滤后的混合氨基酸溶液，实现萎缩芽孢杆菌产量的优化。
所述的混合氨基酸溶液中含有半胱氨酸0.10g/L以及色氨酸0.02g/L。
采用本发明方法成功的对萎缩芽孢杆菌产Bacillamide C的培养基成分进行了优化。在摇瓶水平上，将菌种分别接种到基本培养基和最优培养基中，比较两种培养基中菌种的生长情况和产Bacillamide C的情况。
在最优培养基中发酵96h的Bacillamide C的产量达到22.797mg/L，是在未优化的基本培养基中产量(2.746mg/L)的8.3倍。这表明，在摇瓶水平上，单菌产目标产物的能力明显提高。之后使用最优培养基的成分配比在5L发酵罐上进行放大培养初试。由于部分物理条件的改变，最大菌浓度进一步增至2.385×109/ml，是摇瓶发酵最大菌浓度(1.78×109/ml)的1.34倍。菌体生长期的缩短使得5L罐上发酵的总时长为72h，较之摇瓶发酵所需的96h缩短了24h，但5L罐上发酵72h的Bacillamide C产量为34.80mg/L，是摇瓶发酵96h Bacillamide C产量(22.797mg/L)的1.53倍，是培养基优化前2.746mg/L的12.7倍。本发明所得到的培养基成分不仅能满足摇瓶实验的需要，亦能满足发酵罐发酵的要求。
附图说明
图1萎缩芽孢杆菌发酵Bacillamide C产量在基本培养基和最优培养基中的对比图。
图2萎缩芽孢杆菌采用最优培养基在5L发酵罐上培养的发酵动态监测图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中涉及的Bacillamide C的具体为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus菌株(学 名)，其保藏信息/公开获得渠道为：该菌株16S rRNA序列与多株萎缩芽孢杆菌的16S rRNA序列完全一致，萎缩芽孢杆菌在早稻田(北京)生物科技发展有限公司销售。
1、四种基本培养基的配制。
1)牛肉膏蛋白胨培养基：10g胰蛋白胨，5g牛肉膏溶解于1L人工海水；
2)LB培养基：10胰蛋白胨，5g酵母膏溶解于1L人工海水；
3)M2216培养基：5g胰蛋白胨，1g牛肉膏溶解于1L人工海水；
4)自制培养基：5g玉米淀粉用1L人工海水煮沸糊化，加入5g胰蛋白胨和5g大豆蛋白胨，搅拌溶解，以适量的纯水补足玉米淀粉蒸煮过程中失去的水分至1L。加入5g碳酸钙。
以上四种培养基皆于121℃灭菌20min。
分别以上述四种培养基进行发酵，菌种接种量为1％(v/v)，在250mL三角瓶中装液量100mL，在28℃、150rpm的恒温摇床中培养96h，pH自然。
采用HPLC法测定Bacillamide C含量，以上四种培养基中Bacillamide C含量分别为：2.414mg/L，1.860mg/L，1.306mg/L和2.746mg/L。由此得到比较好的基本培养基配方(配方1)为：5g/L玉米淀粉，5g/L大豆蛋白胨，5g/L胰蛋白胨，5g/L碳酸钙，人工海水配制，pH自然。以配方1进行发酵，Bacillamide C产量为2.746mg/L。
2、培养基中氨基酸前体的添加。在配方1的基础上，通过单因素实验确定半胱氨酸、丙氨酸和色氨酸单独添加时的最佳时间和浓度。对每种氨基酸，分别于发酵起始、迟滞期末、对数期中期、稳定期起始、稳定期开始后20h、稳定期开始后40h单独添加到100ml发酵液中，添加浓度为100mg/L发酵液，测定Bacillamide C产量的变化。而后在最佳添加时间的基础上，对每种氨基酸分别用20mg/L发酵液、60mg/L发酵液、100mg/L发酵液、140mg/L发酵液、180mg/L发酵液作为添加浓度添加到100ml发酵液中，测定Bacillamide C产量的变化。
实验结果表明：半胱氨酸和色氨酸于稳定期开始后40h添加最佳，最佳添加浓度均为100mg/L发酵液，Bacillamide C产量分别达到7.472mg/L和6.360mg/L；丙氨酸于稳定期起始添加最佳，最佳添加浓度为100mg/L发酵液，Bacillamide C产量达到7.315mg/L。从而得到最佳培养基的(配方2)组分为：5g/L玉米淀粉，5g/L大豆蛋白胨，5g/L胰蛋白胨，5g/L碳酸钙，0.1g/L半胱氨酸(稳定期开始后40h添加)，0.1g/L色氨酸(稳定期开始后40h添加)，0.1g/L丙氨酸(稳定期起始添加)，人工海水配制，pH自然。
3、应用Plackett-Burman设计和响应曲面法确定最优培养基。
在配方2的基础上，首先应用Plackett-Burman设计挑选出对Bacillamide C产量影响较大的因素：玉米淀粉、丙氨酸、碳酸钙、半胱氨酸。它们的添加量水平如表1所示：
表1Plackett-Burman实验中各因素的高低值
筛选出重要因素后，应用响应曲面法，进一步优化玉米淀粉、丙氨酸、碳酸钙和半胱氨酸的最优培养浓度。它们的添加量水平如表2所示：
表2Box-Behnken design法中重要因素的编码值和实际值浓度
如图1所示：萎缩芽孢杆菌发酵Bacillamide C产量在基本培养基和最优培养基中的对比图，如图2所示：萎缩芽孢杆菌采用最优培养基在5L发酵罐上培养的发酵动态监测图，结合上述表格可见：优化得到的最优培养基(配方3)的组分为：3.64g/L玉米淀粉，6.0g/L胰蛋白胨，6.29g/L碳酸钙，4.0g/L大豆蛋白胨，0.10g/L半胱氨酸(稳定期开始后40h加入)，0.02g/L色氨酸(稳定期开始后40h加入)，以人工海水配制，pH自然。以配方3培养基进行摇瓶发酵，Bacillamide C的产量达到22.797mg/L。
在摇瓶水平获得最优培养基配方(配方3)后，在5L发酵罐上采用此培养基进行放大发酵初试。发酵条件为：5L罐中装入3L最优发酵培养基(配方3)，接种量为5％(v/v)，温度28℃，pH自然，通气3L/min，转速为0-6h 200rpm，6-8h 300rpm，8h至发酵结束400rpm。通过转速和空气流量的协同控制，使溶氧≥10％。5L发酵罐上采用最优培养基(配方3)发酵72h，Bacillamide C产量达到34.80mg/L。
Claims (7)
1.一种用于萎缩芽孢杆菌的培养基，其特征在于，其组分及含量为：3.64g/L玉米淀粉、6.0g/L胰蛋白胨、6.29g/L碳酸钙、4.0g/L大豆蛋白胨、0.10g/L半胱氨酸和0.02g/L色氨酸，溶剂为人工海水。
2.根据权利要求1所述的用于萎缩芽孢杆菌的培养基，其特征是，所述的人工海水的组份及含量为：26.518g/L的NaCl、2.447g/L的MgCl2、3.305g/L的MgSO4、1.141g/L的CaCl2、0.725g/L的KCl、0.202g/L的NaHCO3以及0.083g/L的NaBr，溶剂为Millpore超纯水，该人工海水的pH 7.0-7.2。
3.一种根据权利要求1所述的培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步、配制人工海水：分别将NaCl、MgCl2、MgSO4、CaCl2、KCl、NaHCO3以及NaBr溶解于超纯水中后进一步混合；
第二步、在人工海水中加入玉米淀粉并加热煮沸糊化，然后依次加入胰蛋白胨、大豆蛋白胨和碳酸钙并搅拌溶解，然后进行高温杀菌，备用；
第三步、将半胱氨酸和色氨酸溶解于人工海水中配成混合氨基酸溶液并采用过滤膜进行过滤，备用。
4.根据权利要求3所述的培养基的制备方法，其特征是，所述的搅拌溶解过程中不断补充纯水补足玉米淀粉蒸煮过程中失去的水分。
5.根据权利要求3所述的培养基的制备方法，其特征是，所述的高温杀菌是指在121℃环境下灭菌20分钟。
6.一种根据权利要求1或2所述的培养基的应用方法，其特征在于，通过将半胱氨酸和色氨酸溶解于人工海水中配成混合氨基酸溶液并采用过滤膜进行过滤，然后将所述培养基对发酵萎缩芽孢杆菌进行发酵培养，在发酵培养过程中添加过滤后的混合氨基酸溶液，实现萎缩芽孢杆菌产量的优化。
7.根据权利要求6所述的培养基的应用方法，其特征是，所述的混合氨基酸溶液中含有半胱氨酸0.10g/L以及色氨酸0.02g/L。
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