CN100469890C - 共轭亚油酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明共轭亚油酸的制备方法涉及用发酵制备共轭亚油酸的方法，它是以盐生植物紫花苜蓿种籽为原料，采用微生物发酵来制备共轭亚油酸，具体步骤包括(1)培养基的配制、(2)种子液预培养，其中特别是将紫花苜蓿籽油和乳酸菌种加入到上述制得的培养基(1)中作为接种物、(3)乳酸菌发酵异构化，其中特别是将由第(2)步制得的接种物和紫花苜蓿籽油接入培养基中，经培养制得发酵液、(4)共轭亚油酸的提取，用异丙醇溶解发酵液，再用正己烷充分萃取发酵液即制得共轭亚油酸；本发明制备方法的主要原料紫花苜蓿籽购价低，制备工艺简单，反应条件温和，异构体组成单一。
Description
技术领域
本发明的技术方案涉及用发酵制备共轭亚油酸的方法。
背景技术
1978年美国威斯康星大学研究者发现煮过的牛肉含有抗突变生物活性物质，即共轭亚油酸(CLA)。此后的动物实验发现CLA具有抗癌、减少体内脂肪、降低胆固醇含量和防止动脉粥样硬化等多种生理作用。天然CLA主要存在于反刍动物的奶和肉制品中，人们主要通过食用动物脂肪和奶制品摄入CLA。但研究发现，人工圈养靠饲料生长的牛的牛乳中的CLA，含量大大低于天然放牧食草的牛的牛乳中的CLA，加之人们食用动物脂肪减少，导致CLA摄入不足。为了满足深入研究CLA生理活性和饲料、食品各领域对于CLA的需求，人们一直努力寻找能够大量廉价制取CLA的可靠方法。CLA的已有制备方法有化学异构法和生物异构法。
用植物籽为原料采用化学异构法来生产共轭亚油酸的中国专利有：CN 02145196.6共轭亚油酸的制造方法，以红花籽油为原料；CN 02145197.4共轭亚油酸的制造方法，以红花籽油为原料；CN 99112451.0共轭亚油酸的生产方法，以碱蓬、滨蒿等其它种子含油量高于20％、种子油脂中亚油酸占总脂肪酸量60％以上的盐生植物种子为原料，确定了合适的醇碱比，改变反应温度，通过改进亚油酸共轭化技术，生产活性异构体含量高的共轭亚油酸；CN 200410075727.2共轭亚油酸及用黄须菜菜籽油生产共轭亚油酸的方法，按质量百分比黄须菜菜籽油∶氢氧化钾∶纯净水＝1∶0.25～0.6∶2～4比例掺和一起，经共轭反应，酸洗超临界萃取所制得；CN 200310112529.4一种共轭亚油酸的制备方法，在110～558瓦的微波功率下，以多元醇作反应溶剂，将红花籽油或葵花籽油溶解于溶剂中，在无机碱催化剂催化下，进行异构化反应10～30分钟，反应完全后用酸性水溶液中和，有机溶剂萃取，水洗，除去溶剂后得共轭亚油酸。化学异构法需要在碱性条件、高温和一定压力下进行，其产生的异构体组成复杂，不利于单一产品的开发应用。
生物异构法，即微生物发酵法，反应条件温和，异构体组成较单一，与天然食物中CLA异构体组成相似，有利于产品的开发应用。然而现有的微生物发酵法只限于用来从亚油酸或谷物制备共轭亚油酸，原料来源有限且价格较贵。这方面公开的中国专利有：CN00815851.7、CN 03807095.2、CN 200510061450.2。
于是寻找一种原料低廉、工艺简单的制备共轭亚油酸方法来满足人们对共轭亚油酸制品的需要成为急待解决的问题。
中国盐碱土约有0.333亿多公顷，另外有次生盐渍化土壤0.066亿多公顷，广泛分布于长江以北的广阔内陆地区。盐生植物是生活在盐渍化土壤上的一类天然植物区系。据调查，我国现有盐生维管植物425种，分属66科，200属，占世界盐生植物总数的27％左右。积极开发利用这些盐生植物资源，对改善盐碱地区的生态环境和增加当地农民收入有着十分重要的经济价值和现实意义。而目前，虽然盐生植物丰富，但利用率不高，特别是利用盐生植物籽来制取共轭亚油酸还有十分广阔的发展空间。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种共轭亚油酸的制备方法，它是以盐生植物紫花苜蓿种籽为原料采用微生物发酵来制备共轭亚油酸的方法，该方法所用原料低廉、制备工艺简单。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：一种共轭亚油酸的制备方法，它是以盐生植物紫花苜蓿种籽为原料，采用微生物发酵来制备共轭亚油酸的方法，其具体步骤是：
第一步，培养基的配制
将市购的牛肉浸膏8～12g、葡萄糖20g、柠檬酸铵1～3g、蛋白胨10～12g、酵母浸粉3～6g、乙酸钠4～6g、磷酸氢二钾1～3g、硫酸镁0.1～0.3g、硫酸锰0.03～0.06g、吐温801～2g混合加蒸馏水至一升，调节pH值为6.2～6.6，高压灭菌20分钟，得到培养基(1)；
第二步，种子液预培养
在无菌条件下用移液枪将紫花苜蓿籽油5～30微升和乳酸菌种加入到上述制得的培养基(1)中，接种量的v/v为5％，摇匀后于35～38℃预培养8～14小时作为接种物；
第三步，乳酸菌发酵异构化
用磷酸钠缓冲溶液将第一步得到的培养基(1)的pH值调到5.8～8.0，高压灭菌20分钟，得到培养基(2)，在无菌条件下用移液枪将由第二步制得的接种物和紫花苜蓿籽油接入培养基(2)，接种量的v/v为5～15％，接油量为10～40微升，摇匀后于35～38℃培养20～24小时，制得发酵液；
第四步，共轭亚油酸的提取
从第三步制得的发酵液中取出1ml于试管中，将异丙醇2ml加入该试管中溶解发酵液，再加入正己烷1ml于试管中，将该试管放入振荡器进行振荡，使正己烷充分萃取发酵液中的共轭亚油酸为止，再将所得混合物置于离心机中以4000转/分钟的转速离心20分钟，然后吸出上层的正己烷层并用水洗，将正己烷层收集后用旋转蒸发器于35℃旋转蒸发20分钟，即制得共轭亚油酸。
在实际生产中，上述各步中所有物质的用量根据需要按比例扩大或缩小。
在上述方法的第二步中所用的乳酸菌种优选菌种编号为6026的乳酸菌Lactobacillus plantarum。
本发明的有益效果是，本发明与已有技术相比具有以下优点：
1.本发明共轭亚油酸的制备方法，其主要原料紫花苜蓿是广泛分布于华北地区的盐碱地中的一种盐生植物。紫花苜蓿籽含油量达到12％，在紫花苜蓿籽油脂中，亚油酸占总脂肪酸含量的30％～35％，并含有粗蛋白31.63％和少量亚麻酸，此外，紫花苜蓿种籽中含有18种氨基酸和23种矿质元素。
2.紫花苜蓿籽购价低，因此制得的共轭亚油酸比市场上用其他方法制得的共轭亚油酸销售价低。
3.本发明的制备工艺简单，反应条件温和，异构体组成单一；并且在制备工艺过程中，于种子液中加入一定量的苜蓿籽油对乳酸菌进行诱导，产生一定诱导效应，使共轭亚油酸的产率更高。
具体实施方式
实施例1
(1)培养基的配制：将市购的牛肉浸膏8g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、葡萄糖20g、柠檬酸铵2g、蛋白胨10g、酵母浸粉4g、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、吐温80 1g混合放入2L烧杯中，加蒸馏水至一升，用磷酸钠缓冲溶液调pH值为6.5，高压灭菌20分钟，得到培养基(1)，并用于下一步的种子液预培养；
(2)种子液预培养：在无菌条件下用移液枪将紫花苜蓿籽油10微升和乳酸菌Lactobacillus plantarum(菌种编号：6026)液1ml加入到20ml培养基(1)中，于37℃培养箱中预培养12小时作为接种物，并用于下一步的乳酸菌发酵异构化；
(3)乳酸菌发酵异构化：按照培养基(1)的配方配制培养基，并用磷酸钠缓冲溶液将pH值调到6.5，高压灭菌20分钟，得到培养基(2)，在无菌条件下用移液枪将由第(2)步得到的接种物和紫花苜蓿籽油接入培养基(2)中，接种量5％(v/v)，接油量10微升，摇匀后于37℃培养箱中培养24小时，制得发酵液；
(4)共轭亚油酸的提取：从第(3)步制得的发酵液中取出1ml于试管中，将异丙醇2ml加入该试管中溶解发酵液，再加入正己烷1ml于试管中，将该试管放入振荡器振荡，使正己烷充分萃取发酵液中的共轭亚油酸为止，再将所得混合物置于离心机中以4000转/分钟的转速离心20分钟，然后吸出上层的正己烷层并用水洗，将正己烷层收集后用旋转蒸发器于35℃旋转蒸发20分钟，即制得共轭亚油酸。与此同时回收正己烷。将所得脂肪酸混合物用正己烷溶解定容至5ml，用紫外分光光度计测定共轭亚油酸的含量，经计算共轭转化率为6.001％。
实施例2
(1)培养基(1)的配制：同实施例1；
(2)种子液预培养：同实施例1；
(3)乳酸菌发酵异构化：按照培养基(1)的配方配制培养基，并用磷酸钠缓冲溶液将pH值调到6.5，高压灭菌20分钟，得到培养基(2)，在无菌条件下用移液枪将由第(2)步得到的接种物和紫花苜蓿籽油接入培养基(2)中，接种量5％(v/v)，接油量20微升，摇匀后于37℃培养箱中培养24小时，制得发酵液；
(4)共轭亚油酸的提取：同实例1，经计算共轭转化率为12.142％。
实施例3
(1)培养基(1)的配制：同实施例1；
(2)种子液预培养：同实施例1；
(3)乳酸菌发酵异构化：按照培养基(1)的配方配制培养基，并用磷酸钠缓冲溶液将pH值调到7.0，高压灭菌20分钟，得到培养基(2)，在无菌条件下用移液枪将由第(2)步得到的接种物和紫花苜蓿籽油接入培养基(2)中，接种量5％(v/v)，接油量10微升，用手摇匀后于37℃培养箱中培养24小时，制得发酵液；
(4)共轭亚油酸的提取：同实例1，经计算共轭转化率为20.789％。
实施例4
(1)培养基(1)的配制：同实施例1；
(2)种子液预培养：同实施例1；
(3)乳酸菌发酵异构化：按照培养基(1)的配方配制培养基，并用磷酸钠缓冲溶液将pH值调到7.4，高压灭菌20分钟，得到培养基(2)，在无菌条件下用移液枪将由第(2)步得到的接种物和紫花苜蓿籽油接入培养基(2)中，接种量5％(v/v)，接油量20微升，用手摇匀后于37℃培养箱中培养24小时，制得发酵液；
(4)共轭亚油酸的提取：同实例1，经计算共轭转化率为21.813％。
实施例5
(1)培养基(1)的配制：同实施例1。
(2)种子液预培养：在无菌条件下用移液枪将紫花苜蓿籽油20微升和乳酸菌种液1ml加入到20ml培养基(1)中，于37℃培养箱中预培养8小时作为接种物，并用于下一步的乳酸菌发酵异构化；
(3)乳酸菌发酵异构化：按照培养基(1)的配方配制培养基，并用磷酸钠缓冲溶液将pH值调到7.4，高压灭菌20分钟，得到培养基(2)，在无菌条件下用移液枪将由第(2)步得到的接种物和紫花苜蓿籽油接入培养基(2)中，接种量5％(v/v)，接油量20微升，用手摇匀后于37℃培养箱中培养24小时，制得发酵液；
(4)共轭亚油酸的提取：同实例1，经计算共轭转化率为26.013％。
实施例6
(1)培养基(1)的配制：同实施例1；
(2)种子液预培养：在无菌条件下用移液枪将紫花苜蓿籽油5微升和乳酸菌种液1ml加入到20ml培养基(1)中，于37℃培养箱中预培养14小时作为接种物，并用于下一步的乳酸菌发酵异构化；
(3)乳酸菌发酵异构化：按照培养基(1)的配方配制培养基，并用磷酸钠缓冲溶液将pH值调到7.4，高压灭菌20分钟，得到培养基(2)，在无菌条件下用移液枪将由第(2)步得到的接种物和紫花苜蓿籽油接入培养基(2)中，接种量10％(v/v)，接油量20微升，用手摇匀后于35℃培养箱中培养24小时，制得发酵液；
(4)共轭亚油酸的提取：同实例1，经计算共轭转化率为27.849％。
实施例7
(1)培养基(1)的配制：同实施例1；
(2)种子液预培养：在无菌条件下用移液枪将紫花苜蓿籽油10微升和乳酸菌种液1ml加入到20ml培养基(1)中，于37℃培养箱中预培养10小时作为接种物，并用于下一步的乳酸菌发酵异构化。
(3)乳酸菌发酵异构化：按照培养基(1)的配方配制培养基，并用磷酸钠缓冲溶液将pH值调到7.4，高压灭菌20分钟，得到培养基(2)，在无菌条件下用移液枪将由第(2)步得到的接种物和紫花苜蓿籽油接入培养基(2)中，接种量15％(v/v)，接油量40微升，用手摇匀后于38℃培养箱中培养20小时，制得发酵液；
(4)共轭亚油酸的提取：同实例1，经计算共轭转化率为41.425％。
Claims (3)
1.一种共轭亚油酸的制备方法，其特征在于：它是以盐生植物紫花苜蓿种籽为原料，采用微生物发酵来制备共轭亚油酸的方法，具体步骤是：
第一步，培养基的配制
将市购的牛肉浸膏8～12g、葡萄糖20g、柠檬酸铵1～3g、蛋白胨10～12g、酵母浸粉3～6g、乙酸钠4～6g、磷酸氢二钾1～3g、硫酸镁0.1～0.3g、硫酸锰0.03～0.06g、吐温801～2g混合加蒸馏水至一升，调节pH值为6.2～6.6，高压灭菌20分钟，得到培养基(1)；
第二步，种子液预培养
在无菌条件下用移液枪将紫花苜蓿籽油5～30微升和乳酸菌种加入到上述制得的培养基(1)中，接种量的v/v为5％，摇匀后于35～38℃预培养8～14小时作为接种物；
第三步，乳酸菌发酵异构化
用磷酸钠缓冲溶液将第一步得到的培养基(1)的pH值调到5.8～8.0，高压灭菌20分钟，得到培养基(2)，在无菌条件下用移液枪将由第二步制得的接种物和紫花苜蓿籽油接入培养基(2)，接种量的v/v为5～15％，接油量为10～40微升，摇匀后于35～38℃培养20～24小时，制得发酵液；
第四步，共轭亚油酸的提取
从第三步制得的发酵液中取出1ml于试管中，将异丙醇2ml加入该试管中溶解发酵液，再加入正己烷1ml于试管中，将该试管放入振荡器进行振荡，使正己烷充分萃取发酵液中的共轭亚油酸为止，再将所得混合物置于离心机中以4000转/分钟的转速离心20分钟，然后吸出上层的正己烷层并用水洗，将正己烷层收集后用旋转蒸发器于35℃旋转蒸发20分钟，即制得共轭亚油酸。
2.根据权利要求1所述的一种共轭亚油酸的制备方法，其特征在于：在第二步中所用的乳酸菌种是菌种编号为6026的乳酸菌Lactobacillus plantarum。
3.根据权利要求1所述的一种共轭亚油酸的制备方法，其特征在于：在制得共轭亚油酸的同时回收正己烷。
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