CN105039444B - 有机介质中生物合成共轭亚油酸异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
有机介质中生物合成共轭亚油酸异构体的方法，包括以下步骤：（1）将干酪乳杆菌CGMCC 1.574菌体重悬于脉冲介质中，经脉冲电场处理后，离心收集菌体；（2）用50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液洗涤后，离心收集菌体，将每克湿菌体重悬于20mL50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液中，加入菌悬液体积0.5‑2.0%的吐温‑80混合均匀，4‑40℃处理2‑6h，离心收集菌体，冷冻干燥后得到包衣菌体；（3）将每克包衣菌体加入到600mL正己烷中，搅拌均匀，加入正己烷体积0.1‑0.3%的亚油酸，4‑40℃下反应1‑12h；（4）离心分离包衣菌体，回收正己烷，产物为c9,t11‑共轭亚油酸异构体。本发明反应时间短，包衣菌体可重复使用多次，产量得到了显著提高，无环境污染，生产成本显著降低。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。
背景技术
共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA) 是一组十八碳共轭二烯酸的统称，共轭双键有4种位置异构（8,10; 9,11; 10,12; 11,13）和4种几何异构（cis,cis; cis,trans; trans,cis; trans,trans），共有多达16种异构体，如：c9,t11-CLA和t10,c12-CLA异构体等。研究发现CLA具有抗癌、预防动脉粥样硬化、增强机体免疫力、抗糖尿病等生理功能，且越来越多的研究表明其生理活性具有异构体特异性，现在普遍认为c9,t11-CLA异构体具有抗癌和预防动脉粥样硬化的作用。在自然界中，CLA主要存在于反刍动物的奶和肉中的脂肪中，主要由c9,t11-CLA和少量t9,t11-CLA，t10,c11-CLA等异构体构成，但其含量通常都小于10mg/g脂肪，无法满足以保健和医疗为目的的开发应用。
为实现CLA异构体的大量制备，人们已对微生物发酵制备CLA进行了较多研究。目前，微生物发酵均在水溶液中进行，由于所加的发酵底物—亚油酸是脂溶性物质，因此亚油酸加入发酵液前需经乳化处理，且添加量受到限制，从发酵液中获得CLA产物需经有机溶剂萃取，整个生产工艺存在发酵周期长、生产成本高、产量低的缺点。发明专利CN201110105610提出了一种植物乳杆菌生物转化共轭亚油酸的方法，底物添加量为25mg/mL，发酵时间长达120h，CLA的产量只有1.02mg/mL，底物的转化率只有4%。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种有机介质中生物合成共轭亚油酸异构体的方法，显著缩短合成时间、提高产量和转化率、降低生产成本。
本发明包括以下步骤。
（1）菌体的电穿孔处理：收集处于对数生长期的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌体，用脉冲介质洗涤，将菌体重悬于脉冲介质中（所述脉冲介质为100mM的蔗糖，50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液，体积百分比0.1%的吐温-80），菌体浓度为1×109cfu/mL，冰浴10min，经电场强度为10kV/cm、脉冲宽度为20μs的脉冲电场处理10次，每次间隔时间为2s，处理后离心收集菌体。
（2）菌体包衣处理：菌体用50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液洗涤后，离心收集菌体，按每克湿菌体重悬于20mL50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液中计，将湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液中，加入菌悬液体积百分比0.5-2.0%的吐温-80混合均匀，于4-40℃处理2-6h，离心收集菌体，将菌体冷冻干燥后得到包衣菌体。
（3）有机介质中生物合成：按每克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中计，将包衣菌体加入到正己烷中，搅拌均匀，加入正己烷体积百分比0.1-0.3%的亚油酸，在4-40℃下反应1-12h。
（4）产物收集：离心分离包衣菌体，将正己烷溶液进行减压蒸馏，回收正己烷，产物为c9,t11-共轭亚油酸异构体。
本发明所述的步骤（2）中吐温-80的加入量优选为菌悬液体积百分比的0.75-1.5%。
本发明所述的步骤（2）中处理温度优选为4-25℃。
本发明所述的步骤（2）中处理时间优选为3-5h。
本发明所述的步骤（3）中优选加入正己烷体积百分比0.125-0.25%的亚油酸，在15-30℃下反应2-6h。
本发明所述的步骤（4）中包衣菌体可重复用于有机介质中生物合成c9,t11-共轭亚油酸异构体。
本发明所用的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574，系中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏菌株，编号为1.574，该菌株能产生特异性的亚油酸异构酶，通过生物异构化可将亚油酸转化成c9,t11-CLA异构体。目前，还没有分离到有确切催化活性的亚油酸异构酶纯品。因此，该异构化反应可能是由多酶体系共同催化完成。
通过该有机介质中生物合成方法，在优化条件下，含体积百分比0.15%亚油酸的正己烷溶液反应后所含c9,t11-CLA异构体的体积百分比为0.1392%，亚油酸的转化率为92.8%。本发明所述的步骤（4）中包衣菌体可重复用于步骤（3）的有机介质中生物合成c9,t11-CLA异构体，包衣菌体重复使用五次后，其催化活性仍大于90%。
针对现有微生物发酵合成CLA均在水溶液中进行，整个生产工艺存在发酵周期长，从发酵液中提取CLA产物困难，菌体不能重复使用，生产成本高，产量低等诸多缺点。本发明提出了在有机介质中生物合成c9,t11-CLA的新方法。该方法首先通过脉冲电场处理干酪乳杆菌CGMCC 1.574，在保持菌体完整性的同时，提高菌体细胞壁和细胞膜的通透性，一方面可以确保在后续包衣处理时细胞内的亚油酸异构酶表面能形成完整包衣层，另一方面可以提高反应底物亚油酸和产物CLA进出菌体的速率，减少高浓度底物和产物对催化反应的抑制作用，大大缩短反应时间。
本发明选用吐温-80对菌体进行包衣，吐温-80分子中含有一个油酸基团，油酸和亚油酸结构相似，是菌体中亚油酸异构酶底物的结构类似物，在菌体包衣时，能在酶的催化活性中心形成分子印迹，使菌体在冷冻干燥后酶的催化活性中心构象不变，在有机溶剂中也保持较高的催化活性。同时，本发明结合在菌体包衣处理过程中选用合适的磷酸盐缓冲液、吐温-80浓度和包衣温度、时间，使所得包衣菌体在有机溶剂中仍具有较高的催化能力。包衣后菌体中酶的热稳定性提高，每批次反应时间仅需4h，远小于传统水溶液中批次发酵所需的数天时间。
本发明所得包衣菌体在正己烷中有较高催化活性，只需离心分离包衣菌体，将正己烷溶液进行减压蒸馏，回收正己烷，即可得到产物c9,t11-CLA。离心所得包衣菌体可多次重复用于有机介质中生物合成c9,t11-CLA异构体，显著缩短了生产时间，提高了产量，降低了生产成本。此外，正己烷是食用油脂工业常用的有机溶剂，这也保证了本发明所得c9,t11-CLA的使用安全性。
本发明与现有技术相比具有如下优点。
本发明直接对菌体进行包衣处理，作为固定化酶用于催化反应，一方面减少了酶分离纯化的成本，避免了酶在提取时活性的损失；另一方面可以将多酶体系包在一起，使整个反应过程得以顺利进行；再者包衣菌体颗粒大于包衣酶，易于从反应溶液中分离出来，且过滤阻力较小，因此，包衣菌体更加适合用于连续反应的柱式反应器。
本发明通过包衣菌体在有机介质中进行生物合成反应，避免了在传统水溶液反应体系中底物亚油酸溶解度低和产物CLA提取困难的问题。包衣菌体中酶的热稳定性提高，每批次反应时间仅需4h，远小于传统水溶液中发酵所需的数天时间。包衣菌体可重复使用多次，显著提高产品产量，且无环境污染，可显著降低生产成本；而传统水溶液体系发酵液中的菌体只能使用一次，生产成本高，且发酵废液处理费用高，易污染环境。
具体实施方式
本发明通过以下实施例作进一步地说明。
实施例1。
将活化的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌种接种到MRS培养基中，于30℃下培养20h，5000g离心10min收集菌体，将10克湿菌体用50mL含100mM蔗糖、50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）、体积百分比0.1%吐温-80的脉冲介质洗涤，5000g离心10min收集菌体，将菌体重悬于脉冲介质中，调整菌体浓度为1×109cfu/mL，冰浴10min，用电场强度10kV/cm、脉冲宽度20μs的脉冲电场处理，脉冲数10次，每次间隔时间2s，经脉冲电场处理后，5000g离心10min得到电穿孔菌体。
电穿孔菌体用40mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）洗涤后，6000g离心10min收集菌体，将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）中，加入2mL吐温-80并混合均匀，于4℃搅拌处理4h，6000g离心10min收集菌体，菌体经-80℃预冻后进行冷冻干燥，得到包衣菌体。
将1克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中，搅拌均匀，加入0.9mL亚油酸，在25℃下搅拌反应4h。6000g离心分离包衣菌体，将正己烷溶液在40℃进行减压蒸馏，回收正己烷，得到0.9mL产物，其中c9,t11-CLA的含量为92.8%。将收集到的包衣菌体重复用于上述合成反应，连续使用五次时产物中c9,t11-CLA的含量为90.7%。
实施例2。
将活化的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌种接种到MRS培养基中，于30℃下培养18h，4000g离心5min收集菌体，将10克湿菌体用50mL含100mM蔗糖、50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）、体积百分比0.1%吐温-80的脉冲介质洗涤，4000g离心10min收集菌体，将菌体重悬于脉冲介质中，调整菌体浓度为1×109cfu/mL，冰浴10min，用电场强度10kV/cm、脉冲宽度20μs的脉冲电场处理，脉冲数10次，每次间隔时间2s，经脉冲电场处理后，5000g离心5min得到电穿孔菌体。
电穿孔菌体用40mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）洗涤后，5000g离心5min收集菌体，将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）中，加入4mL吐温-80并混合均匀，于4℃搅拌处理2h，6000g离心5min收集菌体，菌体经-80℃预冻后进行冷冻干燥，得到包衣菌体。
将1克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中，搅拌均匀，加入1.8mL亚油酸，在40℃下搅拌反应12h。6000g离心分离包衣菌体，将正己烷溶液在40℃进行减压蒸馏，回收正己烷，得到1.8mL产物，其中c9,t11-CLA的含量为81.4%。将收集到的包衣菌体重复用于上述合成反应，连续使用五次时产物中c9,t11-CLA的含量为70.9%。
实施例3。
将活化的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌种接种到MRS培养基中，于30℃下培养18h，4000g离心5min收集菌体，将10克湿菌体用50mL含100mM蔗糖、50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）、体积百分比0.1%吐温-80的脉冲介质洗涤，4000g离心10min收集菌体，将菌体重悬于脉冲介质中，调整菌体浓度为1×109cfu/mL，冰浴10min，用电场强度10kV/cm、脉冲宽度20μs的脉冲电场处理，脉冲数10次，每次间隔时间2s，经脉冲电场处理后，5000g离心5min得到电穿孔菌体。
电穿孔菌体用40mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）洗涤后，5000g离心5min收集菌体，将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）中，加入1mL吐温-80并混合均匀，于4℃搅拌处理6h，6000g离心5min收集菌体，菌体经-80℃预冻后进行冷冻干燥，得到包衣菌体。
将1克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中，搅拌均匀，加入0.6mL亚油酸，在4℃下搅拌反应6h。6000g离心分离包衣菌体，将正己烷溶液在40℃进行减压蒸馏，回收正己烷，得到0.6mL产物，其中c9,t11-CLA的含量为91.8%。将收集到的包衣菌体重复用于上述合成反应，连续使用五次时产物中c9,t11-CLA的含量为86.1%。
实施例4。
将活化的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌种接种到MRS培养基中，于30℃下培养20h，5000g离心10min收集菌体，将10克湿菌体用50mL含100mM蔗糖、50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）、体积百分比0.1%吐温-80的脉冲介质洗涤，5000g离心10min收集菌体，将菌体重悬于脉冲介质中，调整菌体浓度为1×109cfu/mL，冰浴10min，用电场强度10kV/cm、脉冲宽度20μs的脉冲电场处理，脉冲数10次，每次间隔时间2s，经脉冲电场处理后，5000g离心10min得到电穿孔菌体。
电穿孔菌体用40mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）洗涤后，6000g离心10min收集菌体，将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）中，加入2mL吐温-80并混合均匀，于4℃搅拌处理4h，6000g离心10min收集菌体，菌体经-80℃预冻后进行冷冻干燥，得到包衣菌体。
将1克冻干包衣菌体装入柱式生物反应器中，将0.9mL亚油酸加入到300mL正己烷中混匀，通过泵将含亚油酸的正己烷溶液注入反应器，流量为3mL/min，收集流出液，将流出液重复注入反应器2次，收集流出液，在40℃进行减压蒸馏，回收正己烷，得到0.9mL产物，其中c9,t11-CLA的含量为91.5%。通过将数个柱式生物反应器串联在一起，可以实现连续生产。
Claims (5)
1.有机介质中生物合成共轭亚油酸异构体的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）收集处于对数生长期的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌体，用脉冲介质洗涤后，将菌体重悬于脉冲介质中，菌体浓度为1×109cfu/mL，冰浴10min，经电场强度为10kV/cm、脉冲宽度为20μs的脉冲电场处理10次，每次间隔时间为2s，处理后离心收集菌体；
（2）菌体用50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液洗涤后，离心收集菌体，按每克湿菌体重悬于20mL50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液中计，将湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液中，加入菌悬液体积百分比0.5-2.0%的吐温-80混合均匀，于4-40℃处理2-6h，离心收集菌体，将菌体冷冻干燥后得到包衣菌体；
（3）按每克包衣菌体加入到600mL正己烷中计，将包衣菌体加入到正己烷中，搅拌均匀，加入正己烷体积百分比0.1-0.3%的亚油酸，在4-40℃下反应1-12h；
（4）离心分离包衣菌体，将正己烷溶液进行减压蒸馏，回收正己烷，产物为c9,t11-共轭亚油酸异构体；
步骤（1）所述的脉冲介质为100mM的蔗糖，50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液，体积百分比0.1%的吐温-80。
2.根据权利要求1所述的有机介质中生物合成共轭亚油酸异构体的方法，其特征是步骤（2）中所述的吐温-80的加入量为菌悬液体积百分比的0.75-1.5%。
3.根据权利要求1所述的有机介质中生物合成共轭亚油酸异构体的方法，其特征是步骤（2）中所述的处理温度为4-25℃。
4.根据权利要求1所述的有机介质中生物合成共轭亚油酸异构体的方法，其特征是步骤（2）中所述的处理时间为3-5h。
5.根据权利要求1所述的有机介质中生物合成共轭亚油酸异构体的方法，其特征是步骤（3）中加入正己烷体积百分比0.125-0.25%的亚油酸，在15-30℃下反应2-6h。
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