CN105039440B - 包衣菌体在有机介质中生物合成共轭α-亚麻酸异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
包衣菌体在有机介质中生物合成共轭α‑亚麻酸异构体的方法，包括以下步骤：（1）将每克干酪乳杆菌CGMCC 1.574菌体重悬于5mL透性化处理液中，37℃处理20min，离心收集透性化菌体；（2）用50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液洗涤后，离心收集菌体，将每克透性化湿菌体重悬于20mL50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液中，加入菌悬液体积0.5‑2.0%的吐温‑20混合均匀，4‑40℃处理2‑6h，离心收集菌体，冷冻干燥后得到包衣菌体；（3）将每克包衣菌体加入到600mL正己烷中，搅拌均匀，加入正己烷体积0.1‑0.3%的α‑亚麻酸，4‑40℃下反应1‑12h；（4）离心分离包衣菌体，回收正己烷，产物为c9,t11,c15‑共轭α‑亚麻酸异构体；本发明反应时间短，包衣菌体可重复使用多次，产量得到了显著提高，无环境污染，显著降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。
背景技术
共轭α-亚麻酸是α-亚麻酸的共轭异构体，是一组十八碳共轭三烯酸的统称，有多种位置异构和几何异构体，如：c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸和t10,c12,c15-共轭α-亚麻酸异构体等。研究表明共轭α-亚麻酸具有抗癌、预防动脉粥样硬化、减肥等生理功能，且其生理活性具有异构体特异性，如：c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸异构体具有抗癌的作用。在自然界中，共轭α-亚麻酸主要存在于反刍动物的奶和肉的脂肪中，主要由c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸等异构体构成，但其含量通常十分低，无法满足以保健和医疗为目的的开发应用。
为实现共轭α-亚麻酸的大量制备，人们已对微生物发酵合成共轭α-亚麻酸进行了一些研究。目前，微生物发酵均在水溶液中进行，由于所加的发酵底物—α-亚麻酸是脂溶性物质，因此α-亚麻酸加入发酵液前需经乳化处理，且添加量受到限制，从发酵液中获得共轭α-亚麻酸产物需经有机溶剂萃取，整个生产工艺存在发酵周期长、生产成本高、产量低的缺点。发明专利CN200410060670.9报道了通过干酪乳杆菌CGMCC 1.574来特异性生物合成c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸异构体的方法，底物添加量为1mg/mL，发酵时间长达42h，底物的转化率小于50%，且菌体不能重复利用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种包衣菌体在有机介质中生物合成共轭α-亚麻酸异构体的方法，显著缩短合成时间、提高产量和转化率、降低生产成本。
本发明包括以下步骤。
（1）菌体的透性化处理：收集处于对数生长期的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌体，按每克湿菌体重悬于5mL透性化处理液中计，将湿菌体重悬于透性化处理液中（所述透性化处理液为体积百分比0.5-3.0%的曲拉通X-100，5-50μM的α-亚麻酸，20-200mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液），重悬菌体经37℃处理20min，离心收集透性化菌体。
（2）菌体包衣处理：透性化菌体用50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液洗涤后，离心收集菌体，按每克透性化湿菌体重悬于20mL50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液中计，将透性化湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液中，加入菌悬液体积百分比0.5-2.0%的吐温-20混合均匀，于4-40℃处理2-6h，离心收集菌体，将菌体冷冻干燥后得到包衣菌体。
（3）有机介质中生物合成：按每克包衣菌体加入到600mL正己烷中计，将包衣菌体加入到正己烷中，搅拌均匀，加入正己烷体积百分比0.1-0.3%的α-亚麻酸，在4-40℃下反应1-12h。
（4）产物收集：离心分离包衣菌体，将正己烷溶液进行减压蒸馏，回收正己烷，产物为c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸异构体。
本发明所述的步骤（1）中透性化处理液优选为体积百分比1.0-2.0%的曲拉通X-100，15-35μM的α-亚麻酸，30-100mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液。
本发明所述的步骤（2）中吐温-20的加入量优选为菌悬液体积百分比的0.75-1.5%。
本发明所述的步骤（2）中处理温度优选为4-25℃。
本发明所述的步骤（2）中处理时间优选为3-5h。
本发明所述的步骤（3）中优选加入正己烷体积百分比0.125-0.25%的α-亚麻酸，在15-30℃下反应2-6h。
本发明所述的步骤（4）中包衣菌体可重复用于有机介质中生物合成c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸异构体。
本发明所用的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574，系中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏菌株，编号为1.574，该菌株能产生特异性的亚油酸异构酶，能将多不饱和脂肪酸中的c9,c12双键异构成c9,t11共轭双键，通过生物异构化可将α-亚麻酸转化成c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸异构体。目前，还没有从该菌中分离到有确切催化活性的异构酶纯品。因此，该异构化反应可能是由多酶体系共同催化完成。
通过该包衣菌体在有机介质中生物合成方法，在优化条件下，含体积百分比0.15%α-亚麻酸的正己烷溶液反应后所合成c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸异构体的含量为体积百分比0.138%，α-亚麻酸的转化率为92.0%。本发明所述的步骤（4）中包衣菌体可重复用于步骤（3）的有机介质中生物合成c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸异构体，包衣菌体重复使用五次后，其催化活性仍大于90%。
针对现有微生物发酵合成共轭α-亚麻酸均在水溶液中进行，整个生产工艺存在发酵周期长，从发酵液中提取共轭α-亚麻酸产物困难，菌体不能重复使用，生产成本高，产量低等诸多缺点。本发明提出了通过微生物菌体在有机介质中将α-亚麻酸催化合成共轭α-亚麻酸的新方法。该方法首先通过曲拉通X-100处理干酪乳杆菌CGMCC 1.574，在保持菌体完整性的同时，提高菌体细胞壁和细胞膜的通透性，一方面可以确保在后续包衣处理时细胞内的异构酶表面能形成完整包衣层，另一方面可以提高反应底物α-亚麻酸和产物共轭α-亚麻酸进出菌体的速率，减少高浓度底物和产物对催化反应的抑制作用，大大缩短反应时间。
本发明在透性化处理菌体时，加入5-50μM的α-亚麻酸，α-亚麻酸可以和菌体中亚油酸异构酶催化活性中心结合，在菌体包衣处理时，能在酶的催化活性中心形成分子印迹，使菌体在冷冻干燥后酶的催化活性中心构象不变，能在有机介质中保持较高的催化活性。同时，本发明结合在菌体包衣处理过程中选用合适的磷酸盐缓冲液、吐温-20浓度和包衣温度、时间，使所得包衣菌体在有机介质中仍具有较高的催化能力。包衣后菌体中酶的热稳定性提高，每批次反应时间仅需4h，远小于传统水溶液中批次发酵所需的数天时间。
本发明所得包衣菌体在正己烷中有较高催化活性，只需离心分离包衣菌体，将正己烷溶液进行减压蒸馏，回收正己烷，即可得到产物c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸。离心所得包衣菌体可多次重复用于有机介质中生物合成c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸异构体，显著缩短了生产时间，提高了产量，降低了生产成本。此外，正己烷是食用油脂工业常用的有机溶剂，这也保证了本发明所得c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸的使用安全性。
本发明与现有技术相比具有如下优点。
本发明直接对菌体进行包衣处理，作为固定化酶用于催化反应，一方面减少了酶分离纯化的成本，避免了酶在提取时活性的损失；另一方面可以将多酶体系包在一起，使整个反应过程得以顺利进行；再者包衣菌体颗粒大于包衣酶，易于从反应溶液中分离出来，且过滤阻力较小，因此，包衣菌体更加适合用于连续反应的柱式反应器。
本发明通过包衣菌体在有机介质中进行催化反应，避免了在传统水溶液反应体系中底物α-亚麻酸溶解度低和产物共轭α-亚麻酸提取困难的问题。包衣菌体中酶的热稳定性提高，每批次反应时间仅需4h，远小于传统水溶液中发酵所需的数天时间。包衣菌体可重复使用多次，显著提高产品产量，且无环境污染，可显著降低生产成本；而传统水溶液体系发酵液中的菌体只能使用一次，生产成本高，且发酵废液处理费用高，易污染环境。
具体实施方式
本发明通过以下实施例作进一步地说明。
实施例1。
将活化的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌种接种到MRS培养基中，于30℃下培养20h，5000g离心10min收集菌体，将10克湿菌体重悬于50mL含体积百分比1.5%的曲拉通X-100、25μM的α-亚麻酸和50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）的透性化处理液中，37℃水浴处理20min，5000g离心10min得到透性化菌体。
透性化菌体用50mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）洗涤后，6000g离心10min收集菌体，将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）中，加入2 mL吐温-20并混合均匀，于4℃搅拌处理4h，6000g离心10min收集菌体，菌体经-80℃预冻后进行冷冻干燥，得到包衣菌体。
将1克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中，搅拌均匀，加入0.9mLα-亚麻酸，在25℃下搅拌反应4h。6000g离心分离包衣菌体，将正己烷溶液在40℃进行减压蒸馏，回收正己烷，得到0.9mL产物，其中c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸的含量为92.0%。将收集到的包衣菌体重复用于上述合成反应，连续使用五次时产物中c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸的含量为90.5%。
实施例2。
将活化的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌种接种到MRS培养基中，于30℃下培养18h，4000g离心5min收集菌体，将10克湿菌体重悬于50mL含体积百分比3.0%的曲拉通X-100、5μM的α-亚麻酸和200mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）的透性化处理液中，37℃水浴处理20min，4000g离心10min得到透性化菌体。
透性化菌体用50mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）洗涤后，5000g离心10min收集菌体，将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）中，加入4mL吐温-20并混合均匀，于4℃搅拌处理2h，5000g离心10min收集菌体，菌体经-80℃预冻后进行冷冻干燥，得到包衣菌体。
将1克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中，搅拌均匀，加入1.8mLα-亚麻酸，在40℃下搅拌反应12h。6000g离心分离包衣菌体，将正己烷溶液在40℃进行减压蒸馏，回收正己烷，得到1.8mL产物，其中c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸的含量为80.3%。将收集到的包衣菌体重复用于上述合成反应，连续使用五次时产物中c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸的含量为70.2%。
实施例3。
将活化的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌种接种到MRS培养基中，于30℃下培养18h，4000g离心5min收集菌体，将10克湿菌体重悬于50mL含体积百分比0.5%的曲拉通X-100、50μM的α-亚麻酸和20mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）的透性化处理液中，37℃水浴处理20min，4000g离心10min得到透性化菌体。
透性化菌体用50mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）洗涤后，5000g离心10min收集菌体，将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）中，加入1mL吐温-20并混合均匀，于4℃搅拌处理6h，5000g离心10min收集菌体，菌体经-80℃预冻后进行冷冻干燥，得到包衣菌体。
将1克冻干包衣菌体加入到600mL正己烷中，搅拌均匀，加0.6mLα-亚麻酸，在4℃下搅拌反应6h。6000g离心分离包衣菌体，将正己烷溶液在40℃进行减压蒸馏，回收正己烷，得到0.6mL产物，其中c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸的含量为89.8%。将收集到的包衣菌体重复用于上述合成反应，连续使用五次时产物中c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸的含量为82.4%。
实施例4。
将活化的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌种接种到MRS培养基中，于30℃下培养20h，5000g离心10min收集菌体，将10克湿菌体重悬于50mL含体积百分比1.5%的曲拉通X-100、25μM的α-亚麻酸和50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）的透性化处理液中，37℃水浴处理20min，5000g离心10min得到透性化菌体。
透性化菌体用50mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）洗涤后，6000g离心10min收集菌体，将湿菌体重悬于200mL50mM磷酸盐缓冲液（pH5.8）中，加入2 mL吐温-20并混合均匀，于4℃搅拌处理4h，6000g离心10min收集菌体，菌体经-80℃预冻后进行冷冻干燥，得到包衣菌体。
将1克冻干包衣菌体装入柱式生物反应器中，将0.9mLα-亚麻酸加入到300mL正己烷中混匀，通过泵将含α-亚麻酸的正己烷溶液注入反应器，流量为3mL/min，收集流出液，将流出液重复注入反应器2次，收集流出液，在40℃进行减压蒸馏，回收正己烷，得到0.9mL产物，其中c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸的含量为90.5%。通过将数个柱式生物反应器串联在一起，可以实现连续生产。
Claims (6)
1.包衣菌体在有机介质中生物合成共轭α-亚麻酸异构体的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）收集处于对数生长期的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌体，按每克湿菌体重悬于5mL透性化处理液中计，将湿菌体重悬于透性化处理液中，重悬菌体经37℃处理20min，离心收集透性化菌体；
（2）透性化菌体用50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液洗涤后，离心收集菌体，按每克透性化湿菌体重悬于20mL 50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液中计，将透性化湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液中，加入菌悬液体积百分比0.5-2.0%的吐温-20混合均匀，于4-40℃处理2-6h，离心收集菌体，将菌体冷冻干燥后得到包衣菌体；
（3）按每克包衣菌体加入到600mL正己烷中计，将包衣菌体加入到正己烷中，搅拌均匀，加入正己烷体积百分比0.1-0.3%的α-亚麻酸，在4-40℃下反应1-12h；
（4）离心分离包衣菌体，将正己烷溶液进行减压蒸馏，回收正己烷，产物为c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸异构体；
步骤（1）所述的透性化处理液为体积百分比0.5-3.0%的曲拉通X-100，5-50μM的α-亚麻酸，20-200mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的包衣菌体在有机介质中生物合成共轭α-亚麻酸异构体的方法，其特征是步骤（1）中所述的透性化处理液为体积百分比1.0-2.0%的曲拉通X-100，15-35μM的α-亚麻酸，30-100mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的包衣菌体在有机介质中生物合成共轭α-亚麻酸异构体的方法，其特征是步骤（2）中所述的吐温-20的加入量为菌悬液体积百分比的0.75-1.5%。
4.根据权利要求1所述的包衣菌体在有机介质中生物合成共轭α-亚麻酸异构体的方法，其特征是步骤（2）中所述的处理温度为4-25℃。
5.根据权利要求1所述的包衣菌体在有机介质中生物合成共轭α-亚麻酸异构体的方法，其特征是步骤（2）中所述的处理时间为3-5h。
6.根据权利要求1所述的包衣菌体在有机介质中生物合成共轭α-亚麻酸异构体的方法，其特征是步骤（3）中加入正己烷体积百分比0.125-0.25%的α-亚麻酸，在15-30℃下反应2-6h。
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