CN101654695B - 一种添加海藻糖强化2-酮基-l-古龙酸生产强度的方法 - Google Patents

一种添加海藻糖强化2-酮基-l-古龙酸生产强度的方法 Download PDF

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一种添加海藻糖强化2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，属于发酵制备维生素C技术领域。本发明利用酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)混合菌系为生产菌株，通过在发酵培养基中外源添加10mmol·L-1海藻糖作为渗透保护剂，促进细胞生长和2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的生产，实现2-KLG高效生产。高渗(1067.5mOsmol·kg-1)条件下添加10mmol·L-1海藻糖，2-KLG含量在72h时为56.83g·L-1，为对照组(高渗条件下不加海藻糖)29.24g·L-1的1.94倍。正常发酵(不加NaCl)条件下添加10mmol·L-1海藻糖，发酵周期缩短至52h，终点产酸达到69.38g·L-1，L-山梨糖消耗速度和2-KLG生产强度分别提高了43.1％和45.5％。

Description

一种添加海藻糖强化2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法
技术领域
一种添加海藻糖强化2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，属于发酵制备维生素C技术领域。
背景技术
维生素C(即L-抗坏血酸)是人体必需的一种维生素，生理作用广泛，在医药、食品工业上均有重要用途，在整个维生素类药物生产中占有十分重要的地位。目前我国维生素C生产主要采用“二步发酵法”。该工艺的主要特点在于第二步发酵，即从L-山梨糖到2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的转化需要由酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare，通称“小菌”)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，通称“大菌”)搭配而成的组合菌系进行混合发酵。
虽然“二步发酵法”以微生物发酵代替了化学合成法，简化了工艺，减少了污染，降低了成本，但现在仍未完全发挥其潜在的生产能力。比如，工业发酵过程中的补糖以及为维持pH稳定所采取的补碱措施都会引起培养体系渗透压的上升，从而抑制组合菌系的产酸能力。因此，提高菌株对高渗的耐受能力，从而加强2-KLG的生产强度是非常有必要的。
海藻糖是一种独特的非还原性二糖，能够作为相容性溶质使受渗透胁迫的细胞保持稳定。此外，在其它环境胁迫下，如热胁迫、脱水、缺氧等，也常常涉及海藻糖的积累来提高细胞的生存能力。因此，海藻糖是一种优良的胁迫保护剂。目前，添加海藻糖提高混合菌系对高渗的耐受能力，从而加强2-KLG的生产强度尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种添加海藻糖作为渗透保护剂，促进酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)混合菌系细胞生长和2-KLG生产，加强2-KLG生产强度，缩短发酵周期的方法。
1、菌株
酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)DSM 4025及巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)ATCC 21916，由江苏江山制药有限公司(江苏靖江)提供。
2、培养基和培养方法
种子培养基(g·L-1)：L-山梨糖20，酵母膏3，牛肉膏3，大豆蛋白胨10，玉米浆1.5，尿素1，KH2PO4 1，MgSO4 2，CaCO3 1。
发酵培养基(g·L-1)：L-山梨糖80，玉米浆5，尿素12，KH2PO4 1，MgSO4 1，CaCO3 5。NaCl作为渗透压调节剂，根据要求适量添加。渗透保护剂海藻糖添加浓度为10mmol·L-1。
所有培养基由自来水配置并用2mol·L-1NaOH调节pH为6.7～7.0。L-山梨糖和氮源分开灭菌，灭菌条件为121℃，15min。
3、大菌与小菌混合菌系的培养
用接种环挑取新鲜平板上小菌单菌落两环，再挑取大菌单菌落一环，于无菌水中制成混菌悬液，取混菌悬液涂斜面，30℃培养48h；取斜面混合菌0.4mL接种于种子培养液75mL/750mL摇瓶中。30℃，200rpm下培养18h，即制成大小菌混合菌系，接入甘油管中进行保藏。
4、培养方法：从冷冻甘油管中取混菌保藏培养物种液10mL接入发酵培养基(75mL/750mL摇瓶)，30℃，200rpm培养72h，定期取样测定参数。
5、分析方法
菌体浓度测定：取适量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加入等体积2mol·L-1盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，再加入去离子水定容至10mL，摇匀，用UV 7500型可见分光光度计，于660nm处比色测OD值。
渗透压测定：用冰点渗透压计测定。
2-KLG与L-山梨糖含量的测定：采用高效液相色谱(HPLC)测定。色谱柱：Aminex HPX-87H(Bio-Rad)，流动相：0.005mol·L-1H2SO4，流速：0.5mL·min-1，柱温：35℃，进样量：5μL，检测器：示差折光检测器。
本发明的有益效果：在高渗(1067.5mOsmol·kg-1)条件下添加10mmol·L-1海藻糖，2-KLG含量在72h时为对照组(高渗条件下不加海藻糖)29.23g·L-1的1.94倍。正常发酵(不加NaCl)时添加10mmol·L-1海藻糖，发酵周期缩短到52h，终点产酸达到69.38g·L-1，L-山梨糖消耗速度和2-KLG生产强度分别提高了43.1％和45.5％。
具体实施方式
对照实施例：本发明所用的菌种为酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)混合菌系。从冷冻甘油管中取混菌保藏培养物0.4mL接入种子培养基(75mL/750mL摇瓶)，30℃，200rpm培养18h。再取种液10mL接入发酵培养基(75mL/750mL摇瓶)，30℃，200rpm培养72h。正常发酵(652.5mOsmol·kg-1，不加NaCl)时，终点2-KLG和L-山梨糖浓度分别为66.04g·L-1，7.58g·L-1。高渗(1067.5mOsmol·kg-1，加NaCl)条件下，终点2-KLG浓度为29.24g·L-1。
实施例1：在正常发酵(652.5mOsmol·kg-1，不加NaCl)和高渗胁迫(1067.5mOsmol·kg-1，加NaCl)发酵培养基中分别添加10mmol·L-1海藻糖，其余条件同对照实施例。正常发酵(652.5mOsmol·kg-1，不加NaCl)条件下添加10mmol·L-1海藻糖，52h时2-KLG与L-山梨糖浓度分别为69.38g·L-1，3.33g·L-1。高渗(1067.5mOsmol·kg-1，加NaCl)条件下添加10mmol·L-1海藻糖，72h时2-KLG浓度为56.83g·L-1。

Claims (1)

1.一种添加海藻糖强化2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征是利用酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)混合菌系为生产菌株，发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸，通过在发酵培养基中添加海藻糖10mmol·L-1，在过程中作为渗透保护剂，提高耐高渗能力，促进细胞生长和2-酮基-L-古龙酸的生产，实现2-酮基-L-古龙酸高效生产。
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