CN110055231A - 一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法，取PDA固体培养基上生长的产漆酶菌种菌丝部分，放置于PDA液体培养基表面静置培养3‑5d，再将培养好的菌丝块磨碎，转入新的PDA液体培养基中，震荡培养3‑5d之后发酵产酶。本发明发酵操作简单，成本低廉，缩短了发酵周期，提高了漆酶产量，同时减少了药渣废弃物对环境的污染，变废为宝。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于中药渣和白腐真菌发酵产漆酶酶液的方法。
背景技术
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族。白腐真菌漆酶由于具有较高的氧化还原电势和非常广泛的底物范围，可以催化氧化多种芳香族化合物和木素类化合物，因此广泛受到人们关注。其在纸浆生物漂白、有机染料脱色、工业废水处理等方面表现出了很大的研究价值和应用潜力。但是传统实验室制备漆酶时使用高昂培养基，且发酵周期长，很大程度限制了漆酶的工业化应用。
近年来中药渣的排放量日益增大，传统的中药渣处理方法多采取堆积、焚烧以及掩埋的方式，不仅影响生态环境，也是对中药渣资源的极大浪费。中药渣中含有丰富的粗纤维及多种微量元素，与白腐菌发酵可以促进其菌丝体生长、诱导漆酶的表达。本发明旨在利用药渣废弃物为发酵原料，以蔗糖为碳源，利用低营养成分发酵培养基产漆酶，提高漆酶酶活，且缩短发酵周期，降低漆酶发酵成本且达到废弃物资源化利用的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法，该方法简单环保，以丹参药渣为主要原料进行漆酶生产，不仅可以提高漆酶的产量，而且充分利用了药渣废弃物，且发酵培养基仅以0.5％蔗糖为碳源，培养基营养成分低，仅依靠药渣作为诱导剂发酵产漆酶，在降低漆酶生产成本的同时，又减少了废弃物焚烧等对环境产生的影响。本发明是通过以下技术方案实现的：
一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法，包括如下步骤：
(1)种子液制备：取PDA固体培养基上生长的产漆酶菌种菌丝部分，放置于PDA液体培养基表面静置培养3-5d，再将培养好的菌丝块磨碎，转入新的PDA液体培养基中，震荡培养3-5d；
(2)发酵产酶：取步骤(1)制得的种子液接种至发酵培养基，恒温发酵；
所述液体发酵培养基各成分质量含量为：(NH4)2SO40.05％，蔗糖0.5％，MgSO4·6H2O0.05％，KH2PO40.05％，K2HPO40.05％，CuSO4·5H2O 0.001％，丹参单方药渣0.5％，pH自然；
(3)提取酶液：将发酵产物离心，上清即为漆酶酶液。
作为本发明的进一步改进，所述产漆酶菌为平菇、灵芝或云芝；优选灵芝。
作为本发明的进一步改进，所述液体发酵培养基中丹参单方药渣的质量含量为0.1～5.0％；优选0.5％。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)中，采用直径4-6mm的打孔器取一块产漆酶菌种菌丝，置于PDA液体培养基静置培养。
作为本发明的进一步改进，所述PDA固体培养基各成分质量含量为：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，琼脂2％；PDA液体培养基各成分质量含量为：马铃薯汁20％，葡萄糖2％。
作为本发明的进一步改进，静置培养、震荡培养、发酵培养的温度为28℃。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中，种子液接种量为10％。
作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中，发酵时间为64～120h。
本发明的优点及有效效果：
(1)采用中药渣作为发酵原料生产漆酶，充分利用了中药渣中的微量元素、纤维素、半纤维素、木质素等，达到了中药渣废弃物资源化利用的目的，变废为宝，避免了环境污染。
(2)药渣中的粗纤维含量高，在与白腐真菌发酵过程中被逐步分解，诱导漆酶的表达，提高了漆酶酶活。
(3)发酵培养基以廉价蔗糖为碳源，营养成分低，仅依靠药渣作为诱导剂发酵产漆酶，在降低漆酶生产成本的同时，又减少了废弃物焚烧等对环境产生的影响。
(4)药渣在发酵过程中促进菌丝体生长，缩短了漆酶发酵周期，节约时间成本。
附图说明
图1是丹参酮类诱导剂诱导灵芝发酵产漆酶；
图2是芳香族类诱导剂诱导灵芝发酵产漆酶。
具体实施方式
下面结合附图说明和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步阐述。
实施例中采用的菌株均购自中国农业微生物菌株保藏管理中心：灵芝(ACCC50247)、云芝(ACCC 51345)以及平菇(ACCC 50048)。
实施例中采用的漆酶活力的测定方法(ABTS法)：每分钟催化1μmol底物所需酶量定义为一个酶活单位(U)，其具体操作是:4mL反应体系中含0.5mmol/L的ABTS，0.1mol/LpH4.0的柠檬酸缓冲液，1mL适当稀释的粗酶液，35℃反应5min，在420nm处测吸光值，取吸光值线性变化部分计算酶活。
酶活计算公式为：
式中：
OD—吸光度OD的变化值；
V1—反应体系总体积；
n—酶液稀释倍数；
t—反应时间；
V2—反应体系中酶液的体积。
实施例1
丹参单方药渣(水浸提法)的基本组分信息。
参考NREL/TP-510–42618方法，对丹参单方药渣进行多糖、木质素、半纤维素以及纤维素等组分进行分析。参考蓝天凤,王晓,王岱杰,等.一测多评法测定丹参中4种丹参酮类成分[J].中草药,2012(12):2420-2423，对丹参药渣中4种丹参酮类成分进行分析。
结果如表1所示：
表1丹参单方药渣的物质组分情况
实施例2
本实施例具体说明利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法。
包括如下步骤：
(1)种子液制备：用直径4-6mm的打孔器取PDA固体培养基上生长的菌丝块，放置于PDA液体培养基表面，28℃静置培养3-5d，待菌丝铺满液体表面，用灭过菌的组织研磨器将菌丝磨碎，倒入新的PDA液体培养基里，28℃，200rpm转速下培养3-5d；
(2)发酵产酶：取步骤(1)制得的种子液接种至发酵培养基，接种量为10％(v/v)，温度为28℃，自然湿度，恒温发酵；
(3)提取酶液：将发酵产物12000rpm离心5min，上清即为漆酶酶液。
PDA固体培养基组分质量含量为：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，琼脂2％，pH自然，121℃高压灭菌20min。
PDA液体培养基成分(质量含量)：马铃薯汁20％，葡萄糖2％，250mL摇瓶装液量50mL，pH自然，121℃高压灭菌20min；
液体发酵培养基成分(质量含量)为：(NH4)2SO40.05％，蔗糖0.5％，MgSO4·6H2O0.05％，KH2PO40.05％，K2HPO40.05％，CuSO4·5H2O 0.001％，丹参单方药渣0.5％，pH自然，115℃高压灭菌30min。
实施例3
本实施例具体说明利用不同药渣进行促进灵芝液态漆酶发酵的效果对比。
采用实施例2的方法，设计丹参单方药渣、“人参桂圆膏”复方药渣、“产后康膏”复方药渣、“白芷玫瑰阿胶膏”复方药渣4个实验组和一个玉米芯对照组，产漆菌株选择灵芝。
结果表2所示，丹参单方药渣对灵芝发酵产漆酶有很好的诱导作用，其漆酶产量在第三天达到最高，可达4500U/L。显著高于添加其他药渣为诱导剂的实验组，且缩短了发酵周期。
表2不同药渣诱导灵芝发酵产漆酶的作用效果
| 序列 | 药渣种类 | 最高酶活(U/L) | 发酵周期(h) |
| 1 | 丹参单方药渣 | 4550 | 64 |
| 2 | “人参桂圆膏”复方药渣 | 3120 | 72 |
| 3 | “产后康膏”复方药渣 | 3280 | 120 |
| 4 | “白芷玫瑰”复方药渣 | 3875 | 120 |
| 5 | 对照组：玉米芯 | 2650 | 120 |
| 6 | 空白对照 | 1430 | 72 |
实施例4
本实施例具体说明不同药渣诱导云芝液态发酵产漆酶的作用效果。采用实施例2的方法设计丹参单方药渣、人参桂圆膏复方药渣、产后康膏药渣、白芷玫瑰阿胶膏药渣4个实验组和一个玉米芯对照组，产漆菌株为云芝。
结果如表3所示，丹参单方药渣对云芝发酵产漆酶有较好的诱导作用，其漆酶产量在第三天达到最高，可达3225U/L。显著高于添加其他药渣为诱导剂的实验组，且缩短了发酵周期。
表3不同药渣诱导云芝发酵产漆酶的作用效果
| 序列 | 药渣种类 | 最高酶活(U/L) | 发酵周期(h) |
| 1 | 丹参单方药渣 | 3225 | 72 |
| 2 | “人参桂圆膏”复方药渣 | 2370 | 72 |
| 3 | “产后康膏”复方药渣 | 1885 | 120 |
| 4 | “白芷玫瑰阿胶膏”复方药渣 | 1650 | 120 |
| 5 | 对照组：玉米芯 | 2025 | 120 |
| 6 | 空白对照 | 1290 | 72 |
实施例5
本实施例具体说明不同药渣诱导平菇液态发酵产漆酶的作用效果。采用实施例2的方法设计丹参单方药渣、人参桂圆膏复方药渣、产后康膏复方药渣、白芷玫瑰阿胶膏复方药渣4个实验组和一个玉米芯对照组，产漆菌株为平菇。
结果如表4所示，丹参单方药渣对平菇发酵产漆酶有较好的诱导作用，其漆酶产量在第三天达到最高，可达5425U/L；显著高于添加其他药渣为诱导剂的实验组，且缩短了发酵周期。
表4不同药渣诱导平菇发酵产漆酶的作用效果
| 序列 | 药渣种类 | 最高酶活(U/L) | 发酵周期(h) |
| 1 | 丹参单方药渣 | 5425 | 64 |
| 2 | “人参桂圆膏”复方药渣 | 4230 | 72 |
| 3 | “产后康膏”复方药渣 | 3365 | 120 |
| 4 | “白芷玫瑰阿胶膏”复方药渣 | 3640 | 120 |
| 5 | 玉米芯 | 3855 | 120 |
| 6 | 空白对照 | 1860 | 80 |
实施例6
本实施例具体说明丹参酮类物质诱导灵芝液态发酵产漆酶的作用效果。采用实施例2的方法进行发酵，产漆菌株选择灵芝。接种前，分别加入经细菌过滤器除菌的二氢丹参酮2.35mg/L、隐丹参酮3.05mg/L、丹参酮I 7.2mg/L、丹参酮IIA 11.9mg/L、混合丹参酮(二氢丹参酮2.35mg/L、隐丹参酮3.05mg/L、丹参酮I 7.2mg/L、丹参酮IIA 11.9mg/L)。
添加丹参药渣中的丹参酮组分含量等同的物质到灵芝液体发酵培养基中，结果如图1所示，添加丹参酮类诱导剂的实验组，其对漆酶产量的促进作用并不能获得与丹参药渣同等效力。
实施例7
本实施例具体说明芳香族诱导剂诱导灵芝发酵产漆酶的作用效果。采用实施例2的方法进行发酵，产漆菌株选择灵芝。发酵培养基中分别加入用除菌膜过滤后的香草醛、香草酸、藜芦酸、阿魏酸、愈创木酚至终浓度为1mmol，接种量为8-10％。
结果如图2所示，丹参单方诱导剂组的漆酶活性显著高于添加芳香族类诱导剂的实验组，且缩短了发酵周期。
实施例8
本实施例具体说明不同丹参药渣添加量对产酶效果的影响。采用实施例2的方法进行发酵，产漆菌株选择灵芝，在发酵培养基中分别添加0.05％、0.1％、0.5％、1.0％、5.0％的丹参单方药渣。
结果表5所示，添加丹参单方药渣0.1-1.0％时，对灵芝发酵产漆酶都具有显著的促进作用，其中，0.5％添加量时，灵芝发酵产漆酶酶活最高，可达4550U/L。
表5不同药渣添加量诱导灵芝发酵产漆酶的作用效果
Claims (10)
1.一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）种子液制备：取PDA固体培养基上生长的产漆酶菌种菌丝部分，放置于PDA液体培养基表面静置培养3-5d，再将培养好的菌丝块磨碎，转入新的PDA液体培养基中，震荡培养3-5d；
（2）发酵产酶：取步骤（1）制得的种子液接种至发酵培养基，恒温发酵；
所述液体发酵培养基各成分质量含量为：(NH4)2SO4 0.05%，蔗糖0.5%，MgSO4·6H2O0.05%，KH2PO4 0.05%，K2HPO4 0.05%，CuSO4·5H2O 0.001%，丹参单方药渣，pH自然；
（3）提取酶液：将发酵产物离心，上清即为漆酶酶液。
2.根据权利要求1所述的一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法，其特征在于，所述产漆酶菌为平菇、灵芝或云芝。
3.根据权利要求2所述的一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法，其特征在于，所述产漆酶菌为灵芝。
4.根据权利要求1所述的一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基中丹参单方药渣的质量含量为0.1~5.0%。
5.根据权利要求3所述的一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基中丹参单方药渣的质量含量为0.5%。
6.根据权利要求1所述的一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，采用直径4-6mm的打孔器取一块PDA固体培养基上生长的产漆酶菌种菌丝，置于PDA液体培养基静置培养。
7.根据权利要求1所述的一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法，其特征在于，所述PDA固体培养基各成分质量含量为：马铃薯汁20%，葡萄糖2%，琼脂2%；PDA液体培养基各成分质量含量为：马铃薯汁20%，葡萄糖2%。
8.根据权利要求1所述的一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法，其特征在于，静置培养、震荡培养、发酵培养的温度为28℃。
9.根据权利要求1所述的一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，种子液接种量为10%。
10.根据权利要求1所述的一种利用丹参药渣促进漆酶发酵的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，发酵时间为64~120h。
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| CN112042469A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-12-08 | 江苏海昇药业有限公司 | 一种含有中药药渣的食用菌发酵培养基 |
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