CN103444434B - 一种提升冬虫夏草的产率和质量的发酵原材料处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提升冬虫夏草的产率和质量的发酵原材料处理方法，其通过加入蛋白酶，提升了产品的产率和质量。其中发酵原材料处理方法为：将制备好的液体种子培养基中加入蛋白酶0.2-0.4％(酶质量／培养基质量)，酶解后接种。酶解条件为：温度45-55℃，时间4-8小时。
Description
技术领域
本发明涉及冬虫夏草的人工发酵方法的技术领域，具体涉及一种能提升冬虫夏草的产率和质量的发酵原材料处理方法。
背景技术
冬虫夏草又称虫草，是我国传统名贵中药，具有止咳、化痰、降低血清胆固醇、调节和增强免疫力、抗肿瘤等多种药理作用。近年来，国内外对冬虫夏草需求剧增。但由于冬虫夏草有其严格的寄生性和特殊的生长地理环境，产量相当有限，药源比较紧缺。为缓解市场的供需矛盾，冬虫夏草的人工发酵产品越来越重要。
正因如此，国内相关的专利申请也越来越多。这些申请大多公开了发酵所用的不同组分或用量的培养基，例如CN85107991公开了斜面培养基、摇瓶培养基和发酵培养基的具体组成，含有葡萄糖、蛋白胨、蚕蛹粉、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠等；CN01119934公开了发酵培养基含有大豆粉、玉米粉、蔗糖、酵母粉、硫酸镁、氯化钠和磷酸氢二钾等；专利申请CN03102576公开的培养基中除含有常用的碳源、氮源、无机盐等成分外，还含有三氯化铬；此外CN200610040668、CN200810198936、CN201210257839、CN201210556728、CN201210593118、CN201310045628等都涉及具体组分的培养基。
其中CN200710024324为解决现有技术中液体培养基的质量难以控制、冬虫夏草产量低、成本大的缺陷，对培养基的组分进行了优化：斜面培养基包括碳源1.0～8.0％，氮源1.6～8.0％，无机盐0～0.1％，琼脂粉0.5～1.5％，其余为水；发酵培养基包括碳源2.0～4.0％，氮源2.0～4.0％，无机盐0～0.1％；其余为水。在工业生产中，先将菌种接种于斜面培养基，在12～16℃培养25～35天，然后将菌种接种于发酵培养基于摇床上，温度12～16℃培养8～10天，然后接种于一级种子罐，温度12-16℃培养8～10天，然后以培养基量的8～10倍扩大，逐级发酵，直至达到所需的量，出罐后进行固液分离，将固体烘干、粉碎而成。
由于虫草的培养以玉米粉和蚕蛹粉水解液底物基质，同时发酵过程中氨基氮是菌体生长的最主要的限制性基质，因此如何能够更多的从液化的过程中得到氨基氮，对于提升虫草产量和原材料的有效利用很重要。
由此可见，现有技术为提升人工发酵冬虫夏草的产率和质量，研究人员通常仅是调整培养基的组成、发酵培养的条件等因素，并认为该因素决定了最终产品产率和质量。但对于采用水解酶对发酵原材料进行处理条件的优化尚未见报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明的发明人通过大量实验研究后发现，在发酵过程中合理添加蛋白酶，将大大有利于最终产品的产率及产品质量。而本发明正是利用该研究成果，提供了一种提升冬虫夏草的产率和质量的发酵原材料处理方法，其通过加入蛋白酶，提升了产品的产率和质量。
本发明的目的是通过以下方法来实现的：
一种提升冬虫夏草的产率和质量的发酵原材料处理方法，包括在发酵培养基中加入蛋白酶。
优选的，所述发酵原材料处理方法为：将制备好的液体种子培养基中加入蛋白酶0.2-0.4％(酶质量／培养基质量)，酶解后接种。
优选的，酶解条件为：温度45-55℃，时间4-8小时。
优选的，所述发酵包括以下步骤：菌种斜面培养、发酵和固液分离过程，其特征在于，所述一级发酵和二级发酵都分为发酵初期、发酵后期两个阶段，发酵初期阶段结束时，经补料操作后为发酵后期阶段，所述发酵初期和发酵后期采用不同浓度配比的碳源和氮源的培养基进行发酵。上述人工发酵方法中，所述初期碳源浓度为32g／L，氮源浓度为15g／L，所述后期碳源浓度为30g／L，氮源浓度为28g／L。所述碳源为葡萄糖。所述氮源为酵母膏。
优选的，上述方法制得的冬虫夏草菌丝的产率为1.1％～1.5％。
本发明的优点在于：在发酵过程中合理添加蛋白酶，大大提升了最终产品的产率和质量，缩短了发酵周期，给冬虫夏草的人工产业化带来了良好的经济效益。
具体实施方式
实施例1
一种提升冬虫夏草的产率和质量的发酵原材料处理方法，包括在发酵培养基中加入蛋白酶，具体步骤为：
(1)以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为20g／L，酵母膏浓度为17g／L；
(2)加入蛋白酶0.2％(酶质量／培养基质量)，酶解条件为：温度45℃，时间4小时。
实施例2
一种提升冬虫夏草的产率和质量的发酵原材料处理方法，包括在发酵培养基中加入蛋白酶，具体步骤为：
(1)以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为20g／L，酵母膏浓度为35g／L；
(2)加入蛋白酶0.3％(酶质量／培养基质量)，酶解条件为：温度45℃，时间8小时。
实施例3
一种提升冬虫夏草的产率和质量的发酵原材料处理方法，包括在发酵培养基中加入蛋白酶，具体步骤为：
(1)以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为12g／L，酵母膏浓度为40g／L；
(2)加入蛋白酶0.4％(酶质量／培养基质量)，酶解条件为：温度55℃，时间6小时。
实施例4
一种制备人工培养冬虫夏草的方法，包括在发酵培养基中加入蛋白酶，具体步骤为：
(1)以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为12g／L，酵母膏浓度为40g／L；
(2)加入蛋白酶0.4％(酶质量／培养基质量)，酶解条件为：温度55℃，时间6小时，将该培养基作为一级发酵初期的培养基；
(3)菌种斜面培养：将菌种接种于斜面，培养基含有碳源、氮源、无机盐和琼脂粉，在12℃下培养17天；
(4)一级发酵：将斜面培养的菌种接种于一级发酵初期的培养基上，在14℃下培养4天；进行补料操作，补料培养基(即发酵后期的培养基)同样以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为40g／L，酵母膏浓度为22g／L，在14℃下培养5天；
(5)二级发酵：然后接种于二级发酵初期的培养基上，培养条件同一级发酵，初期阶段和后期阶段同样间隔补料操作；
(6)固液分离：其后通过蒸发浓缩和板框过滤的方法使培养基液与生长后的菌体分离，对分离出的菌体进行喷雾干燥，获得干燥菌体。
实施例5
一种制备人工培养冬虫夏草的方法，包括在发酵培养基中加入蛋白酶，具体步骤为：
(1)以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为12g／L，酵母膏浓度为40g／L；
(2)加入蛋白酶0.3％(酶质量／培养基质量)，酶解条件为：温度45℃，时间8小时，将该培养基作为一级发酵初期的培养基；
(3)菌种斜面培养：将菌种接种于斜面，培养基含有碳源、氮源、无机盐和琼脂粉，在12℃下培养16天；
(4)一级发酵：将斜面培养的菌种接种于一级发酵初期的培养基上，在14℃下培养3天；进行补料操作，补料培养基(即发酵后期的培养基)同样以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为30g／L，酵母膏浓度为28g／L，在14℃下培养5天；
(5)二级发酵：然后接种于二级发酵初期的培养基上，培养条件同一级发酵，初期阶段和后期阶段同样间隔补料操作；
(6)固液分离：其后通过蒸发浓缩和板框过滤的方法使培养基液与生长后的菌体分离，对分离出的菌体进行喷雾干燥，获得干燥菌体。
实验例1蛋白酶水解实验：
第一组：以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为20g／L，酵母膏浓度为35g／L；不加入蛋白酶。
第二组：以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为20g／L，酵母膏浓度为35g／L；不加入蛋白酶。
第三组：以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为20g／L，酵母膏浓度为35g／L；加入蛋白酶0.15％(酶质量／培养基质量)，酶解条件为：温度45℃，时间8小时。
第四组：以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为20g／L，酵母膏浓度为35g／L；加入蛋白酶0.15％(酶质量／培养基质量)，酶解条件为：温度45℃，时间8小时。
第五组：以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为20g／L，酵母膏浓度为35g／L；加入蛋白酶0.3％(酶质量／培养基质量)，酶解条件为：温度45℃，时间8小时。
第六组：以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为20g／L，酵母膏浓度为35g／L；加入蛋白酶0.3％(酶质量／培养基质量)，酶解条件为：温度45℃，时间8小时。
第七组：以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为20g／L，酵母膏浓度为35g／L；加入蛋白酶0.3％(酶质量／培养基质量)，酶解条件为：温度45℃，时间8小时。
第八组：以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为20g／L，酵母膏浓度为35g／L；加入蛋白酶0.4％(酶质量／培养基质量)，酶解条件为：温度55℃，时间6小时。
第九组：以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为20g／L，酵母膏浓度为35g/L；加入蛋白酶0.4％(酶质量／培养基质量)，酶解条件为：温度55℃，时间6小时。
第十组：以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为20g／L，酵母膏浓度为35g／L；加入蛋白酶0.3％(酶质量／培养基质量)，酶解条件为：温度55℃，时间6小时。
第十一组：以葡萄糖为碳源，以酵母膏为氮源，其中葡萄糖浓度为20g／L，酵母膏浓度为35g／L；加入蛋白酶0.3％(酶质量／培养基质量)，酶解条件为：温度55℃，时间6小时。
表1
从基础料添加蛋白酶和不添加蛋白酶的效果上来看，随着蛋白酶的添加水解液得到的氨基氮浓度增加。当用酶量为0.3％(酶量／物料质量)时，得到的水解液氨基氮浓度比不加酶的高出了40％以上，该结果具有显著性差异(P<0.05)。
实验例2本发明与未加入蛋白酶的发酵结果的比较
以中国专利CN200710024324.9公开的培养基和发酵方法生产得到冬虫夏草菌丝干品，作为对照组1。按照以下指标对对照组1、实施例4-5的产品进行对照，其中实施例6为以实施例2为液体发酵培养基，按照CN200710024324.9公开的发酵方法生产的菌丝干品；按照产率为发酵冬虫夏草菌粉干品与总投料量所占比率，总氨基酸、甘露醇、腺苷含量为冬虫夏草菌丝干品中的重量百分含量，具体结果见下表(各数值为10批样品的均值)：
表2
| 指标 | 药典标准 | 对照组1 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 |
| 产率(％) | -- | 0.62 | 1.3 | 1.5 | 1.1 |
| 总氨基酸含量(％) | ≥30 | 31.2 | 38.24 | 41.28 | 35.15 |
| 甘露醇含量(％) | ≥7.0 | 8.4 | 9.25 | 9.75 | 9.59 |
| 腺苷含量(％) | ≥0.08 | 0.12 | 0.18 | 0.16 | 0.14 |
由此可见，对照组1冬虫夏草菌丝的产率为0.5％～0.7％；而本发明冬虫夏草菌丝的产率为1.1-1.5％，并且产品干品中总氨基酸、甘露醇和腺苷的百分含量都显著优于对照组1。
Claims (8)
1.一种提升冬虫夏草的产率和质量的发酵原材料处理方法，其特征在于，在发酵培养基中加入蛋白酶；蛋白酶质量/培养基质量为0.2-0.4％，酶解后接种；所述发酵包括以下步骤：菌种斜面培养、还有一级发酵和二级发酵的发酵过程和固液分离过程；所述一级发酵和二级发酵都分为发酵初期、发酵后期两个阶段，发酵初期阶段结束时，经补料操作后为发酵后期阶段，所述发酵初期和发酵后期采用不同浓度配比的碳源和氮源的培养基进行发酵；所述初期碳源浓度为32g/L，氮源浓度为15g/L，所述后期碳源浓度为30g/L，氮源浓度为28g/L；所述碳源为葡萄糖；所述氮源为酵母膏。
2.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，蛋白酶质量/培养基质量为0.3％。
3.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，酶解条件为：温度45-55℃，时间4-8小时。
4.根据权利要求3所述的处理方法，其特征在于，酶解条件为：温度45℃，时间8小时。
5.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，发酵初期阶段为3-4天。
6.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，发酵后期阶段为4-5天。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的处理方法，其特征在于，制得的冬虫夏草菌丝的产率为1.1％～1.5％。
8.通过权利要求1-6任意一项所述的处理方法制得的冬虫夏草菌丝。
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