CN102851348A

CN102851348A - 一种促进2-酮基- l-古龙酸高效生产的方法

Info

Publication number: CN102851348A
Application number: CN2012103147456A
Authority: CN
Inventors: 王敬臣; 史小利; 仲平; 崔凤霞; 黄惠英; 闫世梁; 史立军; 肖媛; 张生克; 宋向军; 刘银霞; 朱腾跃; 王新华; 秦天苍
Original assignee: ZHENGZHOU TUOYANG INDUSTRY Co Ltd
Current assignee: ZHENGZHOU TUOYANG INDUSTRY Co Ltd
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2013-01-02

Abstract

本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其以L-山梨糖为发酵培养基的碳源进行发酵培养，通过在发酵过程中添加0.5－10%D-核糖母液来实现。该方法利用普通生酮古龙酸菌（KetoguLonicigeniumvuLgare）和巨大芽孢杆菌（BaciLLusmegaterium)混合菌系为生产菌株，通过在发酵过程中添加D-核糖母液促进菌体生长，进而促进2-酮基-L-古龙酸高效生产，缩短发酵周期。试验结果表明，在二步发酵过程中流加5%的D-核糖母液，发酵周期从60h缩短至52h，发酵终点2-KLG浓度由122.15g·L^-1提高到131.2·L^-1，发酵转化率（mol/mol）从90.48%提高到97.18%。

Description

一种促进2-酮基- L-古龙酸高效生产的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种在发酵过程中通过连续添加D-核糖母液来促进2-酮基- L-古龙酸高效生产的方法。

背景技术

维生素 C（V_C）是一种水溶性维生素，又名 L-抗坏血酸，能参与体内多种羟化反应和氧化还原反应，是一类重要的细胞代谢氧化还原化合物，在生物体中起着必不可少的生理作用。20世纪70年代初，尹光琳等筛选出了可以直接将L-山梨糖转化为合成维生素C的重要前体2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）的混合菌种—巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和普通生酮古龙酸菌（Ketogulonigenium sp.），发明了维生素C二步发酵法。该方法通过两步发酵大大简化了莱氏法生产维生素C的合成路线，具有糖酸转化率高的突出优势，目前国内生产厂家生产维生素C都采用二步发酵法。

第二步混菌发酵的发酵水平决定了二步发酵法的发酵水平。在目前维生素C的生产企业中，发酵的工艺路线和反应器的改造研究没有大的突破，因此为了提高发酵水平和产能，需要促进菌系高产。D-核糖是一种五碳糖，存在于所有活细胞中，通过影响代谢起作用，是生物体内遗传物质核糖核酸（mRNA、tRNA、rRNA和5 SRNA等各种RNA）的碳水化合物组成部分，它也是若干辅酶和维生素的组成部分，在生物体内通常与磷酸共同转运，具有十分重要的生理作用。D-核糖是一种单糖，具备一般单糖的化学性质，极易被细胞所利用。

发明内容

本发明目的在于提供一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，该方法产率高，且发酵周期短，可显著促进2-KLG的高效生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，包括发酵培养，其以L-山梨糖为发酵培养基的碳源进行发酵培养，在发酵过程中添加0.5－10%（重量体积百分比，下同） D-核糖母液，优选的添加量为5%。

本发明所用D-核糖母液来自郑州拓洋生物工程有限公司，编号为:DR10701。该D-核糖母液是生产D-核糖的副产品，是一种粘稠、红褐色、呈半流动的物体，其主要成分为D-核糖。采用D-核糖母液作为添加物使用，可充分利用它所含的主要成分D-核糖促进生产菌产酸，价格低廉，其二次循环再利用可进一步提升其产品附加值。

菌株普通生酮古龙酸菌（KetoguLonicigenium vuLgare）和巨大芽孢杆菌（BaciLLus megaterium）采用市售普通产品即可，本发明所用菌株购自中原制药厂，产品编号分别为TY92002和TY92003。

具体的，所述发酵培养基中含有如下重量体积百分比的物质：L-山梨糖8－13.5%、玉米浆0.5－2%、尿素0.02－2%、KH₂PO₄ 0.05－1.5%、MgS0₄·7H₂O 0.01－1.0%、泡敌0.02－0.08%；灭菌前培养基的pH为6.0－7.5。

较好的，在发酵5－10小时开始连续添加D-核糖母液。

发酵培养的温度为27－32℃，优选为29.5℃。

发酵培养的pH为5.0－8.0，优选为7.0。可通过流加碱来调控pH，常用的碱有氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾等。

发酵培养的通气量为0.2－1.5v/v/m，优选为0.8 v/v/m。

为避免污染，本发明发酵方法中发酵容器的压力以维持在0.02MPa以上为宜。

本发明发酵培养基中，所用玉米浆中干物质质量百分含量为40%左右。若使用其它浓度的玉米浆，可进行相应计算后确定其培养基的组成。泡敌的量只要控制培养基中的泡沫量适宜即可。在发酵过程中，比较优选的技术方案为：将D-核糖母液与部分L-山梨糖配成溶液，先进行灭菌（灭菌温度为80－110℃，优选100℃），然后一起流加。

本发明中所指的质量体积百分比都是指每100毫升溶液中所含溶质的克数。

具体的，本发明采用连续流加含D-核糖母液的L-山梨糖溶液的工艺。用混菌斜面（普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌斜面）接种摇瓶培养基中，29.5℃、200rpm摇床振荡培养18－24小时。将混菌摇瓶种液按10%接种量接入5L种子罐，在温度29.5℃、转速400rpm、通气量0.5v/v/m的条件下进行培养，当其产酸≥5g·L^-1时，将种子培养液按5－10%接种量通过预先灭菌并冷却的无菌接种管道用压力差接入50L发酵罐中培养。初始L-山梨糖的浓度为15－30g·L^-1，发酵5－10小时后开始流加由D-核糖母液与补糖L-山梨糖组成的混合液（经低灭），控制发酵液中L-山梨糖的浓度为10－30g·L^-1，当发酵液残糖≤0.6 g·L^-1时，二步发酵结束。

本发明工艺包括在发酵容器中培养能够利用L-山梨糖发酵转化2-酮基-L-古龙酸的微生物，向发酵容器中一次性或连续加入含有D-核糖母液的L-山梨糖溶液，在相应的温度、pH、通气量等条件下培养，发酵液达到相应的指标后从所述的容器中放出并从中回收2-酮基-L-古龙酸。本发明通过在第二步混菌发酵中连续添加D-核糖母液来促进普通生酮古龙酸菌（KetoguLonicigenium vuLgare）和巨大芽孢杆菌（BaciLLus megaterium）混合菌系的菌体生长，刺激菌体各种酶的活性，提高糖酸转化率，从而促进2-酮基- L-古龙酸的高效生产，缩短发酵周期。该方法可显著促进2-KLG高效生产，产率高，且发酵周期短。

具体实施方式

以下以通过优选实施例对本发明工艺作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

下述各实施例中用到的相关培养基组成如下：

种子/摇瓶培养基：L-山梨糖2.0%（重量体积百分比，下同），玉米浆0.3%，牛肉膏0.2%，酵母膏0.5%，蛋白胨1.0%，尿素0.1%，KH₂P0₄ 0.1%，MgS0₄·7H₂0 0.01%，CaC0₃ 0.1%，泡敌0.05%；灭菌前培养基pH 6.8。118－120℃，灭菌20－30min。

发酵培养基：L-山梨糖8－13.5%（其中15%作为底料，85%作为补料），玉米浆1.0%，尿素0.1%，KH₂PO₄ 0.1%，MgS0₄·7H₂O 0.04%，泡敌0.05%；灭菌前培养基pH6.5。118－120℃，灭菌30min。作为底料的L-山梨糖在发酵罐内90℃低灭，并与冷却的玉米浆于38℃混合。作为补料的L-山梨糖与D-核糖母液混合后装入补料瓶90℃低灭，D-核糖母液的添加量控制在0.5－10%。

对照例1

一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其包括如下步骤：

1）将混菌斜面（普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌斜面）接种摇瓶培养基中，于29.5℃、200rpm摇床振荡培养18小时。将混菌摇瓶种液按10%接种量接入5L种子罐，在温度29.5℃、转速400rpm、通气量0.5v/v/m的条件下进行培养，当其产酸量≥5g·L^-1时（古龙酸含量测定采用碘量法，该法为本领域的常规方法），将种子培养液按5%的接种量通过预先灭菌并冷却的无菌接种管道用压力差接入50L发酵罐中进行发酵培养。

2）发酵培养在50L自控发酵罐中进行，L-山梨糖的总浓度为10%。将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中，初始L-山梨糖的浓度为20.5 g·L^-1，发酵5h后开始流加L-山梨糖，控制流加速度以维持发酵液中L-山梨糖含量在20 g·L^-1左右。发酵液pH采用流加碱的方式控制在6.8左右，发酵38h流加L-山梨糖结束。发酵终点2-KLG浓度达到90.15g·L^-1，发酵周期49h，发酵转化率（mol/mol）达90.22%。

对照例2

1）将混菌斜面（普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌斜面）接种摇瓶培养基中，于29.5℃、200rpm摇床振荡培养24小时。将混菌摇瓶种液按10%接种量接入5L种子罐，在温度29.5℃、转速400rpm、通气量0.5v/v/m的条件下进行培养，当其产酸量≥5g·L^-1时，将种子培养液按10%的接种量通过预先灭菌并冷却的无菌接种管道用压力差接入50L发酵罐中进行发酵培养。

2）发酵培养在50L自控发酵罐中进行，L-山梨糖的总浓度为13.5%。将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中，初始L-山梨糖的浓度为20.5 g·L^-1，发酵5h后开始流加L-山梨糖，控制流加速度以维持发酵液中山梨糖含量在20 g·L^-1左右。发酵液pH采用流加碱的方式控制在7.0左右，发酵47h流加糖结束。发酵终点2-KLG浓度达到122.15g·L^-1，发酵周期60h，发酵转化率（mol/mol）达90.48%。

实施例1

1）步骤1同对照例1；

2）发酵培养在50L自控发酵罐中进行，L-山梨糖的总浓度为10%。将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中，初始L-山梨糖的浓度为20.5 g·L^-1，D-核糖母液添加量为0.5%。将D-核糖母液与作为补料的L-山梨糖配成溶液并消好后，采用流加方式加入。于发酵5h开始流加由L-山梨糖与D-核糖母液组成的混合液，控制流加速度以维持发酵液中L-山梨糖含量在20 g·L^-1左右。发酵液pH采用流加碱的方式控制在6.8左右，发酵35h流加糖结束。发酵终点2-KLG浓度达到92.07 g·L^-1，发酵周期45h，发酵转化率（mol/mol）达92.15%。

实施例2

1）步骤1同对照例2；

2）发酵培养在50L自控发酵罐中进行，L-山梨糖的总浓度为13.5%。将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中，初始L-山梨糖的浓度为20.5 g·L^-1，D-核糖母液添加量为5%。将D-核糖母液与作为补料的L-山梨糖配成溶液并消好后，采用流加方式加入。于发酵5h开始流加由L-山梨糖与D-核糖母液组成的混合液，控制流加速度以维持发酵液中L-山梨糖含量在20 g·L^-1左右。发酵液pH采用流加碱的方式控制在7.0左右，发酵42h流加糖结束。发酵终点2-KLG浓度达到131.2 g·L^-1，发酵周期52h，发酵转化率（mol/mol）达97.18%。

实施例3

1）步骤1同对照例2；

2）发酵培养在50L自控发酵罐中进行，L-山梨糖的总浓度为13.5%。将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中，初始L-山梨糖的浓度为20.5 g·L^-1，D-核糖母液添加量为10%。将D-核糖母液与作为补料的L-山梨糖配成溶液并消好后，采用流加方式加入。于发酵5h开始流加由L-山梨糖与D-核糖母液组成的混合液，控制流加速度以维持发酵液中L-山梨糖含量在20 g·L^-1左右。发酵液pH采用流加碱的方式控制在7.0左右，发酵41h流加糖结束。发酵终点2-KLG浓度达到131.15g·L^-1·，发酵周期51h，发酵转化率（mol/mol）达97.14%。

Claims

1.一种促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，包括发酵培养，其特征在于，以L-山梨糖为发酵培养基的碳源进行发酵培养，在发酵过程中添加0.5－10% D-核糖母液。

2.如权利要求1所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，所述发酵培养基中含有如下重量体积百分比的物质：L-山梨糖8－13.5%、玉米浆0.5－2%、尿素0.02－2%、KH₂PO₄ 0.05－1.5%、MgS0₄·7H₂O 0.01－1.0%、泡敌0.02－0.08%；灭菌前培养基的pH为6.0－7.5。

3.如权利要求1或2所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，在发酵5－10小时开始连续添加D-核糖母液。

4.如权利要求3所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，D-核糖母液的添加量为5%。

5.如权利要求3所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，发酵培养的温度为27－32℃。

6.如权利要求5所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，发酵培养的温度为29.5℃。

7.如权利要求3所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，发酵培养的pH为5.0－8.0。

8.如权利要求7所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，发酵培养的pH为7.0。

9.如权利要求3所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，发酵培养的通气量为0.2－1.5v/v/m。

10.如权利要求9所述促进2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征在于，发酵培养的通气量为0.8 v/v/m。