CN101555504B - 一种利用短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株发酵生产d-核糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体公开了一种利用短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株发酵生产D-核糖的方法。所述方法在发酵培养时利用淀粉水解糖做碳源，利用氨水和硫酸调节发酵液的pH值同时氨水充当发酵液的氮源。本发明利用淀粉水解糖做为发酵的碳源，在很大程度上降低了生产成本；利用氨水对发酵液的pH值进行调节，可以更精确地调控发酵液pH值，同时补充氮源，提高菌体产核糖能力，提高发酵产量和转化率。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及了一种利用短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株发酵生产D-核糖的方法。
背景技术
D-核糖是存在于活细胞中的一种天然戊醛糖，是生物遗传物质mRNA、rRNA、5sRNA等各种RNA以及许多辅酶的构成成分，在生物体内通常与磷酸共同转运，具有十分重要的生理作用。在医疗保健、制药、食品等工业中都有广泛的应用。
D-核糖的生产方法主要有化学合成法和发酵法。与化学合成法相比，发酵法具有收率高、成本低、产品质量好、对环境污染小等优点，因而在D-核糖的工业生产中得到普遍采用。
工业上D-核糖发酵主要利用口服葡萄糖做为发酵的碳源，利用CaCO3等作为pH缓冲剂。发酵原料的改变直接影响到发酵转化率，发酵产率、产品的制作、产物质量及生产成本等。因此在不影响产品质量及产量的基础上，有必要开发一种低成本的D-核糖发酵原料及pH调控的方法。
发明内容
本发明的目的就是在于提供一种工艺简单、成本低、发酵产量与发酵转化率高的利用短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株发酵生产D-核糖的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种利用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)转酮醇酶(Transketolase)变异株发酵生产D-核糖的方法，包括发酵培养，其特别之处在于：发酵培养时利用淀粉水解糖做碳源，利用氨水和硫酸调节发酵液的pH值同时氨水充当发酵液的氮源。本发明方法从菌株到发酵之前的处理过程可按现有技术进行，包括斜面活化菌株、制备摇瓶种子菌悬液、制备一级种子液和发酵培养。但是，本发明主张斜面培养基配方(g/100ml培养基)优选：山梨醇0.5，蛋白胨1.0，NaCl 0.5，酵母膏0.5，琼脂2.0，pH 7.0(灭菌前)；斜面培养条件优选：温度34～36℃，培养22～30h；摇瓶种子培养基和一级种子培养基配方(g/100ml培养基)优选：葡萄糖2.0，玉米浆0.5，KH2PO4 0.1，K2HPO4 0.3，pH 7.0(灭菌前)；摇瓶种子培养条件优选：温度36℃，摇床转速200r/m，培养12～20h；一级种子培养条件优选：搅拌转速400r/m，温度36℃，压力0.06MPa，通气量1∶0.5v/v/m，培养12～20h。其中v/v/m是指每分钟每单位体积发酵液中的空气体积。
每100ml发酵培养基中含有14～25g的淀粉水解糖。
氨水的质量浓度优选25～28％，硫酸的质量浓度优选20～30％。
每100ml发酵培养基中的各组份用量为：淀粉水解糖14～25g，玉米浆0.5～1.5g，硫酸铵0.5～1.0g，硫酸锰0.05g，泡敌0.05g，灭菌前pH 6.8～7.3；淀粉水解糖是一次性加入或是连续流加。
控制发酵液的pH值在5.0～6.8，pH值降到5.0时，流加氨水控制，pH值大于6.8时，流加硫酸控制。
发酵时，温度为33～40℃，适宜的发酵温度为36℃；罐压为0.06～0.12Mpa，适宜的罐压为0.08Mpa；搅拌转速为300～400r/m，适宜的转速为360r/m；通气量为1∶0.2～1∶0.8v/v/m，适宜的通气量为1∶0.5v/v/m。
本发明利用淀粉水解糖做为发酵的碳源，在很大程度上降低了生产成本；利用氨水对发酵液的pH值进行调节，可以更精确地调控发酵液pH值，同时补充氮源，提高菌体产核糖能力，提高发酵产量和对淀粉水解糖的转化率。
具体实施方式
以下以具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此：
以下实施中的短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株XD-4购自日本三菱化学API公司。
实施例1
本实施例中的斜面培养基、摇瓶种子培养基、一级种子培养基、发酵培养基在使用前均需在118℃灭菌30min。
斜面活化菌株：选用短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株XD-4作为菌株，将该菌株接入装有斜面培养基的斜面试管中。所述斜面培养基配方(g/100ml培养基)为：山梨醇0.5，蛋白胨1.0，NaCl 0.5，酵母膏0.5，琼脂2.0，pH 7.0(灭菌前)；培养条件为：温度34℃，培养22h。
制备摇瓶种子菌悬液：从斜面已活化过的短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株XD-4取一环菌苔转接于装有摇瓶种子培养基的摇瓶中摇床培养制得摇瓶种子菌悬液。摇瓶种子培养基配方(g/100ml培养基)为：葡萄糖2.0，玉米浆0.5，KH2PO4 0.1，K2HPO4 0.3，pH 7.0(灭菌前)；培养条件为：温度36℃，摇床转速200r/m，培养12h。
制备一级种子液：一级种子培养采用5L自控发酵罐，装液量3L，将短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株XD-4摇瓶种子菌悬液接入一级种子培养基中培养制得一级种子液，接种量10％(体积比)，种子培养基配方同摇瓶种子，培养条件：搅拌转速400r/m，温度36℃，压力0.06MPa，通气量1∶0.5v/v/m，培养12h。
发酵培养：发酵采用50L自控发酵罐，装液量30L，将前述培养好的3L一级种子液接入发酵培养基中(即接种量10％，体积比)。发酵培养基的各组份用量如下(g/100ml发酵培养基)：淀粉水解糖14g，玉米浆0.5g，硫酸铵0.5g，硫酸锰0.05g，泡敌0.05g，灭菌前pH 6.8；将淀粉水解糖单独消毒，玉米浆、硫酸铵、硫酸锰、泡敌一起消毒，消毒后温度降到40℃以下混合；发酵培养条件：搅拌转速300r/m，罐温33℃，罐压0.06MPa，通气量1∶0.2v/v/m，控制发酵液的pH值在5.0～6.8，发酵14h左右，pH下降至5.0左右时，开始流加质量浓度25％氨水，利用自动控制系统维持pH在5.0以上，当发酵培养40h左右，pH回升至6.8左右时，改用质量浓度20％硫酸调节并维持在6.8以下，残糖为0，D-核糖浓度不再增长时发酵结束，发酵共耗时49h，发酵液中D-核糖含量高达69.8g/L，发酵转化率(mol/mol)达59.83％。
实施例2
本实施例中的斜面培养基、摇瓶种子培养基、一级种子培养基、发酵培养基在使用前均需在119℃灭菌30min。
斜面活化菌株：培养条件为：温度35℃，培养24h，其它均同实施例1。
制备摇瓶种子菌悬液：培养16h，其它均同实施例1。
制备一级种子液：一级种子培养采用5L自控发酵罐，装液量3L，将短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株XD-4摇瓶种子菌悬液接入一级种子培养基中培养制得一级种子液，接种量10％(体积比)，种子培养基配方同实施例1，培养16h，其它培养条件均同实例1。
发酵培养：发酵采用50L自控发酵罐，装液量30L，将前述培养好的3L一级种子液接入发酵培养基中(即接种量10％，体积比)。发酵培养基的各组份用量如下(g/100ml发酵培养基)：淀粉水解糖20g，玉米浆1g，硫酸铵0.7g，硫酸锰0.05g，泡敌0.05g，灭菌前pH 7.0；将淀粉水解糖单独消毒，玉米浆、硫酸铵、硫酸锰、泡敌一起消毒，消毒后温度降到40℃以下混合；发酵培养条件：搅拌转速360r/m，罐温36℃，罐压0.08MPa，通气量1∶0.5v/v/m，控制发酵液的pH值在5.0～6.8，发酵18h左右时，pH下降至5.0，开始流加质量浓度26％氨水，利用自动控制系统维持pH在5.0以上，发酵培养50h左右时，pH回升至6.8左右，改用质量浓度25％硫酸调节并维持在6.8以下，当发酵液残糖降为0、D-核糖浓度不再增长时发酵结束，发酵共耗时72h，发酵液中D-核糖含量高达105g/L，发酵转化率(mol/mol)达63.0％。
实施例3
本实施例中的斜面培养基、摇瓶种子培养基、一级种子培养基、发酵培养基在使用前均需在120℃灭菌30min。
斜面活化菌株：培养条件为：温度36℃，培养30h，其它均同实施例1。
制备摇瓶种子菌悬液：培养20h，其它均同实施例1。
制备一级种子液：一级种子培养采用5L自控发酵罐，装液量3L，将短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株XD-4摇瓶种子菌悬液接入一级种子培养基中培养制得一级种子液，接种量10％(体积比)，种子培养基配方同实施例1，培养20h，其它培养条件均同实例1。
发酵培养：发酵采用50L自控发酵罐，装液量30L，将前述培养好的3L一级种子液接入发酵培养基中(即接种量10％，体积比)。发酵培养基的各组份用量如下(g/100ml发酵培养基)：淀粉水解糖25g，玉米浆1.5g，硫酸铵1.0g，硫酸锰0.05g，泡敌0.05g，灭菌前pH 7.3；将淀粉水解糖单独消毒，玉米浆、硫酸铵、硫酸锰、泡敌一起消毒，消毒后温度降到40℃以下混合；发酵培养条件：搅拌转速400r/m，罐温40℃，罐压0.12MPa，通气量1∶0.8v/v/m，控制发酵液的pH值在5.0～6.8，发酵16h左右时，pH下降至5.0，开始流加质量浓度28％氨水，利用自动控制系统维持pH在5.0以上，发酵培养40h左右时，pH回升至6.8左右，改用质量浓度30％硫酸调节并维持在6.8以下；当发酵液残糖降为0、D-核糖浓度不再增长时，发酵结束，发酵共耗时76h，发酵液中D-核糖含量高达126.70g/L，发酵转化率(mol/mol)达60.81％。
实施例4
本实例与实施例3的不同之处在于下述的发酵培养过程中淀粉水解糖为连续流加，其它均同实施例3。
发酵培养：发酵采用50L自控发酵罐，总装液量30L，将前述培养好的3L一级种子液接入发酵培养基中(即接种量10％，体积比)。发酵培养基的各组份用量如下(g/100ml培养基)：淀粉水解糖25g(底糖40％，补糖60％，分开消毒)，剩余部分：玉米浆1.5g，硫酸铵1.0g，硫酸锰0.05g，泡敌0.05g，灭菌前pH 7.3，分消；将淀粉水解糖分低糖、补糖单独消毒，玉米浆、硫酸铵、硫酸锰、泡敌一起消毒，消毒后将底糖和玉米浆等剩余部分在温度降到40℃以下混合；发酵培养条件：搅拌转速400r/m，罐温36℃，罐压0.1MPa，通气量1∶0.6v/v/m，控制发酵液的pH值在5.0～6.8，发酵16h左右时，pH下降至5.0，开始流加质量浓度28％氨水，利用自动控制系统维持pH在5.0以上；发酵35h左右时，发酵液中残糖浓度降到5％以下时，开始连续补糖，并维持在5％左右，发酵培养45h左右时，pH回升至6.8左右，改用质量浓度30％硫酸调节并维持在6.8以下，当发酵液残糖降为0、D-核糖浓度不再增长时，发酵结束，发酵共耗时68h，发酵液中D-核糖含量高达128.0g/L，发酵转化率(mol/mol)达61.44％。
Claims (2)
1.一种利用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)转酮醇酶(Transketolase)变异株发酵生产D-核糖的方法，其特征在于：斜面培养基、摇瓶种子培养基、一级种子培养基、发酵培养基在使用前均需在119℃灭菌30min，步骤如下：
斜面活化菌株：选用短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株XD-4作为菌株，将该菌株接入装有斜面培养基的斜面试管中；每100ml斜面培养基配方为：山梨醇0.5g，蛋白胨1.0g，NaCl 0.5g，酵母膏0.5g，琼脂2.0g，灭菌前pH 7.0；培养条件为：温度35℃，培养24h；
制备摇瓶种子菌悬液：从斜面已活化过的短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株XD-4取一环菌苔转接于装有摇瓶种子培养基的摇瓶中摇床培养制得摇瓶种子菌悬液；每100ml摇瓶种子培养基配方为：葡萄糖2.0g，玉米浆0.5g，KH2PO40.1g，K2HPO40.3g，灭菌前pH 7.0；培养条件为：温度36℃，摇床转速200r/m，培养16h；
制备一级种子液：一级种子培养采用5L自控发酵罐，装液量3L，将短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株XD-4摇瓶种子菌悬液接入一级种子培养基中培养制得一级种子液，接种量体积比10％，种子培养基配方同摇瓶种子，培养条件：搅拌转速400r/m，温度36℃，压力0.06MPa，通气量1∶0.5v/v/m，培养16h；
发酵培养：发酵采用50L自控发酵罐，装液量30L，将前述培养好的3L一级种子液接入发酵培养基中；每100ml发酵培养基的各组份用量如下：淀粉水解糖20g，玉米浆1g，硫酸铵0.7g，硫酸锰0.05g，泡敌0.05g，灭菌前pH 7.0；将淀粉水解糖单独消毒，玉米浆、硫酸铵、硫酸锰、泡敌一起消毒，消毒后温度降到40℃以下混合；发酵培养条件：搅拌转速360r/m，罐温36℃，罐压0.08MPa，通气量1∶0.5v/v/m，控制发酵液的pH值在5.0～6.8，发酵18h左右时，pH下降至5.0，开始流加质量浓度26％氨水，利用自动控制系统维持pH在5.0以上，发酵培养50h左右时，pH回升至6.8左右，改用质量浓度25％硫酸调节并维持在6.8以下，当发酵液残糖降为0、D-核糖浓度不再增长时发酵结束，发酵共耗时72h，发酵液中D-核糖含量高达105g/L，发酵转化率(mol/mol)达63.0％。。
2.一种利用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)转酮醇酶(Transketolase)变异株发酵生产D-核糖的方法，其特征在于：斜面培养基、摇瓶种子培养基、一级种子培养基、发酵培养基在使用前均需在120℃灭菌30min，步骤如下：
斜面活化菌株：选用短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株XD-4作为菌株，将该菌株接入装有斜面培养基的斜面试管中；每100ml斜面培养基配方为：山梨醇0.5g，蛋白胨1.0g，NaCl 0.5g，酵母膏0.5g，琼脂2.0g，灭菌前pH 7.0；培养条件为：温度36℃，培养30h；
制备摇瓶种子菌悬液：从斜面已活化过的短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株XD-4取一环菌苔转接于装有摇瓶种子培养基的摇瓶中摇床培养制得摇瓶种子菌悬液；每100ml摇瓶种子培养基配方为：葡萄糖2.0g，玉米浆0.5g，KH2PO40.1g，K2HPO40.3g，灭菌前pH 7.0；培养条件为：温度36℃，摇床转速200r/m，培养20h；
制备一级种子液：一级种子培养采用5L自控发酵罐，装液量3L，将短小芽孢杆菌转酮醇酶变异株XD-4摇瓶种子菌悬液接入一级种子培养基中培养制得一级种子液，接种量体积比10％，种子培养基配方同摇瓶种子，培养条件：搅拌转速400r/m，温度36℃，压力0.06MPa，通气量1∶0.5v/v/m，培养20h；
发酵培养：发酵采用50L自控发酵罐，装液量30L，将前述培养好的3L一级种子液接入发酵培养基中；每100ml发酵培养基的各组份用量如下：淀粉水解糖25g，玉米浆1.5g，硫酸铵1.0g，硫酸锰0.05g，泡敌0.05g，灭菌前pH 7.3；将淀粉水解糖单独消毒，玉米浆、硫酸铵、硫酸锰、泡敌一起消毒，消毒后温度降到40℃以下混合；发酵培养条件：搅拌转速400r/m，罐温40℃，罐压0.12MPa，通气量1∶0.8v/v/m，控制发酵液的pH值在5.0～6.8，发酵16h左右时，pH下降至5.0，开始流加质量浓度28％氨水，利用自动控制系统维持pH在5.0以上，发酵培养40h左右时，pH回升至6.8左右，改用质量浓度30％硫酸调节并维持在6.8以下；当发酵液残糖降为0、D-核糖浓度不再增长时，发酵结束，发酵共耗时76h，发酵液中D-核糖含量高达126.70g/L，发酵转化率(mol/mol)达60.81％。
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