CN104498552B - 一种低pH值胁迫提高ε‑聚赖氨酸产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低pH值胁迫提高ε‑聚赖氨酸产量的方法，属于发酵工程技术领域。在发酵过程中引入酸性pH胁迫工艺，即人为或自发使pH降为2.5‑3.0，维持12‑48h之后，将pH再提高到3.5‑4.5，保持稳定直到发酵结束。采用此种pH调控方法，能够显著提高ε‑聚赖氨酸产生菌的比生长速率和ε‑聚赖氨酸比合成速率；结合补料‑分批发酵方式，ε‑聚赖氨酸的产量较普通两阶段pH调控工艺提高50％以上。本发明将低pH胁迫的方法引入ε‑聚赖氨酸发酵过程中，显著提高了ε‑聚赖氨酸的发酵水平。而且，此方法由于操作简单、效果显著，易于大规模工业化生产的实施。
Description
技术领域
本发明涉及一种低pH值胁迫提高ε-聚赖氨酸产量的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一种微生物合成分泌的L-赖氨酸同聚物，由25-35个L-赖氨酸残基通过α-羧基与ε-氨基的脱水缩合作用聚合而成。ε-PL具有水溶性好、热稳定性高、可食用、可降解以及对人和环境无毒害等优点。另外，ε-PL还具有广泛的抑菌谱，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌等都具有良好的抑制作用。因此，ε-PL作为一种优良的生物食品防腐剂，已相继被日本、韩国以及美国和欧洲等国家和地区批准其在食品加工业中使用。2014年4月，我国食品安全国家标准也批准ε-PL作为食品防腐剂被允许使用。除此之外，作为一种多阳离子生物聚合物，ε-PL还被广泛应用于医药、环境和电子等工业领域。由此可见，ε-PL是一种具有多种用途的重要工业生物技术产品，具有巨大潜在商业价值。
当前，ε-PL生产仅限于利用链霉菌通过液态好氧发酵技术实现。因此，选育高产菌和优化发酵过程就成为提高ε-PL发酵水平的主要途径。基于菌体生长和产物合成需要不同最适pH原则，由Kahar et al.最早提出了两阶段pH值调控方法：发酵周期的前48h维持pH值＞5.0(阶段Ⅰ)，48h后维持pH值4.0左右(阶段Ⅱ)，这种pH值先高后低控制方法结合碳氮源流加技术，实现Streptomyces albulus S410的ε-PL最高产量达到48.3g/L。近年来，发明人以最高ε-PL比合成速率为调控目标，提出了新的两阶段pH值调控方法：发酵前36h维持pH值3.5(阶段Ⅰ)，36h后维持pH值3.8(阶段Ⅱ)，这种pH值先低后高的调控策略，最终实现Streptomyces sp.M-Z18的补料-分批发酵ε-PL产量达到30.11g/L。对比两个pH值调控方法可以发现，它们之间存在明显差异：(1)出发点不同，前者为菌体生长和产物合成分别提供最适pH环境，后者是为了实现产物最大比合成速率；(2)pH值控制策略不同，前者阶段Ⅰ控制的pH值较阶段Ⅱ高，而后者阶段Ⅰ控制的pH值较阶段Ⅱ低。
尽管前面的研究工作成功的通过采用pH调控的方法提高了ε-PL的产量，但是却没有采用极端低pH环境胁迫的方法来提高ε-PL产量。本发明通过极端低pH值胁迫进一步促进ε-PL产量的提高。
发明内容
本发明的目的是通过在ε-PL发酵前期引入极端的酸性pH值胁迫，以提高ε-PL产量。本发明在发酵前期人为或自发地使发酵液pH值从起始7.0下降至2.5—3.0，维持一段时间后，将pH上调至3.5—4.5，维持稳定直到发酵结束。
在本发明的一种实施方式中，在ε-PL发酵开始后，先让发酵液pH自发下降至5.0左右，并控制pH在5.0左右直至菌体量倍增，然后人为或自然地使pH降为2.5-3.0，并维持12-48h，随后将pH调为3.5-4.5并保持稳定直到发酵结束。
本发明的一种实施方式主要包括以下步骤：(1)将ε-PL产生菌链霉菌的种子液接种到以甘油和/或葡萄糖为碳源的发酵培养基中，通过发酵罐进行培养；(2)当pH从起始的7.0自发下降至5.0时，通过碱溶液将pH维持在5.0-6.0，直至菌体干重倍增；(3)在菌体量倍增后，人为或自然地使pH降至2.5-3.0，并维持12-48h，随后通过流加碱溶液将pH调为3.5-4.5并保持稳定，直到发酵结束。
本发明的另一种实施方式主要包括以下步骤：(1)将保藏的ε-PL产生菌链霉菌属孢子，接种到M3G培养基中，30℃培养24h作为种子液；(2)将种子液以8％的接种量接种到以甘油和/或葡萄糖为碳源的发酵培养基中，通过发酵罐进行培养；(3)当pH从起始7.0自发下降至5.0时，通过蠕动泵自动添加碱溶液将pH维持在5.0-6.0，直到菌体干重倍增；(4)在菌体量倍增后，人为或自然地使pH降为2.5-3.0，并维持12-48h，随后通过流加碱溶液将pH调为3.5-4.5并保持稳定，直到分批或补料-分批发酵结束。
在本发明的一种实施方式中，所述的ε-PL生产菌还可以是芽孢杆菌属ε-PL产生菌。
在本发明的一种实施方式中，ε-PL的其他发酵条件为：发酵温度30-37℃，通气量为0.5-2vvm，搅拌转速为200-800rpm。
在本发明的一种实施方式中，调节pH的所述的碱溶液为2-4mol/LNaOH或12.5％-25％氨水。
在本发明的一种实施方式中，所述的发酵罐为搅拌式或气升式发酵罐，并且发酵罐体积不限。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是分批发酵或补料-分批发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述的补料-分批发酵包括流加甘油、葡萄糖或二者混合物以及硫酸铵溶液。
本发明与已有技术相比具有以下优点：
(1)操作方式简单：仅依靠发酵过程中菌体自发或人为流加酸碱溶液进行pH值调节，便于工业推广和应用。(2)显著提高ε-PL产量：相比于普通的两阶段pH调控策略，ε-PL产量能够显著提高50％以上，且能够显著降低后提取成本，增加经济效益。
具体实施方式
发酵培养基参见文献Culture medium containing glucose and glycerol as amixed carbon source improvesε-poly-L-lysine production by Streptomyces sp.M-Z18.Bioprocess Biosyst Eng 2012Mar,35(3):469–475。
实施例1两阶段pH控制策略
在5L发酵罐中装3.26L发酵培养基进行分批发酵，将0.24L培养24h的种子液接种到发酵培养基中，pH值调至6.8-7.5开始发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为200-800rpm，通气量控制为0.5-2vvm，溶氧控制在30％左右；在发酵过程中当pH自发降为5.0时，自动流加氨水或NaOH溶液将pH维持在5.0直到菌体量倍增，后使pH自发下降到4.0，并通过自动流加氨水或NaOH溶液将pH维持在设定值，直到碳源消耗完毕，发酵结束。最终，实现ε-PL产量和菌体量分别为7.83和26.89g/L，ε-PL产率为6.12g/L/d。
若当发酵液中残留的甘油或葡萄糖浓度降为10g/L时，自动流加灭菌后的纯甘油或500g/L的葡萄糖溶液，使其在发酵液中的浓度控制在10g/L左右；当发酵液中NH4 +-N浓度降到1g/L时，自动流加灭菌后的600g/L的硫酸铵溶液，使其浓度维持在1g/L。发酵192h后，ε-PL产量和菌体量分别为35.87和64.02g/L，ε-PL产率为4.48g/L/d。。
实施例2先降后升两阶段pH控制策略
在5L发酵罐中装3.26L发酵培养基进行分批发酵，将0.24L培养24h的种子液接种到发酵培养基中，pH调到6.8-7.5开始发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为200-800rpm，通气量控制为0.5-2vvm，溶氧控制在30％；当发酵pH值自发降为3.5时(约20h)，自动流加氨水或NaOH溶液将此pH维持稳定，直至36h，后将pH上调到3.8，并自动流加氨水或NaOH溶液将此pH维持稳定，直到碳源消耗完毕，发酵结束。最终，实现ε-PL产量和菌体量分别为8.59和27.21g/L，ε-PL产率为6.42g/L/d。
若当发酵液中残留的甘油或葡萄糖浓度降为10g/L时，自动流加灭菌后的纯甘油或500g/L的葡萄糖溶液，使其在发酵液中的浓度控制在10g/L左右；当发酵液中NH4 +-N浓度降到1g/L时，自动流加灭菌后的600g/L的硫酸铵溶液，使其浓度维持在1g/L。发酵176h后，ε-PL产量和菌体量分别为35.24和43.05g/L，ε-PL产率为4.81g/L/d。
实施例3
在5L发酵罐中装3.26L发酵培养基进行分批发酵，将0.24L培养24h的种子液接种到发酵培养基中，pH调到6.8-7.5开始发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为200-800rpm，通气量控制为0.5-2vvm，溶氧控制在30％；发酵进行到20h，人为将pH降为2.5并维持12h，随后将pH上调到3.5，并自动流加氨水将pH维持在设定值，直到葡萄糖消耗完毕，发酵结束。最终，实现ε-PL产量和菌体量分别为10.39和30.61g/L，ε-PL产率为7.12g/L/d。
实施例4
在5L发酵罐中装3.26L发酵培养基进行分批发酵，将0.24L培养24h的种子液接种到发酵培养基中，pH调到6.8-7.5开始发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为200-800rpm，通气量控制为0.5-2vvm，溶氧控制在30％；当发酵pH值自发降为5.0时，自动流加NaOH溶液将pH维持在5.0直到菌体量倍增，后人为将pH降为2.5并维持12h，随后将pH上调到3.5，并自动流加氨水将pH维持在设定值，直到葡萄糖消耗完毕，发酵结束。最终，实现ε-PL产量和菌体量分别为10.21和28.36g/L，ε-PL产率为8.63g/L/d。
实施例5
在5L发酵罐中装3.26L发酵培养基进行分批发酵，将0.24L培养24h的种子液接种到发酵培养基中，pH调到6.8-7.5开始发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为200-800rpm，通气量控制为0.5-2vvm，溶氧控制在30％；在发酵过程中当pH自发降为5.0时，自动流加氨水将pH维持在5.0直到菌体量倍增，后使pH自发下降到3.0，并维持48h，随后将pH上调到4.5，并自动流加NaOH溶液将pH维持在设定值，直到甘油消耗完毕，发酵结束。最终，实现ε-PL产量和菌体量分别为9.65和23.90g/L，ε-PL产率为7.94g/L/d。
实施例6
在5L发酵罐中装3.26L发酵培养基进行分批发酵，将0.24L培养24h的种子液接种到发酵培养基中，pH调到6.8-7.5开始发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为200-800rpm，通气量控制为0.5-2vvm，溶氧控制在30％；在发酵过程中当pH自发降为5.0时，自动流加氨水或NaOH溶液将pH维持在5.0直到菌体量倍增，人为将pH值降为3.0并维持24h，后将pH上调到4.5，并自动流加氨水或NaOH溶液将pH维持在设定值。当发酵液中残留的甘油或葡萄糖浓度降为10g/L时，自动流加灭菌后的纯甘油或500g/L的葡萄糖溶液，使其在发酵液中的浓度控制在10g/L左右；当发酵液中NH4 +-N浓度降到1g/L时，自动流加灭菌后的600g/L的硫酸铵溶液，使其浓度维持在1g/L。发酵192h后，ε-PL产量达到54.70g/L，相比于两阶段pH控制策略分别提高52.50％(实施例1)和55.22％(实施例2)；ε-PL产率为6.84g/L/d，相比于两阶段pH控制策略分别提高52.68％(实施例1)和42.20％(实施例2)。
虽然本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种低pH值胁迫提高ε-聚赖氨酸产量的方法，其特征在于，在ε-聚赖氨酸发酵过程前期引入酸性pH值胁迫策略；所述酸性pH值胁迫策略是使发酵液pH降为2.5-3.0，并维持12-48h，随后将pH调为3.5-4.5并保持稳定直到发酵结束。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵前期人为或自发地使发酵液pH值从起始7.0下降至2.5-3.0，维持12-48h后，将pH上调至3.5-4.5，维持稳定直到发酵结束。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在ε-聚赖氨酸发酵开始后，先让发酵液pH自发下降至5.0，并控制pH在5.0直至菌体量倍增，然后人为或自然地使pH降为2.5-3.0，并维持12-48h，随后将pH调为3.5-4.5并保持稳定直到发酵结束。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)将ε-聚赖氨酸产生菌链霉菌的种子液接种到以甘油和/或葡萄糖为碳源的发酵培养基中，通过发酵罐进行培养；(2)当pH从起始的7.0自发下降至5.0时，通过碱溶液将pH维持在5.0-6.0，直至菌体干重倍增；(3)在菌体量倍增后，人为或自然地使pH降至2.5-3.0，并维持12-48h，随后通过流加碱溶液将pH调为3.5-4.5并保持稳定，直到发酵结束。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)将保藏的ε-聚赖氨酸产生菌链霉菌孢子，接种到M3G培养基中，30℃培养24h作为种子液；(2)将种子液以8％的接种量接种到以甘油和/或葡萄糖为碳源的发酵培养基中，通过发酵罐进行培养；(3)当pH从起始7.0自发下降至5.0时，通过蠕动泵自动添加碱溶液将pH维持在5.0-6.0，直到菌体干重倍增；(4)在菌体量倍增后，人为或自然地使pH降为2.5-3.0，并维持12-48h，随后通过流加碱溶液将pH调为3.5-4.5并保持稳定，直到分批或补料-分批发酵结束。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生产菌是芽孢杆菌属的ε-聚赖氨酸产生菌或链霉菌属的ε-PL产生菌。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，ε-聚赖氨酸的其他发酵条件为：发酵温度30-37℃，通气量为0.5-2vvm，搅拌转速为200-800rpm。
8.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，调节pH的所述碱溶液为2-4mol/LNaOH或12.5％-25％氨水。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵是分批发酵或补料-分批发酵。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的补料-分批发酵包括流加甘油、葡萄糖或二者混合物以及硫酸铵溶液。
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