CN101985646A

CN101985646A - 一种提高2-酮基-l-古龙酸生产强度的方法

Info

Publication number: CN101985646A
Application number: CN 201010578780
Authority: CN
Inventors: 刘立明; 陈克杰; 刘杰; 黄建民; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2010-12-07
Filing date: 2010-12-07
Publication date: 2011-03-16

Abstract

一种提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，属于微生物发酵工程领域。本发明通过添加廉价明胶，强化普通生酮古龙酸菌(Ketogulonigeniumvulgare)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)混菌发酵体系关键氨基酸—L-甘氨酸和L-脯氨酸丰度，从而达到经济、高效生产2-KLG的目的。在2-KLG混菌发酵过程中，当用0.8g/L明胶强化L-甘氨酸和L-脯氨酸丰度时，2-KLG发酵周期缩短至43h(缩短15.6%)，2-KLG浓度可达81.43g·L^-1，2-KLG产酸速率为1.89g·(L·h)^-1(增加25.2%)。

Description

一种提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法

技术领域

本发明涉及一种提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，尤其是一种利用明胶强化关键氨基酸丰度以提升生产强度的方法，属于微生物发酵工程领域。

背景技术

维生素C，又称L-抗坏血酸 (L-ascorbic acid)，其工业化生产普遍采用“二步发酵”工艺，即第一步反应与“莱氏法”相同，由D-葡萄糖加氢生成的D-山梨醇先经细菌，如生黑葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacter melanogenus)、弱氧化醋酸杆菌 (Acetobacter suboxydans) 或生黑醋酸杆菌 (Acetobacter melanogenum) 发酵转化为L-山梨糖；第二步为“二步发酵法”最主要的特点：由普通生酮古龙酸菌 (Ketogulonigenium vulgare，原来鉴定为Gluconobacter oxydans) 和巨大芽胞杆菌 (Bacillusmegaterium) 组成的混合菌系催化L-山梨糖到维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸 (2-KLG) 的反应。

在该混菌发酵体系中，只有普通生酮古龙酸菌能合成2-KLG，伴生菌巨大芽孢杆菌不具有合成2-KLG的酶系，但在发酵过程中分泌的某些未知胞内/胞外蛋白对普通生酮古龙酸菌细胞生长有显著的促进作用，从而促进2-KLG产量显著提高。目前，科学界对普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌两菌间的生理关系没有清晰、透彻的理解，从而难以从生理学和工程学角度阐述影响维生素C“二步发酵”过程的规律，进而难以提出更好的控制方法和策略。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提高2-酮基-L-古龙酸 (2-KLG) 生产强度的方法。

为解决上述技术问题，在普通生酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)组成的混合菌系中添加明胶强化L-甘氨酸和L-脯氨酸丰度。本发明所用菌株普通生酮古龙酸菌 (Ketogulonigenium vulgare) 和巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)混合菌系(2980)为江苏江山制药提供的菌株（一种2-酮基-L-古龙酸高浓度发酵生产工艺，申请号：200810180630.6）。

所述明胶的浓度为0.5~1.5 g·L^-1。

所述明胶的浓度为0.80 g·L^-1。

具体步骤为：

(1)“一步发酵”培养

取新鲜黑醋酸杆菌（Acetobacter melanogenum Beijerinck）斜面，接种于“一步发酵”种子培养基 (75 mL/750 mL锥形瓶)，33??C，200 rpm振荡培养16 h。将培养液按10%接种量转接种子罐 (65 L/100 L搅拌罐) 进行扩大培养。初始种子培养基pH值通过2 mol·L^-1醋酸溶液调为5.1~5.5，整个培养过程中不对pH值进行控制，培养温度、搅拌转速及通气量分别设置为35°C，150 rpm和1 vvm (volume/volume/minute)。L-山梨糖含量达85 g·L^-1以上到达终点后，将种子液以10%接种量转接发酵罐 (650 L/1000 L 搅拌罐)，培养条件同上述种子罐。当醇糖转化率达到98%以上即为发酵终点。获得的培养液通过巴氏消毒法 (80°C, 30min) 灭活黑醋酸杆菌，冷却至20~30°C后无菌保存，备用。

(2)“二步发酵”培养

取普通生酮古龙酸菌和巨大芽胞杆菌混菌斜面接种于“二步发酵”种子培养基 (75 mL/750 mL锥形瓶)，30??C，200 rpm振荡培养18 h。将培养液按10%接种量转接种子罐 (65 L/100 L搅拌罐) 进行扩大培养。初始种子培养基pH值用25% Na₂CO₃溶液调为6.7~7.0，整个培养过程中不对pH值进行控制，培养温度、搅拌转速及通气量分别设置为30°C，150 rpm和1 vvm (volume/volume/minute)。产酸达5~10 g·L^-1，pH值≤6.7时，将二步种液按10%接种量转接发酵罐 (350 L/1000 L 搅拌罐)。初始L-山梨糖浓度为15~25 g·L^-1，发酵4~8 h后开始连续流加L-山梨糖 (即无菌一步发酵液)，控制流加过程中L-山梨糖浓度为15~30 g·L^-1，当流加总糖浓度达到80~85 g·L^-1时流加结束。发酵起始pH值6.7~7.0，24~40 h后调pH值7.1~7.3，发酵40~44 h调pH值7.4~7.6，直至发酵结束。整个发酵过程控制溶解氧在30~50%。

本发明的原理：本研究室利用基因组学和蛋白质组学等系统生物学获得的关于普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌生理关系的理解并结合生化工程策略，确定了对2-KLG生产强度有显著促进作用的关键氨基酸—L-甘氨酸和L-脯氨酸。然而，用自由氨基酸强化2-KLG生产强度时，氨基酸费用就成了重要的成本决定因素，限制了氨基酸在2-KLG工业化生产中的应用。经过研究，我们发现通过廉价明胶强化L-甘氨酸和L-脯氨酸丰度可提升2-KLG生产强度。

相关培养基：

“一步发酵”种子培养基 (g·L^-1)：D-山梨醇 170，大豆蛋白胨 2.5，酵母膏2.5，NaCO₃ 1.5。用2 mol·L^-1醋酸溶液调起始pH值为5.1~5.5，121??C灭菌15 min；

“一步发酵”发酵培养基 (g·L^-1)：D-山梨醇 220，酵母膏 0.46，大豆蛋白胨 0.38，CaCO₃ 1。用2 mol·L^-1醋酸溶液调起始pH值为5.1~5.5，121??C灭菌15 min；

“二步发酵”种子/斜面培养基 (g·L^-1)：L-山梨糖 20，酵母膏 3，蛋白胨 10，牛肉膏 3，玉米浆1.5，尿素 1，CaCO₃ 1，MgSO₄ 0.2，KH₂PO₄ 1，琼脂 20 (斜面培养基)。用2 mol·L^-1 NaOH溶液调起始pH值为6.7~7.0，121??C灭菌15 min；

“二步发酵”发酵初始培养基 (g·L^-1)：L-山梨糖 20，尿素 12，CaCO₃ 5，MgSO₄ 0.1，KH₂PO₄ 1，玉米浆 5。明胶在发酵起始时添加，用25% Na₂CO₃溶液调起始pH值为6.7~7.0，121??C灭菌15 min，明胶的浓度为0.5~1.5 g·L^-1，最佳浓度为0.80 g·L^-1。

2-KLG和L-山梨糖浓度的测定

2-KLG碘量法测定：准确吸取样品2 mL，于25 mL试管中，加入2 mL 7 mol·L^-1的硫酸，摇匀于沸水中加热煮沸25 min，取出稍冷后用蒸馏水分次洗入250 mL三角瓶中，以淀粉为指示剂，用0.1 mol·L^-1碘标准溶液滴定至蓝色 (30 s不褪色即可) 为终点。

2-KLG含量计算公式：

式中：

C—I₂液浓度 (mol·L^-1)

V—I₂液消耗数 (mL)

0.9072—维生素C分子量/2-KLG分子量

8.806—由反应式推出1 mL 0.1 mol·L^-1碘液相当于8.806 mg的维生素C

A—2-KLG转化为维生素C的转化率 (%)，(按63.08%计算)

B—吸取发酵液的mL数 (2 mL)

L-山梨糖甘油酮法测定：准确吸取样品0.5 mL (含量高可吸取0.25 mL)，于250 mL锥形瓶中，加入20 mL甘油酮试剂，以蒸馏水冲洗瓶壁，使总体积为50 mL左右，由滴定管加入适量的标准L-山梨糖 (离终点前1.5 mL于电炉加热煮沸)，加次甲基兰指示剂3滴，以半秒半滴的速度滴至终点 (蓝色消失出现砖红色)。

L-山梨糖 (g·L^-1)=(V1-V2)×C/0.5

式中：

V₁—空白 (即20 mL甘油酮) 消耗标准糖的 mL数

V₂—加入样品后消耗标准糖的 mL数

C—标准L-山梨糖溶液的浓度 (g·L^-1)

0.5—吸取样品的 mL数

本发明提供的方法，可以显著地提高2-酮基-L-古龙酸的生产强度。当用0.80 g·L^-1明胶强化L-甘氨酸和L-脯氨酸丰度时，2-KLG发酵周期缩短至43 h (缩短15.6%)，2-KLG产酸速率为1.89 g·(L·h)^-1 (增加25.2%)。此外本发明采用2步法发酵，首先将将L-山梨醇转化为L-山梨糖，为二步发酵提供原料，降低了成本。

附图说明

图1 1吨搅拌罐不添加明胶对2-KLG发酵的影响

■: 2-KLG; ▲: L-sorbose

图2 1吨搅拌罐添加0.80 g·L^-1明胶对2-KLG发酵的影响

■: 2-KLG; ▲: L-sorbose。

具体实施方式

本专利“一步发酵”所用菌株为黑醋酸杆菌 (Acetobacter melanogenum)，“二步发酵”所用菌株为普通生酮古龙酸菌 (Ketogulonigenium vulgare)和巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)组成的混合菌系。

实施例1：

在1 m³发酵罐中进行，发酵培养基初始L-山梨糖浓度为16.15 g·L^-1，发酵6 h，开始流加L-山梨糖 (即无菌一步发酵液)，流加过程中控制L-山梨糖浓度为15~30 g·L^-1，发酵39 h后流加L-山梨糖结束，发酵过程溶解氧控制在40%，发酵终点2-KLG浓度为77.09 g·L^-1，发酵周期为51 h，产酸速率1.51 g·(L·h)^-1??（图1）。

实施例2：

在1 m³发酵罐中进行，发酵培养基初始L-山梨糖浓度为15.48 g·L^-1，添加0.8 g·L^-1明胶，发酵5 h，开始流加L-山梨糖 (即无菌一步发酵液)，流加过程中控制L-山梨糖浓度为15~30 g·L^-1，发酵31 h后流加L-山梨糖结束，发酵过程溶解氧控制在40%，发酵终点2-KLG浓度为81.43 g·L^-1，发酵周期为43h，产酸速率1.89 g·(L·h)^-1（图2）。

实施例3：

在1 m³发酵罐中进行，发酵培养基初始L-山梨糖浓度为15.48 g·L^-1，添加0.5 g·L^-1明胶，发酵5 h，开始流加L-山梨糖 (即无菌一步发酵液)，流加过程中控制L-山梨糖浓度为15~30 g·L^-1，发酵31 h后流加L-山梨糖结束，发酵过程溶解氧控制在40%，发酵终点2-KLG浓度为80.23 g·L^-1，发酵周期为46h，产酸速率1.73 g·(L·h)^-1。

实施例3：

在1 m³发酵罐中进行，发酵培养基初始L-山梨糖浓度为15.48 g·L^-1，添加1.5 g·L^-1明胶，发酵5 h，开始流加L-山梨糖 (即无菌一步发酵液)，流加过程中控制L-山梨糖浓度为15~30 g·L^-1，发酵31 h后流加L-山梨糖结束，发酵过程溶解氧控制在40%，发酵终点2-KLG浓度为81.25 g·L^-1，发酵周期为43h，产酸速率1.87 g·(L·h)^-1。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征在于在普通生酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)组成的混合菌系发酵中添加明胶强化L-甘氨酸和L-脯氨酸丰度。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌组成的混合菌可大量积累2-KLG。

3.权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于所述明胶的浓度为0.5~1.5 g·L^-1。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于所述明胶的浓度为0.80 g·L^-1。