CN110938564B - 一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法 - Google Patents

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Abstract

一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法，它以普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌为生产菌株，在种子培养基、发酵培养基或同时在种子培养基和发酵培养基中添加适量黄原胶和透明质酸钠进行培养，试验表明：能促进普通生酮基古龙酸菌增殖和代谢产酸，缩短发酵周期，提高发酵指数。具体地，在培养基中添加黄原胶，小菌数量增多，产酸量提高；在培养基中添加透明质酸钠，菌体分散性好，大小均匀，普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的生长状态更为同步，大菌易于形成芽孢，小菌产酸能力提升；在含有黄原胶的培养基中辅以加入适量的透明质酸钠，小菌菌量明显增加，大菌和小菌生长同步性提高，小菌产酸速率加快，效果较单独添加更为显著。

Description

一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法
技术领域
本发明涉及一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法，属于微生物发酵技术领域。
技术背景
2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，简称2-KLG)是合成维生素C的前体，目前国内采用“二步发酵法”生产，第一步单菌发酵，将D-山梨醇转化成L-山梨糖；第二步混合菌发酵，通过普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonogenium vulgarum，俗称小菌)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，俗称大菌)的共同作用将L-山梨糖转化成2-酮基-L-古龙酸。在“二步发酵法”的2-酮基-L-古龙酸生产过程中，第二步混合菌发酵中的小菌是产酸菌，单独培养生长弱，大菌是伴生菌不产酸，但为小菌提供生物活性物质促进其生长，因此提高小菌的增殖数量、控制大菌和小菌的同步生长、激发小菌代谢产酸能力，就是推进高效合成2-酮基-L-古龙酸的关键。
研究表明：微生物多糖是一种天然高分子聚合物，参与细胞的生长繁殖、控制细胞的分裂分化，具有保障生物分子结构稳定的作用。
黄原胶是由糖类经黄单胞杆菌发酵产生的胞外微生物多糖，具有良好的悬浮性、增稠性、热稳定性、酸碱稳定性等特点，广泛应用于食品、制药、化工等多个领域。在医药领域的研究表明，黄原胶能够为细胞生长提供适宜的三维微环境，促进多种细胞增殖和分化，有利于新生组织的形成。因此研究黄原胶对小菌(普通生酮基古龙酸菌)增殖的促进作用很有意义。
透明质酸钠是一种大分子多糖，参与调控细胞内外电解质的交流，可以调节渗透压，以及蛋白质、水、电解质的扩散及运转，促进细胞修复，在大菌(巨大芽孢杆菌)芽孢形成和细胞内生物活性物质的释放过程中起到协调作用，有利于生长环境的改善，促进大菌和小菌(普通生酮基古龙酸菌)的同步生长，增强小菌产酸酶系的酶活力。
黄原胶和透明质酸钠在促进普通生酮基古龙酸菌生长和产酸方面未见有相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供维生素C前体2-酮基-L-古龙酸生产技术一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法，即一种通过在种子培养基、发酵培养基或同时在种子培养基和发酵培养基中添加适量黄原胶和透明质酸钠，以促使普通生酮基古龙酸菌增殖和酶活力提升，从而实现2-酮基-L-古龙酸高效合成的方法。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案为：
一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法，它以普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌为生产菌株，在种子培养基、发酵培养基或同时在种子培养基和发酵培养基中添加适量黄原胶和透明质酸钠进行培养，其中：
在种子培养基中添加适量黄原胶和透明质酸钠进行培养，步骤包括：
(1)种子培养基基础配方：L-山梨糖20g/L、酵母膏3g/L、玉米浆3g/L、蛋白胨8g/L、尿素1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙1g/L；
(2)在种子培养基中以0.2～1.0g/L的添加量添加黄原胶，或以0.5～1.2g/L的添加量添加透明质酸钠，或同时以0.6～0.8g/L的添加量添加黄原胶和以0.6～0.8g/L的添加量添加透明质酸钠，调pH值为6.5～7.0，121℃±1℃灭菌15min；
(3)种子培养
将普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌液以2％的接种量接入含上述培养基的种子罐中，在温度28～32℃的条件下培养18h，制备普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液；
在发酵培养基中添加适量黄原胶和透明质酸钠进行培养，步骤包括：
(1)发酵培养基基础配方：L-山梨糖80g/L、玉米浆10g/L、尿素1.2g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.2g/L，其中山梨糖、尿素分别单独灭菌；
(2)在发酵培养基中以0.2～0.8g/L的添加量添加黄原胶，或以0.2～1.0g/L的添加量添加透明质酸钠，或同时以0.4～0.6g/L的添加量添加黄原胶和以0.6～0.8g/L的添加量添加透明质酸钠，调pH值为6.5～7.0，121℃±1℃灭菌15min；
(3)发酵培养
将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液以10％的接种量接入含上述培养基的发酵罐中，在温度29～33℃的条件下进行培养，期间用NaOH调控pH值保持在6.5～7.5，至发酵液残糖小于0.6mg/mL结束发酵，生产2-酮基-L-古龙酸。
本发明取得的有益效果是：
在种子培养基、发酵培养基或同时在种子培养基和发酵培养基中添加适量黄原胶和透明质酸钠，能促进普通生酮基古龙酸菌增殖和代谢产酸，缩短发酵周期，提高发酵指数。具体地，在培养基中添加黄原胶，小菌数量增多，产酸量提高；在培养基中添加透明质酸钠，菌体分散性好，大小均匀，普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的生长状态更为同步，大菌易于形成芽孢，小菌产酸能力提升；在含有黄原胶的培养基中辅以加入适量的透明质酸钠，小菌菌量明显增加，大菌和小菌生长同步性提高，小菌产酸速率加快，效果较单独添加更为显著。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，举出以下实例，但本发明的范围并不局限于此，其要求保护的范围记载于权利要求的权项中。
实施例1
一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法，它以普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌为生产菌株，在种子培养基中添加适量黄原胶进行培养，步骤包括：
(1)种子培养基基础配方：L-山梨糖20g/L、酵母膏3g/L、玉米浆3g/L、蛋白胨8g/L、尿素1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙1g/L；
(2)配制10种种子培养基，分别以0g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1.0g/L的添加量添加黄原胶，调pH值为6.5～7.0，121℃±1℃灭菌15min；
(3)采用10L四联罐进行种子培养
以不添加黄原胶的种子培养基为对照组，9种添加黄原胶的种子培养基为试验组，将试验组分为三组，每组均与对照组进行平行对比，将普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌液以2％的接种量分别接入含上述培养基的种子罐中，种后体积7L，在温度28～32℃的条件下培养18h，制备普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液。
检测
采用改进的碘量法测定制备的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液中2-KLG的含量，采用平板菌落计数法测定制备的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液中存活小菌的数量，结果如表1所示(其中，对照组数据为三次测定的平均值)。
表1
编号 黄原胶(g/L) 小菌活菌数(CFU/mL) 2-KLG(mg/mL)
对照组 0 <![CDATA[2.26×10<sup>9</sup>]]> 9.10
1 0.2 <![CDATA[2.39×10<sup>9</sup>]]> 9.38
2 0.3 <![CDATA[2.57×10<sup>9</sup>]]> 9.46
3 0.4 <![CDATA[2.71×10<sup>9</sup>]]> 9.61
4 0.5 <![CDATA[2.74×10<sup>9</sup>]]> 9.61
5 0.6 <![CDATA[2.88×10<sup>9</sup>]]> 10.07
6 0.7 <![CDATA[2.89×10<sup>9</sup>]]> 10.00
7 0.8 <![CDATA[2.85×10<sup>9</sup>]]> 9.77
8 0.9 <![CDATA[2.68×10<sup>9</sup>]]> 9.54
9 1.0 <![CDATA[2.62×10<sup>9</sup>]]> 9.46
表1显示，与对照组相比，在种子培养基中添加0.2～1.0g/L的黄原胶，在相同培养时间下存活小菌的数量增加了5.75～27.88％，种液酸量提高了3.08～10.66％。反映：在种子培养基中添加黄原胶有利于小菌的增殖，从而促进2-KLG的合成。
实施例2
一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法，它以普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌为生产菌株，在发酵培养基中添加适量黄原胶进行培养，步骤包括：
(1)发酵培养基基础配方：L-山梨糖80g/L、玉米浆10g/L、尿素1.2g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.2g/L，其中山梨糖、尿素分别单独灭菌；
(2)配制8种发酵培养基，分别以0g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L的添加量添加黄原胶，调pH值为6.5～7.0，121℃±1℃灭菌15min；
(3)采用10L四联罐进行发酵培养
以不添加黄原胶的发酵培养基为对照组，7种添加黄原胶的发酵培养基为试验组，将试验组分为三组，每组均与对照组进行平行对比，将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液以10％的接种量分别接入含上述培养基的发酵罐中，种后体积7L，在温度29～33℃的条件下进行培养，期间用NaOH调控pH值保持在6.5～7.5，至发酵液残糖小于0.6mg/mL结束发酵，生产2-酮基-L-古龙酸。
检测
采用改进的碘量法测定结束发酵后发酵液中2-KLG含量，采用蒽酮法测定结束发酵后发酵液中残糖含量，结果如表2所示(其中，对照组数据为三次测定的平均值)。
表2
Figure BDA0002304430020000051
Figure BDA0002304430020000061
表2显示，与对照组相比，在发酵培养基中分别添加0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L的黄原胶，发酵周期缩短了1～3h，2-KLG生成速率提高了2.38～8.57％，发酵指数增长了2.16～7.91％。反映：添加不同浓度的黄原胶对混合菌代谢产酸有一定促进作用。
实施例3
一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法，它以普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌为生产菌株，在种子培养基中添加适量透明质酸钠进行培养，步骤包括：
(1)种子培养基基础配方：L-山梨糖20g/L、酵母膏3g/L、玉米浆3g/L、蛋白胨8g/L、尿素1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙1g/L；
(2)配制9种种子培养基，分别以0g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1.0g/L、1.1g/L、1.2g/L的添加量添加透明质酸钠，调pH值为6.5～7.0，121℃±1℃灭菌15min；
(3)采用10L四联罐进行种子培养
以不添加透明质酸钠的种子培养基为对照组，8种添加透明质酸钠的种子培养基为试验组，将试验组分为三组，每组均与对照组进行平行对比，将普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌液以2％的接种量分别接入含上述培养基的种子罐中，种后体积7L，在温度28～32℃的条件下培养18h，制备普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液。
检测
采用改进的碘量法测定制备的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液中2-KLG的含量，采用平板菌落计数法测定制备的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液中存活小菌的数量，结果如表3所示(其中，对照组数据为三次测定的平均值)。
表3
Figure BDA0002304430020000062
Figure BDA0002304430020000071
表3显示，与对照组相比，在种子培养基中添加0.5～1.2g/L的透明质酸钠，在相同培养时间下存活小菌的数量增加了0.88～5.29％，种液酸量提高了4.57～13.15％。反映：在种子培养基中添加透明质酸钠虽然小菌增殖没有明显加快，但代谢产酸能力增强。
实施例4
一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法，它以普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌为生产菌株，在发酵培养基中添加适量透明质酸钠进行培养，步骤包括：
(1)发酵培养基基础配方：L-山梨糖80g/L、玉米浆10g/L、尿素1.2g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.2g/L，其中山梨糖、尿素分别单独灭菌；
(2)配制10种发酵培养基，分别以0g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1.0g/L的添加量添加透明质酸钠，调pH值为6.5～7.0，121℃±1℃灭菌15min；
(3)采用10L四联罐进行发酵培养
以不添加透明质酸钠的发酵培养基为对照组，9种添加透明质酸钠的发酵培养基为试验组，将试验组分为三组，每组均与对照组进行平行对比，将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液以10％的接种量分别接入含上述培养基的发酵罐中，种后体积7L，在温度29～33℃的条件下进行培养，期间用NaOH调控pH值保持在6.5～7.5，至发酵液残糖小于0.6mg/mL结束发酵，生产2-酮基-L-古龙酸。
检测
采用改进的碘量法测定结束发酵后发酵液中2-KLG含量，采用蒽酮法测定结束发酵后发酵液中残糖含量，结果如表4所示(其中，对照组数据为三次测定的平均值)。
表4
Figure BDA0002304430020000081
表4显示，与对照组相比，在发酵培养基中添加0.2～1.0g/L的透明质酸钠，发酵周期缩短了0.8～2.8h，2-KLG生成速率提高了1.90～8.06％，发酵指数增长了1.44～7.19％。反映：添加不同浓度的透明质酸钠对混合菌代谢产酸有一定促进作用。
实施例5
一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法，它以普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌为生产菌株，在种子培养基中添加适量黄原胶和透明质酸钠进行培养，步骤包括：
(1)种子培养基基础配方：L-山梨糖20g/L、酵母膏3g/L、玉米浆3g/L、蛋白胨8g/L、尿素1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙1g/L；
(2)配制10种种子培养基，分别以0g/L、0.6g/L、0.6g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.7g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.8g/L、0.8g/L的添加量添加黄原胶，并分别以0g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L的添加量添加透明质酸钠，调pH值为6.5～7.0，121℃±1℃灭菌15min；
(3)采用10L四联罐进行种子培养
以不添加黄原胶和透明质酸钠的种子培养基为对照组，9种添加黄原胶和透明质酸钠的种子培养基为试验组，将试验组分为三组，每组均与对照组进行平行对比，将普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌液以2％的接种量分别接入含上述培养基的种子罐中，种后体积7L，在温度28～32℃的条件下培养18h，制备普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液。
检测
采用改进的碘量法测定制备的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液中2-KLG的含量，采用平板菌落计数法测定制备的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液中存活小菌的数量，结果如表5所示(其中，对照组数据为三次测定的平均值)。
表5
序号 黄原胶(g/L) 透明质酸钠(g/L) 小菌活菌数(CFU/mL) 2-KLG(mg/mL)
对照组 0 0 <![CDATA[2.29×10<sup>9</sup>]]> 9.18
1 0.6 0.6 <![CDATA[2.86×10<sup>9</sup>]]> 10.77
2 0.6 0.7 <![CDATA[2.92×10<sup>9</sup>]]> 11.38
3 0.6 0.8 <![CDATA[2.97×10<sup>9</sup>]]> 11.54
4 0.7 0.6 <![CDATA[2.89×10<sup>9</sup>]]> 11.15
5 0.7 0.7 <![CDATA[2.95×10<sup>9</sup>]]> 11.54
6 0.7 0.8 <![CDATA[2.91×10<sup>9</sup>]]> 11.15
7 0.8 0.6 <![CDATA[2.85×10<sup>9</sup>]]> 10.77
8 0.8 0.7 <![CDATA[2.84×10<sup>9</sup>]]> 10.77
9 0.8 0.8 <![CDATA[2.82×10<sup>9</sup>]]> 10.38
表5显示，与对照组相比，在种子培养基中同时添加0.6～0.8g/L的黄原胶和0.6～0.8g/L的透明质酸钠，在相同培养时间下存活小菌的数量增加了23.14～29.69％，种液酸量提高了13.07～25.71％。反映：在种子培养基中同时添加黄原胶和透明质酸钠对小菌的增殖和2-KLG的合成有明显的促进作用。
实施例6
一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法，它以普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌为生产菌株，在发酵培养基中添加适量黄原胶和透明质酸钠进行培养，步骤包括：
(1)发酵培养基基础配方：L-山梨糖80g/L、玉米浆10g/L、尿素1.2g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.2g/L，其中山梨糖、尿素分别单独灭菌；
(2)配制10种发酵培养基，分别以0g/L、0.4g/L、0.4g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.5g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.6g/L、0.6g/L的添加量添加黄原胶，并分别以0g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L的添加量添加透明质酸钠，调pH值为6.5～7.0，121℃±1℃灭菌15min；
(3)采用10L四联罐进行发酵培养
以不添加黄原胶和透明质酸钠的发酵培养基为对照组，9种添加黄原胶和透明质酸钠的发酵培养基为试验组，将试验组分为三组，每组均与对照组进行平行对比，将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液以10％的接种量分别接入含上述培养基的发酵罐中，种后体积7L，在温度29～33℃的条件下进行培养，期间用NaOH调控pH值保持在6.5～7.5，至发酵液残糖小于0.6mg/mL结束发酵，生产2-酮基-L-古龙酸。
检测
采用改进的碘量法测定结束发酵后发酵液中2-KLG含量，采用蒽酮法测定结束发酵后发酵液中残糖含量，结果如表6所示(其中，对照组数据为三次测定的平均值)。
表6
Figure BDA0002304430020000101
Figure BDA0002304430020000111
表6显示，与对照组相比，在发酵培养基中同时添加0.4～0.6g/L的黄原胶和0.6～0.8g/L的透明质酸钠，发酵周期缩短了2.2～4.2h，2-KLG生成速率提高了7.08～12.26％，发酵指数增长了5.71～11.43％。反映：添加不同浓度的黄原胶和透明质酸钠对混合菌代谢产酸有促进作用。
实施例7
一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法，它以普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌为生产菌株，同时在种子培养基和发酵培养基中添加适量黄原胶和透明质酸钠进行培养，其中：
在种子培养基中添加适量黄原胶和透明质酸钠进行培养，步骤包括：
(1)种子培养基基础配方：L-山梨糖20g/L、酵母膏3g/L、玉米浆3g/L、蛋白胨8g/L、尿素1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙1g/L；
(2)配制2种种子培养基，分别以0g/L、0.6g/L的添加量添加黄原胶，并分别以0g/L、0.8g/L的添加量添加透明质酸钠，调pH值为6.5～7.0，121℃±1℃灭菌15min；
(3)采用10L四联罐进行种子培养
以不添加黄原胶和透明质酸钠的种子培养基为对照组，另一种添加黄原胶和透明质酸钠的种子培养基为试验组，试验组与对照组进行平行对比，将普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌液以2％的接种量分别接入含上述种子培养基的种子罐中，种后体积7L，在温度28～32℃的条件下培养18h，制备普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液；
在发酵培养基中添加适量黄原胶和透明质酸钠进行培养，步骤包括：
(1)发酵培养基基础配方：L-山梨糖80g/L、玉米浆10g/L、尿素1.2g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.2g/L，其中山梨糖、尿素分别单独灭菌；
(2)配制2种发酵培养基，分别以0g/L、0.4g/L的添加量添加黄原胶，并分别以0g/L、0.7g/L的添加量添加透明质酸钠，调pH值为6.5～7.0，121℃±1℃灭菌15min；
(3)采用10L四联罐进行发酵培养
以不添加黄原胶和透明质酸钠的发酵培养基为对照组，另一种添加黄原胶和透明质酸钠的发酵培养基为试验组，试验组与对照组进行平行对比，将不添加黄原胶和透明质酸钠制备的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液以10％的接种量接入含上述对照组发酵培养基的发酵罐中、添加黄原胶和透明质酸钠制备的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液以10％的接种量接入含上述试验组发酵培养基的发酵罐中，种后体积均为7L，在温度29～33℃的条件下进行培养，期间用NaOH调控pH值保持在6.5～7.5，至发酵液残糖小于0.6mg/mL结束发酵，生产2-酮基-L-古龙酸。
检测
采用改进的碘量法测定种子培养制备的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液中2-KLG的含量，采用平板菌落计数法测定种子培养制备的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液中存活小菌的数量，结果如表7所示。
表7
组别 黄原胶(g/L) 透明质酸钠(g/L) 小菌活菌数(CFU/mL) 2-KLG(mg/mL)
对照组 0 0 <![CDATA[2.31×10<sup>9</sup>]]> 9.23
试验组 0.6 0.8 <![CDATA[2.98×10<sup>9</sup>]]> 11.54
表7显示，与对照组相比，同时在种子培养基中添加0.6g/L的黄原胶和0.8g/L的透明质酸钠，在相同培养时间下存活小菌的数量增加了29.00％，种液酸量提高了25.03％。
采用改进的碘量法测定结束发酵后发酵液中2-KLG含量，采用蒽酮法测定结束发酵后发酵液中残糖含量，结果如表8所示。
表8
Figure BDA0002304430020000131
表8显示，将添加黄原胶和透明质酸钠制备的种液接入添加黄原胶和透明质酸钠的发酵培养基中进行发酵培养，发酵周期缩短了5.0h，2-KLG生成速率提高了13.20％，发酵指数增长了13.57％。反映：在种子培养基和发酵培养基中同时添加黄原胶和透明质酸钠对混合菌代谢产酸的促进作用更为显著。
附录：
存活小菌数量的测定方法
采用平板菌落计数法，具体方法如下：准确吸取种液样品1mL于装有9mL无菌水的试管中，充分混匀，记为10-1，再吸取该稀释液1mL于第二个装有9mL无菌水的试管中，充分混匀，记为10-2……，按以上方法逐级稀释至10-6。吸取0.1mL稀释样品涂布于固体培养基平板上，每个样品做3组平行，28～32℃培养72h，进行小菌菌落计数，根据每皿的平均菌落数和稀释倍数计算种液中的存活小菌数(CFU/mL)。
2-KLG含量的测定方法
采用改进的碘量法，具体方法如下：准确吸取样品2mL于试管中，加入7mol/L的硫酸2ml，摇匀，沸水浴中加热25min，取出冷却后用纯化水分次洗入250ml三角瓶中，再加入0.5％的淀粉溶液3ml，用0.1mol/L的碘液滴定至蓝色，30s不褪色，即为滴定终点。
残糖的测定方法
采用蒽酮法，具体方法如下：取发酵液样品1mL于100mL容量瓶中，加纯化水定容，再吸取1mL稀释液于洁净干燥的试管中，加入6mL蒽酮溶液，混匀，静置10min，空白对照用纯化水代替样品进行上述操作。分光光度计620nm波长测OD值，然后换算为残糖含量。当残糖含量≤0.42mg/mL时即为发酵终点。

Claims (1)

1.一种促进普通生酮基古龙酸菌生长代谢的方法，其特征在于：它以普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌为生产菌株，在种子培养基、发酵培养基或同时在种子培养基和发酵培养基中添加适量黄原胶和/或透明质酸钠进行培养，其中：
在种子培养基中添加适量黄原胶和/或透明质酸钠进行培养，步骤包括：
（1）种子培养基基础配方：L-山梨糖20g/L、酵母膏3g/L、玉米浆3g/L、蛋白胨8g/L、尿素1g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙1g/L；
（2）在种子培养基中以0.2～1.0g/L的添加量添加黄原胶，或以0.5～1.2g/L的添加量添加透明质酸钠，或同时以0.6～0.8g/L的添加量添加黄原胶和以0.6～0.8g/L的添加量添加透明质酸钠，调pH值为6.5～7.0，121℃±1℃灭菌15min；
（3）种子培养
将普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌液以2%的接种量接入含上述培养基的种子罐中，在温度28～32℃的条件下培养18h，制备普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液；
在发酵培养基中添加适量黄原胶和/或透明质酸钠进行培养，步骤包括：
（1）发酵培养基基础配方：L-山梨糖80g/L、玉米浆10g/L、尿素1.2g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.2g/L，其中山梨糖、尿素分别单独灭菌；
（2）在发酵培养基中以0.2～0.8g/L的添加量添加黄原胶，或以0.2～1.0g/L的添加量添加透明质酸钠，或同时以0.4～0.6g/L的添加量添加黄原胶和以0.6～0.8g/L的添加量添加透明质酸钠，调pH值为6.5～7.0，121℃±1℃灭菌15min；
（3）发酵培养
将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌种液以10%的接种量接入含上述培养基的发酵罐中，在温度29～33℃的条件下进行培养，期间用NaOH调控pH值保持在6.5～7.5，至发酵液残糖小于0.6mg/mL结束发酵，生产2-酮基-L-古龙酸。
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