CN103642889A - 一种添加甜菜碱提高2-酮基-l-古龙酸生产强度的方法 - Google Patents

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胡少斌
陈红
刘杰
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Abstract

本发明阐述了一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，属于发酵制备维生素C技术领域。采用普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌系为生产菌株，通过在发酵培养基中外源添加0.05%～1.0%甜菜碱作为渗透压调节剂，促进细胞生长和2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的生产，实现2-KLG高效生产。本发明采用上述工艺，可有效缩短2-酮基-L-古龙酸的发酵周期，提高生产强度。

Description

一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法
技术领域
本发明属于发酵制备维生素C技术领域，更具体地说，涉及一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法。
背景技术
维生素C是人体必需的水溶性维生素，参与多种代谢活动。2-酮基-L-古龙酸酸 (2-keto-L-gulonic acid，以下简称 2-KLG)是合成维生素C重要的前体。目前国内主要维生素C生产厂家均采用“二步发酵法”生产工艺，这一技术的关键步骤是其第二步发酵过程，L-山梨糖在一种混合菌系作用下被生物氧化为2-KLG，该混合菌系由两种微生物组成，其中起糖酸转化作用的微生物为普通生酮基古龙酸菌，俗称小菌。混合菌系中另一种微生物为伴生菌，大多为革兰氏阳性芽孢杆菌，俗称大菌，如巨大芽孢杆菌等。在第二步发酵过程中，常出现生产前期大、小菌比例失调，大菌旺盛生长，发酵前期PH异常波动，小菌受到抑制，小菌不适应高浓发酵等现象，造成发酵周期长、能耗高等技术问题，因此，改进原有发酵生产工艺，提高2-KLG生产强度是非常必要的。
甜菜碱是一种中性物质，能够维持细胞渗透压，甜菜碱的溶解度很高，不带净电荷，其高浓度对许多酶及其他生物大分子没有影响，甚至有保护作用。目前通过添加甜菜碱来提高2-酮基-L-古龙酸生产强度尚未见文献报道。专利CN200910034773.0公开了一种添加海藻糖强化2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，在发酵培养基中添加海藻糖，海藻糖作为渗透保护剂，提高耐高渗透能力；专利CN201010533043.8公开了一种提高2-酮基-L-古龙酸发酵生产强度的方法，通过在发酵培养基中添加明胶提高2-酮基-L-古龙酸发酵生产强度；专利CN201210314745.6公开了一种促进2-酮基- L-古龙酸高效生产的方法，是通过在发酵培养基中添加D-核糖母液实现的。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种提高2-酮基-L-古龙酸发酵生产强度的方法，能够有效提高2-酮基-L-古龙酸的转化率，缩短发酵周期，实现高浓发酵。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，采用普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌系为生产菌株，以L-山梨糖为底物发酵，在发酵培养基中添加0.05%~1.0%的甜菜碱。
培养基条件为：
固体培养基（%）：山梨糖2.0，酵母膏0.2，玉米浆0.5，尿素0.2，MgSO4·H 2O 0.03，KH2PO4 0.02，CaCO3 0.5，琼脂2.5，PH6.8-7.2。
液体种子培养基（%）：山梨糖2.0，酵母膏0.3，玉米浆0.5，尿素0.2，MgSO4·H 2O 0.01，KH2PO4 0.02，CaCO3 0.5，琼脂2.5，PH6.8-7.2。
发酵培养基（%）：山梨糖8.0，玉米浆0.5，尿素1.2，MgSO4·H 2O 0.02，KH2PO4 0.05，CaCO3 0.5，PH6.8-7.2，其中山梨糖单独灭菌。
本发明采用摇瓶培养方法培养菌种。
种液培养条件：培养温度28-30℃，培养时间为24小时，摇床转速200rpm。
发酵瓶培养条件：培养温度29-33℃，接种量12%，摇床转速210rpm，培养时间为72小时，发酵培养基中按实验要求添加不同浓度的甜菜碱（浓度范围0.05%~1.0%）。
用碘量法测定发酵液中的2-酮基-L-古龙酸；用二苯胺法测定发酵液中残余的L-山梨糖。
有益效果：本发明采用的上述工艺，发酵前期PH波动小，混合菌比例合适，菌种活力增强，2-酮基-L-古龙酸的生成速率大幅提高，可以有效缩短2-酮基-L-古龙酸的发酵周期，提高生产强度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
本发明培养基：
固体培养基（%）：山梨糖2.0，酵母膏0.2，玉米浆0.5，尿素0.2，MgSO4·H 2O 0.03，KH2PO4 0.02，CaCO3 0.5，琼脂2.5，PH6.8-7.2。
液体种子培养基（%）：山梨糖2.0，酵母膏0.3，玉米浆0.5，尿素0.2，MgSO4·H 2O 0.01，KH2PO4 0.02，CaCO3 0.5，琼脂2.5，PH6.8-7.2。
发酵培养基（%）：山梨糖8.0，玉米浆0.5，尿素1.2，MgSO4·H 2O 0.02，KH2PO4 0.05，CaCO3 0.5，PH6.8-7.2，其中山梨糖单独灭菌。
本发明摇瓶培养
种液培养条件：培养温度28-30℃，培养时间为24小时，摇床转速200rpm。
发酵瓶培养条件：培养温度29-33℃，接种量12%，摇床转速210rpm，培养时间为72小时，发酵培养基中按实验要求添加不同浓度的甜菜碱（浓度范围0.05%~1.0%）。
发酵液中2-KLG的测定：改进的碘量法；发酵液中残余的L-山梨糖测定：二苯胺法。
实施例1
    将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌的混合菌液6ml，接入到40ml含有8%的山梨糖、0.5%玉米浆、1.2%尿素、0.02%硫酸镁、0.05%磷酸二氢钾、0.5%碳酸钙、0.1%甜菜碱的发酵培养基，培养基初始pH7.0，培养温度29℃，摇瓶容积500ml，摇床转速210rpm，发酵液终点2-KLG含量79.16mg/ml，发酵周期60小时，生产强度为1.32g/l·h。试验组与对照组相比发酵周期缩短了9.1%，2-KLG产量和生产强度分别提高了2.87%和14.2%。
实施例2
    将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢菌的混合菌液12ml，接入到80ml含有8%的山梨糖、0.5%玉米浆、1.2%尿素、0.02%硫酸镁、0.05%磷酸二氢钾。0.5%碳酸钙、0.5%甜菜碱的发酵培养基，培养基初始pH7.0，培养温度31℃，摇瓶容积750ml，摇床转速210rpm，发酵液终点2-KLG含量79.72mg/ml，发酵周期56小时，生产强度为1.42g/l·h。试验组与对照组相比发酵周期缩短了15.2%，2-KLG产量和生产强度分别提高了2.96%和16.4%。
实施例3
将培养好的普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢菌的混合菌液12ml，接入到80ml含有8%的山梨糖、0.5%玉米浆、1.2%尿素、0.02%硫酸镁、0.05%磷酸二氢钾。0.5%碳酸钙、0.2%甜菜碱的发酵培养基，培养基初始pH7.0，培养温度31℃，摇瓶容积750ml，摇床转速210rpm。发酵12h后，每间隔4h补加0.02%甜菜碱至终点。发酵液终点2-KLG含量79.95mg/ml，发酵周期54小时，生产强度为1.48g/l·h试验组与对照组相比发酵周期缩短了18.1%，2-KLG产量和生产强度分别提高了4.29％和19.1%。
显然，本发明不限于这些公开的实施例，本发明将覆盖技术方案所描述的范围，以及权利要求范围的各种变形和等效变化，在不偏离本发明的技术解决方案的前体下，对本发明所作的本领域技术人员容易实现的任何修改或改进均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征在于：采用普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合菌系为生产菌株，以L-山梨糖为底物发酵，在发酵培养基中添加0.05%~1.0%的甜菜碱。
2.如权利要求1所述的一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征在于：培养基条件为：
固体培养基（%）：山梨糖2.0，酵母膏0.2，玉米浆0.5，尿素0.2，MgSO4·H 2O 0.03，KH2PO4 0.02，CaCO3 0.5，琼脂2.5，PH6.8-7.2；
液体种子培养基（%）：山梨糖2.0，酵母膏0.3，玉米浆0.5，尿素0.2，MgSO4·H 2O 0.01，KH2PO4 0.02，CaCO3 0.5，琼脂2.5，PH6.8-7.2；
发酵培养基（%）：山梨糖8.0，玉米浆0.5，尿素1.2，MgSO4·H 2O 0.02，KH2PO4 0.05，CaCO3 0.5，PH6.8-7.2，其中山梨糖单独灭菌。
3.如权利要求1所述的一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征在于：采用摇瓶培养方法培养菌种。
4.如权利要求1所述的一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征在于：种液培养条件为：培养温度28-30℃，培养时间为24小时，摇床转速200rpm。
5.如权利要求1所述的一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征在于：发酵瓶培养条件为：培养温度29-33℃，接种量12%，摇床转速210rpm，培养时间为72小时。
6.如权利要求1所述的一种添加甜菜碱提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征在于：用碘量法测定发酵液中的2-酮基-L-古龙酸；用二苯胺法测定发酵液中残余的L-山梨糖。
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