CN101591670A - 一种提高光滑球拟酵母抵御高渗透压胁迫的方法 - Google Patents

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徐沙
刘立明
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Abstract

一种提高光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)抵御高渗透压胁迫的方法，属于代谢控制策略优化发酵过程技术领域。本发明采用将来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中编码形成水的NADH氧化酶nox基因过量表达于丙酮酸工业生产菌株T.glabrata中，获得了一株NADH氧化酶活性为34.8U·mg－1 protein的重组菌T.glabrata PDnoxE。在T.glabrata中表达nox基因，显著降低了NADH/NAD+的比例，提高了与水形成途径相关的酶活，使胞内的含水量升高。在高渗条件下(3824mOsmol·kg－1)T.glabrata PDnoxE的菌体生长明显提高。结果表明可以通过控制水的生成途径提高酵母细胞渗透适应性。

Description

一种提高光滑球拟酵母抵御高渗透压胁迫的方法
技术领域
一种提高光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)抵御高渗透压胁迫的方法，属于代谢控制策略优化发酵过程技术领域。本发明涉及一种在T.glabrata内过量表达来源于L.lactis中编码形成水的NADH氧化酶nox基因。提高了与水形成途径相关的酶活，使胞内的水含量升高，保护细胞在高渗条件下的生长和功能。
背景技术
NADH氧化酶直接将NADH氧化成NAD+并将O2还原成H2O。研究结果表明这个酶的表达会导致NADH/NAD+的比例急剧下降，并显著的提高细胞对抗氧胁迫的能力。另外，NADH可以将O2直接还原成水，不需要经过电子传递链，提高了形成水的效率，增加了胞内水含量，增强了细胞在高渗条件下的生长和功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过在光滑球拟酵母T.glabrata表达形成水的NADH氧化酶，显著降低了NADH/NAD+的比例，提高了与水形成途径相关的酶活，使胞内水含量升高。在高渗条件下(3824mOsmol·kg-1)T.glabrata PDnoxE的菌体生长明显提高。
本发明的技术方案：一种提高光滑球拟酵母抵御高渗透压胁迫的方法，利用多重维生素营养缺陷型的丙酮酸工业生产菌株光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M202019为模式菌株，采用将来源于乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)中编码形成水的NADH氧化酶nox基因过量表达于CCTCC M202019中，获得了一株NADH氧化酶活性为34.8 U·mg-1 protein的重组菌T.glabrataPDnoxE，在T.glabrata中表达nox基因，显著降低了NADH/NAD+的比例，提高了与水形成途径相关的酶活，使胞内的含水量升高，在3824 mOsmol·kg-1高渗条件下T.glabrata PDnoxE的菌体生长明显提高，表明通过控制水的生成途径提高酵母细胞渗透适应性，通过过量表达NADH氧化酶，保护光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)抵御高渗透压胁迫。
1、菌株
原菌(模式菌株)：光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M 202019，烟酸(NA)、生物素(Bio)、硫胺素(B1)、吡哆醇(Pdx)四种维生素营养缺陷型，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低，为江南大学选育菌株，该菌种已申请中国专利，申请号为02113142.2，公开号为CN1392246A。
工程菌：在光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCC M 202019细胞内过量表达来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中编码形成水的NADH氧化酶nox基因，构建工程菌T.glabrata PDnoxE。
2、培养基
种子和斜面培养基(g·L-1)：葡萄糖30，蛋白胨10，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O0.5；琼脂20(斜面培养基)，pH 5.5。
基本发酵培养基(L)：葡萄糖100g，NH4SO4 7g，MgSO4·7H2O 0.8g，KH2PO45g，CH3COONa 5g，pH 5.0。
3、摇瓶培养：
将30℃、200rpm下培养24h的种子以10％的接种量分别转入基本发酵培养基，于30℃、200rpm条件下培养48h，按实验要求添加不同浓度的烟酸、维生素B1、维生素B6、生物素Bio。
细胞干重的测定：取一定量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加2mL盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10mL，摇匀，用UV 7500型可见分光光度计，于660nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。
本发明的有益效果：原菌和工程菌在渗透压升高到2947mOsmol·kg-1时菌体量都有明显下降。然而，在高渗条件下，工程菌T.glabrata PDnoxE在发酵终点的菌体量高于原菌，分别提高17.5％(2018 mOsmol·kg-1)，33.2％(2947mOsmol·kg-1)和71.8％(3824mOsmol·kg-1)。
具体实施方式
实施例1：
在光滑球拟酵母T.glabrata细胞内过量表达来源于乳酸乳球菌中编码形成水的NADH氧化酶nox基因，构建工程菌T.glabrata PDnoxE。发酵48h，在渗透压分别为2018mOsmol·kg-1，2947mOsmol·kg-1和3824mOsmol·kg-1的条件下，最终菌体浓度分别为7.2g·L-1，5.8g·L-1，2.3g·L-1，相比对照分别提高18.0％(2018mOsmol·kg-1)，34.9％(2947mOsmol·kg-1)和76.9％(3824mOsmol·kg-1)。
对照实施例：
本发明所用的菌种光滑球拟酵母T.glabrata，先转斜面在30℃培养箱中培养12h，然后挑取单菌落用种子培养基培养24h，最后摇瓶发酵48h，温度30℃，转速200rpm。渗透压分别为2018mOsmol·kg-1，2947mOsmol·kg-1和3824mOsmol·kg-1，最终菌体浓度分别是6.1g·L-1(2018mOsmol·kg-1)，4.3g·L-1(2947mOsmol·kg-1)和1.3g·L-1(3824mOsmol·kg-1)。

Claims (1)

1、一种提高光滑球拟酵母抵御高渗透压胁迫的方法，其特征是利用多重维生素营养缺陷型的丙酮酸工业生产菌株光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCCM202019为模式菌株，采用将来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中编码形成水的NADH氧化酶nox基因过量表达于CCTCC M202019中，获得了一株NADH氧化酶活性为34.8U·mg-1 protein的重组菌T.glabrata PDnoxE，在T.glabrata中表达nox基因，显著降低了NADH/NAD+的比例，提高了与水形成途径相关的酶活，使胞内的含水量升高，在3824mOsmol·kg-1高渗条件下T.glabrata PDnoxE的菌体生长明显提高，表明通过控制水的生成途径提高酵母细胞渗透适应性，通过过量表达NADH氧化酶，保护光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)抵御高渗透压胁迫。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102864179A (zh) * 2012-08-29 2013-01-09 太仓市茂通化建有限公司 一种利用光滑球拟酵母菌高效制备丙酮酸的方法
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