CN107653276B - 一种抑制色素形成的环β-1,2-葡聚糖发酵方法 - Google Patents

一种抑制色素形成的环β-1,2-葡聚糖发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑制色素形成的环β‑1,2‑葡聚糖发酵方法，属于智能化轻工过程控制领域。本发明成功抑制了Rhizobium radiobacter NBRC 13259发酵过程中色素的形成，并将细胞浓度提高到8.0g/L，解决了Rhizobium radiobacter NBRC 13259发酵过程中色素形成难于控制和细胞浓度难于提高的问题，为提高单位体积中环β‑1,2‑葡聚糖浓度的提高奠定了基础。

Description

一种抑制色素形成的环β-1,2-葡聚糖发酵方法
技术领域
本发明涉及一种抑制色素形成的环β-1,2-葡聚糖发酵方法，属于智能化轻工过程控制领域。
背景技术
环状β-1,2-葡聚糖是以葡萄糖为单体，经β-1,2糖苷键连接、聚合度位于17～25之间且具有较强水溶性能力的环形多糖。其在根瘤形成、布鲁士菌侵入机体细胞以及其在细胞内逃脱人体自然免疫系统的过程中有着关键的作用。获得足够的环β-1,2-葡聚糖是分析其功能的基础，但是目前尚没有有效的大量获得β-1,2-葡聚糖的方法与途径。
通过对Rhizobium meliloti MTCC 3402进行发酵法生产环状β-1,2-葡聚糖研究，所取得的最高生物量仅为1.8g/L。这主要是由于产环状β-1,2-葡聚糖的菌株主要以谷氨酸为氮源，一般来说提高氮源可以提高细胞浓度，但是当提高氮源谷氨酸的浓度时，会发生色素形成，使发酵液颜色加深，并造成细胞浓度不能提高。而细胞生物量的提高与环β-1,2-葡聚糖的产量紧密相关；同时，色素的形成将增加后续纯化环状β-1,2-葡聚糖工艺流程中去除色素的成本。所以如何提高抑制发酵液中色素的形成和发酵液中的生物量成为进一步提高环β-1,2-葡聚糖产量和降低生产成本的关键。
发明内容
为解决现有技术存在的上述缺陷，实现环状β-1,2-葡聚糖发酵过程中色素形成的抑制，并同时达到大大提高细胞浓度目的，本发明提供一种环状β-1,2-葡聚糖的生产方法，所述方法以放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)为发酵菌株，通过控制pH并结合谷氨酸流加的方式进行发酵；所述控制pH是控制发酵pH≤7.2。
在本发明的一种实施方式中，所述放射型根瘤菌为放射型根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)NBRC13259。
在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸流加是从发酵初始(即接种后)时刻开始计，0h开始，每4～6h补充一次谷氨酸，使谷氨酸浓度较0h时的浓度相比增加0.8～1.2g/L，补加四次后停止补加谷氨酸。
在本发明的一种实施方式中，谷氨酸的初始浓度为5±0.5g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述pH控制是在发酵第0～40h，控制pH为6.8～7.2；第40～60h控制pH为6.3～6.5；第60～80h，pH逐渐降低到5.5～5.7；第80h后维持pH为5.5～5.7直至发酵结束。
在本发明的一种实施方式中，在第一阶段即第0～40h，pH控制为6.8～7.2，通气量为1～1.5vvm，溶氧控制在25～30％；第40～60h为第二阶段，pH控制为6.3～6.5，通气量为1～1.5vvm，溶氧控制在20～25％；第60～80h，pH逐渐降低到5.5～5.7，通气量为1～1.5vvm，溶氧控制在20～25％；第80h后维持pH为5.5～5.7直至发酵结束，通气量为1vvm，溶氧控制在20～25％。
在本发明的一种实施方式中，控制策略与发酵规模无关，在不同发酵规模下，均采用所述发酵方法。
在本发明的一种实施方式中，所述方法的发酵培养基组成是：按g/L计，甘露醇10.0,谷氨酸5.0,NaCl 0.2,K2HPO41.0,MgSO4·7H2O 0.2,CaCl2·2H2O 0.04,FeCl3·6H2O0.0025,MnCl2·4H2O 0.001,Na2MO4·7H2O 0.00001,ZnSO4·7H2O 0.00001,CuSO4·5H2O0.00001,H3BO3 0.00001,CoCl2·6H2O 0.00001,生物素0.00001,维生素B10.00001，pH7.0–7.2。
在本发明的一种实施方式中，所述Rhizobium radiobacterNBRC13259的接种量为10％，种子液中菌体数量为1～5×1010CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，种子液中菌体数量为1.2×1010CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是基于PID控制器对发酵过程pH进行控制：0～40h，将pH控制在7.0；40～60h，将pH控制在6.4；60～80h，基于PID系统将pH逐渐降低到5.6；80h后将pH维持在5.6直至144h发酵结束。
在本发明的一种实施方式中，在40～60h，发酵处于环β-1,2-葡聚糖生成阶段，在发酵液pH不高于6.4的条件下，不需要启动pH流加设备来控制罐体pH，在高于6.4时，启动pH自动调控系统，通过补充HCl来调控pH；80h后，只要发酵液pH不高于5.6的条件下,就让发酵过程处于自动状态。
在本发明的一种方式中，流加HCl或NH3H2O进行pH控制。
在本发明的一种方式中，所述HCl的浓度为1.5～2mol/L。
在本发明的一种方式中，NH3H2O的浓度为20％(v/v,mL/mL)。
在本发明的一种方式中，谷氨酸流加方式控制模式为：从0h开始计时，每隔5h间歇补充谷氨酸，相比于补加时刻的谷氨酸，使发酵液中谷氨酸浓度增加1g/L，共补4次，20h后停止补充谷氨酸。
在本发明的一种实施方式中，培养24h时，补料浓度为30g/L的甘露醇，从培养24h后到发酵结束，以后每隔12h补料浓度为30g/L的甘露醇，使发酵液中甘露醇浓度与补料时刻相比提高20g/L，β-1,2-葡聚糖主要在该阶段生成。
本发明还提供所述方法在制备含环β-1,2-葡聚糖的产品中的应用。
本发明的有益效果：本发明实现了发酵过程中高谷氨酸浓度条件下，色素的形成受到抑制，在发酵液稀释50倍的条件下，发酵液的吸光度(或色度)由3.2降低为0.03，并且大大提高了Rhizobium radiobacterNBRC13259细胞浓度，使发酵24h时，细胞浓度相比对照提高了5倍。采用本方法，Rhizobium radiobacterNBRC13259发酵144小时后，环β-1,2-葡聚糖的产量达到5.2g/L。相比于自然发酵提高了1倍。
附图说明
图1为基于pH控制来控制Rhizobium radiobacterNBRC13259发酵进程的工艺图
图2为pH控制策略的发酵液颜色对比图；左图为为自然发酵的发酵液颜色；右图为采用本申请专利pH控制后发酵液颜色；
图3为pH控制前后发酵液颜色OD230nm吸光值对比图；
图4为在1吨罐发酵水平下pH控制前后发酵过程的细胞生长曲线。
具体实施方式
细胞浓度测定：采用分光光度计测定600nm下的吸光度。
发酵液颜色测定：采用分光光度计测定230nm下的吸光度。
实施例1
种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏2，MgSO4·7H2O 1，调pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。
发酵培养基为(g/L)甘露醇10.0,谷氨酸5.0,NaCl 0.2,K2HPO41.0,MgSO4·7H2O0.2,CaCl2·2H2O 0.04,FeCl3·6H2O 0.0025,MnCl2·4H2O 0.001,Na2MO4·7H2O 0.00001,ZnSO4·7H2O 0.00001,CuSO4·5H2O 0.00001,H3BO30.00001,CoCl2·6H2O 0.00001,生物素0.00001,维生素B10.00001，pH 7.0–7.2。
将Rhizobium radiobacterNBRC13259接种至种子培养基，于30℃培养20小时时间，按10％的比例接种种子液，种子液中菌体数量为1.2×1010CFU/mL。
发酵过程基于PID系统控制pH，同时采用定时脉冲流加谷氨酸补充氮源的RhizobiumradiobacterNBRC13259发酵产环状β-1,2-葡聚糖的发酵工艺，该工艺的实现主要包括以下步骤：发酵开始后在0-40h，通过基于PID的反馈控制系统，通过流加20％(v/v)的NH3·H2O和2mol/L的HCl将发酵液pH控制在7.0，并从0h开始计时，每隔5个h间歇补充浓度为30g/L谷氨酸补料液，每次使发酵液中谷氨酸浓度增加1g/L，共补4次，20h完成最后一次补料谷氨酸后停止补充谷氨酸；40-60h，将pH控制在6.4；60-80h，基于PID系统将pH逐渐降低到5.6；80h后将pH维持在5.6直至144h发酵结束。碳源甘露醇的补料如下：培养24h时，补料浓度为30g/L的甘露醇，从培养24h后到发酵结束，以后每隔12h补料浓度为30g/L的甘露醇(在121℃灭菌20分钟)，使发酵液中甘露醇浓度与补料时刻相比提高20g/L，β-1,2-葡聚糖主要在该阶段生成。
对照例1
实施方式同实施例1，区别在于，采用不控制pH自然发酵的方式，但补加谷氨酸。即从0h开始计时，每隔5个h间歇补充浓度为30g/L谷氨酸补料液，与流加开始时刻发酵培养基中谷氨酸浓度相比，每次使发酵液中的谷氨酸浓度增加1g/L，共补4次，20h完成最后一次补料谷氨酸后停止补充谷氨酸。
发酵结果为：细胞浓度仅仅达到3.5g/L，大量色素形成，发酵液呈墨色。环β-1,2-葡聚糖的产量达到2.3g/L。
对实施例1和对照例1获得的发酵液中的目的物产量、细胞浓度进行测定，结果如图2～4所示，采用实施案例1的发酵批次，在前48小时，细菌处于增值阶段，pH控制在7.0(图1)，采用实施例1的方法发酵获得的发酵液无黑褐色的色素(图2右)，而采用对照例1的方法发酵获得的发酵液色素明显(图2左)。
通过测定OD230吸光值来确定色素含量(图3)，实施例1的发酵方法，在不稀释的情况下，吸光值仅仅为3，而采用对照例1的方法发酵获得的发酵液，在稀释30倍的情况下，OD230吸光值高达15。
对实施例1的细胞浓度的测定结果显示(图4)，发酵至21h时，细胞浓度即达到8g/L，发酵144小时后，环β-1,2-葡聚糖的产量达到5.2g/L。相比于自然发酵提高了1倍。
对照例2
实施方式同实施例1，区别在于：不补加谷氨酸，发酵结果为：细胞浓度仅仅达到2.5g/L,环β-1,2-葡聚糖的产量达到1.6g/L。
对照例3
具体实施方式同实施例1，区别在于，发酵24h时一次性补加谷氨酸。测定发酵结束时的发酵液颜色及细胞浓度，分别为发酵液稀释30倍，OD600吸光值高达14.2，细胞浓度为3.1g/L。
对照例4
具体实施方式同对照例1，区别在于，培养24h时，补料浓度为30g/L的甘露醇，从培养24h后到发酵结束，以后每隔12h补料浓度为30g/L的经灭菌的甘露醇，使发酵液中甘露醇浓度与补加时相比提高20g/L，β-1,2-葡聚糖主要在该阶段生成，葡聚糖浓度达到2.1g/L，细胞浓度为2.8g/L,色素浓度在稀释30倍条件下，OD230吸光值高达13.7。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种环状β-1,2-葡聚糖的生产方法，其特征在于，所述方法以放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)为发酵菌株，通过控制pH并结合谷氨酸流加的方式进行发酵；所述放射型根瘤菌为放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)NBRC13259；所述pH控制是在发酵第0～40h，控制pH为6.8～7.2；第40～60h控制pH为6.3～6.5；第60～80h将pH逐渐降低到5.5～5.7；第80h后维持pH为5.5～5.7直至发酵结束；所述谷氨酸流加是从发酵初始时计，每4～6h补充一次谷氨酸，使谷氨酸浓度与初始浓度相比增加0.8～1.2g/L，补加四次后停止补加谷氨酸；培养至20～24h时，补料甘露醇，之后每隔10～12h补料甘露醇，使发酵液中甘露醇浓度与补料时刻相比提高18～20g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在0～40h，pH控制为6.8～7.2，通气量为1～1.5vvm，溶氧控制在25～30％；第40～60h，pH控制为6.3～6.5，通气量为1～1.5vvm，溶氧控制在20～25％；第60～80h，pH逐渐降低到5.5～5.7，通气量为1～1.5vvm，溶氧控制在20～25％；第80h后维持pH为5.5～5.7直至发酵结束，通气量为0.8～1.2vvm，溶氧控制在20～25％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，权利要求1所述的放射型根瘤菌的接种量为发酵液体积的6～12％，接种的种子液中放射型根瘤菌的菌体数量为1×108～5×1010CFU/mL。
4.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，基于PID控制器对发酵过程pH、谷氨酸流加、甘露醇补料进行控制。
5.根据权利要求4所述的方法，流加HCl或NH3·H2O进行pH控制。
6.根据权利要求1～5任一所述方法在制备含环β-1,2-葡聚糖的产品中的应用。
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