CN104152365A

CN104152365A - 一株生产2-酮基-l-古龙酸的菌株及其生产方法

Info

Publication number: CN104152365A
Application number: CN201310457218.5A
Authority: CN
Inventors: 张怡轩; 吴春福
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2013-09-30
Filing date: 2013-09-30
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2033-09-30
Also published as: CN104152365B

Abstract

本发明属于微生物发酵领域,涉及一株生产2-酮基-L-古龙酸的菌株及其生产方法，具体涉及利用微生物发酵的手段将底物L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）的菌株及工艺。本发明从土壤中分离筛选，并进一步人工驯化得到一株遗传性状稳定，可独立生长与产2-KLG的新菌株SPUB-003。SPUB-003经鉴定为酮古龙酸菌（Ketogulonicigeniumsp.），已送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏。保藏日期2013年7月3日，保藏编号为CGMCCNo.7876。SPUB-003在20℃~34℃可独立生长和产酸，该菌株可通过液态发酵独立生产2-KLG，经过24-96h的摇瓶发酵可得到2-KLG的转化率为70%以上，5L发酵罐24-68h发酵2-KLG的转化率可达到80%以上。在发酵过程中，添加微量生理活性物质可以提高转化率达到90%以上，并缩短发酵周期。

Description

一株生产2-酮基-L-古龙酸的菌株及其生产方法

技术领域:

本发明属于微生物发酵领域，涉及一株生产2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）的菌株及其生产方法，具体涉及利用微生物发酵的手段将底物L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸的菌株及工艺。

背景技术：

VC是人体必需的一种维生素，在抗氧化和维持新陈代谢平衡等方面具有广泛的生理作用，在医药工业、食品工业、饲料行业以及化妆品行业上均有重要用途。其应用范围广阔，市场规模巨大。

目前，全球90%以上的VC生产，均利用我国发明的“二步发酵法”。其第一步发酵是在氧化葡萄糖酸杆菌作用下将D-山梨醇氧化为L-山梨糖。第二步是在一种混合菌系的作用下将L-山梨糖进一步氧化成VC的重要中间体2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）。最后经过化学转化使2-KLG生成VC。

第二步发酵生产2-KLG（俗称产酸）是决定VC发酵产率和成本的关键步骤。在其混合菌系中：酮古龙酸菌（俗称小菌）是产2-KLG的关键菌株，具有氧化底物L-山梨糖为2-KLG的酶系统。但该菌独立生长及产2-KLG能力非常弱，需要巨大芽孢杆菌（俗称大菌）提供某些“效应物”促进其生长及产2-KLG。大菌本身能独立生长，却不能转化L-山梨糖为2-KLG。

长期以来产2-KLG发酵由于大菌的存在，导致该工艺一直存在物耗高，污染大，工艺控制复杂等问题，体现为：

（1）大菌不具有产2-KLG的能力，而发酵系统却要为之提供额外的空间与营养，导致了对物料的与发酵资源的浪费。

（2）由于大菌的参与，亦导致发酵液中代谢物更加复杂，进而提高了产物后处理难度，增加了污染风险。

（3）由于小菌产2-KLG是大小菌共同作用的结果，并且两菌在混合培养过程中既表现为共生又表现为有拮抗，且环境因素影响混菌间的相互作用，导致混菌发酵过程中产2-KLG难以调控，进而限制了发酵工艺的进一步优化。

（4）另外在实际生产中，大菌极易被噬菌体污染，导致产2-KLG水平下降甚至发酵失败，又进一步提高了工艺控制的难度。

本发明利用一株不需要大菌伴生的酮古龙酸菌，可独立生长和发酵产2-KLG，该工艺将从根本上改变由混菌发酵所带来的一系列问题，并创造巨大的社会效益，经济效益和生态效益。

发明内容：

本发明的目的是克服原有二步发酵过程中，混菌发酵工艺中存在的物耗高，污染大，工艺控制复杂等不足，提供一种由纯菌发酵将L-山梨糖转化为2-KLG的菌株及方法。

本发明的技术方案如下：

本发明的目的是提供一株可以单独生长并且可以独立生产2-KLG的微生物，经过实验室分离筛选、诱变选得到了性状稳定，能独立生长的酮古龙酸菌SPUB-003（Ketogulonicigeniumsp.），并可通过液态发酵生产2-KLG，产量稳定。该菌株生物学特性：菌株革兰氏染色为革兰阴性菌，短杆，可形成短链或丝状体，不能形成芽孢；在酮古龙酸菌SPUB-003固体培养基培养4天的菌落形态为点状，凸起，完整，光滑的圆形菌落，菌落表面成油状，透明。

本发明要解决的一个技术问题是提供菌株酮古龙酸菌SPUB-003发酵生产2-KLG的方法，具体方法如下:

1. 斜面培养基：酵母膏1-10g/L、牛肉膏1-10g/L、玉米浆1-30g/L、蛋白胨1-15g/L、无水硫酸镁1-10g/L、山梨糖2-20g/L、水解酪蛋白1-15g/L、碳酸钙1-10g/L、琼脂20g/L、pH5.0-8.0。

2. 基础种子培养基：L-山梨糖5-40g/L、玉米浆1-30g/L、蛋白胨1-15g/L、D-山梨醇2-20g/L、D-甘露醇1-20g/L、碳酸钙1-10g/L、pH5.0-8.0。

3. 基础发酵培养基：L-山梨糖10-150g/L、热轧黄豆粉1-20g/L、玉米浆1-20g/L、D-山梨醇1-10g/L、无水硫酸镁0.1-5 g/L、碳酸钙1-30g/L、烟酰胺0.001-1.0 g/L、泛酸钙0.01-10g/L、p-氨基苯甲酸0.01-10g/L、pH5.0-8.0。

4. 培养方法：

（1）斜面培养

挑取SPUB-003菌体于斜面培养基表面划线。

（2）种子培养

挑取一环已经培养2~4天的SPUB-003斜面纯培养物，加入到装有15~30mL的基础种子培养基的250mL三角瓶中20-48h，于20~34℃震荡培养，转速为100-300rpm，制备发酵用种子液。

（3）摇瓶发酵培养

将培养好的种子液按接种量1-20%(v/v)接种于装有20~40mL基础发酵培养基的250mL三角瓶中，温度控制在30-34℃，220rpm，发酵36-72h。

（4）发酵罐培养

接种量1-20%（v/v），25-34℃培养，转速为150-600rpm，通气量为0.3-1.5VVM，其中山梨糖底物初始度为1-5%，发酵24小时后可采用连续流加山梨糖控制底物L-山梨糖浓度，流加浓度控制在1-7%，流加时间控制在24~36小时；使用15%的碳酸钠调pH6.5-8.0。山梨糖的最终浓度为1-13%。

（5）本发明提供了该菌株在基础发酵培养基中，产生2-KLG的发酵温度为25-34℃，最佳30-32℃，L-山梨糖浓度为6~10%，最佳为7%；发酵罐培养最佳底物L-山梨糖浓度为2%，最佳L-山梨糖流加总量为5.1%。

（6）通过向基础培养基中单独或者任一组合添加适当种类和浓度的生理活性物，选自氨基酸类物质、糖代谢途径物质、维生素和其他物质从而提高2-KLG转化率。所述氨基酸类物质选自：丝氨酸0.1-10g/L、苏氨酸0.1-10 g/L、甘氨酸0.1-10 g/L、脯氨酸0.1-10 g/L、半胱氨酸0.1-10g/L、天冬氨酸0.1-10g/L、天冬酰胺0.1-10g/L或组氨酸0.1-10g/L中的一种或几种；所述糖代谢途径物质选自：D-山梨醇0.5-50g/L、D-果糖0.5-50g/L、D-甘露糖0.5-50g/L、D-甘露醇0.5-50g/L、蔗糖0.5-50g/L、乳糖0.5-50g/L或半乳糖0.5-50g/L中的一种或几种；所述维生素类物质选自：VC 1-100mg/L、VB₁₂ 0.01-50mg/L或VB₂ 0.01-50mg/L中的一种或几种；其它生物活性物质选自：二氢叶酸0.01-2 mg/L、生物素0.1-10 mg/L、维生素C 1-100mg/L、对羟基苯甲酸1-100mg/L、对氨基苯甲酸0.01-1 g/L、烟酰胺0.01-100 mg/L、泛酸钙0.1-10 g/L、肌醇0.01-50g/L、胆碱0.01-50g/L、硫辛酸0.01-50g/L、氯化钴0.01-50g/L、亚硫酸钠0.01-50g/L、亚硫酸氢钠0.01-50g/L、焦亚硫酸钠0.01-50g/L、硫代硫酸钠0.01-50g/L、硫脲0.01-50g/L、谷胱甘肽0.01-50g/L、二硫苏糖醇0.01-50g/L、辅酶A 0.01-50g/L或氨基丁酸(GABA)0.01-50g/L中的一种或几种。

本发明的有益效果：该菌株是通过对从土壤中分离筛选菌株，并经过实验室驯化后获得性状稳定的酮古龙酸菌SPUB-003，该菌株可通过液态发酵独立生产2-KLG，经过36-72h的摇瓶发酵可得到2-KLG的转化率为70%以上，5L发酵罐24-68h发酵2-KLG的转化率可达到80%以上，添加生理活性物后，转化率可达到90%以上，缩短发酵周期。

本发明使用的酮古龙酸菌已送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。保藏日期2013年7月3日，保藏编号为CGMCC No.7876，分类命名为：SPUB-003（Ketogulonicigeniumsp.）。

附图说明：

图1 菌株B-003在1000倍油镜下形态；

图2 菌株B-003菌落形态；

图3 菌株B003依据16s rRNA序列构建的系统进化树；

具体实施方式：

实施实例1：酮古龙酸菌SPUB-003生物学特性

酮古龙酸菌SPUB-003在革兰氏染色后，呈革兰阴性菌短杆菌，可形成短链或丝状体，不能形成芽孢。该菌在斜面培养基上生长4天，其菌落形态为点状，凸起，完整，光滑的圆形菌落，菌落表面成油状，透明，几乎无色素产生。其各项生理生化指标见表1。

提取菌株SPUB-003的基因组DNA，以Primer(S)：5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’；和Primer(A)：5’AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA 3’为引物进行PCR扩增16s rRNA基因，纯化后进行基因测序，并将所测序列与Genbank中的rRNA同源序列比对，选取7株较高同源性的菌株，利用软件Mega5构建菌种进化树。菌株SPUB-003与Ketogulonicigeniumsp. 291-19同源性最高。再结合形态学鉴定结果，该菌株被鉴定为Ketogulonicigeniumsp.。

实施实例2：菌株SPUB-003摇瓶发酵特性

将纯培养的菌株SPUB-003接于基础种子培养基中，30℃、220rpm摇瓶培养24h后，以10%转种量接种于基础发酵培养基中，其发酵培养基内含有7%的山梨糖，于25~34℃，220r/min振荡培养至72h。每隔4h取样，在650nm处测定菌种浓度（OD650值）、pH值、2-KLG产量以及转化率，获得实验结果见表2。由此可见，菌株SPUB-003在32℃发酵68h转化率最高，可到达73.32%。

实施实例3：菌株SPUB-003发酵的最适山梨糖浓度的确定

将纯培养的菌株SPUB-003接于基础种子培养基中，32℃、220rpm摇瓶培养24h后，以10%转种量接种于基础发酵培养基中，其发酵培养基内含有1%~13%的山梨糖，于32℃，220r/min振荡培养至68h，发酵过程中控制pH 6.8~7.0。发酵结束后测定2-KLG的产量和转化率，如表3所示，可见菌株SPUB-003最适的山梨糖底物浓度为不超过7%，此条件下转化率可达76.20%；优选1-5%，其转化率为85%以上；更优选1-3%，其转化率为95%以上。

实施实例4 菌株SPUB-003发酵罐上发酵特性

根据摇瓶发酵研究结果利用基础发酵培养基，设计5L全自动发罐上控制参数如表4，进行不同温度下：在全自动发酵罐上发酵性能的研究，结果见表5。可见菌株SPUB-003在68h时其转化率为82.40%。

实施实例5 生理活性增强物质组合促进SPUB-003菌株发酵产2-KLG

本发明所涉及的生理活性增强物质主要包括：氨基酸类（如：丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸）、糖代谢中间体（如：D-山梨醇、D-果糖、D-甘露糖、D-甘露醇、蔗糖、乳糖、半乳糖）及维生素（VC、VB₁₂、VK₂）和其它生物活性物质（如：二氢叶酸、生物素、对羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸、烟酰胺、泛酸钙、肌醇、胆碱、硫辛酸、氯化钴、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、硫脲、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、辅酶A、GABA）等。利用正交分析法设计出3种具有不同生理促进功能的配方组合（见表6.），添加至基础发酵培养基中，在5L全自动发罐发酵中发酵（发酵工艺参见实例4），可提高2-KLG转化率，以及缩短发酵周期。发酵结果见表7。

Claims

1.一种酮古龙酸菌SPUB-003（Ketogulonicigeniumsp.），其特征是：保藏编号为CGMCC No.7876。

2.权利要求1所述的酮古龙酸菌SPUB-003在单独生产2-酮基-L-古龙酸中的应用。

3.权利要求1所述的酮古龙酸菌SPUB-003在制备Vc中的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，酮古龙酸菌通过如下方法制备2-酮基-L-古龙酸：

（1）种子培养

挑取一环已经培养2～4天的SPUB-003斜面培养物，加入到装有15～30mL的基础种子培养基的250mL三角瓶中20-48h，于20～34℃震荡培养，转速为100-300rpm，制备发酵用种子液；所述的斜面培养基为：酵母膏1-10g/L、牛肉膏1-10g/L、玉米浆1-30g/L、蛋白胨1-15g/L、无水硫酸镁1-10g/L、山梨糖2-20g/L、水解酪蛋白1-15g/L、碳酸钙1-10g/L、琼脂20g/L、pH5.0-8.0；基础种子培养基为：L-山梨糖5-40g/L、玉米浆1-30g/L、蛋白胨1-15g/L、D-山梨醇2-20g/L、D-甘露醇1-20g/L、碳酸钙1-10g/L、pH5.0-8.0；

（2）摇瓶发酵培养

将培养好的种子液按接种量1-20%(v/v)接种于装有20～40mL基础发酵培养基的250mL三角瓶中；基础发酵培养基为：L-山梨糖10-150g/L、热轧黄豆粉1-20g/L、玉米浆1-20g/L、D-山梨醇1-10g/L、无水硫酸镁0.1-5 g/L、碳酸钙1-30g/L、烟酰胺0.001-1.0 g/L、泛酸钙0.01-10g/L、p-氨基苯甲酸0.01-10g/L、pH5.0-8.0；

（3）发酵24小时后采用连续流加山梨糖控制底物L-山梨糖浓度，山梨糖底物初始度为1-5%，流加浓度控制在1-7%，流加时间控制在24～36小时，使用15%的碳酸钠调pH6.5-8.0。

5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2）中发酵条件：20-34℃培养，转速为150-600rpm，通气量为0.3-1.5VVM，15%的碳酸钠调pH6.5-8.0。

6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，加入的种子培养基为15～30mL种子培养基/250mL，20-34℃培养20-28h。

7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（2）发酵培养的温度为25-34℃，220rpm，发酵24-96h。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（3）中L-山梨糖最终浓度为1-13%。

9. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在发酵过程中，于基础培养基中单独或者任一组合添加适当种类和浓度的生理活性物，选自氨基酸类物质、糖代谢途径物质、维生素类物质和其他生物活性物质。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述氨基酸类物质选自：丝氨酸0.1-10g/L、苏氨酸0.1-10 g/L、甘氨酸0.1-10 g/L、脯氨酸0.1-10 g/L、半胱氨酸0.1-10g/L、天冬氨酸0.1-10g/L、天冬酰胺0.1-10g/L或组氨酸0.1-10g/L中的一种或几种；所述糖代谢途径物质选自：D-山梨醇0.5-50g/L、D-果糖0.5-50g/L、D-甘露糖0.5-50g/L、D-甘露醇0.5-50g/L、蔗糖0.5-50g/L、乳糖0.5-50g/L或半乳糖0.5-50g/L中的一种或几种；所述维生素类物质选自：VC 1-100mg/L、VB₁₂ 0.01-50mg/L或VB₂ 0.01-50mg/L中的一种或几种；其它生物活性物质选自：二氢叶酸0.01-2 mg/L、生物素0.1-10 mg/L、对羟基苯甲酸1-100mg/L、对氨基苯甲酸0.01-1 g/L、烟酰胺0.01-100 mg/L、泛酸钙0.1- 10 g/L、肌醇0.01-50g/L、胆碱0.01-50g/L、硫辛酸0.01-50g/L、氯化钴0.01-50g/L、亚硫酸钠0.01-50g/L、亚硫酸氢钠0.01-50g/L、焦亚硫酸钠0.01-50g/L、硫代硫酸钠0.01-50g/L、硫脲0.01-50g/L、谷胱甘肽0.01-50g/L、二硫苏糖醇0.01-50g/L、辅酶A 0.01-50g/L或氨基丁酸0.01-50g/L中的一种或几种。