CN111537638A - 一种酵母抽提物挥发性成分的提取富集方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酵母抽提物挥发性成分的提取富集方法，其特征在于，包括一个提取YE中挥发性成分的步骤；一个利用气相色谱‑质谱联用技术检测分析所得到的YE中挥发性化合物的步骤；一个对检出的挥发性化合物进行定性分析的步骤；一个确定最佳萃取头、萃取温度和萃取时间的评价指标的步骤。本发明对YE挥发性成分灵敏度高、提取充分，为YE风味研究提供一种切实可行的分析方法。

Description

一种酵母抽提物挥发性成分的提取富集方法
技术领域
本发明涉及一种酵母抽提物挥发性成分的提取富集方法，属于分析检测技术领域。
背景技术
酵母抽提物(yeast extract,YE)是以食品用酵母为主要原料，在酵母自身的酶或外加食品级酶的作用下，酶解自溶(可再经分离提取)后得到的产品，并富含氨基酸肽、多肽等酵母细胞中的可溶性成分。酵母抽提物营养丰富，香气独特，在食品领域应用广泛，在调味品、肉制品、焙烤食品中均有应用。酵母抽提物中挥发性成分种类丰富，酵母原料、生产工艺、产品形态、产地不同，酵母产品的香气组成存在差异。近年来，酵母抽提物相关研究较多，酵母抽提物中富含醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、酚类、吡嗪类、含硫化合物等挥发性成分，这些成分对YE风味有很大影响。若对YE挥发性成分进行分析，首先应将成分提取出来。由于其挥发性成分复杂，只有选择合适的提取方法，才能够全面、正确地反映出YE挥发性成分的组成。
目前，常用的YE挥发性成分提取方法主要有溶剂提取法(Solvent Extraction,SE)、溶剂辅助风味蒸发(Solvent Assist Flavor Evaporation,SAFE)、同时蒸馏提取(Simultaneous Distillation and Extraction,SDE)、固相微萃取(Solid PhaseMicroextraction,SPME)和吹扫捕集提取(purge-and-trap extraction，P&T)等。与其它提取方法相比，SPME具有萃取、浓缩、解吸、进样等功能集于一体，具有样品量少、无需溶剂、操作简单、成本低、检测速度快、灵敏度高、能够尽可能减少被分析的香气物质的损失等优点。在挥发性成分的分析中被广泛应用，影响SPME提取效果的因素很多，SPME萃取头是影响挥发性成分提取的重要因素。目前，SPME提取法在酵母抽提物挥发性成分分析方面应用较多，但有关优化SPME提取YE挥发性成分的报道却很少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：如何利用SPME高效、充分提取YE中挥发性成分，为YE风味研究提供一种切实可行的分析方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种酵母抽提物挥发性成分的提取富集方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：一个提取YE中挥发性成分的步骤：将酵母抽提物样品置于容器内，加入内标物邻二氯苯，密封，将萃取头插入到容器中进行萃取；萃取完成后，迅速将萃取头插入气相色谱-质谱联用仪进样口，进行解析；
步骤2)：一个利用气相色谱-质谱联用技术检测分析步骤1)所得到的YE中挥发性化合物的步骤；
步骤3)：一个对检出的挥发性化合物进行定性分析的步骤：未知化合物的质谱通过与NIST11.L谱库对比进行定性，在相同的仪器条件下，进样正构烷烃，根据正构烷烃和挥发性化合物的出峰时间计算保留指数RI后，比对定性；
步骤4)：一个确定最佳萃取头、萃取温度和萃取时间的评价指标的步骤：比较挥发性化合物的有效峰数目、有效峰面积、化合物种类数、累计峰面积标准化值，确定最佳萃取条件。
优选地，所述步骤1)中酵母抽提物样品的质量与容器的容积比为1.0g：3mL。
优选地，所述步骤1)中萃取的工艺参数为：恒温水浴温度40～70℃，平衡20min，萃取时间20～60min；萃取完成后，迅速将萃取头插入气相色谱-质谱联用仪进样口，于250℃不分流模式下解析5min。
优选地，所述步骤2)中气相色谱的工艺参数为：HP-INNOWAX毛细管色谱柱，其规格为60m×0.25mm×0.25μm，N2为载气，流速1.0mL/min，手动不分流进样，进样口温度为250℃；升温程序为：40℃保持3min，以2℃/min升温至60℃，再以4℃/min升温至200℃，后以5℃/min升至230℃，保留5min；质谱的工艺参数为：采用EI离子源，电离电压为70eV，离子源温度为230℃，接口温度为250℃，扫描范围30～500amu，溶剂延迟3min。
优选地，所述步骤3)中正构烷烃的烷基数量为C7-C30；保留指数RI的计算公式为：
Figure BDA0002491457930000021
其中，RI为待测物的保留指数；tx为挥发性物质x的保留时间，单位min；tn、tn+1为正构烷烃Cn、Cn+1的保留时间，单位min；n为挥发性物质的碳原子数。
优选地，所述步骤4)中累积峰面积标准化值(cμmulative area normalizationvalue，CANV)的计算公式为：
Figure BDA0002491457930000031
Figure BDA0002491457930000032
Figure BDA0002491457930000033
其中，n为萃取头的数量；
Figure BDA0002491457930000034
为第i种萃取头萃取挥发性成分“K”的峰面积；AVK为n种萃取头萃取挥发性成分“K”的峰面积的平均值；NAK(X)为任意一个萃取头“X”萃取到挥发性成分“K”的峰面积标准化值；AK(X)为萃取头“X”萃取到挥发性成分“K”的峰面积绝对值；CAK(X)为萃取头“X”萃取到的一类挥发性成分中1～k个成分的累积峰面积标准化值。
与现有技术相比，本发明对用于YE挥发性成分的SPME提取方法进行了优化，本发明优化后的SPME提取方法，对YE挥发性成分灵敏度高、提取充分，为YE风味研究提供一种切实可行的分析方法，为YE的科学研究和检测分析奠定基础。
附图说明
图1a-d分别为四种萃取头萃取YE中挥发性成分的总离子流图；
图2a-b分别为四种萃取头萃取YE中挥发性成分的有效峰数目和有效峰面积；
图3a-j分别为四种萃取头萃取YE各类挥发性成分累计峰面积标准化值；
图4a-b分别为不同萃取温度下的有效峰数目和有效峰面积；
图5a-b分别为不同萃取时间下有效峰的数目和有效峰面积。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例中所采用的酵母抽提物样品来自安琪酵母股份有限公司；采用的萃取头型号为100μm PDMS、75μm CAR/PDMS、65μm PDMS/DVB、50/30μm DVB/CAR/PDMS，均来自上海安谱实验科技股份有限公司；正构烷烃来自上海安谱实验科技股份有限公司。
实施例
一种酵母抽提物挥发性成分的提取富集方法，包括以下步骤：
步骤(1)：SPME最佳萃取头的确定
SPME：在萃取之前，先将4种不同型号萃取头(100μm PDMS、75μm CAR/PDMS、65μmPDMS/DVB、50/30μm DVB/CAR/PDMS)在气相色谱仪上预处理20分钟，老化温度为250℃(若是新萃取头，则应按照说明书在特定温度下老化特定时间)。准确称取5.0g的酵母抽提物于15mL顶空瓶，在60℃下水浴平衡20min，用老化后的固相微萃取头萃取30min，将萃取装置插入GC进样器，在250℃下解析5min。GC-MS条件：
GC条件：HP-INNOWAX毛细管色谱柱(60m×0.25mm×0.25μm)，N2为载气，流速1.0mL/min，手动不分流进样，进样口温度为250℃，升温程序：40℃保持3min，以2℃/min升温至60℃，再以4℃/min升温至200℃，后以5℃/min升至230℃，保留5min；
MS条件：质谱采用EI离子源，电离电压为70eV，离子源温度为230℃，接口温度为250℃，扫描范围30～500amu，溶剂延迟3min。
定性：一个对检出的挥发性化合物进行定性分析的步骤，未知化合物的质谱通过与NIST11.L谱库对比进行定性，在相同的仪器条件下，进正构烷烃C7-C30，根据正构烷烃和挥发性化合物的出峰时间计算保留指数RI，比对参考文献进行定性。保留指数RI的计算公式如下：
Figure BDA0002491457930000041
RI为待测物的保留指数；tx为挥发性物质x的保留时间，min；tn、tn+1为正构烷烃Cn、Cn+1的保留时间，min；n为挥发性物质的碳原子数。
对总离子图积分，确定有效峰数目和面积，并根据挥发性化合物定性结果对其分类，根据挥发性化合物的峰面积和以下式2-4计算每类挥发性化合物的累计峰面积标准化值，
Figure BDA0002491457930000042
Figure BDA0002491457930000043
Figure BDA0002491457930000051
其中，n为萃取头的数量；
Figure BDA0002491457930000052
为第i种萃取头萃取挥发性成分“K”的峰面积；AVK为n种萃取头萃取挥发性成分“K”的峰面积的平均值；NAK(X)为任意一个萃取头“X”萃取到挥发性成分“K”的峰面积标准化值；AK(X)为萃取头“X”萃取到挥发性成分“K”的峰面积绝对值；CAK(X)为萃取头“X”萃取到的一类挥发性成分中1～k个成分的累积峰面积标准化值。
通过比较不同材质萃取头在相同条件下萃取YE获得有效峰的数目、有效峰的面积和累计峰面积标准化值，实验结果如图1a-d、2a-b、3a-j所示。
4种萃取头的总离子图结果参见图1a-d，横坐标为出峰时间，纵坐标为丰度。结果显示，4种萃取头均获得清晰的离子谱图，说明所采用的气相色谱条件符合分析要求。50/30μm DVB/CAR/PDMS纤维头获得的总离子图的出峰多且在时间上分布均匀，说明50/30μmDVB/CAR/PDMS纤维头能充分吸收LA00L酵母抽提物中挥发性香气化合物，在中间时间段的出峰明显偏高，说明LA00L中出峰时间在中间时间段的化合物，即中等分子挥发性化合物在LA00L中相对含量占比较高；65μm PDMS/DVB纤维头吸附的化合物集中在后半部分，说明此纤维头对大分子挥发性化合物吸附性较好；75μm CAR/PDMS纤维头中化合物出峰在时间分布上比较均匀，但出峰不高，说明对挥发性化合物的吸附效果不如50/30μm DVB/CAR/PDMS纤维头好；100μm PDMS萃取头对应的离子图出峰太靠后，不宜用于酵母抽提物中挥发性物质的提取。综上所述，50/30μm DVB/CAR/PDMS纤维头和75μm CAR/PDMS纤维头适于YE中挥发性物质的提取，并且50/30μm DVB/CAR/PDMS纤维头提取效果最好。
4种萃取头萃取YE中挥发性成分的有效峰数目和有效峰面积参见图2a-b，横坐标为不同萃取头，纵坐标分别为有效峰数目、有效峰面积。结果显示萃取头50/30μm DVB/CAR/PDMS的有效峰的数目和峰面积均比另3种萃取头大，说明其对LA00酵母提取物中挥发性风味物质的吸附能力明显高于其他3种萃取头萃取头，50/30μm DVB/CAR/PDMS的萃取效果最佳。
4种萃取头萃取到的YE挥发性成分经GC-MS分析，共鉴定出醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、呋喃类、烯烃类、吡嗪类、酚类、含硫化合物等10类成分，而不同型号萃取头对YE各类挥发性成分表现出明显不同的萃取效果。以各类挥发性成分的累积峰面积标准化值为指标，比较不同型号萃取头对各类挥发性成分的萃取灵敏度，累计峰面积标准化值越高，相应萃取头的灵敏度越高，实验结果见图3a-j，横坐标为化合物累计数，纵坐标为累计峰面积标准化值。由附图可知，50/30μm DVB/CAR/PDMS较其他萃取头在醇类、醛类、酸类、酯类、呋喃类、烯烃类、酚类、含硫化合物类上显示较高的累计峰面积标准化值，说明其对以上类别挥发性化合物均有很强的萃取灵敏度。其中，醛类、含硫化合物对YE风味贡献很大，尤其含硫化合物在YE中含量很低，但其阈值也很低，因此是YE中很关键的香气化合物。50/30μm DVB/CAR/PDMS和65μm PDMS/DVB对酮类的萃取灵敏度比另两种萃取头强。65μm PDMS/DVB和75μmCAR/PDMS对吡嗪类的萃取灵敏度比另两种萃取头强。综合考量结果显示，50/30μm DVB/CAR/PDMS对YE中各类挥发性化合物的灵明度较高。
综上所述，确定50/30μmCAR/DVB/PDMS为萃取YE挥发性成分的最佳萃取头。
步骤(2)：SPME最佳萃取温度的确定
SPME：准确称取5.0g的酵母抽提物于15mL顶空瓶，用老化后的50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，分别在40、50、60、70℃下水浴平衡20min，萃取30min，将萃取装置插入GC进样器，在250℃下解析5min。
GC-MS条件：同步骤(1)
定性：同步骤(1)
对不同萃取温度下挥发性化合物的有效峰面积和有效峰数目进行分析，实验结果如图4a-b所示。
与其他萃取温度结果相比，60℃下的挥发性化合物有效峰数目和有效峰面积均高，说明在60℃萃取YE挥发性成分效果最佳，而且60℃是常用的萃取温度，故最佳萃取温度为60℃。
步骤(3)：SPME最佳萃取时间的确定
SPME：准确称取5.0g的酵母抽提物于15mL顶空瓶，用老化后的50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，在60℃下水浴平衡20min，分别萃取20、30、40、50、60min，将萃取装置插入GC进样器，在250℃下解析5min。
GC-MS条件：同步骤(1)
定性：同步骤(1)
对不同萃取时间下挥发性化合物的有效峰面积和有效峰数目进行分析，实验结果如图5a-b所示。
随着萃取时间的延长，有效峰的数目和面积呈现先上升后下降的趋势，在50min处有效峰的数目最多且有效峰的面积最大，故确定最佳萃取时间50min。
综上所述，SPME萃取提取YE中挥发性最佳萃取条件：萃取头老化20min，同时水浴平衡20min，最适萃取头50/30μm CAR/DVB/PDMS，最佳萃取温度60℃，最佳萃取时间50min。本发明优化后的SPME方法，对YE挥发性成分灵敏度高、提取充分，为YE风味研究提供一种切实可行的分析方法，为YE的科学研究和检测分析奠定基础。

Claims (6)

1.一种酵母抽提物挥发性成分的提取富集方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：一个提取YE中挥发性成分的步骤：将酵母抽提物样品置于容器内，加入内标物邻二氯苯，密封，将萃取头插入到容器中进行萃取；萃取完成后，迅速将萃取头插入气相色谱-质谱联用仪进样口，进行解析；
步骤2)：一个利用气相色谱-质谱联用技术检测分析步骤1)所得到的YE中挥发性化合物的步骤；
步骤3)：一个对检出的挥发性化合物进行定性分析的步骤：未知化合物的质谱通过与NIST11.L谱库对比进行定性，在相同的仪器条件下，进样正构烷烃，根据正构烷烃和挥发性化合物的出峰时间计算保留指数RI后，比对定性；
步骤4)：一个确定最佳萃取头、萃取温度和萃取时间的评价指标的步骤：比较挥发性化合物的有效峰数目、有效峰面积、化合物种类数、累计峰面积标准化值，确定最佳萃取条件。
2.如权利要求1所述的酵母抽提物挥发性成分的提取富集方法，其特征在于，所述步骤1)中酵母抽提物样品的质量与容器的容积比为1.0g：3mL。
3.如权利要求1所述的酵母抽提物挥发性成分的提取富集方法，其特征在于，所述步骤1)中萃取的工艺参数为：恒温水浴温度40～70℃，平衡20min，萃取时间20～60min；萃取完成后，迅速将萃取头插入气相色谱-质谱联用仪进样口，于250℃不分流模式下解析5min。
4.如权利要求1所述的酵母抽提物挥发性成分的提取富集方法，其特征在于，所述步骤2)中气相色谱的工艺参数为：HP-INNOWAX毛细管色谱柱，其规格为60m×0.25mm×0.25μm，N2为载气，流速1.0mL/min，手动不分流进样，进样口温度为250℃；升温程序为：40℃保持3min，以2℃/min升温至60℃，再以4℃/min升温至200℃，后以5℃/min升至230℃，保留5min；质谱的工艺参数为：采用EI离子源，电离电压为70eV，离子源温度为230℃，接口温度为250℃，扫描范围30～500amu，溶剂延迟3min。
5.如权利要求1所述的酵母抽提物挥发性成分的提取富集方法，其特征在于，所述步骤3)中正构烷烃的烷基数量为C7-C30；保留指数RI的计算公式为：
Figure FDA0002491457920000011
其中，RI为待测物的保留指数；tx为挥发性物质x的保留时间，单位min；tn、tn+1为正构烷烃Cn、Cn+1的保留时间，单位min；n为挥发性物质的碳原子数。
6.如权利要求1所述的酵母抽提物挥发性成分的提取富集方法，其特征在于，所述步骤4)中累积峰面积标准化值的计算公式为：
Figure FDA0002491457920000021
Figure FDA0002491457920000022
Figure FDA0002491457920000023
其中，n为萃取头的数量；
Figure FDA0002491457920000024
为第i种萃取头萃取挥发性成分“K”的峰面积；AVK为n种萃取头萃取挥发性成分“K”的峰面积的平均值；NAK(X)为任意一个萃取头“X”萃取到挥发性成分“K”的峰面积标准化值；AK(X)为萃取头“X”萃取到挥发性成分“K”的峰面积绝对值；CAK(X)为萃取头“X”萃取到的一类挥发性成分中1～k个成分的累积峰面积标准化值。
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