CN109187784A - 一种沙棘挥发油组分的顶空固相微萃取-气质联用检测分析方法 - Google Patents

一种沙棘挥发油组分的顶空固相微萃取-气质联用检测分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种沙棘挥发油成分的顶空固相微萃取‑气质联用检测分析方法。本发明通过顶空固相微萃取‑气质联用的方法分析沙棘，共检测到106个峰，并鉴定出其中76种成分。经比较发现，本发明鉴定出的沙棘挥发油成分远多于现有技术报道的方法，说明本发明的检测方法和定性分析手段具有显著的优越性。并且本发明的方法自动化程度高、操作简单、定性更加准确、结果更加可靠，也可以应用到其他药食同源植物挥发性成分检测分析中，为控制药食同源植物的质量，促进药食同源产业的发展提供了科学支持。

Description

一种沙棘挥发油组分的顶空固相微萃取-气质联用检测分析 方法
技术领域
本发明涉及一种沙棘挥发油组分的顶空固相微萃取-气质联用检测分析方法。
背景技术
沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.)又名酸刺，是胡颓子科沙棘属植物的干燥成熟果实，是一种药食同源植物，归脾、胃、肺、心经，具有活血散瘀、止咳祛痰、健脾消食等功效，可用于治疗脾虚食少，食积腹痛，咳嗽痰多，胸痹心痛，瘀血经闭，跌扑瘀肿等病症。沙棘适应能力强，能够耐旱、耐寒、耐盐碱、抗风沙，对生态环境的改善具有积极作用，主要在我国的西北、西南、东北等地区种植。沙棘营养丰富含有多种生物活性成分，如黄酮类、抗坏血酸、氨基酸、不饱和脂肪酸、生育酚、类胡萝卜素、甾醇等，在抗肿瘤、抗氧化、抗过敏、保护心脑血管系统、增强免疫等方面具有明显的药理作用，并在化妆品、医药保健品、食品中中应用广泛，具有较高的经济价值。近些年人们对沙棘的研究主要集中在黄酮类、氨基酸、脂肪酸等化学成分，有关沙棘挥发油的报道较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种沙棘挥发油组分的顶空固相微萃取-气质联用检测分析方法，它包括以下步骤：
(1)顶空固相微萃取提取挥发油成分
称取沙棘置于顶空瓶内，40～80℃平衡10～30min，将DVB/CAR/PDMS固相微萃取头插入顶空瓶内萃取吸附30～60min，取出，立即插入气相色谱进样口，在250℃下解吸3～11min；在最后进入GC-MS系统进行分离检测；
(2)GC-MS分析条件
色谱条件：毛细管色谱柱初始温度40℃，保持2min，然后以5℃/min的速率升温至190℃，再以3℃/min的速率升温至225℃，最后以10℃/min的速率升温至250℃并保持3min；进样口温度为250℃；
质谱条件：离子源：EI离子源；离子源温度：280℃；传输线温度：280℃；电子轰击能量：70eV；扫描方式：全扫描；质量扫描范围：m/z 35～450amu，溶剂延迟4.0min；
对最终得到的挥发油成分的数据进行定性分析。
进一步地，步骤(1)中，所述平衡时的温度为70℃。
进一步地，步骤(1)中，所述平衡的时间为20min。
进一步地，步骤(1)中，所述萃取吸附的时间为50min。
进一步地，步骤(1)中，所述解吸的时间为7min。
进一步地，步骤(1)中，所述固相萃取头的尺寸为50/30μm。
进一步地，步骤(1)中，所述固相微萃取头在萃取沙棘挥发油成分之前在270℃下老化处理30min。
进一步地，步骤(2)中，所述色谱柱为TR-PESTICIDE弹性石英毛细柱，尺寸为30m×0.25mm×0.25μm。
进一步地，步骤(2)中，所述色谱条件中，载气为99.999％高纯度氦气；流速1.2mL/min；分流比为10:1。
本发明通过顶空固相微萃取-气质联用的方法分析沙棘，共检测到106个峰，并鉴定出其中76种成分。经比较发现，本发明鉴定出的沙棘挥发油成分远多于现有技术报道的方法，说明本发明的检测方法和定性分析手段具有显著的优越性。并且本发明的方法自动化程度高、操作简单、定性更加准确、结果更加可靠，也可以应用到其他药食同源植物挥发性成分检测分析中，为控制药食同源植物的质量，促进药食同源产业的发展提供了科学支持。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明顶空固相微萃取参数提取沙棘挥发性成分的总离子流图。
图2为水蒸气蒸馏法提取沙棘挥发性成分的总离子流图。
图3为对比文献顶空固相微萃取参数提取沙棘挥发性成分的总离子流图。
具体实施方式
实施例1、沙棘挥发油成分的检测与分析
1材料与试剂
氯化钠、无水硫酸钠、正己烷均为分析纯，购自中国广州化学试剂厂；正构烷烃混合标准品(C7～C40)，美国o2si公司。
沙棘干药材(产地：内蒙古，批号：1 80201)，水分为7.8％，总灰分为3.8％，购自湖南省南国药都中药饮片有限公司。
2仪器与设备
TSQ 8000气相色谱-三重四级杆串联质谱仪：配电子电离源及Xcalibur数据处理系统、TRIPLUSRSH自动进样器、20mL顶空样品瓶、固相微萃取自动进样手柄，美国Thermo公司；50/30μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取头，美国Supelco公司；7890B-7200GC-QTOF MS气相色谱飞行时间质谱联用仪：配有电子电离源、7693Autosampler自动进样器、MassHunter B.07SP2工作站、NIST1 4.LIB标准质谱库，美国安捷伦公司。
3检测分析方法
3.1顶空固相微萃取法(HS-SPME)
准确称取2.0g沙棘置于20mL顶空瓶中(配有聚四氟乙烯垫的螺纹密封盖)，自动进样器将顶空瓶放在70℃的孵化炉中平衡20min后，将事先在进样口270℃下老化30min的50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头迅速插入样品瓶顶空部分进行萃取热吸附50min，然后将吸附后的萃取头插入气相色谱进样口，在250℃条件下解吸7min，最后进入GC-MS系统进行分离检测。
3.2气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析条件
色谱条件：TR-PESTICIDE弹性石英毛细柱(30m×0.25mm，0.25μm)；升温程序：初始温度40℃，保持2min，然后以5℃/min的速率升温至190℃，再以3℃/min的速率升温至225℃，最后以10℃/min的速率升温至250℃并保持3min；分流比10：1，色谱柱流速1.2mL/min；进样口温度为250℃；载气：99.999％高纯度氦气。
质谱条件：EI离子源；离子源温度：280℃；传输线温度：280℃；电子轰击能量：70eV；扫描方式：全扫描；质量扫描范围m/z 35～450amu，溶剂延迟4.0min。
3.3保留指数的计算
C7～C40正构烷烃混标在与沙棘样品相同的气相条件下得到总离子流图后，工作站根据保留指数计算公式自动得出各挥发性组分的保留指数。保留指数的计算公式如下：
式中：RI为待测化合物的保留指数；n为正构烷烃的碳原子数；RTx为待测化合物的保留时间(min)；RTn和RTn+1分别为碳原子数为n、n+1的正构烷烃的保留时间(min)，且RTn+1>RTx>RTn。
3.4定性分析
对“3.2”得到的总离子流图通过自动质谱退卷积定性系统(AMDIS)进行处理，所分辨的质谱在NIST2.2标准谱库中检索，根据匹配度和保留指数进行核对，只选择正匹配和反匹配均大于800的物质，并用峰面积归一化法计算沙棘各挥发性物质的相对含量。
4检测分析结果
按照“3.1”得到的HS-SPME的萃取条件对沙棘挥发性成分进行提取并通过GC-MS进行检测，得到沙棘挥发性物质的总离子流图(图1)，再利用AMDIS和保留指数进行定性分析。最终显示共检测到106个峰，鉴定出76种组分，占挥发性物质总量的90.19％，分别为20种酯类化合物(31.84％)、17种醛类化合物(31.51％)、9种酮类化合物(10.30％)、13种烯烃类化合物(6.44％)、7个醇类化合物(5.86％)和10种其他种类化合物(4.25％)，具体结果见表1。其中，含量最高的组分为反-9-十六烯酸甲酯，相对百分含量为9.42％，其次是壬醛(9.40％)、糠醛(7.24％)、棕榈酸甲酯(5.96％)等。另外，试验中检测到的α-姜黄烯具有抑菌、抗病毒、抗肿瘤、抗癌等药理活性；乙酸龙脑酯具有镇痛抗炎的作用；樟脑具有抑菌作用；柠檬烯在抗肿瘤、抗氧化应激、抗炎等方面具有药理作用。
表1沙棘HS-SPME提取物的GC-MS分析结果
实施例2、顶空固相微萃取条件的筛选
由于顶空-固相微萃取法的萃取效果受萃取时间、萃取温度、解吸时间、平衡时间等条件的影响，本发明通过选取挥发性物质的总峰面积和总峰数目为考察指标，比较了不同的萃取时间、萃取温度、解吸时间、平衡时间对沙棘挥发性物质萃取效果的影响，并确定优化参数。
实验方法按照实施例1进行，其中萃取时间、萃取温度、解吸时间、平衡时间按表2选择，不同萃取时间、萃取温度、解吸时间、平衡时间对沙棘挥发性物质萃取效果的影响结果见表2。
表2不同因素对沙棘挥发性物质萃取效果的影响
从表2可以看出，顶空固相微萃取法萃取沙棘挥发性物质的优选条件为：萃取温度为70℃、萃取时间50min、解吸时间为7min，平衡时间为5min。
对比例1、沙棘挥发油成分的SD-GC-QTOF MS检测分析方法
1实验原料和仪器
同实施例1。
2检测分析方法
2.1水蒸气蒸馏法(SD法)
准确称取沙棘200.0g放入2000mL的圆底烧瓶中，加入1500mL饱和氯化钠溶液，浸泡过夜，参照2015版《中国药典》一部挥发油测定法甲法提取5h，静置30min，加入2mL正己烷萃取，在萃取液中添加适量无水硫酸钠除水干燥，最后经0.45μm有机滤膜过滤后做为样品储备液，稀释10倍后进入GC-QTOF MS系统检测。
2.2气相色谱-四级杆-飞行时间质谱仪(GC-QTOF MS)分析条件
色谱条件：色谱柱为HP-5SILMS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气为高纯氦气，流速为1.2mL/min(恒流模式)，分流比为10：1；进样口温度为250℃；程序升温条件：初始温度40℃，保持2min，然后以5℃/min的速率升温至190℃，再以3℃/min的速率升温至225℃，最后以10℃/min的速率升温至250℃并保持3min；进样量1μL。
质谱条件：EI离子源；离子源温度为230℃，发射电流15μA；电子能量70eV；四级杆温度为150℃；全扫描范围m/z 35～450；溶剂延迟4.0min。
2.3保留指数的计算
同实施例1.
2.4定性分析
对“2.2”方法得到的总离子流图根据谱库检索结果，结合准确质量测定和保留指数对色谱峰进行定性分析，并运用峰面积归一化法计算沙棘挥发油各组分的相对含量。
3检测结果分析
利用GC-QTOF MS检测SD法提取的沙棘挥发油，得到沙棘挥发油总离子流图(图2)，并对各色谱峰进行定性分析。结果显示，共检测到93个峰，鉴定出其中56种组分，占挥发性物质总峰面积的91.98％(表3)，主要分为21种酯类化合物(83.74％)、7种烯烃类化合物(4.25％)、5种醛类化合物(0.98％)、2种有机酸类化合物(0.72％)、3种醇类化合物(0.56％)和13种其他种类化合物(1.13％)等。其中有4种组分的相对百分含量超过10％，分别是反-9-十六烯酸甲酯(18.61％)、棕榈酸甲酯(16.21％)、亚油酸甲酯(13.41％)、(Z)-9-十八烯酸甲酯(12.78％)，这4种酯类化合物占挥发性组分总量的61.01％，构成了沙棘挥发油的主要成分。
表3沙棘SD提取物的GC-QTOF MS分析结果
经比较发现，传统的SD法提取装置简易、成本低、易操作，但是需要大量样品，且样品浸泡和提取时间较长，加热温度高，可能会使部分沸点低挥发性强的组分流失，一些组分甚至发生分解或变性，丢失了沙棘原有的挥发性成分。HS-SPME法是一种集取样、萃取、浓缩、进样于一体的无溶剂、纯绿色的样品前处理技术，具有样品用量少，成本低，操作简单，富集效果强，加热时间短等特点。两种方法提取的沙棘挥发性组分的种类及含量差异较大，其中HS-SPME法提取的化合物种类更加全面，活性成分相对含量较高，而SD法提取物的酯类含量较高。若从提取物的全面性来考虑，HS-SPME法更能真实的反应沙棘挥发性成分的组成，更适合作为沙棘挥发性分析的一种快速、准确检测手段。
对比例2
采用文献《王永苓,牛广财,朱丹,等.沙棘果醋香气成分的GC/MS分析[J].中国调味品,2010,35(4):94-96》所述的方法对沙棘挥发油成分进行检测和分析，得到沙棘挥发油成分的总离子流图(图3)。结果显示，共检测到24个峰，鉴定出其中10种组分，占挥发性物质总峰面积的69.84％(表4)，主要为是酯类化合物。除了棕榈油酸甲酯和顺式-9-二十三烯，其余8种组分均在本研究优化方法中检出。
表4文献方法下沙棘挥发性组分
经比较发现，本研究建立的方法检出的组分种类远远多于文献方法，更能全面反映沙棘挥发性物质的组成。
综上，本发明通过顶空固相微萃取-气质联用的方法分析沙棘，共检测到106个峰，并鉴定出其中76种成分。经比较发现，本发明鉴定出的沙棘挥发油成分远多于现有技术报道的方法，说明本发明的检测方法和定性分析手段具有显著的优越性。并且本发明的方法自动化程度高、操作简单、定性更加准确、结果更加可靠，也可以应用到其他药食同源植物挥发性成分检测分析中，为控制药食同源植物的质量，促进药食同源产业的发展提供了科学支持。

Claims (9)

1.一种沙棘挥发油成分的顶空固相微萃取-气质联用检测分析方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)顶空固相微萃取提取挥发油成分
称取沙棘置于顶空瓶内，40～80℃平衡10～30min，将DVB/CAR/PDMS固相微萃取头插入顶空瓶内萃取吸附30～60min，取出，立即插入气相色谱进样口，在250℃下解吸3～11min；在最后进入GC-MS系统进行分离检测；
(2)GC-MS分析条件
色谱条件：毛细管色谱柱初始温度40℃，保持2min，然后以5℃/min的速率升温至190℃，再以3℃/min的速率升温至225℃，最后以10℃/min的速率升温至250℃并保持3min；进样口温度为250℃；
质谱条件：离子源：EI离子源；离子源温度：280℃；传输线温度：280℃；电子轰击能量：70eV；扫描方式：全扫描；质量扫描范围：m/z 35～450amu，溶剂延迟4.0min；
对最终得到的挥发油成分的数据进行定性分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述平衡时的温度为70℃。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述平衡的时间为20min。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述萃取吸附的时间为50min。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述解吸的时间为7min。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述固相萃取头的尺寸为50/30μm。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述固相微萃取头在萃取沙棘挥发油成分之前在270℃下老化处理30min。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述色谱柱为TR-PESTICIDE弹性石英毛细柱，尺寸为30m×0.25mm×0.25μm。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述色谱条件中，载气为99.999％高纯度氦气；流速1.2mL/min；分流比为10:1。
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