CN115144476A - 一种酵母抽提物中关键风味物质的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酵母抽提物中关键风味物质的分析方法，其包括如下步骤：步骤1)对酵母抽提物样品进行感官评价，确定感官描述词和相应的气味强度；步骤2)利用溶剂辅助风味蒸发法对酵母抽提物样品中的挥发性风味成分进行富集提取；步骤3)定性和定量分析挥发性风味成分并确定关键香气化合物；以及步骤4)确定关键香气化合物中的关键风味物质。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种酵母抽提物中关键风味物质的分析方法。
背景技术
酵母抽提物(yeast extract,YE)是以食品用酵母为主要原料，在酵母自身的酶或外加食品级酶的作用下，酶解自溶(可再经分离提取)后得到的产品，其富含氨基酸肽、多肽等酵母细胞中的可溶性成分。酵母抽提物营养丰富，香气独特，具有浓郁的肉香味和鲜味，在食品领域广泛用作调味剂来提升食品例如调味料、肉制品、焙烤制品、酱料、汤汁等的风味。国内外科研工作者对酵母抽提物的风味研究较多，酵母抽提物中主体挥发性化合物有醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、酚类、吡嗪类、含硫化合物等，其中醛类、吡嗪类、含硫化合物对酵母抽提物香气贡献大，一些含硫化合物虽然含量少，但阈值低，对酵母抽提物风味贡献起到很大的作用，所述含硫化合物例如为3-甲硫基丙醛(烤土豆味)、二甲基二硫醚(蒜香)、2-甲基-5-甲硫基呋喃(肉香)、2-甲基-3-呋喃硫醇(肉香)或4-甲基-5-噻唑乙醇(肉香)等。对于具有不同风味特征的酵母抽提物，关键风味物质可能不同，目前很少对酵母抽提中关键风味物质进行系统地研究。
溶剂辅助风味蒸发法(SAFE)是一种从复杂食品基质中温和、全面地提取挥发性成分的方法，该方法使挥发性成分在高真空接近室温条件下蒸发，样品中的热敏性挥发性成分损失少，萃取物具有样品原有的自然、逼真的香味，比较适合酵母抽提物中挥发性化合物的分离。气相色谱-质谱(GC-MS)联用兼具色谱分离效率强、定量准确，质谱的选择性高和鉴别能力强两大优点，同时具有灵敏度高、分析速度快、所需样品少等优点，提供了一种用于高效地定性、定量分析化合物的工具。感官组学(sensomics)是近年提出的一种新型技术，将仪器分析方法和人类的气味感觉结合，在分子水平上定性、定量和描述风味，是确定食品中的关键香气化合物的有效方法。
发明内容
本发明解决的技术问题是：克服现有技术中的不足，提供一种酵母抽提物中关键风味物质的分析方法，该方法可对酵母抽提物中的关键香气化合物和关键风味物质进行系统地分析，解决现有技术中缺乏对关键风味物质系统研究的技术问题。
具体而言，本发明提供如下技术方案。
本发明提供一种酵母抽提物中关键风味物质的分析方法，其包括如下步骤：
步骤1)对酵母抽提物样品进行感官评价，确定感官描述词和相应的气味强度；
步骤2)利用溶剂辅助风味蒸发法对酵母抽提物样品中的挥发性风味成分进行富集提取；
步骤3)定性和定量分析挥发性风味成分并确定关键香气化合物；以及
步骤4)确定关键香气化合物中的关键风味物质。
优选地，步骤1)中感官描述词包括酚味、动物臭味、发酵味、硫味、花香、焦甜香、青香、烤香和脂肪香。
优选地，步骤1)包括：由有经验的感官评价人员采用10点强度等级基于每个感官描述词对酵母抽提物样品进行感官评价，评分为0-9，其中0表示无香气，9表示香气强度最高。
优选地，步骤2)中溶剂辅助风味蒸发法的关键参数包括：酵母抽提物样品的质量与水的体积比为(20.0-40.0g):(130-270mL)，优选为(25.0-35.0g):(150-250mL)，最优选为30.0g:200mL；水浴温度为30-50℃，优选为35-45℃，最优选为40℃；冷凝器温度为30-50℃，优选为35-45℃，最优选为40℃；NaCl添加量为酵母抽提物样品质量的10％-30％，优选15％-25％，最优选20％。
优选地，步骤2)中酵母抽提物样品为由安琪酵母股份有限公司提供的酵母抽提物KA02、LA00L、LA00或FA31。
优选地，步骤3)中定性和定量分析方法包括：质谱定性、保留指数定性、嗅闻定性和内标法定量。
优选地，质谱定性通过如下方式进行：将酵母抽提物的质谱谱图中的各个峰与NIST11.L谱库相对比，从而确定各峰所对应的化合物。
优选地，保留指数定性通过如下方式进行：测定挥发性风味成分与正构烷烃的保留时间，计算挥发性风味成分的保留指数(RI)，将计算得到的保留指数与NIST ChemistryWebBook中的参考值相对比，从而确定各挥发性风味成分所对应的化合物。
优选地，所述正构烷烃的碳原子数为7-30，保留指数的计算公式如下：
其中，RI为挥发性风味成分的保留指数；tx为挥发性风味成分的保留时间，单位为min；n为碳原子数；tn和tn+1分别为碳原子数为n和n+1的正构烷烃的保留时间，单位为min。
优选地，嗅闻定性通过如下方式进行：感官人员记录从用于嗅闻定性的嗅觉检测器的嗅探口流出的气味的保留时间，描述气味特征--即给出气味的香气描述词，并将所述气味特征与标准化合物的芳香特性相对比来进行，从而确定各种气味所对应的化合物。
优选地，内标法所选取的内标为100mg/L的邻二氯苯。
优选地，内标法所用到的计算公式为Ax/Ai＝Cx/Ci，其中Ax和Ai分别表示挥发性风味成分和内标的出峰面积，Cx和Ci分别表示挥发性风味成分和内标的浓度。
优选地，气相色谱(GC)的工艺参数为：HP-INNOWAX毛细管色谱柱(60m×0.25mm×0.25μm)和DB-5毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm)，N2为载气，流速1.0mL/min，手动不分流进样，进样口温度为250℃；升温程序为：40℃保持3min，以2℃/min升温至60℃，再以4℃/min升温至200℃，之后以5℃/min升至230℃，保留5min。
优选地，质谱(MS)的工艺参数为：采用EI离子源，电离电压为70eV，离子源温度为230℃，接口温度为250℃，扫描范围为30～500amu，溶剂延迟3min。
优选地，气相色谱-嗅闻(GC-O)的工艺参数为：HP-INNOWAX毛细管色谱柱(60m×0.25mm×0.25μm)，N2为载气，流速1.0mL/min，手动不分流进样，进样口温度为250℃，升温程序同气相色谱，流出物以1:1的比例流入火焰离子化检测仪(FID)和嗅探口。
优选地，步骤3)中确定关键香气化合物包括：计算香气活力值(OAV)，香气活力值＝香气物质浓度/香气物质阈值，将香气活力值≥1的化合物确定为关键香气化合物。
优选地，将在上述嗅闻定性步骤中得到的与所有关键香气化合物有关的香气描述词与在步骤1)中确定的感官属性相对比，从而确定各个关键香气化合物对应的感官属性，即确定各个关键香气化合物的香韵分路。
优选地，步骤4)中确定关键香气化合物中的关键风味物质包括：利用关键香气化合物，并根据其在步骤3)中测定的含量结果，进行重组实验；在重组实验的基础上，以重组实验结果为参考，通过缺失实验香气进一步确定关键香气化合物中的关键风味物质。
优选地，本发明方法确定酵母抽提物LA00L中的关键风味物质包括：苯酚、4-甲基苯酚、吲哚、二甲基二硫、3-甲硫基丙醛、苯乙酮、苯乙醛、3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪和壬醛。
优选地，本发明方法确定酵母抽提物LA00L的酚味由苯酚和4-甲基苯酚提供；动物臭味由吲哚提供；硫味由二甲基二硫和3-甲硫基丙醛提供；花香由苯乙酮提供；青香由苯乙醛提供；烤香由3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪提供；并且脂肪香由壬醛提供。
优选地，本发明方法确定酵母抽提物LA00中的关键风味物质包括：4-甲基苯酚、吲哚、正戊酸、二甲基二硫、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、2-乙基-6-甲基吡嗪和壬醛。
优选地，本发明方法确定酵母抽提物LA00的酚味由4-甲基苯酚提供；动物臭味由吲哚提供；发酵味由正戊酸提供；硫味由二甲基二硫和3-甲硫基丙醛提供；青香由苯乙醛提供；烤香由2-乙基-6-甲基吡嗪提供；并且脂肪香由壬醛提供。
优选地，本发明方法确定酵母抽提物FA31中的关键风味物质包括：4-甲基苯酚、吲哚、3-甲硫基丙醛、苯乙酮、苯乙醛和2,5-二甲基吡嗪。
优选地，本发明方法确定酵母抽提物FA31的酚味由4-甲基苯酚提供；动物臭味由吲哚提供；硫味由3-甲硫基丙醛提供；花香由苯乙酮提供；青香由苯乙醛提供；烤香由2,5-二甲基吡嗪提供。
优选地，本发明方法确定酵母抽提物KA02中的关键风味物质包括：苯酚、4-甲基苯酚、吲哚、2-甲基丙酸、3-甲硫基丙醛、苯乙酮、苯乙醇、苯乙醛、三甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪和壬醛。
优选地，本发明方法确定酵母抽提物KA02的酚味由苯酚和4-甲基苯酚提供；动物臭味由吲哚提供；发酵味由2-甲基丙酸提供；硫味由3-甲硫基丙醛提供；花香由苯乙酮和苯乙醇提供；青香由苯乙醛提供；烤香由三甲基吡嗪和3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪提供；并且脂肪香由壬醛提供。
本发明所取得的有益效果是：
与现有技术相比，本发明通过风味组学对酵母抽提物中的关键风味物质进行系统科学的研究，确定了不同酵母抽提物中的关键风味物质。为酵母抽提物中的关键风味物质的研究提供了一种方法。
附图说明
图1为酵母抽提物样品LA00L、LA00、FA31和KA02的感官雷达图，基于本发明方法的步骤1)的结果绘制得到。
图2为酵母抽提物样品LA00L与其重组模型的感官雷达图。
图3为酵母抽提物样品LA00与其重组模型的感官雷达图。
图4为酵母抽提物样品FA31与其重组模型的感官雷达图。
图5为酵母抽提物样品KA02与其重组模型的感官雷达图。
具体实施方式
如上所述，本发明提供了一种酵母抽提物中关键风味物质的分析方法，其包括如下步骤：
步骤1)对酵母抽提物样品进行感官评价，确定感官描述词和相应的气味强度；
步骤2)利用溶剂辅助风味蒸发法对酵母抽提物样品中的挥发性风味成分进行富集提取；
步骤3)定性和定量分析挥发性风味成分并确定关键香气化合物；
步骤4)确定关键香气化合物中的关键风味物质。
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施例对本发明所述的技术方案做进一步说明，但本发明不仅限于此。
下面对实施例所用的原料及设备的生产厂家，以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下，本文未记载的试剂、仪器或操作步骤均是本领域普通技术人员可常规确定的内容：
表1本发明所用到的原料和仪器的信息
实施例
实施例1
〈分析酵母抽提物样品1中的关键风味物质〉
步骤1)：对酵母抽提物样品1进行感官评价，具体步骤如下：
参考ISO 8589-2007标准，感官实验在香料学院的感官实验室进行。选取10名经过专业训练的人员组成小组(5名男性和5名女性，年龄20-45岁)，评估样品的香气特征，这个小组接受6小时的培训，包括在2周内进行的3次2小时的培训。
培训环节如下：
i.感官小组讨论样品的香气特征，然后讨论确定样品的感官属性；
ii.感官小组对感官属性达成共识，确定感官描述词及每个感官属性对应的参考化合物；
iii.感官小组对不同浓度样品感官评定，使其对强度达成共识，通过10点强度等级从0到9评估香气强度；“0”表示无香气，“9”表示香气强度最高。
培训结束后，感官小组在具有独立隔间的25℃感官实验室对样品感官评定，在9个感官属性(酚味、动物臭味、发酵味、硫味、花香、焦甜香、青香、烤香和脂肪香)上打分(0-9分)确定香气强度，每两个样品之间有休息间隔，每个小组成员对每个感官属性进行3次打分，采用10个成员的平均分数作为该气味的强度值，并根据打分结果确定重组模型的感官雷达图。
酵母抽提物样品1的感官雷达图如图1和图2所示。
步骤2)：对酵母抽提物样品1中的挥发性风味成分进行富集提取，具体步骤如下：
准确称取30.0g酵母抽提物样品1(即LA00L)，加入200mL去离子水、6.0g的氯化钠和100μL内标邻二氯苯(100mg/L)，25℃下磁力搅拌1h，10000r/min离心取上清液；用溶剂辅助蒸发装置在5×10-5pa压力下将上清液在40℃下萃取2h，将溶剂辅助蒸发装置的冷阱瓶中的萃取物解冻后，立即用二氯甲烷萃取，并用无水硫酸钠干燥，过滤；之后，将滤液旋转蒸发浓缩至5mL，并进一步氮吹浓缩至1mL，储存在-20℃下待进GC-MS和GC-O。
步骤3)：定性和定量分析挥发性风味成分并确定关键香气化合物，具体步骤如下：
采用气相色谱-质谱联用仪和气相色谱-嗅闻联用仪，
其中，气相色谱仪的工艺参数：HP-INNOWAX毛细管色谱柱(60m×0.25mm×0.25μm)和DB-5毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm)，N2为载气，载气流速1.0mL/min，手动不分流进样，进样量为1μl，进样口温度为250℃；升温程序：40℃保持3min，以2℃/min升温至60℃，再以4℃/min升温至200℃，后以5℃/min升至230℃，保留5min；
质谱仪的工艺参数：质谱采用EI离子源，电离电压为70eV，离子源温度为230℃，接口温度为250℃，扫描范围30～500amu，溶剂延迟3min；
气相色谱-嗅闻联用仪的工艺参数：HP-INNOWAX毛细管色谱柱(60m×0.25mm×0.25μm)，N2为载气，载气流速1.0mL/min，手动不分流进样，进样量1μL，进样口温度为250℃，升温程序同GC-MS，流出物以1:1的比例流入火焰离子化检测仪(FID)和嗅觉检测器。
利用气相色谱-质谱联用仪在上述条件下进行质谱定性：将所得到的酵母抽提物样品1的质谱谱图中的各个峰与NIST11.L谱库相对比，从而确定各峰所对应的化合物。
利用气相色谱-质谱联用仪在上述条件下进行保留指数定性：测定挥发性风味成分与C7-C30正构烷烃的保留时间，并按如下公式计算挥发性风味成分的保留指数(RI)，将计算得到的保留指数与NIST Chemistry WebBook中的参考值相对比，从而确定各挥发性风味成分所对应的化合物，
保留指数的计算公式如下：
其中，RI为挥发性风味成分的保留指数；tx为挥发性风味成分的保留时间，单位为min；n为碳原子数；tn和tn+1分别为碳原子数为n和n+1的正构烷烃的保留时间，单位为min。
利用气相色谱-嗅闻联用仪在上述条件下进行嗅闻定性：感官人员记录从嗅觉检测器的嗅探口流出的气味的保留时间，描述气味特征--即给出气味的香气描述词，并将嗅探口闻到的气味特征与标准化合物的芳香特性(标准化合物的芳香特性可在如下网站搜索到：http://www.thegoodscentscompany.com/search2.html)相对比，从而确定各种气味所对应的化合物。
利用气相色谱-质谱联用仪在上述条件下进行内标法定量：利用如下公式计算各挥发性风味成分的浓度：Ax/Ai＝Cx/Ci，其中Ax和Ai分别表示挥发性风味成分和内标的出峰面积，Cx和Ci分别表示挥发性风味成分和内标的浓度。
酵母抽提物样品1中的挥发性风味成分的定性和定量结果如下表2所示。
根据酵母抽提物样品1中的挥发性风味成分的定性和定量结果，确定关键香气化合物：计算香气活力值(OAV)，香气活力值＝香气物质浓度/香气物质阈值，将香气活力值≥1的化合物确定为关键香气化合物。将上述嗅闻定性步骤中得到的与所有关键香气化合物有关的香气描述词与在步骤1)中确定的感官属性相对比，从而确定各个关键香气化合物对应的感官属性，即确定各个关键香气化合物的香韵分路。
酵母抽提物样品1中的关键香气化合物及其香韵分路如下表3所示。
步骤4)：确定关键风味物质，具体步骤如下：
基于酵母抽提物样品1中的关键香气化合物及其香韵分路，通过重组遗漏模型确定关键香气化合物中的关键风味物质，具体步骤如下。将酵母抽提物样品1(即LA00L)的21个关键香气化合物(OAV≥1)按其在步骤3)中测定的含量添加到无味酵母抽提物基质(所述无味酵母抽提物基质的制备方法如下：以购自安琪酵母股份有限公司的酵母抽提物LA00L为原料，用二氯甲烷洗脱3次，每次200ml，然后鼓吹氮气1h，得到无味酵母抽提物基质)中，混合均匀，得到重组模型，对重组模型进行感官评价。感官评价的具体步骤如下：感官小组在具有独立隔间的25℃感官实验室对样品感官评定，在9个感官属性(酚味、动物臭味、发酵味、硫味、花香、焦甜香、青香、烤香和脂肪香)上打分(0-9分)确定香气强度，每两个样品之间有休息间隔，每个小组成员对每个感官属性进行3次打分，采用10个成员的平均分数作为该气味的强度值，并根据打分结果确定重组模型的感官雷达图，如图2所示。在重组实验的基础上，以重组实验结果为参考，通过缺失实验香气进一步确定关键香气化合物中的关键风味物质，具体步骤如下。通过3点检验法，将2个相同的重组模型和1个缺失模型通过3个不同的数字随机编码，呈递给感官人员，感官人员从中选取有差别的一个样品，记录感官小组成员中回答正确的人数，回答正确的人数越多，说明缺失模型与重组模型之间的差距越大，说明所缺失的化合物越关键。酵母抽提物样品1的重组模型的缺失实验的结果如下表4所示。由下表4可以看出，酵母抽提物样品1的关键风味物质包括苯酚、4-甲基苯酚、吲哚、二甲基二硫、3-甲硫基丙醛、苯乙酮、苯乙醛、3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪和壬醛。根据香韵分路可确定上述关键风味物质与酵母抽提物样品的感官属性的对应关系，结果如下：酵母抽提物样品1的酚味由苯酚和4-甲基苯酚提供；动物臭味由吲哚提供；硫味由二甲基二硫和3-甲硫基丙醛提供；花香由苯乙酮提供；青香由苯乙醛提供；烤香由3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪提供；并且脂肪香由壬醛提供。
表2酵母抽提物样品1(LA00L)中挥发性风味成分的定性和定量结果
备注：
1挥发性化合物双柱定性定性结果，保留指数RI计算值。
2挥发性化合物定性“MS”-匹配谱库质谱图；“RI”-化合物RI计算值与文献参考值一致；“O”-评价员嗅闻到的气味与标准化合物的芳香特性相符。
3含量结果为平均值±标准差(SD,n＝3)。
4挥发性化合物在水中阈值(除4-甲基-5-羟乙基噻唑)，参考Van Gemert,L.J.(2003).Compilations of odor threshold values in air,water and othermedia.Houten,The Netherlands:Van SettenKwadraat。
5“N”表示未查询到阈值。
64-甲基-5-羟乙基噻唑在15％(体积分数)乙醇中阈值(Rapp et al.1985)。
表3酵母抽提物样品1(LA00L)中的关键香气化合物及其香韵分路
表4酵母抽提物样品1(LA00L)的重组模型的缺失实验的结果
备注：1在3点检验中，10名感官人员中回答正确者的人数。
2***表示非常高度显著(α≤0.001)；**表示高度显著(α≤0.01)；*表示显著(α≤0.05)。
实施例2
〈分析酵母抽提物样品2中的关键风味物质〉
按照实施例1描述的方法进行，不同之处在于：在步骤2)中，使用20.0g酵母抽提物样品2(即LA00)，去离子水的体积为130mL，水浴温度为30℃；冷凝器温度为30℃；NaCl添加量为2.0g。
酵母抽提物样品2中的挥发性风味成分的定性和定量结果如下表5所示。
酵母抽提物样品2中的关键香气化合物及其香韵分路如下表6所示。
酵母抽提物样品2的重组模型的缺失实验的结果如下表7所示。由下表7可以看出，酵母抽提物样品2的关键风味物质包括4-甲基苯酚、吲哚、正戊酸、二甲基二硫、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、2-乙基-6-甲基吡嗪和壬醛。根据香韵分路可确定上述关键风味物质与酵母抽提物样品的感官属性的对应关系，结果如下：酵母抽提物样品2的酚味由4-甲基苯酚提供；动物臭味由吲哚提供；发酵味由正戊酸提供；硫味由二甲基二硫和3-甲硫基丙醛提供；青香由苯乙醛提供；烤香由2-乙基-6-甲基吡嗪提供；并且脂肪香由壬醛提供。
酵母抽提物样品2与其重组模型的感官雷达图如图1和图3所示。
表5酵母抽提物样品2(LA00)中挥发性风味成分的定性和定量结果
备注：
1挥发性化合物双柱定性定性结果，保留指数RI计算值。
2挥发性化合物定性“MS”-匹配谱库质谱图；“RI”-化合物RI计算值与文献参考值一致；“O”-评价员嗅闻到的气味与标准化合物的芳香特性相符。
3含量结果为平均值±标准差(SD,n＝3)。
4挥发性化合物在水中阈值(除4-甲基-5-羟乙基噻唑)，参考Van Gemert,L.J.(2003).Compilations of odor threshold values in air,water and othermedia.Houten,The Netherlands:Van SettenKwadraat。
5“N”表示未查询到阈值。
64-甲基-5-羟乙基噻唑在15体积％乙醇中阈值(Rapp et al.1985)。
表6酵母抽提物样品2(LA00)中的关键香气化合物及其香韵分路
表7酵母抽提物样品2(LA00)的重组模型的缺失实验的结果
备注：1在3点检验中，10名感官人员中回答正确者的人数。
2***表示非常高度显著(α≤0.001)；**表示高度显著(α≤0.01)；*表示显著(α≤0.05)。
实施例3
〈分析酵母抽提物样品3中的关键风味物质〉
按照实施例1描述的方法进行，不同之处在于：在步骤2)中，使用40.0g酵母抽提物样品3(即FA31)，去离子水的体积为270mL，水浴温度为50℃，冷凝器温度为50℃，NaCl添加量为12.0g。
酵母抽提物样品3中的挥发性风味成分的定性和定量结果如下表8所示。
酵母抽提物样品3中的关键香气化合物及其香韵分路如下表9所示。
酵母抽提物样品3的重组模型的缺失实验的结果如下表10所示。由下表10可以看出，酵母抽提物样品3的关键风味物质包括：4-甲基苯酚、吲哚、3-甲硫基丙醛、苯乙酮、苯乙醛和2,5-二甲基吡嗪。根据香韵分路可确定上述关键风味物质与酵母抽提物样品的感官属性的对应关系，结果如下：酵母抽提物样品3的酚味由4-甲基苯酚提供；动物臭味由吲哚提供；硫味由3-甲硫基丙醛提供；花香由苯乙酮提供；青香由苯乙醛提供；烤香由2,5-二甲基吡嗪提供。
酵母抽提物样品3与其重组模型的感官雷达图如图1和图4所示。
表8酵母抽提物样品3(FA31)中挥发性风味成分的定性和定量结果
备注：
1挥发性化合物双柱定性定性结果，保留指数RI计算值。
2挥发性化合物定性“MS”-匹配谱库质谱图；“RI”-化合物RI计算值与文献参考值一致；“O”-评价员嗅闻到的气味与标准化合物的芳香特性相符。
3含量结果为平均值±标准差(SD,n＝3)。
4挥发性化合物在水中阈值，参考Van Gemert，L.J.(2003).Compilations ofodor threshold values in air，water and other media.Houten，The Netherlands：VanSettenKwadraat。
5“N”表示未查询到阈值。
表9酵母抽提物样品3(FA31)中的关键香气化合物及其香韵分路
| 香韵分路 | 序号 | 化合物 | 香气描述词 | OAV值 |
| 硫味 | C8 | 3-甲硫基丙醛 | 烤土豆味，硫味 | 540 |
| 青香 | C1 | 右旋萜二烯 | 柑橘味，甜味，青味 | 3 |
| C10 | 苯甲醛 | 果味，杏仁味，青味 | 2 | |
| C11 | 苯乙醛 | 青味，花香，甜味 | 37 | |
| 烤香 | C5 | 2，5-二甲基吡嗪 | 坚果味，烤香味 | 1 |
| 花香 | C3 | 苯乙烯 | 香膏味，汽油味，花香 | 4 |
| C12 | 苯乙酮 | 花香，杏仁味 | 17 | |
| C14 | 苯乙醇 | 花香，玫瑰味，蜂蜜味 | 3 | |
| 酚味 | C18 | 苯酚 | 酚味 | 2 |
| C19 | 4-甲基苯酚 | 药味，酚味，烟熏味 | 24 | |
| 动物臭味 | C21 | 吲哚 | 动物臭味 | 20 |
表10酵母抽提物样品3(FA31)的重组模型的缺失实验的结果
| 香韵分路 | 序号 | 化合物 | n | 显著性<sup>2</sup> |
| 硫味 | C8 | 3-甲硫基丙醛 | 10 | *** |
| 青香 | C1 | 右旋萜二烯 | 5 | - |
| C10 | 苯甲醛 | 6 | - | |
| C11 | 苯乙醛 | 8 | ** | |
| 烤香 | C5 | 2，5-二甲基吡嗪 | 7 | * |
| 花香 | C3 | 苯乙烯 | 4 | - |
| C12 | 苯乙酮 | 8 | ** | |
| C14 | 苯乙醇 | 4 | - | |
| 酚味 | C18 | 苯酚 | 6 | - |
| C19 | 4-甲基苯酚 | 7 | * | |
| 动物臭味 | C21 | 吲哚 | 9 | ** |
备注：1在3点检验中，10名感官人员中回答正确者的人数。
2***表示非常高度显著(α≤0.001)；**表示高度显著(α≤0.01)；*表示显著(α≤0.05)。
实施例4
〈分析酵母抽提物样品4中的关键风味物质〉
按照实施例1描述的方法进行，不同之处在于：在步骤2)中，使用25.0g酵母抽提物样品4(即KA02)，去离子水的体积为150mL水浴温度为35℃，冷凝器温度为35℃，NaCl添加量为3.75g。
酵母抽提物样品4中的挥发性风味成分的定性和定量结果如下表11所示。
酵母抽提物样品4中的关键香气化合物及其香韵分路如下表12所示。
酵母抽提物样品4的重组模型的缺失实验的结果如下表13所示。由下表13可以看出，酵母抽提物样品4的关键风味物质包括：苯酚、4-甲基苯酚、吲哚、2-甲基丙酸、3-甲硫基丙醛、苯乙酮、苯乙醇、苯乙醛、三甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪和壬醛。根据香韵分路可确定上述关键风味物质与酵母抽提物样品的感官属性的对应关系，结果如下：酵母抽提物样品4的酚味由苯酚和4-甲基苯酚提供；动物臭味由吲哚提供；发酵味由2-甲基丙酸提供；硫味由3-甲硫基丙醛提供；花香由苯乙酮和苯乙醇提供；青香由苯乙醛提供；烤香由三甲基吡嗪和3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪提供；并且脂肪香由壬醛提供。
酵母抽提物样品4与其重组模型的感官雷达图如图1和图5所示。
表11酵母抽提物样品4(KA02)中挥发性风味成分的定性和定量结果
备注：1挥发性化合物双柱定性定性结果，保留指数RI计算值。
2挥发性化合物定性“MS”-匹配谱库质谱图；“RI”-化合物RI计算值与文献参考值一致；“O”-评价员嗅闻到的气味与标准化合物的芳香特性相符。
3含量结果为平均值±标准差(SD,n＝3)。
4挥发性化合物在水中阈值(除γ-丁内酯和4-甲基-5-羟乙基噻唑)，参考VanGemert,L.J.(2003).Compilations of odor threshold values in air,water andother media.Houten,The Netherlands:Van SettenKwadraat。
5“N”表示未查询到阈值。
64-甲基-5-羟乙基噻唑在15％(体积分数)乙醇中阈值(Rapp et al.1985)。
7γ-丁内酯在10％水/乙醇,酒石酸5g/l,pH3.2介质中的阈值(Cullere etal.2004)。
表12酵母抽提物样品4(KA02)中的关键香气化合物及其香韵分路
表13酵母抽提物样品4(KA02)的重组模型的缺失实验得到结果
| 香韵分路 | 序号 | 化合物 | n | 显著性<sup>2</sup> |
| 硫味 | D14 | 3-甲硫基丙醛 | 9 | *** |
| D37 | 4-甲基-5-羟乙基噻唑 | 5 | - | |
| 青香 | D18 | 苯甲醛 | 4 | - |
| D22 | 苯乙醛 | 7 | * | |
| 花香 | D1 | 苯乙烯 | 2 | - |
| D23 | 苯乙酮 | 8 | ** | |
| D28 | 苯甲醇 | 1 | - | |
| D29 | 苯乙醇 | 7 | * | |
| 焦甜香 | D2 | 甲基吡嗪 | 4 | - |
| D6 | 2，6-二甲基吡嗪 | 3 | - | |
| 烤香 | D5 | 2，5-二甲基吡嗪 | 5 | - |
| D9 | 2-乙基-6-甲基吡嗪 | 6 | - | |
| D11 | 三甲基吡嗪 | 7 | * | |
| D13 | 3-乙基-2，5-二甲基-吡嗪 | 9 | ** | |
| D15 | 糠醛 | 5 | - | |
| 脂肪 | D3 | 3-羟基-2-丁酮 | 6 | - |
| D10 | 壬醛 | 7 | * | |
| D21 | gamma-丁内酯 | 4 | - | |
| 发酵味 | D17 | 丙酸 | 6 | - |
| D19 | 2-甲基丙酸 | 7 | * | |
| D20 | 丁酸 | 5 | - | |
| D24 | 3-甲基丁酸 | 6 | - | |
| D26 | 己酸 | 4 | - | |
| 酚味 | D27 | 愈创木酚 | 6 | - |
| D33 | 苯酚 | 7 | * | |
| D35 | 4-甲基苯酚 | 9 | ** | |
| 动物臭味 | D38 | 吲哚 | 10 | *** |
备注：1在3点检验中，10名感官人员中回答正确者的人数。
2***表示非常高度显著(α≤0.001)；**表示高度显著(α≤0.01)；*表示显著(α≤0.05)。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。
Claims (21)
1.一种酵母抽提物中关键风味物质的分析方法，其包括如下步骤：
步骤1)对酵母抽提物样品进行感官评价，确定感官描述词和相应的气味强度；
步骤2)利用溶剂辅助风味蒸发法对酵母抽提物样品中的挥发性风味成分进行富集提取；
步骤3)定性和定量分析挥发性风味成分并确定关键香气化合物；以及
步骤4)确定关键香气化合物中的关键风味物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1)中感官描述词包括酚味、动物臭味、发酵味、硫味、花香、焦甜香、青香、烤香和脂肪香。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤1)包括：由有经验的感官评价人员采用10点强度等级基于每个感官描述词对酵母抽提物样品进行感官评价，评分为0-9，其中0表示无香气，9表示香气强度最高。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，步骤2)中溶剂辅助风味蒸发法的关键参数包括：酵母抽提物样品的质量与水的体积比为(20.0-40.0g):(130-270mL)，优选为(25.0-35.0g):(150-250mL)，最优选为30.0g:200mL；水浴温度为30-50℃，优选为35-45℃，最优选为40℃；冷凝器温度为30-50℃，优选为35-45℃，最优选为40℃；NaCl添加量为酵母抽提物样品质量的10％-30％，优选15％-25％，最优选20％。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，步骤2)中酵母抽提物样品为由安琪酵母股份有限公司提供的酵母抽提物KA02、LA00L、LA00或FA31。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，步骤3)中定性和定量分析方法包括：质谱定性、保留指数定性、嗅闻定性和内标法定量。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，质谱定性通过如下方式进行：将酵母抽提物的质谱谱图中的各个峰与NIST11.L谱库相对比，从而确定各峰所对应的化合物。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，保留指数定性通过如下方式进行：测定挥发性风味成分与正构烷烃的保留时间，计算挥发性风味成分的保留指数(RI)，将计算得到的保留指数与NIST Chemistry WebBook中的参考值相对比，从而确定各挥发性风味成分所对应的化合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述正构烷烃的碳原子数为7-30，保留指数的计算公式如下：
其中，RI为挥发性风味成分的保留指数；tx为挥发性风味成分的保留时间，单位为min；n为碳原子数；tn和tn+1分别为碳原子数为n和n+1的正构烷烃的保留时间，单位为min。
10.根据权利要求6所述的方法，其中，嗅闻定性通过如下方式进行：感官人员记录从用于嗅闻定性的嗅觉检测器的嗅探口流出的气味的保留时间，描述气味特征--即给出气味的香气描述词，并将所述气味特征与标准化合物的芳香特性相对比来进行，从而确定各种气味所对应的化合物。
11.根据权利要求6所述的方法，其中，内标法所选取的内标为100mg/L的邻二氯苯。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，步骤3)中确定关键香气化合物包括：计算香气活力值(OAV)，香气活力值＝香气物质浓度/香气物质阈值，将香气活力值≥1的化合物确定为关键香气化合物。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，步骤4)中确定关键香气化合物中的关键风味物质包括：利用关键香气化合物，并根据其在步骤3)中测定的含量结果，进行重组实验；在重组实验的基础上，以重组实验结果为参考，通过缺失实验香气进一步确定关键香气化合物中的关键风味物质。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，酵母抽提物LA00L中的关键风味物质包括：苯酚、4-甲基苯酚、吲哚、二甲基二硫、3-甲硫基丙醛、苯乙酮、苯乙醛、3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪和壬醛。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，酵母抽提物LA00L的酚味由苯酚和4-甲基苯酚提供；动物臭味由吲哚提供；硫味由二甲基二硫和3-甲硫基丙醛提供；花香由苯乙酮提供；青香由苯乙醛提供；烤香由3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪提供；并且脂肪香由壬醛提供。
16.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，酵母抽提物LA00中的关键风味物质包括：4-甲基苯酚、吲哚、正戊酸、二甲基二硫、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、2-乙基-6-甲基吡嗪和壬醛。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，酵母抽提物LA00的酚味由4-甲基苯酚提供；动物臭味由吲哚提供；发酵味由正戊酸提供；硫味由二甲基二硫和3-甲硫基丙醛提供；青香由苯乙醛提供；烤香由2-乙基-6-甲基吡嗪提供；并且脂肪香由壬醛提供。
18.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，酵母抽提物FA31中的关键风味物质包括：4-甲基苯酚、吲哚、3-甲硫基丙醛、苯乙酮、苯乙醛和2,5-二甲基吡嗪。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，酵母抽提物FA31的酚味由4-甲基苯酚提供；动物臭味由吲哚提供；硫味由3-甲硫基丙醛提供；花香由苯乙酮提供；青香由苯乙醛提供；烤香由2,5-二甲基吡嗪提供。
20.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，酵母抽提物KA02中的关键风味物质包括：苯酚、4-甲基苯酚、吲哚、2-甲基丙酸、3-甲硫基丙醛、苯乙酮、苯乙醇、苯乙醛、三甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪和壬醛。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，酵母抽提物KA02的酚味由苯酚和4-甲基苯酚提供；动物臭味由吲哚提供；发酵味由2-甲基丙酸提供；硫味由3-甲硫基丙醛提供；花香由苯乙酮和苯乙醇提供；青香由苯乙醛提供；烤香由三甲基吡嗪和3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪提供；并且脂肪香由壬醛提供。
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