ES2300347T3 - Levaduras modificadas y utilizaciones, particularmente para la produccion de derivados esteroideos. - Google Patents
Levaduras modificadas y utilizaciones, particularmente para la produccion de derivados esteroideos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2300347T3 ES2300347T3 ES01956637T ES01956637T ES2300347T3 ES 2300347 T3 ES2300347 T3 ES 2300347T3 ES 01956637 T ES01956637 T ES 01956637T ES 01956637 T ES01956637 T ES 01956637T ES 2300347 T3 ES2300347 T3 ES 2300347T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gene
- baselineskip
- yeast
- gcy1
- ypr1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
- C12N9/0087—Steroid 21-monooxygenase (1.14.99.10)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/06—Hydroxylating
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
Cepa de levadura que presenta una actividad de tipo 20a hidroxiesteroide deshidrogenasa (20a HSD) reducida caracterizada porque posee : -una modificación genética inactivadora del gen GCY1, o -una modificación genética inactivadora del gen YPR1, o -una modificación genética inactivadora de los genes GCY1 e YPR1, con la excepción de las cepas gcyD0 y gcyDD0.
Description
Levaduras modificadas y utilizaciones,
particularmente para la producción de derivados esteroideos.
La presente invención se refiere al campo de la
biología y de la farmacia. Se refiere principalmente a nuevas
composiciones y métodos útiles para la producción de compuestos
esteroideos o para la transformación (selectiva) de compuestos
esteroideos. Se refiere, más particularmente, a nuevas cepas de
levadura, a los procedimientos y construcciones genéticas para su
preparación, así como a su utilización para la síntesis o la
modificación de compuestos esteroideos. Las cepas de levadura de la
invención permiten mejorar la eficacia de la síntesis o aumentar la
selectividad o los rendimientos del procedimiento, así como la
calidad del producto final. Las cepas, procedimientos y compuestos
de la invención son útiles en la investigación, el desarrollo y la
producción de productos con actividad terapéutica o profiláctica,
en el ser humano o los animales, principalmente de derivados
esteroideos.
La capacidad natural de los microorganismos de
transformar los esteroides se ha descrito ampliamente en la
bibliografía. A este respecto, representan una alternativa ventajosa
para la producción de derivados esteroideos difíciles de obtener
por síntesis química. Las levaduras están, por otra parte, adaptadas
particularmente para la expresión de ADNc que codifica enzimas
activas en los orgánulos. Por esto, las levaduras, tales como S.
cerevisiae, se han utilizado ampliamente para expresar los ADNc
que codifican enzimas esteroidógenas, tales como las P450
microsomales o mitocondriales. Además, determinados estudios
destinados a expresar las enzimas implicadas en la vía de
biosíntesis de la hidrocortisona han permitido mostrar que las
levaduras eran capaces de transformar eficazmente determinados
intermedios. Así, la utilización de levaduras transformadas que
permiten la expresión de una o varias enzimas de mamíferos
implicadas en la vía de biosíntesis de los esteroides se ha
descrito, por ejemplo, en la solicitud EP340878, la patente
EEUU5.137.822 o en Dumas et al. En particular, se ha
descrito anteriormente la utilización de una levadura
Saccharomyces cerevisiae que expresa el citocromo P450 C21
adrenal bovino para producir 11-desoxicortisol a
partir de 17\alpha-hidroxiprogesterona (Base de
Datos WPI Sección Ch., Semana 199011 Derwent Publications Ltd.,
Londres, Inglaterra). Así mismo, los solicitantes han encontrado
que los hidroxiesteroides \Delta5-3\beta tales
como la pregnenolona, la
17\alpha-hidroxipregnenolona y la DHEA se
convertían por las levaduras en los ésteres acetato
correspondientes. Los solicitantes han puesto de manifiesto
igualmente que esta conversión la realizaba esencialmente el
producto del gen ATF2 (Cauet et al., 1999). Las levaduras
representan, por lo tanto, un organismo particularmente útil en el
plano industrial para la producción de derivados esteroideos.
Sin embargo, se sabe igualmente que la
17\alpha-hidroxiprogesterona puede, en
determinadas condiciones, reducirse por las levaduras en
4-pregneno-17\alpha,20\alpha-diol-3-ona
(Dumas et al., 1994) y que la producción de este
sub-producto afecta a los rendimientos de la
síntesis así como a la calidad del producto final. Sin embargo,
hasta ahora, no se han identificado la o las actividades enzimáticas
responsables de esta reacción, de tipo 20\alpha hidroxiesteroide
deshidrogenasa (20\alphaHSD).
La presente invención resulta precisamente del
estudio de las actividades endógenas de la levadura que actúan
sobre la hidroxiprogesterona y describe la identificación de dos
genes que codifican enzimas dotadas de actividad de tipo
20\alphaHSD. Más particularmente, la presente solicitud muestra
que los genes GCY1 e YPR1 son portadores de la actividad de tipo
20\alphaHSD en la levadura y que el producto de estos genes
permite, por ejemplo, convertir la hidroxiprogesterona en
sub-productos in vitro. En efecto, aún cuando
se ha descrito una inactivación del gen GCY en la levadura por
Oechsner et al. (1988), no se ha identificado ningún fenotipo
asociado a esta inactivación. Así mismo, se ha propuesto inactivar
el gen YPR1 para limitar la virulencia de cepas fúngicas
(WO99/25865, Microbia Inc.). La presente solicitud muestra, por otra
parte, que la supresión de la actividad de estos genes en la
levadura reduce considerablemente o suprime la formación de
sub-productos de tipo
4-pregneno-17\alpha,20a-diol-3-ona
y permite mejorar de manera significativa los rendimientos de la
síntesis de derivados esteroideos y/o transformar la
hidroxiprogesterona (o sus precursores) en derivados esteroideos de
manera más selectiva. La presente solicitud describe, por lo tanto,
composiciones y métodos nuevos utilizables para la síntesis de
derivados esteroideos con una selectividad mejor. La invención
describe, en particular, cepas de levadura nuevas que tienen una
actividad de tipo 20\alphaHSD reducida y que son esencialmente
incapaces de transformar la hidroxiprogesterona en
sub-productos de tipo
4-pregneno-17\alpha,20a-diol-3-ona.
La invención puede utilizarse igualmente para aumentar la
producción de dichos productos, con objeto de su utilización o
transformación en compuestos activos.
Un primer objeto de la invención reside, más
particularmente, en un procedimiento de modificación de un compuesto
esteroide, que comprende poner en contacto este compuesto (o un
precursor de éste) con una levadura que presenta una actividad
20\alphaHSD reducida, en particular, una levadura que presenta un
gen GCY1 y/o YPR1 no funcional, principalmente interrumpido, más
preferiblemente una levadura del género Saccharomyces, o una
preparación derivada de dicha levadura.
La invención se refiere igualmente a la
utilización de una levadura que presenta una actividad 20\alphaHSD
reducida, en particular, una levadura que presenta un gen GCY1 y/o
YPR1 no funcional, principalmente interrumpido, más
preferiblemente, una levadura del género Saccharomyces, o una
preparación derivada de dicha levadura, para la preparación, la
producción, la síntesis, la modificación y/o la mejora de compuestos
esteroideos in vitro o ex vivo.
La invención se refiere igualmente a cualquier
procedimiento de producción de derivados esteroideos a partir de
compuestos hidroxi-esteroide, principalmente de
hidroxiprogesterona o de sus precursores, utilizando una levadura
que presenta una actividad de tipo 20\alphaHSD reducida,
principalmente una levadura que presenta un gen GCY1 y/o YPR1 no
funcional, principalmente interrumpido, más preferiblemente, una
levadura del género Saccharomyces, o una preparación derivada de
dicha levadura.
La invención se refiere igualmente a un
procedimiento de conversión de
17\alpha-hidroxiprogesterona, principalmente en
11-desoxicortisol, utilizando una levadura que
presenta una actividad de tipo 20\alphaHSD reducida,
principalmente una levadura que presenta un gen GCY1 y/o YPR1 no
funcional, principalmente interrumpido, más preferiblemente, una
levadura del género Saccharomyces, o una preparación derivada de
dicha levadura.
La invención tiene igualmente por objeto la
utilización de una levadura que presenta una actividad 20\alphaHSD
reducida, en particular, una levadura que presenta un gen GCY1 y/o
YPR1 no funcional, principalmente interrumpido, más
preferiblemente, una levadura del género Saccharomyces, o una
preparación derivada de dicha levadura, para la conversión de
17\alpha-hidroxiprogesterona en
11-desoxicortisol.
Otro objeto de la invención reside además en un
procedimiento de modificación de la actividad de tipo 20\alphaHSD
de una levadura, que comprende la modificación de la actividad del
gen GCY1 y/o YPR1 de dicha levadura. Se trata, más particularmente,
de un procedimiento para reducir o inhibir la actividad
20\alphaHSD de una levadura, que comprende la inactivación del
gen GCY1 y/o YPR1 de dicha levadura, preferiblemente por disrupción
génica, aún más preferiblemente sobre levaduras del género
Saccharomyces.
La presente invención también tiene por objeto
las cepas particulares de levadura que presentan una actividad de
tipo 20\alpha-HSD reducida. Más preferiblemente,
se trata de levaduras que poseen un gen YPR1 no funcional, de
levaduras que poseen un gen GCY1 y un gen YPR1 no funcionales o
también de determinadas levaduras que poseen un gen GCY1 no
funcional.
La invención también se refiere a cualquier
preparación acelular derivada de una levadura tal como se ha
descrito anteriormente, principalmente un lisado celular,
homogenado celular, sobrenadante de cultivo, una disolución (pre)
purificada o enriquecida derivada, etc.
Como se ha indicado anteriormente, la presente
invención describe por primera vez cepas (o células o cultivos) de
levadura, así como preparaciones derivadas, que presentan una
actividad de tipo 20\alphaHSD reducida, incluso indetectable. La
invención describe, en efecto, la identificación de genes de
levadura que presentan esta actividad, los genes GCY1 e YPR1, y
muestra que estos genes pueden modificarse de manera específica,
principalmente mediante técnicas de recombinación genética, sin
perjudicar la capacidad de crecimiento o de supervivencia de las
células, ni su facultad de transformar o convertir los compuestos
esteroideos. La invención proporciona así, por primera vez,
procedimientos de síntesis, producción, modificación y/o conversión
de compuestos esteroideos utilizando levaduras ventajosas.
Un objeto de la invención reside, por lo tanto
más particularmente, en la utilización de una cepa (o una célula o
un cultivo) de levadura, caracterizada porque posee una modificación
genética y porque presenta una actividad 20\alphaHSD reducida,
para la producción de compuestos esteroideos. La presente invención
utiliza, más particularmente, una cepa de levadura caracterizada
porque posee:
- -
- una modificación genética del gen GCY1, o
- -
- una modificación genética del gen YPR1, o
- -
- una modificación genética de los genes GCY1 e YPR1.
Más preferiblemente, la o las modificaciones
genéticas presentes en las levaduras de la invención son
modificaciones inactivadoras, es decir, que dan lugar a la pérdida
de actividad del gen y/o de la proteína correspondiente. Un tipo
más particularmente preferido de modificación genética inactivadora
según la invención es una disrupción génica, como se describirá con
detalle en el texto que sigue.
De manera más específica, la invención reside,
por lo tanto, en la utilización de levaduras en las que:
- -
- el gen GCY1 no es funcional, o
- -
- el gen YPR1 no es funcional, o
- -
- los genes GCY1 e YPR1 no son funcionales, para la preparación de compuestos esteroideos.
Dichas levaduras presentan una actividad
20\alphaHSD reducida, incluso indetectable, y son, por lo tanto,
particularmente ventajosas para la producción o la modificación o la
conversión de compuestos esteroideos.
Según un modo de realización preferido de la
invención, las levaduras pertenecen, más preferiblemente, al género
Saccharomyces, principalmente S. cerevisiae. Así, en un modo
de realización más específico, la presente invención reside en
procedimientos o utilizaciones de células (o cepas o cultivos) de
levaduras del género S. cerevisiae que comprenden un gen GCY1
y/o un gen YPR1 no funcional, preferiblemente interrumpido.
Sin embargo, aunque los ejemplos se refieren,
más específicamente, a la levadura Saccharomyces cerevisiae,
se entiende que la enseñanza de la invención no está limitada a este
tipo particular de levaduras y puede extenderse esencialmente a
cualquier levadura que presenta una actividad natural de tipo
20\alphaHSD o que contiene un gen GCY1 o YPR1. En este contexto,
se pueden citar principalmente las levaduras Saccharomyces,
Kluyveromyces (principalmente K. lactis),
Schizosaccharomyces, Hansenula, Pichia (principalmente P.
pastoris), Candida (principalmente C. maltosa), etc.,
cuyo cultivo en fermentadores y modificación genética se han
descrito en la técnica
anterior.
anterior.
Por otra parte, en el sentido de la invención,
se entiende por gen GCY1 el gen GCY1 de S. cerevisiae tal
como se describe en GenBank con la referencia X96740 (Bandlow et
al., Gene 90(1), 1990, 105-114), así como
cualquier variante u homólogo funcional de éste presente en las
células de levadura. De manera similar, el gen YPR1 designa al gen
YPR1 (o YDR368w) de S. cerevisiae tal como se describe en
GenBank con la referencia X80642, así como cualquier variante u
homólogo funcional de éste presente en las células de levadura. La
secuencia de estos genes puede obtenerse igualmente a partir de
otros bancos en los que se describe la secuencia completa del
genoma de la levadura S. cerevisiae (Universidad Stanford,
MIPS, etc.). Los homólogos funcionales pueden identificarse
mediante la investigación de las homologías de secuencias o mediante
la clonación por hibridación, utilizando sondas derivadas de los
genes GCY1 e YPR1 de S. cerevisiae, según las técnicas
clásicas de biología
molecular.
molecular.
Como se ha indicado, la presente invención
reside en procedimientos o utilizaciones de levaduras que presentan
una modificación genética de uno o varios genes implicados en la
actividad 20\alphaHSD, principalmente los genes GCY1 y/o YPR1, y
que tienen preferiblemente una actividad 20\alphaHSD reducida,
incluso suprimida.
En el sentido de la invención el término
"modificación genética" designa cualquier alteración del
genoma de una célula, obtenida por cualquier método posible, tal
como el empleo de agentes mutágenos y/o la realización de una
modificación o de modificaciones por vía genética o recombinante.
Preferiblemente, una modificación genética es una modificación de
la secuencia de un gen al menos, que resulta en la modificación de
la actividad del gen, y principalmente en la estimulación o,
preferiblemente, en la inactivación de dicho gen. La inactivación
de un gen, o el carácter no funcional de un gen, puede manifestarse
por la ausencia de la expresión de una proteína, por la expresión
de una forma no funcional de la proteína, debido a mutación o
mutaciones, deleción o deleciones, sustitución o sustituciones,
inserción o inserciones, etc., o además por la expresión de la
proteína a niveles bajos, que no permiten una actividad suficiente.
Por esto, la modificación genética de un gen puede referirse
principalmente a toda o parte de la región que codifica dicho gen o
de una región reguladora de dicho gen (promotor, etc.).
Preferentemente, la modificación genética según
la invención comprende al menos una mutación, sustitución, deleción
y/o inserción de uno o varios pares de bases en la región reguladora
o codificadora del gen considerado. Aún más preferiblemente, se
trata de una modificación por deleción de todo o parte del gen
considerado, que puede estar reemplazado por secuencias extrañas,
según la técnica de disrupción génica (o "reemplazo génico").
Se prefieren las modificaciones genéticas por deleción y/o inserción
para la realización de la presente invención, en la medida en la
que son selectivas del gen considerado y estables en el tiempo. Más
preferiblemente, la modificación genética reside, por lo tanto, en
el reemplazo de una parte al menos del gen considerado por
secuencias extrañas. Esta modificación puede realizarse por técnicas
conocidas que consisten en preparar un gen modificado in
vitro, que puede introducirse en el genoma de las levaduras por
doble recombinación homóloga, como se describe en los ejemplos
(véase igualmente Baudin et al., Nucleic Acids Res. 21 (14)
(1993) 3329).
Así, un objeto preferido de la invención reside
en procedimientos o utilizaciones de levaduras en las que todo o
una parte del gen GCY1 y/o YPR1 se ha reemplazado por secuencias
extrañas (o heterólogas), por ejemplo, por un gen marcador (que
codifica una resistencia a un antibiótico). Más particularmente,
para la disrupción génica, se prepara un ácido nucleico
recombinante in vitro, que comprende una secuencia extraña
elegida bordeada de secuencias homólogas a las regiones contiguas o
no contiguas del gen considerado. La secuencia extraña puede ser,
por ejemplo, un gen marcador, un gen que complementa una auxotrofía,
un bloque de la expresión, etc. Más particularmente, la secuencia
extraña puede ser un gen de selección auxótrofa que complementa una
exigencia nutricional de la cepa de levadura anfitriona, tal como el
gen URA3, el gen LEU2, el gen TRP1, el gen HIS3 o el gen ADE2, por
ejemplo; un gen de selección dominante, tal como un gen de
resistencia a un antibiótico (G418, fleomicina, higromicina B,
etc.); o además un gen informador
(\beta-galactosidasa, etc.). Puede tratarse
igualmente de un bloque interruptor de la expresión, que comprende,
por ejemplo, un terminador transcripcional tal como principalmente
un terminador de levadura elegido entre CYC1, TDH3, TEF1 o PGK. Se
entiende que en el marco de la presente invención, puede utilizarse
cualquier otra secuencia extraña (es decir, que no está
naturalmente presente en esta forma en el gen considerado) que
permita alterar las condiciones de expresión del gen y/o la
estructura misma de la proteína codificada. El ácido nucleico así
preparado se introduce en las levaduras, por las técnicas
convencionales (litio, protoplastos, etc.), lo que da lugar a la
inserción de la secuencia extraña en el genoma de la levadura, en
la secuencia del gen considerado, reemplazando opcionalmente una
región de éste por doble recombinación
homóloga.
homóloga.
Se entiende que en el marco de la presente
invención puede utilizarse cualquier otra técnica de modificación
genética, como, por ejemplo, la mutagénesis dirigida, la utilización
de transposones, etc.
\newpage
Los ejemplos específicos de levaduras que
presentan un gen GCY1 y/o YPR1 inactivado por disrupción génica son
principalmente:
- -
- las células TGY170 (gcy1 ::LEU2): en las células TGY170, una parte del gen GCY1 se ha reemplazado por un ácido nucleico que codifica la proteína LEU2 lo que permite la selección de los recombinantes.
- -
- las células TGY197 (gcy1 :LEU2, ydr368w ::URA3): las células TGY197 contienen, respecto a las células TGY170, una modificación genética adicional que afecta al gen YPR1 (designado igualmente YDR368w), en el que una parte se ha reemplazado por el gen de selección URA3.
- -
- Las células TGY195 (ydr368w ::URA3): las células TGY195 contienen una modificación genética que afecta al gen YPR1 (designado igualmente YDR368W), en el que una parte se ha reemplazado por el gen de selección URA3.
- -
- las células TGY194 (gcy1 ::URA3): en las células TGY194, una parte del gen GCY1 se ha reemplazado por un ácido nucleico que codifica la proteína URA3 lo que permite la selección de los recombinantes.
Dichas células constituyen igualmente un objeto
particular de la invención. Principalmente, la invención se refiere
a cualquier célula (o cepa o cultivo) de levadura que comprende una
modificación genética del (o en el) gen YPR1, principalmente una
deleción y/o una inserción del o en el gen YPR1. La invención se
refiere igualmente a cualquier célula (o cepa o cultivo) de
levadura que comprende una modificación genética de los (o en los)
genes GCY1 e YPR1, principalmente una deleción y/o una inserción de
los o en los genes GCY1 e YPR1. La invención se refiere también a
las preparaciones acelulares derivadas de dichas levaduras.
Las células de la invención o utilizadas en los
procedimientos de la invención presentan ventajosamente una
actividad de tipo 20\alphaHSD reducida, es decir, disminuida un
20% al menos, preferiblemente un 40% al menos, más preferiblemente
un 60% al menos, respecto a la cepa no modificada genéticamente.
Como se muestra en los ejemplos, la invención demuestra que la
inactivación del gen GCY1 en la levadura da lugar a una reducción
del 95% de la actividad de tipo 20\alphaHSD en el sobrenadante de
un homogenado celular. Los resultados obtenidos muestran igualmente
que la doble modificación genética de los genes GCY1 e YPR1 da lugar
a la supresión de la actividad de tipo 20\alphaHSD, que es
indetectable en el sobrenadante de un homogenado celular. Estos
resultados aportan la demostración del papel de estos genes e
ilustran la posibilidad de modificarlos para mejorar las propiedades
de las levaduras para las aplicaciones de producción de derivados
esteroideos.
La presente invención es utilizable para la
producción de compuestos esteroideos, con el objeto de aplicaciones
farmacéuticas variadas. A este respecto, la invención describe
métodos de producción de compuestos esteroideos utilizando las
levaduras de la invención. La solicitud reside igualmente en métodos
mejorados de producción de compuestos esteroideos utilizando
levaduras que tienen una actividad 20\alpha-HSD
reducida. Los métodos de la invención se realizan ventajosamente
poniendo en contacto, in vitro, una población de levaduras
tales como se han descrito anteriormente con un compuesto
esteroideo, seguido de la extracción de los compuestos
sintetizados. El compuesto esteroideo de partida puede ser cualquier
esteroide natural o modificado o de síntesis, principalmente
cualquier compuesto hidroxi-esteroide o precursor,
en particular, el colesterol, la progesterona, la pregnenolona o la
17OH-progesterona. Los procedimientos de la
invención son utilizables para la producción de derivados
esteroideos tales como el 11-desoxicortisol, el
cortisol, la hidrocortisona, etc. o derivados de éstos.
Otros aspectos y ventajas de la presente
invención aparecerán con la lectura de los ejemplos siguientes, que
deben considerarse como ilustrativos y no limitativos.
Figura 1: Análisis SDS-PAGE de
una fracción purificada de la actividad
20\alpha-HSD por cromatografía en
Red120-Agarosa a partir de un homogenado de
levadura. La flecha superior indica la banda cuya secuencia
N-terminal corresponde a GCY1, la flecha inferior,
la correspondiente a la secuencia N-terminal de
YPR1. La línea 1 corresponde al marcador de peso molecular mientras
que la línea 2 corresponde a la fracción purificada de la actividad
20\alphaHSD.
Figura 2: Producción de
4-pregneno-17\alpha,20\alpha-diol-3-ona
por las levaduras S. cerevisiae cultivadas en medio galactosa
(YNB-gal) o glucosa (YPD) en presencia de 0,1 mg/ml
de 17\alphahidroxiprogesterona.
Figura 3: Producción de
4-pregneno-17\alpha,20\alpha-diol-3-ona
por las levaduras S. cerevisiae de tipo salvaje (wt) o mutado
en la secuencia del gen GCY1 (gcy-) cultivadas en medio
galactosa (YNB-gal) o glucosa (YPD) en presencia de
0,1 mg/ml de 17\alphahidroxiprogesterona.
Figura 4: Estructura del plásmido de disrupción
del gen GCY1. El plásmido se lineariza con las enzimas BamHI y
HindIII y se transforma en S. cerevisiae según el método
descrito en el apartado de Materiales y Métodos. La deleción de la
secuencia del gen GCY1 comprende el promotor y 306pb de secuencia
codificadora, incluido el codón de inicio de la traducción.
\newpage
Figura 5: Estructura del plásmido de disrupción
del gen GCY1 (plásmido pTG12010 clón 40). El plásmido se lineariza
con las enzimas EcoRI y SphI y se transforma en S. cerevisiae
según el método descrito en el apartado de Materiales y Métodos. La
deleción de la secuencia proteica de GCY1 comprende los aminoácidos
47 a 268 inclus. pTG12010 clón 36 posee la misma estructura, sin el
sitio ClaI en 5' del gen URA3 pero con un sitio HindIII en 3' del
gen URA3.
Figura 6: Estructura del plásmido de disrupción
del gen YPR1 (YDR368w) (plásmido pTG12011). El plásmido se lineariza
con la enzima XhoI y se transforma en S. cerevisiae según el
método descrito en el apartado de Materiales y Métodos. La deleción
de la secuencia proteica de YPR1 comprende los aminoácidos 5 a 198
inclus.
Productos químicos: La
17\alpha-hidroxiprogesterona se obtuvo de Hoechst
Marion Roussel (Romainville, Francia). El Tergitol Nonidet P40 y el
Tiloxapol provienen de Sigma.
Conversión in vivo de
17\alpha-hidroxiprogesterona: las células de
levadura se cultivaron a 28ºC en medio YPD (10 ml) inoculado a
A_{600} = 0,1 a partir de un precultivo de 24 h. A continuación,
se añaden al cultivo 100 \mul de una disolución de
17\alpha-hidroxiprogesterona (10 mg/ml) en una
mezcla de Tergitol y de etanol (1:1; v:v). A diferentes intervalos
se tomaron alicuotas del medio de cultivo (250 \mul) y los
esteroides se extrajeron con diclorometano. Los esteroides se
separaron en Ultrasphere ODS en presencia de 45% de acetonitrilo
acuoso con un caudal de 1 ml/min, a 45ºC. Estos esteroides se
detectaron a 240 nm.
La cepa E. coli BJ5183 (Hanahan, 1983) se
utilizó para las recombinaciones in vivo y la cepa C600, hsdR
(Hubacek y Glover, 1970) para las reacciones clásicas de
ligación.
Se utilizó la cepa parental de levadura
FY1679-28c (MATa ura3-52
trpl-63 leu2- 1fen1 his3- 200 GAL) (Thierry et
al., 1995). Las cepas TGY170, TGY197, TGY195, TGY194 TGY212,
TGY245 y FY1679-28c/pTG10497 se construyeron como se
describe en los ejemplos.
Se utilizaron los métodos clásicos de biología
molecular y de recombinación in vivo en E. coli o en
la levadura, como se describe en Sambrook et al. (1989) o en
Degryse et al (1995, 1996).
Las levaduras se cultivaron generalmente en
medio mínimo sintético (Sherman, 1991) suplementado con aportes
nutricionales a 100 \mug/ml. Para las transformaciones de S.
cerevisiae, las células se hicieron competentes según la
técnica del acetato de Litio (Ito et al., 1983), después de
crecimiento en medio YPD (Sherman, 1991).
La reducción dependiente de NADPH de la
17\alpha-hidroxiprogesterona en el C20 en
4-pregneno-17\alpha,20\alpha-diol-3-ona
por la levadura S. cerevisiae se ha descrito anteriormente
(Dumas et al., 1994). Esta actividad es similar a la
actividad 20\alpha-HSD mostrada en diferentes
tejidos. Las enzimas caracterizadas a partir de estos tejidos son
monoméricas, con un peso molecular de aproximadamente 35 kDa. Con el
objetivo de identificar la o las enzimas responsables de la
actividad 20\alpha-HSD en la levadura, se han
realizado estudios de homologías con la enzima
20\alpha-HSD de testículo bovino en los bancos de
S. cerevisiae. Estas investigaciones han permitido
identificar 6 productos de genes de levadura que presentan 44 a 32%
de identidad de secuencias de aminoácidos con la enzima de mamífero.
Estos genes se reúnen en la Tabla I.
Con el objetivo de caracterizar mejor las
enzimas implicadas, se ha reconstituido in vitro la actividad
de tipo 20\alpha-HSD de levadura utilizando la
17\alpha-hidroxiprogesterona y el NADPH como
sustratos. En este sistema se han ensayado diferentes preparaciones
derivadas del cultivo de la levadura S. cerevisiae, lo que
ha permitido la localización de la actividad en el sobrenadante
después de centrifugar a 100.000 xg un homogenado celular. Este
resultado indica que la actividad enzimática es soluble. A
continuación, se realizó una purificación parcial de la actividad
de tipo 20\alpha-HSD mediante cromatografía Red
120, lo que ha permitido la obtención de un doblete en la región 35
kDa, después de SDS-PAGE (Fig. 1). La secuenciación
de estas bandas ha mostrado que estaban compuestas principalmente
por el producto de los genes GCY1 e YPR1. Estas dos enzimas forman
parte de los homólogos bovinos de 20\alpha-HSD
listados en la Tabla I. La secuencia completa de los genes GCY1 e
YPR1 es accesible, por ejemplo, en GenBank con las referencias
X96740 y X80642, respectivamente.
\newpage
Es interesante indicar que GCY1 se ha descrito
como codificador de una
aldo-ceto-reductasa (AKR) cuya
expresión se incrementa significativamente en presencia de
galactosa (Magdolen et al., Gene 90(1), 1990, 105).
Las enzimas AKR tienen una gran especificidad de sustrato.
Metabolizan diferentes sustratos, incluyendo los aldehídos
alifáticos, monosacáridos, prostaglandinas y esteroides. Así, GCY1
constituye un buen candidato potencial y hemos decidido verificar
si esta enzima podía estar implicada en la generación de
4-pregneno-17\alpha-20\alpha-diol-3-ona
a partir de 17\alpha-hidroxiprogesterona.
Los experimentos realizados han permitido
mostrar que la actividad 20\alpha-HSD es inducible
por la galactosa en la levadura. Así, la conversión in vivo
de 17\alpha-hidroxiprogesterona en
4-pregneno-17\alpha-20a-diol-3-ona
se ha determinado en cultivos de levaduras cultivadas en diferentes
fuentes de carbono. El retraso observado cuando las levaduras se
cultivan en glucosa no se observa en presencia de galactosa (Fig.
2). Esta observación concuerda con una represión por la glucosa del
gen que codifica 20\alpha-HSD. La conversión
comienza después de 16 h cuando se agota la glucosa. La conversión
de 17\alpha-hidroxiprogesterona en
4-pregneno-17\alpha-20\alpha-diol-3-ona
es aproximadamente 4 veces mayor después de 48 h cuando las
levaduras se cultivan en presencia de galactosa. Estos resultados
se han confirmado, por otra parte, in vitro midiendo la
actividad 20\alpha-HSD en un extracto acelular
obtenido a partir de levaduras cultivadas en medio galactosa o
glucosa. Las actividades específicas 20\alpha-HSD
fueron respectivamente de 0,05 y de 0,75 \muM/min/mg en los
homogenados de células cultivadas en medio con glucosa o
galactosa.
Estos resultados muestran, por lo tanto, (i) que
la actividad 20\alpha-HSD está producida por el
producto de los genes GCY1 e YPR1 de levadura, (ii) que estas
enzimas son solubles, y (iii) que su actividad puede aumentarse en
presencia de galactosa y reprimirse en presencia de glucosa.
Con el objetivo de confirmar que Gcylp era
responsable de la actividad 20\alpha-HSD, se
delecionó el gen correspondiente de ORF YOR120w ("Knock Out")
del genoma de la levadura. Los resultados obtenidos muestran que la
cepa obtenida presenta una actividad 20\alpha-HSD
fuertemente reducida respecto a la cepa salvaje. Por otra parte,
también se construyeron y ensayaron para su actividad cepas en las
que el gen YPR1 solo o en combinación con GCY1 está delecionado,
como se describe a continuación.
Las levaduras deficientes en la actividad GCY1
y/o YPR1 se prepararon por disrupción génica. Mas
particularmente:
- La cepa TGY170 (FY1679-28c, gcy1::LEU2) se construyó por disrupción del gen GCY1 mediante el plásmido Pgcy1::LEU2.
- La cepa TGY197 (FY1679-28c, gcy1::LEU2 ydr368w::URA3) se generó por disrupción adicional del gen YDR368w (YPR1), según el método descrito para ATF2 (Cauet et al., 1999) mediante el plásmido pTG12011.
- Las cepas TGY195 se generaron por disrupción del gen YDR368w (YPR1), según el método descrito para ATF2 (Cauet et al., 1999) mediante el plásmido pTG12011.
- Las cepas TGY194 (FY1679-28c, gcyl::URA3) se construyeron por disrupción del gen GCY1 mediante el plásmido pTG12010.
- Las cepas FY1679-28c/pTG10497 y TGY245 se construyeron mediante los plásmidos pTG10497 y pTG12045.
Los plásmidos siguientes se utilizaron para
interrumpir los genes GCY1 e YPR1: pgcy1::LEU2, pTG12010, pTG12011
(Figuras 4-6), pTG12086 y pTG12045. El plásmido
monocopia pTG10497 se utilizó para la expresión de P450c21.
El plásmido pgcy1 : :LEU2, descrito por Magdolen
et al Gene, 90 (1990) 105-114, contiene el
gen GCY1 cuya secuencia codificadora y el promotor se han
interrumpido con la secuencia que codifica el gen LEU2. Más
precisamente, el promotor y la parte codificadora correspondiente
al fragmento de restricción EcoRV, HincII se han reemplazado por el
fragmento HpaI de 2,17 Kbases del gen LEU2. Así, se delecionó del
gen GCY1 su promotor y 306 pares de bases de su secuencia
codificadora.
El plásmido pgcyl : : LEU2 se linearizó con las
enzimas de restricción HindIII y BamHI, el fragmento HindIII BamHI
de 3,1 kb que contiene el gen interrumpido se preparó para
transformar la cepa Fy 1679-28c utilizando el
protocolo descrito por Gietz RD et al (Yeast 1995 Abr 15;
11(4):355-60 Studies on the transformation of
intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG
procedure). Las colonias se seleccionaron en medio desprovisto de
leucina. Las colonias positivas en este cribado se cultivan en medio
rico para hacer una bioconversión de 17OH progesterona como se
describe en Dumas et al (Eur J Biochem 1996 Jun
1;238(2):495-504 11
beta-hydroxylase activity in recombinant yeast
mitochondria. In vivo conversion of
11-deoxycortisol to hydrocortisone). La
concentración del sustrato 17OH progesterona es 100 mg/l, la fuente
de carbono es galactosa y la densidad óptica de partida es 0,1. El
volumen del cultivo es 10 ml, la incubación es 48 horas a 30ºC.
Después de 48 horas de incubación, los clones positivos se evalúan
por extracción de un ml de medio (con las células) con 2 ml de
diclorometano y análisis de la fase orgánica mediante cromatografía
de alta presión en fase reversa como se ha descrito anteriormente
(Dumas et al 1996). Los cromatogramas se analizan para la
presencia de 17,20 dihidro progesterona en comparación con el
producto purificado. Durante esta incubación, aparece en el medio de
cultivo de la cepa salvaje (no transformada por el fragmento de
disrupción) una cantidad del orden de 4 mg/l de 17,20 dihidro
progesterona, es decir 4% del sustrato, mientras que en determinados
transformantes la presencia de 17, 20 dihidroprogesterona no es
mayor de 1 mg/l. Se selecciona una cepa TGY170 que convierte a un
nivel bajo la 17OH progesterona en 17,20 OH progesterona y que
presenta un crecimiento idéntico a la cepa salvaje.
Se construyeron dos plásmidos nuevos pTG12010 y
pTG12011 para permitir la disrupción de los genes GCY1 e YPR1
asociados al marcador de selección URA3.
El plásmido pTG 12010 se construyó sobre una
base del plásmido pUC19 (Gene
1985;33(1):103-19 Improved M13 phage cloning
vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and
pUC19 vectors. Yanisch-Perron C, Vieira J, Messing
J) mientras que el plásmido pTG12011 se construyó sobre una base del
plásmido pPOLYIII (Lathe,R., Vilotte, J.-L. y Clark,J.A. Plasmid
and bacteriophage vectors for excision of intact inserts JOURNAL
Gene 57, 193-201 (1987)).
La construcción de la disrupción del gen GCY1
por el gen URA3 en el plásmido pUC19 para dar lugar a pTG12010 se
obtuvo por cuatro amplificaciones por PCR sucesivas. Por una parte,
se realizaron tres PCR independientes para obtener la parte 5' del
gen GCY1 (PCR1), el gen URA3 funcional bordeado por las secuencias
GCY1 (PCR2), la parte 3' del gen GCY1(PCR3). Las partes 5' y
3' del gen GCY1 se obtuvieron mediante las parejas OTG11285,
OTG11286 y OTG11287, OTG11289, en una matriz de ADN genómico de la
cepa Fy 1679-28c. La secuencia de los
oligonucleótidos es la siguiente: OTG11285:
GATTCGGTAATCTCCGAACAggtaccAATTATATCAGTTATTACCCGGGA (SEQ ID NO 1);
OTG11286: AGCCATCTTTCAAAGCGGTT (SEQ ID NO: 2); OTG11287:
CCGATCGAATCAAAAC
GAACAG (SEQ ID NO: 3); OTG11289: TCTAATCAGCTAGTAAGAAC (SEQ ID NO: 4).
GAACAG (SEQ ID NO: 3); OTG11289: TCTAATCAGCTAGTAAGAAC (SEQ ID NO: 4).
El gen URA3 flanqueado por las secuencias GCY1
(de tal forma que se obtiene una deleción de una parte de la
secuencia codificadora del gen GCY1) se amplifica mediante los
oligonucleótidos OTG 11305
(aaccgctttgaaagatggc
tATCGATTTTCAATTCAATTCATCATTTTTTTTTTATTCTT TTTTTTG, (SEQ ID NO: 5) y OTG11306 (ctgttcgtttt
gattcgatcgggAAGCTTGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAACTC (SEQ ID NO: 6) a partir de una matriz del plásmido pTG10054 linearizado (Degryse et al In vivo cloning by homologous recombination in yeast using a two-plasmid-based system. Yeast. 1995 Jun 15;11(7):629-40). Las condiciones del tampón y de concentración en la matriz y de los cebadores para la amplificación están descritas por el productor o fabricante de la enzima TAQ ADN polimerasa y, en particular, para la enzima elongasa desarrollada por Life Technologies. Los ciclos de temperaturas son los siguientes: un primer ciclo de 6'30 para desnaturalizar el cebador y la matriz y 30 ciclos de 30s a 93ºC, 2 mn a 54ºC y 3 mn a 68ºC, el último ciclo es de 5 mn a 72ºC. Los productos PCR1, PCR2 y PCR3 se mezclan de forma equimolecular y se amplifican de nuevo mediante los oligonucleótidos OTG 11285 y OTG11289 (Véase más arriba). El producto final PCR4 de un tamaño de 1,9 Kbases se subclona entre los sitios de restricción KpnI y BamHI del plásmido pUC19 para obtener el plásmido pTG12010. La estructura del plásmido se verificó mediante el perfil de restricción y secuenciación nucleotídica de los extremos. La clonación de pTG12010 ha permitido obtener de hecho dos versiones de este plásmido, la versión pTG12010#40 (pTG12010 clón 40) y pTG12010#36 (pTG12010 clón 36). La voluntad inicial era obtener el gen GCY1 interrumpido por el gen URA3 bordeado por los sitios de ClaI y HindIII respectivamente en 5' y en 3' del gen. De hecho, se obtuvieron dos plásmidos diferentes, PTG12010#36 y pTG12010#40. Estos dos plásmidos difieren únicamente por la presencia o ausencia de sitios ClaI y HindIII en los extremos del gen URA3. El plásmido pTG12010#40 posee un sito de restricción HindIII en el extremo 3' del gen URA3 pero no posee un sitio ClaI en 5'. El plásmido pTG12010#36 no posee el sitio HindIII en el extremo 3' pero posee un sitio ClaI en el extremo 5' del gen.
tATCGATTTTCAATTCAATTCATCATTTTTTTTTTATTCTT TTTTTTG, (SEQ ID NO: 5) y OTG11306 (ctgttcgtttt
gattcgatcgggAAGCTTGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAACTC (SEQ ID NO: 6) a partir de una matriz del plásmido pTG10054 linearizado (Degryse et al In vivo cloning by homologous recombination in yeast using a two-plasmid-based system. Yeast. 1995 Jun 15;11(7):629-40). Las condiciones del tampón y de concentración en la matriz y de los cebadores para la amplificación están descritas por el productor o fabricante de la enzima TAQ ADN polimerasa y, en particular, para la enzima elongasa desarrollada por Life Technologies. Los ciclos de temperaturas son los siguientes: un primer ciclo de 6'30 para desnaturalizar el cebador y la matriz y 30 ciclos de 30s a 93ºC, 2 mn a 54ºC y 3 mn a 68ºC, el último ciclo es de 5 mn a 72ºC. Los productos PCR1, PCR2 y PCR3 se mezclan de forma equimolecular y se amplifican de nuevo mediante los oligonucleótidos OTG 11285 y OTG11289 (Véase más arriba). El producto final PCR4 de un tamaño de 1,9 Kbases se subclona entre los sitios de restricción KpnI y BamHI del plásmido pUC19 para obtener el plásmido pTG12010. La estructura del plásmido se verificó mediante el perfil de restricción y secuenciación nucleotídica de los extremos. La clonación de pTG12010 ha permitido obtener de hecho dos versiones de este plásmido, la versión pTG12010#40 (pTG12010 clón 40) y pTG12010#36 (pTG12010 clón 36). La voluntad inicial era obtener el gen GCY1 interrumpido por el gen URA3 bordeado por los sitios de ClaI y HindIII respectivamente en 5' y en 3' del gen. De hecho, se obtuvieron dos plásmidos diferentes, PTG12010#36 y pTG12010#40. Estos dos plásmidos difieren únicamente por la presencia o ausencia de sitios ClaI y HindIII en los extremos del gen URA3. El plásmido pTG12010#40 posee un sito de restricción HindIII en el extremo 3' del gen URA3 pero no posee un sitio ClaI en 5'. El plásmido pTG12010#36 no posee el sitio HindIII en el extremo 3' pero posee un sitio ClaI en el extremo 5' del gen.
Esta propiedad se utiliza para obtener el
plásmido que posee el gen URA3 bordeado por los sitios HindIII y
ClaI interrumpiendo la secuencia codificadora de GCY1.
El plásmido pTG12036 se construyó en 4 etapas a
partir de pTG10802. El plásmido pTG10801 (que es el origen del
plásmido pTG10802) es un plásmido de tipo pUC en el que se ha
insertado una serie de sitios de restricción entre los sitios XhoI
y XhoI. Esta serie de sitios comprende los sitios HindIII, SnabI,
ClaI y SpeI. Entre los sitos HindIII y ClaI, el casete HindIII ClaI
de pTG10470 (como se describe más adelante) que comprende el
promotor TEF1, el ADNc P450c21 humano y el terminador PGK se insertó
entre los sitos HindIII y ClaI de pTG10801 para proporcionar
pTG10802. Este plásmido se digirió con XhoI y, por lo tanto, el
casete introducido se deleciona para introducir un fragmento de PCR
bordeado por sitios XhoI. Este fragmento de 2,5 kb proviene de la
amplificación por la pareja de oligonucleótidos OTG11844.
(tttgctcgaggttacagaagggc, SEQ ID NO: 13) y OTG11845
(gattctcgagcaattggctgacta, SEQ ID NO: 14) en el plásmido pTG12010
(#40) para obtener un fragmento bordeado por XhoI que contiene el
gen GCY1 interrumpido por el gen URA3 bordeado en 5' por un sitio de
restricción ClaI. Este fragmento se clonó entre los sitos XhoI del
plásmido pTG10802 para obtener el plásmido pTG12035. Con el
objetivo de introducir el sitio HindIII ausente, se utilizó el
plásmido pTG12010 (#36). Este plásmido es esencialmente idéntico a
pTG12010 (#40) pero posee un sitio HindIII en 3' del gen URA3 en el
límite con el gen GCY1 y no posee el sitio ClaI en 5' del gen URA3
en la unión con el gen GCY1. Se procede a una recombinación in
vivo en E. coli, entre el fragmento NcoI BamHI de 2,2 kb
de pTG12010 (#36) (que contiene de 5' hacia 3' un fragmento del gen
URA3 y en 3' un fragmento del gen GCY1) y una parte del plásmido
pTG12035, es decir, el fragmento grande StuI, AflII de 4,45 kb. El
plásmido obtenido pTG12036 posee el gen GCY1 interrumpido por el gen
URA3 bordeado por sitios ClaI y HindIII respectivamente en 5' y
3'.
Este fragmento se reemplaza por el casete de
expresión de P450c21 producido por el fragmento 2,33 Kb ClaI,
HindIII del plásmido pTG10469 (véase más abajo) para obtener el
plásmido pTG12036.
Para la sobreexpresión de esta proteína en la
levadura se utilizaron dos tipos de promotores, TEF1
("Transcription elongation factor 1") y TDH3
("Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase 3"). En todos los casos, el terminador de la
transcripción es el terminador PGK.
En estos plásmidos, el fragmento SalI, MluI
lleva el ADNc de P450c21 humana.
El plásmido pTG10289 se obtuvo por modificación
de pMAc21 (Expression and functional study of
wild-type and mutant human cytochrome P450c21 in
Saccharomyces cerevisiae. Wu DA, Hu MC, Chung BC DNA Cell
Biol 1991 Abr; 10(3): 201-9)) digestión
KpnI, MluI e introducción del oligonucleótido OTG5868. El ADNc de
este plásmido proviene de la American Type Culture Collection con
el nombre pc21/3c. Este es el fragmento EcoRI-BamHI
de 1,6 Kb que ha servido de base para la construcción de los
diferentes plásmidos. Las modificaciones aportadas se describen en
el artículo anterior y en el artículo (Expression of human
21-hydroxylase (P450c21) in bacterial and mammalian
cells: A system to characterize normal and mutant enzyme
Meng-Chun Hu y Bon-chu Chung DNA and
Cell Biology 1991 Abr; 10 (3) 201-209).
En esta maniobra, la parte no codificadora de
P450c21 del plásmido pMAc21 que contiene el casete de expresión de
P450c21 se eliminó así como el sitio KpnI que estaba presente. El
plásmido pTG10292 se obtuvo por transferencia del ADNc c21 humano
(fragmento SalI, MluI) del plásmido pTG10289 en el plásmido pTG10031
mediante los sitios SalI y MluI. El plásmido pTG10475 se obtuvo por
PCR y recombinación. En efecto, a partir del plásmido pTG10292, se
amplificó un fragmento del ADNc P450c21 humano que representa
aproximadamente 250 nucleótidos mediante los oligonucleótidos
OTG7410 (GGAATTCCGTCGACAAAAATGCTGCTCCTGGGCCTGCTGC, SEQ ID NO: 15) y
OTG5927 (CCTCAATGGTCCTCTTGGAGTTCAGCACC, SEQ ID NO: 16). Este
fragmento representa la secuencia codificadora de P450c21 humana
bordeada por un sitio SalI y por la secuencia AAAA, como se
describe en el oligonucleótido OTG7410. Este fragmento se digirió
con SalI y se ligó en el fragmento lineal de pTG10292 digerido con
SalI y se realizó un experimento de recombinación en la cepa
BJ5183. El plásmido obtenido pTG10475 lleva un ADNc de P450c21 con
una secuencia codificadora idéntica a la del ADNc natural
contrariamente al plásmido pMAc21 en un fragmento que es compatible
con los vectores que utilizamos en el laboratorio, es decir, un
fragmento bordeado por los sitios de restricción SalI y MluI. Este
fragmento posee el entorno siguiente alrededor del codón ATG de
inicio de la traducción GTCGACAAAAATGCTGCTCCTGGGCCTGCTGC (SEQ ID
NO: 17). A partir de este plásmido, se transfirió el fragmento SalI,
MluI que lleva el ADNc de P450c21 humana al plásmido pTG10158
(Degryse et al 1996) por clonación clásica para proporcionar
el plásmido pTG10472. Este mismo fragmento SalI MluI del plásmido
pTG10472 se transfirió por recombinación al plásmido pTG 10085
(Degryse et al 1996) para proporcionar el plásmido pTG 10469.
Este mismo fragmento que lleva el ADNc P450c21 en un fragmento de
restricción SalI y MluI se transfirió al plásmido pTG10092 para
proporcionar el plásmido pTG10470 (Degryse et al 1996). Este
plásmido lleva, por lo tanto, el ADNc de P450c21 humana bajo el
control del promotor TEF1 y de un terminador PGK con un marcador de
selección URA3-d con un entorno del codón de inicio
ATG, como se ha descrito anteriormente.
Este plásmido sirve para la integración de un
casete de expresión para P450c21 así como para la disrupción del gen
GCY1 al mismo tiempo.
Este plásmido se construyó a partir del plásmido
pTG12036 y del plásmido pTG10614.
Este último plásmido se construyó a partir de
pTG10212 (Degryse et al Yeast 11: 629-640
(1995)) que es un plásmido de expresión de levadura basado en un
promotor TDH3, un terminador PGK y un marcador de selección
URA3-d.
Por recombinación homóloga en E. coli, el
marcador de selección se reemplaza por el marcador de selección del
plásmido pTG10054 (Degryse et al 1995), para hacer esto el
fragmento MluI, FspI de pTG10054 de 2,1 kb que contiene el marcador
URA3 flanqueado por las secuencias de recombinación se recombina con
el fragmento grande HindIII de pTG10212 para proporcionar el
plásmido pTG10610 que posee las mismas características que pTG10212
(Degryse et al 1995) con un marcador URA3 en la misma
orientación que pTG10054. El fragmento SalI MluI que lleva el ADNc
del citocromo P450 c21 humano del plásmido pTG10472 (véase más
arriba) se transfiere al plásmido pTG10610 para proporcionar el
plásmido pTG10614. El fragmento ClaI HindIII de este plásmido que
contiene de 5' hacia 3', el promotor TDH3, el ADNc de P450c21 humana
bordeado por sitios SalI y MluI y el terminador PGK se transfiere
al plásmido pTG12036 para proporcionar el plásmido pTG12086 que
contiene, por lo tanto, la secuencia del gen GCY1 interrumpida por
el casete de expresión TDH3 del citocromo P450c21 humano.
El sitio único SphI del plásmido pPolyIII se
destruye por inserción de la pareja de oligonucleótidos
complementarios OTG11975 (AAATCGATAACATG, SEQ ID NO: 18) y OTG
11976 (TTATCGATTTCATG, SEQ ID NO: 19). El sitio SphI de pPOLYIII se
destruye y se reemplaza por un sitio ClaI para proporcionar el
plásmido pTG12040. En el plásmido pTG12040 entre los sitos únicos
ClaI y EcoRI se introduce un fragmento de ADN genómico ClaI EcoRI
correspondiente a la parte 3' de 0,7 kb del gen YPR1 obtenido por
amplificación con los oligonucleótidos OTG11981
(ATTGATATCGATAAAAAGCACGGCGTTGAG, SEQ ID NO: 20) y OTG11982
(TCTCGGAATTCAGGTACTG
CAGCCAG, SEQ ID NO: 21) para proporcionar el plásmido pTG12041. En este plásmido pTG12041 de 2,84 kb, la parte 5' del gen YPR1 (0,66 kb) amplificada con los oligonucleótidos OTG11314 (tacgctcgagACGTTGGTGTCATT
GATATTCA, SEQ ID NO: 22) y OTG11980 (CAACTAAGCTTCATTCAAATAGATAGCCGC, SEQ ID NO: 23) a partir de ADN genómico de levadura salvaje se clona en forma de un fragmento XhoI HindIII entre los sitios SalI y HindIII del plásmido pTG12041. Se obtiene el plásmido pTG12042 de 3,5 kb. Este plásmido lleva el gen YPR1 interrumpido por los sitios ClaI y HindIII. Entre estos sitios se clona el casete de expresión del citocromo P450c21 en forma de un fragmento ClaI HindIII de 2,33 kb que proviene del plásmido pTG10469. Se obtiene así el plásmido pTG12045.
CAGCCAG, SEQ ID NO: 21) para proporcionar el plásmido pTG12041. En este plásmido pTG12041 de 2,84 kb, la parte 5' del gen YPR1 (0,66 kb) amplificada con los oligonucleótidos OTG11314 (tacgctcgagACGTTGGTGTCATT
GATATTCA, SEQ ID NO: 22) y OTG11980 (CAACTAAGCTTCATTCAAATAGATAGCCGC, SEQ ID NO: 23) a partir de ADN genómico de levadura salvaje se clona en forma de un fragmento XhoI HindIII entre los sitios SalI y HindIII del plásmido pTG12041. Se obtiene el plásmido pTG12042 de 3,5 kb. Este plásmido lleva el gen YPR1 interrumpido por los sitios ClaI y HindIII. Entre estos sitios se clona el casete de expresión del citocromo P450c21 en forma de un fragmento ClaI HindIII de 2,33 kb que proviene del plásmido pTG10469. Se obtiene así el plásmido pTG12045.
Este plásmido es un plásmido de expresión con un
número de copias bajo (de tipo ARS CEN), que contiene un casete de
expresión para el citocromo P450c21 humano que se encuentra bajo el
control del promotor TDH3 y del terminador PGK. Este plásmido se
construyó a partir del plásmido pTG10434 que contiene el marcador de
selección URA3 así como el promotor TEF1, el terminador PGK así
como un origen de replicación en la levadura de tipo ARSH4/CEN6
(Degryse et al 1995).
Este plásmido se modificó para contener un
marcador LEU2 y el promotor TDH3 en lugar de los marcadores URA3 y
del promotor TEF1, respectivamente. Para hacer esto, el fragmento
SpeI, MluI que contiene el marcador LEU2 bordeado por los
fragmentos de recombinación que son el terminador PGK y un fragmento
del origen de replicación, se clona por recombinación en lugar de
la región URA3 del plásmido pTG10434 digerido con HindIII para
obtener el plásmido pTG10466. En este plásmido pTG10466, el
promotor TEF1 se reemplaza por el promotor TDH3 recombinando en
E. coli el fragmento HindIII-EcoRI de
pTG10212 (Degryse et al 1995) (que contiene el origen de
replicación de E. coli así como el promotor y el terminador
TDH3 y PGK respectivamente) con el fragmento MluI FspI de pTG10466
que contiene el marcador LEU2 y el origen de replicación ARSCEN
bordeados por las secuencias de recombinación; se obtiene así el
plásmido pTG10612. Entre los sitios SalI y MluI de este plásmido, se
sitúa el casete de expresión TDH3 : :citocromo P450c21 humano y el
terminador para proporcionar el plásmido pTG10497.
Para obtener la cepa desprovista de actividad
GCY1, la cepa FY 167928c se transforma con el plásmido pTG121010
linearizado con las enzimas SphI y EcoRI según el método del acetato
de litio descrito anteriormente. Los clones transformados se
seleccionan en un medio desprovisto de uracilo y se criban por
amplificación en colonia mediante las parejas de oligonucleótidos
OTG11285, OTG11289 y OTG11285, OTG11306 utilizando como matriz un
extracto o una preparación de ADN genómico de levadura según las
condiciones descritas anteriormente. Las colonias que muestran los
productos ADN de PCR del tamaño esperado respectivamente 1,9 Kb y
1,4 Kb se cultivan en medio rico para hacer una bioconversión de
17OH progesterona como se describe en Dumas et al (Eur J
Biochem 1996 Jun 1;238(2):495-504 11
beta-hydroxylase activity in recombinant yeast
mitochondria. In vivo conversion of
11-deoxycortisol to hydrocortisone). La
concentración de sustrato es 100 mg/l, la fuente de carbono es la
galactosa y la densidad óptica de partida es 0,1. El volumen del
cultivo es 10 ml, la incubación es 24 horas a 30ºC. Después de 24
horas de incubación, los clones positivos se evalúan por extracción
de un ml de medio (con las células) con 2 ml de diclorometano y
análisis de la fase orgánica mediante cromatografía de alta presión
en fase reversa como se ha descrito anteriormente (Dumas et
al 1996). Las cepas TGY194 #10 y TGY194#11 están desprovistas
de actividad 20 ceto reductasa sobre la 17OH progesterona y
proporcionan una señal positiva en PCR.
La construcción de la interrupción del gen YPR1
(YDR368w) por el gen URA3 en el plásmido pPOLYIII para dar lugar a
pTG12011 se obtuvo mediante 4 PCR sucesivas. Por una parte, se
realizaron tres PCR independientes para obtener la parte 5' del gen
YPR1 (PCR 5), el gen URA3 funcional bordeado por las secuencias YPR1
(PCR 6), la parte 3' del gen YPR1 (PCR 7). El ADN de PCR5 se obtuvo
por amplificación sobre una matriz de ADN genómico con los
oligonucleótidos OTG11314 (tacgctcgagACGTTGGTGTCATTGATATTCA, (SEQ ID
NO: 7) y OTG11315 (CTTCATTCAAATAGATAGCCG, (SEQ ID NO: 8), así mismo
el ADN de PCR7 se obtiene por amplificación mediante los
oligonucleótidos OTG11316 (TATGGCTAAAAAGCACGGCGTT, (SEQ ID NO: 9) y
OTG11317 (cgatctcgagTTTCTCGTTGTTCAGGTACTG, (SEQ ID NO: 10) sobre la
misma matriz. El gen URA3 flanqueado por la región YPR1 5' y 3' se
amplifica mediante los oligonucleótidos OTG11463
(CGGCTATCTATTTGAATGAAGatcgattttcaattcaattcatcattttttttttattct
tttttttg, (SEQ ID NO: 11) y OTG11464
(AACGCCGTGCTTTTTAGCCATAAGCTTgggtaataactgatataattaaattgaactc, (SEQ ID
NO: 12) sobre una matriz pTG10054 linearizado como se ha descrito
anteriormente. Los productos de las PCR, PCR6 y PCR7 se mezclaron de
forma equimolecular y se amplificaron por PCR mediante los
oligonucleótidos OTGI1314 y OTG11317 para obtener un producto de
PCR8 de 1,X kb como se ha descrito anteriormente. Este producto
PCR8 se digirió con la enzima XhoI y se subclonó en el plásmido
pPOLYIII digerido con XhoI. La orientación de la inserción en el
plásmido pPOLYIII se determinó por digestión con las enzimas NcoI y
EcoRI.
Curiosamente, se observa la ausencia de un sitio
ClaI y de un sitio HindIII respectivamente para el plásmido
pTG12010 y pTG12011. Las uniones de clonación se verificaron por
secuenciación nucleotídica.
El plásmido pTG12011 se digiere con la enzima
XhoI y el producto de la digestión se utiliza para transformar la
cepa Fy 1679-28c utilizando el método del cloruro de
litio citado anteriormente. Los transformantes se seleccionan en un
medio desprovisto de uracilo. Los transformantes se analizan por
amplificación por PCR utilizando los oligonucleótidos que han
servido para la construcción del plásmido pTG12011. Los clones
positivos en este ensayo se criban por el método de bioconversión
de 17OH progesterona descrito más arriba en presencia de glucosa
como fuente de carbono. Se selecciona un clón TGY195#4 para nuevas
caracterizaciones.
Se selecciona un clón TGY195#4 que presenta una
actividad 20 ceto reductasa reducida en estas condiciones para una
nueva transformación mediante el plásmido pgcy1 : :LEU2 como se ha
descrito anteriormente para la cepa Fy1679-28c. Los
clones capaces de crecer en ausencia de Leucina se seleccionan para
una nueva bioconversión sobre la 170H progesterona como se ha
descrito anteriormente en presencia de glucosa o de galactosa. Se
selecciona un clón TGY197#a que presenta una actividad reducida en
las dos condiciones de bioconversión. Así, la actividad 20 ceto
reductasa que en un principio era 12% (a 100 mg/l de sustrato) se
reduce a 0,2% aproximadamente, es decir una reducción de más de 60
veces.
La cepa TGY245 se construye a partir de la cepa
TGY195#4. A partir de la cepa TGY195#4, se obtiene en primer lugar
la cepa TGY212#1 y después la cepa TGY243#1 y finalmente la cepa
TGY245.
La cepa TGY195#4 se transforma a la vez con el
plásmido YRP7 (1 \mug) y 5 \mug del plásmido pTG12045 digerido
con NotI. Las cepas transformadas se seleccionan en un medio
desprovisto de triptófano. Las colonias (678 colonias) se
subcultivan en un medio que contiene triptófano (para eliminar el
plásmido YRP7) y en un medio que contiene triptófano y 5 fluoro
orotato (5FO) para seleccionar las colonias que han perdido el gen
URA3 que interrumpe el gen GCY1. En este cribado se selecciona una
colonia, TGY212#1. Esta colonia se somete a un experimento de
bioconversión como se ha descrito anteriormente con 100 \mug/ml de
sustrato 17OH progesterona, la cepa se crece en un medio mínimo
complementado con los aminoácidos necesarios y uracilo. Esta cepa es
capaz de convertir la 17OH progesterona en
11-desoxicortisol con una eficacia del orden del 47%
en 24 horas con una producción baja de 4 pregneno
17\alpha-20\alpha-diol-3ona
en estas condiciones (< 0,5%). En determinadas condiciones
(medio rico definido de tipo Kappeli con galactosa como fuente de
carbono y comienzo del cultivo a alta densidad: DO 600 nm=5), la
capacidad de reducción de la cetona se aumenta para llegar al 11%
del sustrato de partida con una capacidad de bioconversión reducida
al 1,5% de sustrato de partida. En estas condiciones, la presencia
probable del gen GCY1 afecta negativamente la bioconversión de la
170H progesterona. Por lo tanto, decidimos interrumpir el gen GCY1
para impedir su actividad.
Para hacer esto, la cepa TGY212#1 se transformó
con 3 \mug del plásmido pTG12010#36 linearizado con las enzimas
de restricción SphI y EcoRI. Se seleccionaron veintisiete
transformantes en un medio mínimo complementado para los
auxotrofías de TGY212#1 pero que no contiene uracilo. Estas colonias
se sometieron a ensayos de bioconversión en un medio mínimo
complementado con galactosa como fuente de carbono porque ésta es un
inductor conocido de GCY1. Todos los clones TGY243 presentaban una
capacidad de convertir la 17OH progesterona en
11-desoxicortisol sin producir sin embargo
cantidades detectables de 4 pregneno
17\alpha,20\alpha-diol-3ona. Se
seleccionó un clón TGY243#1 para introducir en lugar del gen URA3
un casete de expresión para P450c21 humana.
Esta cepa TGY243#1 se transforma con el plásmido
YRP7 (2 \mug) y con el plásmido pTG12086 linearizado con la
enzima XhoI (5 \mug). El fragmento transformador de pTG12086
contiene la secuencia que codifica GCY1 interrumpida por un casete
de expresión para P450c21 humana (TDH3 : : ADNcP450c21 humana : :
terminador PGKº). Se seleccionan las colonias que crecen en
ausencia de triptófano. Estas 381 colonias se transfieren a un medio
que contiene triptófano y 5 fluoro orotato. Se ensaya una decena de
colonias en un medio rico de tipo YPG complementado con triptófano,
histidina, leucina y uracilo a una concentración de 50 \mug/ml.
Las cepas se ponen a convertir la 17OH progesterona a una
concentración de 100 \mug/ml a partir de una DO600 nm de 0,1
durante 16 horas.
Entre estos 10 clones, se elige un clón
TGY245#1D siguiendo dos criterios, principalmente la capacidad de
convertir la 17OH progesterona en 11-desoxicortisol
y en segundo lugar la ausencia de formación de 4 pregneno
17\alpha-20\alpha-diol-3ona
lo que indica la interrupción de GCY1.
Propiedad de las cepas deficientes en GCY1:
Los resultados obtenidos muestran que el
"Knock Out" de CGY1 elimina la actividad
20\alpha-HSD inducible por la galactosa. Así, se
ensayó la producción in vivo de
4-pregneno-17\alpha-20\alpha-diol-3-ona
a partir de 17\alpha-hidroxiprogesterona (100
\mug/ml) en cultivos de cepas salvajes y de cepas TGY170
(gcyl-\Delta::LEU2), cultivadas bien en medio
glucosa o bien en medio galactosa (Fig. 3). En el caso de un
cultivo en medio galactosa, se observó una reducción de
aproximadamente el 95% de la producción de
4-pregneno-17\alpha-20\alpha-diol-3-ona
de la cepa mutante respecto a la cepa salvaje. En medio glucosa, la
reducción es más baja, lo que parece indicar que el producto del
gen GCY1 comporta una actividad 20\alpha-HSD
inducible por la galactosa. Cualquiera que sea la fuente de carbono
utilizada, está presente una actividad residual en el mutante
gcyl1-\Delta, que es sensiblemente idéntica.
Habida cuenta del hecho de que se ha encontrado
que Gcylp e Yprlp están asociados a la actividad
20\alpha-HSD (véase más arriba), y que Yprlp es
el homólogo más cercano de Gcylp (65% de identidad de los
aminoácidos), se realizó una disrupción doble de GCY1 y de YPR1 y
se ensayó para su actividad de tipo 20\alpha-HSD.
Los resultados obtenidos muestran que la cepa deficiente para los
dos genes (TGY197) está desprovista esencialmente de actividad
20\alpha-HSD.
Más particularmente, las levaduras TGY197
(gcy1::LEU2, ypr1::URA3) se generaron y se ensayaron in vivo
para su actividad 20\alpha-HSD. Las células se
cultivaron bien con glucosa o con galactosa como fuente de carbono,
en presencia de 100 \mug/ml de
17\alpha-hidroxiprogesterona. Después de 72 h, la
4-pregneno-17\alpha-20\alpha-diol-3-ona
es indetectable en el líquido de fermentación, lo que demuestra que
la inactivación de los dos genes da lugar a una supresión de la
actividad 20\alpha-HSD detectable.
Se ensayó una serie de componentes ya descritos
como sustratos para diferentes clases de reductasas (aldosa-,
aldehído- y carbonil-reductasas) en homogenados
salvajes y en cepas mutantes en diferentes condiciones de cultivo
(Tabla II). Se observó que Gcylp e Ypr1P son las únicas reductasas
de levaduras aldo-ceto que aceptan a la
17\alpha-hidroxiprogesterona como sustrato.
Gcylp parece utilizar todos los sustratos
ensayados ya que, en todos los casos, la inducción por galactosa
incrementa la actividad. En medio glucosa, se observó una actividad
basal para todos los componentes con la excepción de la
17\alpha-hidroxiprogesterona, independientemente
de la presencia de GcylP y de Yprlp. En medio galactosa, se observó
una actividad mayor en las cepas mutantes para los dos aldehídos
ensayados, aunque menos pronunciada que en las cepas salvajes. Esto
indica que una enzima específica para los aldehídos distintos de
GcylP es inducible por la galactosa.
En una publicación reciente sobre la fisiología
de las levaduras bajo estrés osmótico, GCY1 se ha identificado como
reactivo. La secuenciación de un péptido aislado a partir de una
glicerol deshidrogenasa de Aspergillus niger ha mostrado una
homología con dos proteínas de levaduras: Gcylp e Yprlp. La
inducción de GCY1 bajo estrés osmótico (además de su inducción por
galactosa) podría indicar que GCY1 contiene una actividad glicerol
deshidrogenasa, así como se sugiere en Norbeck y Blomberg. Sin
embargo, hasta la fecha no se ha evidenciado una actividad de este
tipo.
La reducción de
17\alpha-hidroxiprogesterona en
4-pregneno-17\alpha-20\alpha-diol-3-ona
en S. cerevisiae se debe principalmente al producto del gen
GCY y, en menor medida, al producto del gen YPR1. Según la
nomenclatura propuesta por Jez et al. (1997), estas enzimas
deberían clasificarse en la sub-familia AKR1C. En
los mamíferos, hemos propuesto las HSD, que pertenecen a la familia
de las AKR, para regular la disponibilidad de las hormonas
esteroideas. El papel fisiológico de estas enzimas en la levadura no
se conoce, ya que no se espera que las levaduras puedan estar en
presencia de esteroides en un entorno natural. Cualquiera que sea el
significado biológico de dicha actividad en la levadura, su
eliminación contribuye a la mejora de la producción de
corticosteroides a partir de levaduras, principalmente de levaduras
genéticamente modificadas según la invención.
Con el objetivo de mostrar que la interrupción
de GCY1 e YPR1 es indispensable para obtener una bioconversión
específica en la levadura S. cerevisiae, hemos comparado la
capacidad de bioconversión de la 17OH-progesterona
de las cepas Fy1679-28c/pTG10497 (Fy/pTG10497),
TGY212#1 y TGY245#2D.
La cepa Fy/pTG10497 contiene los dos genes
salvajes GCY 1 e YPR1 y el plásmido monocopia de tipo ARSCEN
("Autonomously Replicating Sequence Centromere") de expresión
de P450c21 humana. El ADNc de P450c21 humana está bajo el control
del promotor TEF1 en este plásmido.
La cepa TG212#1 contiene una copia del casete de
expresión del gen P450c21 humano (TEF1: : P450c21 humano : :
terminador PGK) integrada en el locus YPR1 y posee una copia salvaje
del gen GCY1.
TGY245#2D no posee copias de los genes YPR1 y
GCY1: en su lugar, una copia del casete TEF1 : :P450c21 humano y
una copia de TDH3 : P450c21 están integradas en cada uno de los
loci, respectivamente.
Estas cepas se cultivaron en un medio mínimo con
un suplemento de aminoácidos durante 48 horas. Las cepas se
resuspenden en medio fresco Kappeli con un suplemento de uracilo,
histidina y triptófano en presencia de 200 mg/l de 170H
progesterona. Después de una incubación de 72 horas, el medio en
presencia de las células de levadura se extrae y se analiza como
anteriormente mediante cromatografía líquida de alta presión en fase
inversa. Se mide la presencia de 17OH progesterona,
11-desoxicortisol y 4 pregneno
17\alpha-20\alpha-diol-3ona.
Los resultados se presentan en la tabla III.
Cada producto se expresa en porcentaje de la suma del conjunto de
los productos.
Según este experimento, parece claramente que la
interrupción de GCY1 e YPR1 disminuye de forma significativa la
cantidad de 4 pregneno
17\alpha-20\alpha-diol-3ona
de 7-11% a un nivel no detectable por nuestras
técnicas (sensibilidad de 0,5 a 1 mg/l).
Amberg et al. (1995),
Yeast 11, 1275-1280.
Cauet et al (1999), Eur.
J. Biochem. 261, 317-324.
Degryse. et al. (1995),
J. Biotech. 39, 181-187.
Degryse, E. (1996), Gene
170, 45-50.
Degryse. et al. (1995),
Yeast 11, 629-640.
Dumas et al (1994),
Cytochrome P450, 8th International Conference, Ed. M. C. Lechner,
John Libbey Eurotext, Paris, p. 527-530.
Dumas et al (1996), Eur.
J. Biochem. 238, 495-504.
Duport et al (1998),
Nat. Biotech. 16, 1-6.
Hanahan, D. (1983) J. Mol.
Biol. 166, 557-580.
Hubacek et al (1970), J.
Mol. Biol. 50, 111-127.
Ito et al (1983), J.
Bact. 153, 163-168.
Miller et al (1988),
Endocrine Revs 9, 295-318.
Sakaki et al (1989),
DNA 8, 409-418.
Sakaki et al (1991),
Pharmacogen. 1, 86-93.
Sambrook et al (1989), Cold
Spring Harbor University Press, 2a edición, Cold Spring Harbor.
Sherman, F. (1991), Methods
Enzymol. 194, 3-21.
Thierry et al (1995),
Yeast 11, 121-135.
WU et al (1991), Saccharomyces
cerevisiae DNA Cell Biol. 10, 201-209.
Base de Datos WPI Sección Ch, Semana 199011
Document Publications Ltd., Londres, GB, AN
1990-079090 (JP 02 031680 A).
Dechsner et al. (1988),
FEBS LETTERS 238, 123-128.
WO99/25865 A (1999) Microbia,
Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<110> AVENTIS PHARMA SA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> LEVADURAS MODIFICADAS Y
UTILIZACIONES, PRINCIPALMENTE PARA LA PRODUCCIÓN DE DERIVADOS
ESTEROIDEOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 17142WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 00FR0010437
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-08-08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Ver. PatentIn 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattcggtaa tctccgaaca ggtaccaatt atatcagtta ttacccggga
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccatcttt caaagcggtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgatcgaat caaaacgaac ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctaatcagc tagtaagaac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgttcgttt tgattcgatc gggaagcttg ggtaataact gatataatta aattgaactc
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacgctcgag acgttggtgt cattgatatt ca
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcattcaa atagatagcc g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatggctaaa aagcacggcg tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatctcgag tttctcgttg ttcaggtact g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacgccgtgc tttttagcca taagcttggg taataactga tataattaaa ttgaactc
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttgctcgag gttacagaag ggc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattctcgag caattggctg acta
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattccgt cgacaaaaat gctgctcctg ggcctgctgc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctcaatggt cctcttggag ttcagcacc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgacaaaa atgctgctcc tgggcctgct gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaatcgataa catg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatcgattt catg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgatatcg ataaaaagca cggcgttgag
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcggaatt caggtactgc agccag
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacgctcgag acgttggtgt cattgatatt ca
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaactaagct tcattcaaat agatagccgc
\hfill30
Claims (19)
1. Cepa de levadura que presenta una actividad
de tipo 20\alpha hidroxiesteroide deshidrogenasa (20\alpha HSD)
reducida caracterizada porque posee:
- -
- una modificación genética inactivadora del gen GCY1, o
- -
- una modificación genética inactivadora del gen YPR1, o
- -
- una modificación genética inactivadora de los genes GCY1 e YPR1,
con la excepción de las cepas gcyD0 y
gcyDD0.
2. Cepa de levadura según la reivindicación 1,
caracterizada porque la modificación génica comprende al
menos una mutación, sustitución, deleción y/o inserción de uno o
varios pares de bases en la región reguladora o codificadora del o
de los genes considerados.
3. Cepa de levadura según la reivindicación 2,
caracterizada porque la modificación genética es una deleción
de todo o parte del o de los genes considerados.
4. Cepa de levadura según la reivindicación 3,
caracterizada porque la deleción de todo o parte del o de los
genes considerados se reemplaza por secuencias extrañas, según la
técnica de disrupción génica.
5. Cepa de levadura según la reivindicación 4,
caracterizada porque la secuencia extraña es un gen de
selección auxótrofa que complementa una exigencia nutricional de la
cepa de levadura anfitriona; un gen de selección dominante, tal como
un gen de resistencia a un antibiótico o un gen informador.
6. Cepa de levadura según la reivindicación 5,
caracterizada porque el gen de selección auxótrofa es el gen
URA3, el gen LEU2, el gen TRP1, el gen HIS3 o el gen ADE2.
7. Cepa de levadura según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque se trata de una
levadura del género Saccharomyces.
8. Cepa de levadura según la reivindicación 7,
caracterizada porque se trata de una levadura
Saccharomyces cerevisiae.
9. Cepa de levadura según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que comprende un gen GCY1 y un gen YPR1
interrumpidos.
10. Procedimiento de producción de derivados
esteroideos a partir de compuestos
hidroxi-esteroides, utilizando una levadura que
presenta una actividad de tipo 20\alpha hidroxiesteroide
deshidrogenasa (20\alphaHSD) reducida y que presenta un gen GCY1
y/o YPR1 no funcional, o una preparación derivada de dicha
levadura.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque la levadura utilizada posee:
- -
- una modificación genética inactivadora del gen GCY1, o
- -
- una modificación genética inactivadora del gen YPR1, o
- -
- una modificación genética inactivadora de los genes GCY1 e YPR1.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 u 11, en el que el
hidroxi-esteroide es la hidroxiprogesterona o sus
precursores.
13. Procedimiento según la reivindicación 12 en
el que el hidroxiesteroide es la
17\alpha-hidroxiprogesterona y el derivado
esteroideo es el 11-desoxicortisol.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque la levadura
presenta un gen GCY1 y un gen YPR1 interrumpidos.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque la levadura es
una levadura del género Saccharomyces.
16. Utilización de una levadura que presenta una
actividad de tipo 20\alpha hidroxiesteroide deshidrogenasa
(20\alphaHSD) reducida y que presenta un gen GCY1 y/o YPR1 no
funcional, o una preparación derivada de dicha levadura, para la
preparación, la producción, la síntesis y/o la modificación de
compuestos esteroideos in vitro o ex vivo.
17. Utilización según la reivindicación 16,
caracterizada porque la levadura presenta:
- -
- una modificación genética inactivadora del gen GCY1, o
- -
- una modificación genética inactivadora del gen YPR1, o
- -
- una modificación genética inactivadora de los genes GCY1 e YPR1.
18. Utilización según la reivindicación 17,
caracterizada porque la levadura presenta un gen GCY1 y un
gen YPR1 interrumpidos.
19. Utilización según la reivindicación 18,
caracterizada porque la levadura es una levadura del género
Saccharomyces.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0010437 | 2000-08-08 | ||
| FR0010437A FR2812884B1 (fr) | 2000-08-08 | 2000-08-08 | Levures modifiees et utilisations, notamment pour la production de derives steroidiens |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2300347T3 true ES2300347T3 (es) | 2008-06-16 |
Family
ID=8853403
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01956637T Expired - Lifetime ES2300347T3 (es) | 2000-08-08 | 2001-07-24 | Levaduras modificadas y utilizaciones, particularmente para la produccion de derivados esteroideos. |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7879592B2 (es) |
| EP (1) | EP1313873B1 (es) |
| JP (1) | JP4864277B2 (es) |
| KR (1) | KR100860702B1 (es) |
| AR (1) | AR030080A1 (es) |
| AT (1) | ATE390479T1 (es) |
| AU (2) | AU2001278562B2 (es) |
| BR (1) | BRPI0113048B8 (es) |
| CA (1) | CA2418370C (es) |
| CY (1) | CY1108080T1 (es) |
| DE (1) | DE60133396T2 (es) |
| DK (1) | DK1313873T3 (es) |
| ES (1) | ES2300347T3 (es) |
| FR (1) | FR2812884B1 (es) |
| IL (2) | IL154294A0 (es) |
| MX (1) | MXPA03000702A (es) |
| NO (1) | NO334484B1 (es) |
| NZ (1) | NZ523612A (es) |
| PT (1) | PT1313873E (es) |
| TW (1) | TWI315739B (es) |
| WO (1) | WO2002012536A1 (es) |
| ZA (1) | ZA200300376B (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2812884B1 (fr) * | 2000-08-08 | 2002-11-08 | Aventis Pharma Sa | Levures modifiees et utilisations, notamment pour la production de derives steroidiens |
| FR2820145B1 (fr) | 2001-01-31 | 2004-01-23 | Aventis Pharma Sa | Souche de levure produisant des steroides de facon autonome |
| FR2976949B1 (fr) * | 2011-06-21 | 2015-08-28 | Sanofi Sa | Procede de preparation de levures genetiquement transformees capables de produire une molecule d'interet a haut titre |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5571250A (en) | 1978-11-22 | 1980-05-29 | Hatano Kk | Paper for paper box with lid and method of assembling paper box with lid by using same |
| BE889407A (fr) | 1980-06-27 | 1981-10-16 | Mallinckrodt Inc | Amelioration du procede de preparation d'un lysat de limule |
| JPS62181571A (ja) | 1986-08-11 | 1987-08-08 | Canon Inc | 画像処理装置 |
| JPS63181571A (ja) | 1987-01-22 | 1988-07-26 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 自動焦点整合装置 |
| JPS6447380A (en) | 1987-08-19 | 1989-02-21 | Agency Ind Science Techn | Steroid-oxidizing yeast strain |
| JPS6471250A (en) | 1987-09-11 | 1989-03-16 | Nec Corp | Multi-function telephone set |
| EP0340878B1 (en) | 1988-05-06 | 2001-05-16 | Aventis Pharma S.A. | Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor |
| JPH0231680A (ja) * | 1988-07-22 | 1990-02-01 | Agency Of Ind Science & Technol | チトクロムＰ４５０ｃ↓２↓１産生酵母菌株 |
| CN1042567A (zh) | 1988-09-23 | 1990-05-30 | 吉斯特-布罗卡迪斯公司 | 类固醇多步氧化方法和所用的遗传工程细胞 |
| JPH02249488A (ja) * | 1989-03-22 | 1990-10-05 | Sumitomo Chem Co Ltd | チトクロムＰ４５０↓ｃ↓２↓１と酵母ＮＡＤＰＨ‐チトクロムＰ４５０還元酵素の融合酸化酵素、該酵素をコードする遺伝子および該酵素の製造方法 |
| JP2645130B2 (ja) | 1989-03-31 | 1997-08-25 | 日清製粉株式会社 | ステロイド誘導体 |
| FR2678611B1 (fr) | 1991-07-04 | 1995-01-20 | Roussel Uclaf | Nouveaux esters pyrethrinouides de l'alcool 1,3,4,5,6,7-hexahydro 1,3-dioxo-2h-isoindol-2-yl-methylique, leur procede de preparation et leur application comme pesticides. |
| JP3363197B2 (ja) | 1992-06-18 | 2003-01-08 | 麒麟麦酒株式会社 | アルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子およびその利用 |
| US5547868A (en) | 1993-06-09 | 1996-08-20 | Regents Of The University Of California | Cholesterol disposal fusion enzymes |
| IL116872A (en) | 1995-02-15 | 2004-12-15 | Aventis Pharma Sa | Delta 5,7-Strol Reductase from Arbidopsis Thaliana |
| JP4093598B2 (ja) | 1995-03-14 | 2008-06-04 | 大関株式会社 | 新規なアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子 |
| DE19744212B4 (de) | 1997-09-30 | 2006-01-19 | Schering Ag | Verfahren zur Herstellung von Ergosterol und dessen Zwischenprodukten mittels rekombinanter Hefen |
| US6303302B1 (en) | 1997-11-19 | 2001-10-16 | The Whitehead Institute For Biomedical Research | Regulation of fungal gene expression |
| FR2774393B1 (fr) | 1998-02-05 | 2000-03-24 | Hoechst Marion Roussel Inc | Souches de levure ayant le gene atf2 interrompu et leurs applications |
| FR2799206A1 (fr) | 1999-10-05 | 2001-04-06 | Transgene Sa | Procede de production de steroides modifies par fermentation de levures |
| FR2812884B1 (fr) | 2000-08-08 | 2002-11-08 | Aventis Pharma Sa | Levures modifiees et utilisations, notamment pour la production de derives steroidiens |
| FR2820145B1 (fr) | 2001-01-31 | 2004-01-23 | Aventis Pharma Sa | Souche de levure produisant des steroides de facon autonome |
-
2000
- 2000-08-08 FR FR0010437A patent/FR2812884B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-07-24 DE DE60133396T patent/DE60133396T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-24 US US10/343,993 patent/US7879592B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-24 KR KR1020037001820A patent/KR100860702B1/ko active IP Right Grant
- 2001-07-24 ES ES01956637T patent/ES2300347T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-24 NZ NZ523612A patent/NZ523612A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-07-24 AT AT01956637T patent/ATE390479T1/de active
- 2001-07-24 MX MXPA03000702A patent/MXPA03000702A/es active IP Right Grant
- 2001-07-24 AU AU2001278562A patent/AU2001278562B2/en not_active Expired
- 2001-07-24 CA CA2418370A patent/CA2418370C/fr not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-24 PT PT01956637T patent/PT1313873E/pt unknown
- 2001-07-24 IL IL15429401A patent/IL154294A0/xx unknown
- 2001-07-24 WO PCT/FR2001/002417 patent/WO2002012536A1/fr active IP Right Grant
- 2001-07-24 JP JP2002517820A patent/JP4864277B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-24 EP EP01956637A patent/EP1313873B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-24 DK DK01956637T patent/DK1313873T3/da active
- 2001-07-24 AU AU7856201A patent/AU7856201A/xx active Pending
- 2001-07-24 BR BRPI0113048A patent/BRPI0113048B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-07-30 AR ARP010103640A patent/AR030080A1/es active IP Right Grant
- 2001-08-08 TW TW090119307A patent/TWI315739B/zh not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-01-14 ZA ZA200300376A patent/ZA200300376B/en unknown
- 2003-02-04 IL IL154294A patent/IL154294A/en active IP Right Grant
- 2003-02-07 NO NO20030606A patent/NO334484B1/no not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-05-20 CY CY20081100524T patent/CY1108080T1/el unknown
-
2011
- 2011-01-14 US US13/006,607 patent/US8173402B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2354603T3 (es) | Cepas de levadura que producen esteroides de forma autónoma. | |
| JP2001516584A (ja) | 乳酸生産のための酵母菌株 | |
| FI120877B (fi) | DNA-sekvenssi, joka koodaa A. thaliana -proteiinia, jolla on delta-5,7-steroli, delta-7-reduktaasiaktiivisuutta, delta-7-Red-proteiinia, menetelmä sen valmistamiseksi, muunnettuja hiivakantoja sekä sovellutuksia | |
| US8173402B2 (en) | Modified yeasts and uses thereof, in particular for producing steroid derivatives | |
| CN112135905A (zh) | C-8甾醇异构化的优化 | |
| CA2285686C (fr) | Souches de levure ayant le gene atf2 interrompu et leurs applications | |
| US7033779B1 (en) | Method for preparing steroids modified by yeast fermentation |