DE60133396T2

DE60133396T2 - Modifizierte zellen und ihre verwendungen, insbesondere zur herstellung von steroidderivate

Info

Publication number: DE60133396T2
Application number: DE60133396T
Authority: DE
Inventors: Bruno Dumas; Gilles Cauet; Tilman Achstetter; Eric Degryse
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 2000-08-08
Filing date: 2001-07-24
Publication date: 2009-07-09
Anticipated expiration: 2021-07-25
Also published as: DK1313873T3; DE60133396D1; FR2812884A1; WO2002012536A1; IL154294A0; US20040082025A1; NO20030606L; US20110104749A1; AR030080A1; ATE390479T1; CA2418370A1; PT1313873E; US8173402B2; TWI315739B; JP4864277B2; BR0113048A; NO334484B1; MXPA03000702A; KR100860702B1; EP1313873A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biologie und der Pharmazie. Insbesondere betrifft sie neue Zusammensetzungen und Verfahren, die sich für die Herstellung von Steroidverbindungen oder für die (selektive) Transformation von Steroidverbindungen eignen. Ganz besonders betrifft sie neue Hefestämme, Verfahren und genetische Konstrukte zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung für die Synthese oder Modifikation von Steroidverbindungen. Die erfindungsgemäßen Hefestämme gestatten es, die Wirksamkeit der Synthese zu verbessern oder die Selektivität oder Ausbeuten des Verfahrens sowie die Qualität des Endprodukts zu erhöhen. Die erfindungsgemäßen Stämme, Verfahren und Verbindungen eignen sich für die Forschung, die Entwicklung und die Erzeugung von Produkten mit therapeutischer oder prophylaktischer Wirksamkeit bei Mensch oder Tier, insbesondere von Steroidderivaten.
Die natürliche Fähigkeit von Mikroorganismen, Steroide zu transformieren, ist ausführlich in der Literatur beschrieben worden. In dieser Hinsicht stellen sie eine vorteilhafte Alternative zur Produktion von Steroidderivaten, die auf chemischem Weg schwierig zu erhalten sind, dar. Hefen eignen sich weiterhin besonders für die Expression von cDNA, die für in den Organellen aktive Enzyme codiert. Aufgrund dieser Tatsache wurden Hefen wie S. cerevisiae größtenteils dazu verwendet, um cDNAs, die für steroidogene Enzyme wie mikrosomale oder mitochondrielle P450s codiert, zu exprimieren. Weiterhin haben gewisse Studien zur Expression von Enzymen, die am Hydrocortisonbiosyntheseweg beteiligt sind, den Nachweis er möglicht, daß diese Hefen fähig waren, gewisse Zwischenstufen wirksam zu transformieren. So wurde zum Beispiel die Verwendung von transformierten Hefen, die die Expression von einem oder mehreren Säugetierenzymen, die am Steroidbiosyntheseweg beteiligt sind, ermöglichen, zum Beispiel in der Anmeldung EP 340878 , in dem US-Patent 5,137,822 oder bei Dumas et al. beschrieben. Insbesondere wurde bereits die Verwendung einer Hefe Saccharomyces cerevisiae, die das Rinder-Cytochrom P450 C21 aus der Nebenniere exprimiert, für die Herstellung von 11-Desoxycortisol ausgehend von 17α-Hydroxyprogesteron beschrieben (Database WPI Section Ch., Week 199011 Derwent Publications Ltd., London, GB). Ebenso wurde von den Anmeldern gefunden, daß die Δ5-3β-Hydroxysteriode wie Pregnenolon, 17α-Hydroxypregnenolon und DHEA von Hefen in die entsprechenden Acetatester umgewandelt wurden. Die Anmelder haben auch nachgewiesen, daß diese Umwandlung im wesentlichen durch das Produkt des ATF2-Gens (Cauet et al., 1999) erfolgte. Bei Hefen handelt es sich daher um einen Organismus, der insbesondere im Industriemaßstab für die Produktion von Steroidderivaten geeignet ist.
Es ist jedoch auch bekannt, daß 17α-Hydroxyprogesteron unter gewissen Bedingungen von Hefen zu 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on reduziert werden kann (Dumas et al., 1994) und daß die Herstellung dieses Nebenprodukts die Syntheseausbeuten sowie die Qualität des Endprodukts beeinflußt. Bis zum heutigen Tag ist/sind jedoch die für diese Reaktion verantwortliche(n) Enzymaktivität(en) vom Typ der 20α-Hydroxysteroiddehydrogenase (20αHSD) nicht identifiziert worden.
Die vorliegende Erfindung ist genau das Ergebnis der Untersuchung der endogenen Aktivitäten von Hefe, die auf das Hydroxyprogesteron einwirken, und beschreibt die Identifikation von zwei Genen, die für Enzyme mit einer Aktivität des 20αHSD-Typs codieren. Ganz besonders zeigt die vorliegende Anmeldung, daß die GCY1- und YPR1-Gene die Träger der Aktivität des 20αHSD-Typs bei der Hefe sind und daß das Produkt dieser Gene es zum Beispiel gestattet, Hydroxyprogesteron in vitro zu Nebenprodukten umzuwandeln. Wenngleich nämlich auch eine Inaktivierung des GCY-Gens bei der Hefe von Oechsner et al. (1988) beschrieben wurde, wurde jedoch kein Phänotyp, der mit dieser Inaktivierung assoziiert ist, identifiziert. Die Inaktivierung des YPR1-Gens zur Begrenzung der Virulenz von Pilzstämmen ist ebenfalls vorgeschlagen worden ( WO99/25865 , Microbia Inc.). Die vorliegende Anmeldung zeigt weiterhin, daß die Unterdrückung der Aktivität dieser Gene bei der Hefe die Bildung von Nebenprodukten des 4-Pregnen-17α20a-diol-3-on-typs unterdrückt oder beträchtlich reduziert und es ermöglicht, die Syntheseausbeuten an Steroidderivaten signifikant zu verbessern und/oder Hydroxyprogesteron (oder seine Vorstufen) selektiver zu Steroidderivaten zu transformieren. Die vorliegende Anmeldung beschreibt daher neue Zusammensetzungen und Verfahren, die sich für die Synthese von Steroidderivaten mit besserer Selektivität eignen. Insbesondere beschreibt die Erfindung neue Hefestämme mit einer verringerten 20αHSD-Aktivität, die im wesentlichen unfähig sind, Hydroxyprogesteron zu Nebenprodukten des 4-Pregnen-17α,20a-diol-3-on-Typs zu transformieren. Die Erfindung kann auch für die Erhöhung der Produktion solcher Produkte im Hinblick auf ihre Verwendung oder Transformation zu wirksamen Verbindungen eingesetzt werden.
Ein erster Gegenstand der Erfindung ist ganz besonders ein Verfahren zum Modifizieren einer Steroidverbindung, welches umfaßt, daß man diese Verbindung (oder eine Vorstufe davon) mit einer Hefe mit verringerter 20αHSD-Aktivität, insbesondere einer Hefe mit einem nicht funktionellen, insbesondere disrumpierten, GCY1- und/oder YPR1-Gen, stärker bevorzugt eine Hefe der Gattung Saccharomyces, oder ein von solch einer Hefe abstammendes Präparat in Kontakt bringt.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Hefe mit reduzierter 20αHSD-Aktivität, insbesondere einer Hefe mit einem nicht funktionellen, insbesondere disrumpierten, GCY1- und/oder YPR1-Gen, stärker bevorzugt eine Hefe der Gattung Saccharomyces, oder ein von solch einer Hefe abstammendes Präparat für die in-vitro oder ex-vivo Herstellung, Produktion, Synthese, Modifikation und/oder Verbesserung von Steroidverbindungen.
Die Erfindung betrifft auch jegliches Verfahren zur Herstellung von Steroidderivaten ausgehend von Hydroxysteroidderivaten, insbesondere von Hydroxyprogesteron oder seinen Vorstufen, bei dem man eine Hefe mit verringerter 20αHSD-Aktivität, insbesondere eine Hefe mit einem nicht funktionellen, insbesondere disrumpierten, GCY1- und/oder YPR1-Gen, stärker bevorzugt eine Hefe der Gattung Saccaromyces, oder ein von solch einer Hefe stammendes Präparat verwendet.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Umwandlung von 17α-Hydroxyprogesteron zu insbesondere 11-Desoxycortisol, bei dem man eine Hefe mit verringerter 20αHSD-Aktivität, insbesondere eine Hefe mit einem nicht funktionellen, insbesondere disrumpierten, GCY1- und/oder YPR1-Gen, stärker bevorzugt eine Hefe der Gattung Saccaromyces, oder ein von solch einer Hefe stammendes Präparat verwendet.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Verwendung einer Hefe mit reduzierter 20αHSD-Aktivität, insbesondere einer Hefe mit einem nicht funktionellen, insbesondere disrumpierten, GCY1- und/oder YPR1-Gen, stärker bevorzugt eine Hefe der Gattung Saccharomyces, oder ein von solch einer Hefe abstammendes Präparat für die Umwandlung von 17α-Hydroxyprogesteron in 11-Desoxycortisol.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Modifikation der 20αHSD-Aktivität einer Hefe, bei dem die Aktivität des GCY1- und/oder YPR1-Gens dieser Hefe modifiziert wird. Insbesondere handelt es sich um ein Verfahren Reduktion oder Hemmung der 20αHSD-Aktivität einer Hefe, das die Inaktivierung des GCY1- und/oder YPR1-Gens dieser Hefe, vorzugsweise mittels Gendisruption, umfaßt, noch stärker bevorzugt an Hefen der Gattung Saccharomyces.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch bestimmte Hefestämme mit einer reduzierten 20αHSD-Aktivität. Stärker bevorzugt handelt es sich um Hefen mit einem nicht funktionellen YPR1-Gen, Hefen mit nicht funktionellen GCY1- und YPR1-Genen oder auch gewisse Hefen mit einem nicht funktionellen GCY1-Gen.
Die Erfindung betrifft auch jegliches Zellpräparat, das von einer wie oben beschriebenen Hefe abstammt, insbesondere ein Zellysat, ein Zellhomogenisat, einen Kulturüberstand, eine abgeleitete (vor-)bereinigte oder angereicherte Lösung, usw.
Wie oben angeführt beschreibt die vorliegende Erfindung zum ersten Mal Hefestämme (oder Hefezellen oder Hefekulturen) sowie abgeleitete Präparate mit einer reduzierten, ja sogar nicht nachweisbaren, 20αHSD-Aktivität. Die Erfindung beschreibt nämlich die Identifikation von Hefegenen, die solch eine Aktivität aufweisen, die GCY1- und YPR1-Gene, und zeigt, daß diese Gene spezifisch modifiziert werden können, insbesondere mittels Techniken der genetischen Rekombination, ohne die Wachstums- oder Überlebensfähigkeit der Zellen oder ihr Vermögen, Steroidverbindungen zu transformieren oder umzuwandeln, zu schädigen. Die Erfindung stellt daher zum ersten Mal Verfahren zur Synthese, Produktion, Modifikation und/oder Umwandlung von Steroidverbindungen mittels vorteilhafter Hefen bereit.
Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ganz besonders die Verwendung eines Hefestamms (oder einer Hefezelle oder Hefekultur), der/die dadurch gekennzeichnet ist, daß er/sie eine genetische Modifikation aufweist, und daß er/sie eine verringerte 20αHSD-Aktivität aufweist, für die Herstellung von Steroidverbindungen. Die vorliegende Erfindung bedient sich ganz besonders eines Hefestamms, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er folgendes aufweist:

– eine genetische Modifikation des GCY1-Gens, oder
– eine genetische Modifikation des YPR1-Gens, oder
– eine genetische Modifikation des GCY1- und des YPR1-Gens.

Stärker bevorzugt handelt es sich bei der/den in den erfindungsgemäßen Hefen vorhandenen genetische(n) Modifikation(en) um inaktivierende Modifikationen, das heißt um Modifikationen, die zum Verlust der Aktivität des Gens und/oder des entsprechenden Proteins führen. Eine Art der ganz besonders bevorzugten erfindungsgemäßen inaktivierenden genetischen Modifikation ist eine Gendisruption, wie dies detailliert im folgenden Text beschrieben werden wird.
Genauer gesagt betrifft die Erfindung daher die Verwendung von Hefen, in denen:

– das GCY1-Gen nicht funktionell ist, oder
– das YPR1-Gen nicht funktionell ist, oder
– das GCY1- und das YPR1-Gen nicht funktionell sind, für die Herstellung von Steroidverbindungen.

Solche Hefen weisen eine verringerte, ja sogar nicht nachweisbare, 20αHSD-Aktivität auf und sind daher für die Produktion oder Modifikation oder Umwandlung von Steroidverbindungen besonders vorteilhaft.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gehören die Hefen stärker bevorzugt zur Gattung Saccharomyces, insbesondere S. cerevisiae. So betrifft die vorliegende Erfindung in einer spezielleren Ausführungsform Verfahren oder Verwendungen von Hefezellen (oder -stämmen oder -kulturen) der Gattung S. cerevisiae mit einem nicht funktionellen, vorzugsweise disrumpierten, GCY1- und/oder YPR1-Gen.
Obwohl sich die Beispiele spezifischer auf die Hefe Saccharomyces cerevisiae beziehen, soll die Lehre der Erfindung nicht auf diesen bestimmten Hefetyp beschränkt sein und kann sich auch im wesentlichen auf jegliche beliebige Hefe, die eine natürliche 20αHSD-Aktivität aufweist oder die ein GCY1- oder YPR1-Gen enthält, erstrecken. In diesem Zusammenhang sind insbesondere die Hefen Saccharomyces, Kluyveromyces (insbesondere K. lactis), Schizosaccharomyces, Hansenula, Pichia (insbesondere P. pastoris), Candida (insbesondere C. maltosa), usw. zu nennen, deren Kultur in Fermentern und genetische Modifikation im Stand der Technik beschrieben worden sind.
Weiterhin versteht man unter dem GCY1-Gen das GCY1-Gen aus S. cerevisiae, wie es in GenBank unter der Bezeichnung X96740 (Bandlow et al., Gene 90(01), 1990, 105–114) beschrieben ist, sowie jegliche Variante bzw. jegliches funktionelle Homolog davon, die/das in Hefezellen vorliegt. Auf ähnliche Art und Weise bezeichnet das YPR1-Gen das YPR1-Gen (oder YDR368w-Gen) aus S. cerevisiae, wie es in GenBank unter der Bezeichnung X80642 beschrieben ist, sowie jegliche Variante bzw. jegliches funktionelle Homolog davon, die/das in Hefezellen vorkommt. Die Sequenz dieser Gene kann auch aus anderen Banken, in denen die vollständige Sequenz des Genoms der Hefe S. cerevisiae beschrieben ist, erhalten werden (Universität Stanford, MIPS usw.). Die funktionellen Homologe können durch Homologiesuche von Sequenzen oder durch Klonierung mittels Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, die sich vom GCY1- und YPR1-Gen von S. cerevisiae ableiten, gemäß den klassischen Techniken der Molekularbiologie identifiziert werden.
Wie erwähnt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren oder Verwendungen von Hefen mit einer genetischen Modifikation von einem oder mehreren Genen, die an der 20αHSD-Aktivität beteiligt sind, insbesondere dem GCY1- und/oder YPR1-Gen, und die vorzugsweise eine verringerte, ja sogar supprimierte, 20αHSD-Aktivität aufweisen.
Im Sinn der Erfindung bedeutet der Begriff „genetische Modifikation" jegliche Veränderung des Genoms einer Zelle, die durch jegliches mögliche Verfahren erzielt wurde, wie die Verwendung von mutagenen Agentien und/oder die Durchführung von einer oder mehreren Modifikation(en) auf dem genetischen oder rekombinanten Weg. Vorzugsweise ist eine genetische Modifikation eine Modifikation der Sequenz von mindestens einem Gen, die zur Modifikation der Aktivität des Gens, insbesondere zur Stimulation oder vorzugsweise Inaktivierung dieses Gens führt. Die Inaktivierung eines Gens, oder der nicht funktionelle Charakter eines Gens, kann sich durch die Abwesenheit der Expression eines Proteins, durch die Expression einer nicht funktionellen Form des Proteins, als Mutation(en), Deletion(en), Substitution(en), Insertion(en) usw. oder auch durch die schwache Expression des Proteins, die keine ausreichende Aktivität ermöglicht, manifestieren. Aufgrund dieser Tatsache kann sich die genetische Modifikation eines Gens insbesondere auf die gesamte Codierregion oder einen Teil der Codierregion dieses Gens oder eine Regulationsregion dieses Gens (Promoter usw.) auswirken.
Vorteilhaft umfaßt die erfindungsgemäße genetische Modifikation mindestens eine Mutation, Substitution, Deletion und/oder Insertion von einem oder mehreren Basenpaar(en) in der Regulations- oder Codierregion des jeweiligen Gens. Noch stärker bevorzugt handelt es sich um eine Modifikation durch die Deletion des gesamten jeweiligen Gens oder eines Teils des jeweiligen Gens, das nach dem Verfahren der Gendisruption (oder „Genaustauschs") gegen Fremdsequenzen ausgetauscht werden kann. Die genetischen Modifikationen durch Deletion und/oder Insertion werden für die Durchführung der vorliegenden Erfindung insofern bevorzugt, als sie für das jeweilige Gen selektiv und zeitmäßig stabil sind. Stärker bevorzugt betrifft daher die genetische Modifikation den Austausch von mindestens einem Teil des jeweiligen Gens gegen Fremdsequenzen. Diese Modifikation kann durch bekannte Techniken erfolgen, die darin bestehen, daß man in vitro ein modifiziertes Gen herstellt, das durch doppelte homologe Rekombination in das Genom der Hefen eingeführt werden kann, wie dies in den Beispielen beschrieben ist (siehe auch Baudin et al., Nucleic Acids Res. 21 (14) (1993) 3329).
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung betrifft daher Verfahren oder Verwendungen von Hefen, bei denen das gesamte GCY1- und/oder YPR1-Gen oder ein Teil des GCY1- und/oder YPR1-Gens durch Fremdsequenzen (oder heterologe Sequenzen) ersetzt worden ist, zum Beispiel durch ein Markergen (das für eine Resistenz gegen ein Antibiotikum codiert). Genauer gesagt wird für die Gendisruption in vitro eine rekombinante Nukleinsäure hergestellt, die eine gewählte Fremdsequenz umfaßt, welche „Borders" von Sequenzen mit Homologie zu Contig- oder Nicht-Contig-Regionen des jeweiligen Gens aufweist. Bei der Fremdsequenz kann es sich zum Beispiel um ein Markergen, um ein Gen, das für eine Auxotrophie komplementiert, um eine Expressionskassette usw. handeln. Genauer gesagt kann es sich bei der Fremdsequenz um ein Auxotrophie-Selektionsgen, das einen Ernährungsanspruch des Wirtshefestamms komplementiert, zum Beispiel um das URA3-Gen, das LEU2-Gen, das TRP1-Gen, das HIS3-Gen oder das ADE2-Gen; um ein dominantes Selektionsgen, wie um ein Gen für Resistenz gegen ein Antibiotikum (G418, Phleomycin, Hygromycin B, usw.); oder auch um ein Rapportergen (β-Galactosidase usw.) handeln. Es kann sich auch um eine Kassette, die die Expression unterbricht, handeln, die zum Beispiel einen Transkriptionsterminator wie insbesondere einen Hefeterminator aus der Gruppe CYC1, TDH3, TEF1 oder PGK handeln. Es ist klar, daß jegliche andere Fremdsequenz (d. h. eine Sequenz, die nicht natürlich in dieser Form in dem jeweiligen Gen vorhanden ist), die es ermöglicht, die Expressionsbedingungen des Gens und/oder die codierte Proteinstruktur selbst zu verändern, im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Die so hergestellte Nukleinsäure wird dann mittels traditioneller Techniken (Lithium, Protoplasten usw.) in die Hefen eingebracht, was zur Insertion der Fremdsequenz in das Genom der Hefe innerhalb der Sequenz des jeweiligen Gens führt, gegebenenfalls unter Austausch einer Region dieses Gens durch doppelte homologe Rekombination.
Es ist klar, daß auch jegliche andere Technik der genetischen Modifikation im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, wie zum Beispiel die gerichtete Mutagenese, die Verwendung von Transposons usw.
Spezifische Beispiele für Hefen mit einem durch Gen-disruption inaktivierten GCY1- und/oder YPR1-Gen sind insbesondere:

– die TGY170 (gcy1::LEU2)-Zellen: In den TGY170-Zellen wurde ein Teil des GCY1-Gens durch eine Nukleinsäure, die für das Protein LEU2 codiert, ersetzt, was die Selektion von Rekombinanten ermöglicht.
– die TGY197 (gcy1:LEU2, ydr368w::URA3)-Zellen: Die TGY197-Zellen umfassen im Vergleich zu den TGY170-Zellen eine zusätzliche genetische Modifikation, die das YPR1-Gen (auch YDR368w genannt), betrifft, bei dem ein Teil gegen das Selektionsgen URA3 ausgetauscht worden ist.
– die TGY195 (ydr368w::URA3)-Zellen: Die TGY195-Zellen umfassen eine genetische Modifikation, die das YPR1-Gen (auch YDR368w genannt), betrifft, bei dem ein Teil gegen das Selektionsgen URA3 ausgetauscht worden ist.
– die TGY194 (gcy1::URA3)-Zellen: In den TGY194-Zellen wurde ein Teil des GCY1-Gens gegen eine Nukleinsäure, die für das Protein URA3 codiert, ausgetauscht, was die Selektion von Rekombinanten ermöglicht.

Solche Zellen stellen ebenfalls einen bestimmten Gegenstand der Erfindung dar. Insbesondere betrifft die Erfindung jegliche(n) Hefezelle (oder -stamm oder -kultur) mit einer genetischen Modifikation des YPR1-Gens (oder im YPR1-Gen), insbesondere eine Deletion des und/oder Insertion in das YPR1-Gen(s). Die Erfindung betrifft auch jegliche(n) Hefezelle (oder -stamm oder -kultur) mit einer genetischen Modifikation des (oder in dem) GCY1- und YPR1-Gen, insbesondere eine Deletion des und/oder Insertion in das GCY1- und YPR1-Gen(s). Die Erfindung betrifft auch zellfreie Präparate, die sich von solchen Hefen ableiten.
Die erfindungsgemäßen Zellen, bzw. die Zellen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, weisen vorteilhafterweise eine verringerte 20αHSD-Aktivität auf, das heißt eine 20αHSD-Aktivität, die mindestens um 20%, bevorzugt um mindestens 40%, stärker bevorzugt um mindestens 60%, im Vergleich zu dem nicht genetisch modifizierten Stamm reduziert ist. Wie in den Beispielen gezeigt wird, zeigt die Erfindung, daß die Inaktivierung des GCY1-Gens in der Hefe zu einer 95%igen Reaktion der 20αHSD-Aktivität im Überstand eines Zellhomogenisats führt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen auch, daß die doppelte Genmodifikation des GCY1- und des YPR1-Gens zur Suppression der 20αHSD-Aktivität führt, welche nun im Überstand eines Zellhomogenisats nicht nachweisbar ist. Diese Ergebnisse bringen den Beweis für die Rolle dieser Gene und erläutern die Möglichkeit, sie zu modifizieren, um die Eigenschaften der Hefen für die Anwendungen bei der Produktion von Steroidderivaten zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung kann für die Herstellung von Steroidverbindungen im Hinblick auf verschiedene pharmazeutische Anwendungen eingesetzt werden. Diesbezüglich beschreibt die Erfindung Verfahren zur Produktion von Steroidverbindungen, bei denen die erfindungsgemäßen Hefen eingesetzt werden. Die Anmeldung betrifft auch verbesserte Verfahren zur Produktion von Steroidverbindungen, bei denen Hefen mit einer verringerten 20αHSD-Aktivität eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren werden vorteilhaft dadurch durchgeführt, daß eine Population von Hefen wie oben beschrieben mit einer Steroidverbindung in vitro in Kontakt gebracht wird, wonach die synthetisierten Verbindungen extrahiert werden. Bei der Ausgangssteroidverbindung kann es sich um ein beliebiges natürliches oder modifiziertes oder synthetisches Steroid handeln, insbesondere um jegliche Hydroxysteroidverbindung oder Vorstufe, insbesondere Cholesterol, Progesteron, Pregnenolon oder 17OH-Progesteron. Die erfindungsgemäßen Verfahren können für die Herstellung von Steroidderivaten wie 11-Desoxycortisol, Cortisol, Hydrocortison usw. oder den Derivaten der genannten Verbindungen verwendet werden.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen der folgenden Beispiele klar werden, wobei diese Beispiele als Erläuterung und nicht als Einschränkung aufzufassen sind.
LEGENDE ZU DEN FIGUREN
1: SDS-PAGE-Analyse einer aufgereinigten Fraktion de 20αHSD-Aktivität mittels Chromatographie an Red120-Agarose mit einem Hefehomogenisat als Ausgangsmaterial. Der obere Pfeil gibt die Bande an, deren N-terminale Sequenz GCY1 entspricht, während der untere Pfeil diejenige Bande angibt, die der N-terminalen Sequenz von YPR1 entspricht. Bahn 1 entspricht dem Molekulargewichtsmarker, während Bahn 2 der aufgereinigten Fraktion der 20αHSD-Aktivität entspricht.
2: 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on-Produktion durch S. cerevisiae Hefen, die in Gegenwart von 0,1 mg/ml 17α-Hydroxyprogesteron in Galactose-Medium (YNB-gal) bzw. Glucosemedium (YPD) kultiviert worden waren.
3: 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on-Produktion durch S. cerevisiae Hefen des Wildtyps (wt) oder mit Mutation in der Sequenz des GCY1-Gens (gcy-), die in Gegenwart von 0,1 mg/ml 17α-Hydroxyprogesteron in Galactose-Medium (YNB-gal) bzw. Glucosemedium (YPD) kultiviert worden waren.
4: Struktur des Plasmids für die Disruption des GCY1-Gens. Das Plasmid wird mit den Enzymen BamHI und HindIII linearisiert und anschließend nach den im Abschnitt Material und Methoden beschriebenen Verfahren in S. cerevisiae hineintransformiert. Die Deletion der Sequenz des GCY1-Gens umfaßt den Promoter und 306Bp der Codiersequenz, darunter auch den Translationsstartcodon.
5: Struktur des Plasmids für die Disruption des GCY1-Gens (Plasmid pTG12010 Klon 40). Das Plasmid wird mit den Enzymen EcoRI und SphI linearisiert und anschließend nach den im Abschnitt Material und Methoden beschriebenen Verfahren in S. cerevisiae hineintransformiert. Die Deletion der Proteinsequenz von GCY1 umfaßt die Aminosäuren 47 bis einschließlich 268. pTG12010 Klon 36 weist dieselbe Struktur auf, jedoch ohne die ClaI-Stelle 5' des URA3-Gens, jedoch mit einer HindIII-Stelle 3' des URA3-Gens.
6: Struktur des Plasmids für die Disruption des YPR1-Gens (YDR368w) (Plasmid pTG12011). Das Plasmid wird mit dem Enzym XhoI linearisiert und anschließend nach den im Abschnitt Material und Methoden beschriebenen Verfahren in S. cerevisiae hineintransformiert. Die Deletion der Proteinsequenz von YPR1 umfaßt die Aminosäuren 5 bis einschließlich 198.
MATERIAL UND METHODEN
Chemische Produkte: Das 17α-Hydroxyprogesteron wurde von Hoechst Marion Roussel (Romainville, Frankreich) bezogen. Tergitol Nonidet P40 und Tyloxapol stammen von Sigma.
Enzymtest:
In-vivo-Umwandlung von 17α-Hydroxyprogesteron: die Hefezellen wurden bei 28°C in YPD-Medium (10 ml), das mit einer 24-Stunden-Vorkultur als Ausgangsmaterial auf einen A₆₀₀-Wert von 0,1 inokuliert worden war, kultiviert. Anschließend wurden 100 μl einer Lösung von 17α-Hydroxyprogesteron (10 mg/ml) in einer Mischung von Tergitol und Ethanol (1:1, v:v) zu der Kultur gegeben. Aliquote Teile der Kulturbrühe (250 μl) wurden zu unterschiedlichen Zeitabständen entnommen, und die Steroide wurden mit Dichlormethan extrahiert. Die Steroide wurden anschließend auf Ultrasphere ODS in Gegenwart von 45% wäßrigem Acetonitril mit einer Aufgabemenge von 1 ml/min bei 45°C getrennt. Diese Steroide wurden bei 240 nm nachgewiesen.
Zellen:
Der Stamm E. coli BJ5183 (Hanahan, 1983) wurde für die In-vivo-Rekombinationen eingesetzt, und der Stamm C600, hsdR (Hubacek und Glover, 1970) für die klassischen Ligationsreaktionen.
Es wurde der Hefe-Elternstamm FY1679-28c (MATa ura3-52 trpl-63 leu2-2-1fen1 his3-200 GAL) (Thierry et al., 1995) verwendet. Die Stämme TGY170, TGY197, TGY195, TGY194, TGY212, TGY245 UND FY1679-28c/pTG10497 wurden wie in den Beispielen beschrieben konstruiert.
Es wurden die klassischen Methoden der Molekularbiologie und der In-vivo-Rekombination bei E. coli oder in der Hefe verwendet, wie dies bei Sambrook et al. (1989) oder bei Degryse et al (1995, 1996) beschrieben ist.
Hefekultur:
Die Hefen wurden im allgemeinen auf synthetischem Minimalmedium (Sherman, 1991) mit einem Nährstoffzusatz von 100 μg/ml kultiviert. Für die Transformationen von S. cerevisiae wurden die Zellen nach Wachstum auf YPD-Medium (Sherman, 1991) mit der Lithiumacetat-Technik (Ito et al., 1983) kompetent gemacht.
ERGEBNISSE
Identifikation der 20αHSD-Aktivität von Hefe, die für unerwünschte Reaktionen mit 17α-Hydroxyprogesteron verantwortlich ist
Die NADPH-abhängige Reduktion des 17α-Hydroxyprogesterons am C20-Atom zu 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on durch die Hefe S. cerevisiae ist bereits beschrieben worden (Dumas et al., 1994). Diese Aktivität ist der 20αHSD-Aktivität, über die in unterschiedlichen Geweben berichtet wird, ähnlich. Die an diesen Geweben charakterisierten Enzyme sind monomer und weisen ein ungefähres Molekulargewicht von 35 kDa auf. Um das bzw. die für die 20αHSD-Aktivität bei der Hefe verantwortliche(n) Enzym(e) zu identifizieren, wurden Homologiesuchen mit dem Enzym 20αHSD aus Stierhoden in Banken von S. cerevisiae durchgeführt. Mit diesen Versuchen konnten 6 Genprodukte der Hefe mit 44 bis 32% Identität auf Aminosäureebene mit dem Säugetierenzym identifiziert werden. Diese Gene sind in Tabelle I zusammengefaßt.
Um die beteiligten Enzyme besser charakterisieren zu können, wurde die 20α-HSD-Aktivität der Hefe in vitro unter Verwendung von 17α-Hydroxyprogesteron und NADPH als Substrate rekonstruiert. In diesem System wurden unterschiedliche Präparate, die von Kulturen der Hefe S. cerevisiae stammten, geprüft, wodurch man die Aktivität im Überstand nach Zentrifugation eines Zellhomogenisats bei 100 000 × g lokalisieren konnte. Aus diesem Ergebnis geht hervor, daß die Enzymaktivität löslich ist. Es wurde eine partielle Aufreinigung der 20α-HSD-Aktivität mittels Chromatographie Red 120 durchgeführt, wodurch es möglich war, nach SDS-PAGE ein Dublett in der 35 kDa Region zu erhalten (1). Sequenzieren dieser Banden ergab, daß sie in erster Linie aus dem Produkt des GCY1- und des YPR1-Gens bestanden. Diese beiden Enzyme sind ein Bestandteil der in Tabelle I angeführten Rinder-Homologe der 20α-HSD. Die vollständige Sequenz des GCY1- und des YPR1-Gens ist zum Beispiel in GenBank unter den Bezeichnungen X96740 bzw. X80642 zugänglich.
Es ist interessant, festzustellen, daß GCY1 als für eine Aldo-Keto-Reduktase (AKR), deren Expression in Gegenwart von Galactose signifikant erhöht wird, codierend beschrieben wurde (Magdolen et al., Gene 90(1), 1990, 105). Die AKR-Enzyme weisen eine breite Substratspezifität auf. Sie metabolisieren unterschiedliche Substrate, darunter auch aliphatische Aldehyde, Monosaccharide, Prostaglandine und Steroide. So stellt GCY1 einen guten möglichen Kandidaten dar, und wir haben uns dazu entschlossen, zu überprüfen, ob dieses Enzym an der Erzeugung von 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on aus 17α-Hydroxyprogesteron beteiligt sein könnte.
Induzierbarkeit der 20α-HSD-Aktivität, und Expression im zellfreien System
Mit den durchgeführten Versuchen konnte gezeigt werden, daß die 20α-HSD-Aktivität bei der Hefe durch Galactose induzierbar ist. So wurde die In-vivo-Umwandlung von 17α-Hydroxyprogesteron zu 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on in Hefekulturen, die auf unterschiedlichen Kohlenstoffquellen gezüchtet wurden, bestimmt. Die Verzögerung, die beobachtet wird, wenn die Hefen auf Glucose kultiviert werden, wird in Gegenwart von Galactose nicht beobachtet (2). Diese Beobachtung stimmt mit einer Unterdrückung des für 20α-HSD-codierenden Gens durch Glucose überein. Die Umwandlung beginnt nach 16 Stunden, wenn die Glucose verbraucht ist. Die Umwandlung von 17α-Hydroxyprogesteron zu 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on ist, wenn die Hefen in Gegenwart von Galactose gezüchtet werden, nach 48 Stunden ungefähr 4 mal höher. Diese Ergebnisse sind weiterhin auch in vitro bestätigt worden, und zwar dadurch, daß man die 20α-HSD-Aktivität an einem zellfreien Extrakt, der mit in Galactose- oder Glucosemedium gezüchteten Hefen als Ausgangsmaterial erhalten wurde, maß. Die spezifischen 20α-HSD-Aktivitäten betrugen bei den Homogenisaten von Zellen, die in Glucose- oder Galactosemedium gezüchtet worden waren, 0,05 bzw. 0,75 μM/min/mg.
Diese Ergebnisse zeigen also, (i) daß die 20α-HSD-Aktivität auf das Produkt des GCY1- und des YPR1-Gens der Hefe zurückzuführen ist, (ii) daß diese Enzyme löslich sind, und (iii) daß Ihre Aktivität in Gegenwart von Galactose erhöht und in Gegenwart von Glucose reprimiert werden kann.
Konstruktion und Eigenschaften von Hefe, die ein nicht funktionelles GCY1- und/oder YPR1-Gen enthalten
Um zu bestätigen, daß GcyIp für die 20α-HSD-Aktivität verantwortlich ist, wurde das entsprechende Gen von ORF YOR120w aus dem Genom der Hefe deletiert („Knock Out"). Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß der erhaltene Stamm eine im Vergleich zum Wildstamm stark reduzierte 20α-HSD-Aktivität aufweist. Außerdem wurden Stämme, in denen das YPR1-Gen allein oder in Kombination mit GCY1 deletiert ist, ebenfalls konstruiert und auf ihre Aktivität geprüft, wie dies im folgenden beschrieben wird.
Konstruktion von GCY1- und/oder YPR1-defizienten Hefen:
Die Hefen, die für eine GCY1- und/oder YPR1-Aktivität defizient sind, wurden durch Gendisruption hergestellt. Insbesondere gilt:
Der Stamm TGY170 (FY1679-28c, gcy1::LEU2) wurde durch Disruption des GCY1-Gens mit Hilfe des Plasmids Pgcy1::LEU2 konstruiert.
Der Stamm TGY197 (FY1679-28c, gcy1::LEU2 ydr368w::URA3) wurde durch zusätzliche Disruption des YDR368w (YPR1)-Gens nach den für ATF2 (Cauet et al., 1999) beschriebenen Verfahren mit Hilfe des Plasmids pTG12011 erzeugt.
Die TGY195-Stämme wurden durch Disruption des YDR368w (YPR1)-Gens nach den für AFT beschriebenen Verfahren ATF2 (Cauet et al., 1999) mit Hilfe des Plasmids pTG12011 erzeugt.
Die Stämme TGY194 (FY1679-28c, gcyI::URA3) wurden durch Disruption des GCY1-Gens mit Hilfe des Plasmids pTG12010 konstruiert.
Die Stämme FY1679-28c/pTG10497 und TGY245 wurden mit Hilfe der Plasmide pTG10497 und pTG12045 konstruiert.
Für die Disruption des GCY1- und des YPR1-Gens wurden die folgenden Plasmide verwendet: pgcy1::LEU2, pTG12010, pTG12011 (4–6), pTG12086 und pTG12045. Für die Expression von P450c21 wird das Einkopienplasmid pTG10497 verwendet.
Das von Magdolen et al. (Gene, 90 (1990) 105–114) beschriebene Plasmid pgcy1::LEU2 enthält das GCY1-Gen, dessen Codiersequenz und Promoter durch die für das LEU2-Gen codierende Sequenz unterbrochen sind. Genauer ausgedrückt wurden der Promoter und der codierende Teil, der dem EcoRV, HincII-Restriktionsfragment entspricht, gegen das 2,17 Kilobasen große HpaI-Fragment des LEU2-Gens ausgetauscht. So wurden der Promoter und 306 Basenpaare der Codiersequenz des GCY1-Gens deletiert.
Das Plasmid pgcyI::LEU2 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI linearisiert, und das 3,1 Kb große HindIII/BamHI-Fragment, das das disrumpierte Gen enthält, wurde hergestellt, um den Stamm Fy 1679-28c mit dem von Gietz RD et al. (Yeast 1995 Apr 15; 11(4): 355–60 Studies an the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure) beschriebenen Protokoll zu transformieren. Die Kolonien wurden auf leucinfreiem Medium selektiert. Bei dieser Durchmusterung positive Kolonien werden anschließend in einem reichen Medium kultiviert, um eine biologische Umwandlung des 17OH-Progesterons durchzuführen, wie dies bei Dumas et al (Eur. J. Biochem. 1996, June 1; 238(2): 495–504 11 beta-hydroxylase activity in recombinant yeast mitochondria. In vivo conversation of 11-Deoxycortisol to hydrocortisone) beschrieben ist. Die Konzentration des Substrats 17OH-Progesteron beträgt 100 mg/l, die Kohlenstoffquelle ist Galactose, und die optische Dichte zu Beginn beträgt 0,1. Das Kulturvolumen beträgt 10 ml, und die Inkubationsdauer beträgt 48 Stunden bei 30°C. Nach 48 Stunden Inkubation werden die positiven Klone durch Extraktion von 1 ml Medium (mit den Zellen) mit 2 ml Dichlormethan und anschließender Analyse der organischen Phase mittels Umkehrphasen-Hochdruckchromatographie wie oben beschrieben (Dumas et al 1996) ausgewertet. Die Chromatogramme werden auf das Vorhandensein von 17,20-Dihydroprogesteron im Vergleich mit dem aufgereinigten Produkt analysiert. Nach dieser Inkubation tritt in dem Kulturmedium des Wildstamms (der nicht mit dem Disruptionsfragment transformiert ist) eine 17,20-Dihydroprogesteronmenge von 4 mg/l, also 4% des Substrats, auf, während bei gewissen Transformanten das 17,20-Dihydroprogesteron nicht mehr als 1 mg/ml ausmacht. Ein TGY170-Stamm, der 17OH-Progesteron schwach zu 17,20-OH-Progesteron umwandelt und ein Wachstum, das dem des Wildtyps gleicht aufweist, wird ausgewählt.
Es wurden zwei neue Plasmide, nämlich pTG12010 und pTG12011, konstruiert, um die Disruption des GCY1- und des YPR1-Gens, die mit dem Selektionsmarker URA3 assoziiert sind, zu ermöglichen.
Das Plasmid pTG12010 wurde auf Grundlage des Plasmids pUC19 (Gene 1985; 33(1): 103–19 Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Yanish-Perron C. Vieira J. Messing J) konstruiert, während das Plasmid pTG12011 auf Grundlage des Plasmids pPOLYIII (Lathe, R., Vilotte, J.-L. and Clark, J.A., Plasmid and bacteriophage vectors for excision of intact inserts JOURNAL Gene 57, 193–201 (1987)) konstruiert wurde.
Konstruktion der Plasmide pTG12010 und pTG12011
Das Konstrukt der Disruption des Gens GCY1 durch das Gen URA3 in dem Plasmid pUC19, um zu pTG12010 zu gelangen, wurde durch vier Amplifikationen durch aufeinanderfolgende PCRs erhalten. Einerseits wurden drei unabhängige PCRs durchgeführt, um den 5'-Teil des Gens GCY1 (PCR1), das funktionelle URA3-Gen, das von den GCY1-Sequenzen begrenzt ist, (PCR2), und den 3'-Teil des GCY1-Gens (PCR3) zu erhalten. Der 5'- und der 3'-Teil des GCY1-Gens wurden mit Hilfe der Paare OTG11285, OTG11286 bzw. OTG11287, OTG11289 mit einer genomischen DNA-Matrize des Stamms Fy 1679-28c erhalten. Die Sequenz der Oligonukleotide lautet: OTG11285: GATTCGGTAATCTCCGAACAggtaccAATTATATCAGTTATTACCCGGGA (SEQ ID NO 1); OTG11286: AGCCATCTTTCAAAGCGGTT (SEQ ID NO 2); OTG11287: CCGATCGAATCAAAACGAACAG (SEQ ID NO 3); OTG11289: TCTAATCAGCTAGTAAGAAC (SEQ ID NO 4).
Das von den Sequenzen GCY1 flankierte URA3-Gen (so, daß man eine Deletion eines Teils der Codiersequenz des GCY1-Gens erhält) wird mit Hilfe der Oligonukleotide OTG 11305 (aaccgctttgaaagatggctATCGATTTTCAATTCAATTCATCATTTTTTTTTTATTCTT TTTTTTG, (SEQ ID NO 5) und OTG11306 (ctgttcgttttgattcgatcgggAAGCTTGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAACTC (SEQ ID NO 6) ausgehend von einer Matrize des linearisierten Plasmids pTG10054 (Degryse et al. in vivo cloning by homologous recombination in yeast using a two-plasmid-based system. Yeast. 1995 Jun 15; 11(7): 629–40) amplifiziert. Die Bedingungen bezüglich Puffer und Matrizen- und Primerkonzentration für die Amplifikation werden vom Hersteller oder Produzenten des Enzyms TAQ DNA-Polymerase angegeben, insbesondere für das von Life Technologies entwickelte Enzym Elongase. Die Temperaturzyclen lauten folgendermaßen: ein erster Zyclus von 6 min 30 sec, um Primer und Matrize zu denaturieren, dann 30 Zyclen zu 30 sec bei 93°C, 2 min bei 54°C und 3 min bei 68°C, der letzte Zyclus lautet 5 min bei 72°C. Die Produkte PCR1, PCR2 und PCR3 werden äquimolar gemischt und erneut mit Hilfe der Oligonukleotide OTG11285 und OTG11289 (siehe oben) amplifiziert. Das Endprodukt PCR4, das eine Größe von 1,9 Kilobasen aufweist, wird anschließend zwischen die KpnI- und BamHI-Restriktionsstellen des Plasmids pUC19 subkloniert, um zu dem Plasmid pTG12010 zu gelangen. Die Struktur des Plasmids wurde durch Restriktionsprofil und Nukleotidsequenzierung der Enden verifiziert. Mittles Klonierung von pTG12010 konnte man nun aber zwei Versionen dieses Plasmids erhalten, nämlich die Version pTG12010#40 (pTG12010 Klon 40) und pTG12010#36 (pTG12010 Klon 36). Das ursprüngliche Ziel bestand darin, das Gen GCY1 zu erhalten, das von dem Gen URA3, das von den Spaltstellen ClaI und HindIII 5' bzw. 3' des Gens begrenzt ist, unterbrochen ist. Nun wurden aber zwei unterschiedliche Plasmide erhalten, nämlich PTG12010#36 und pTG12010#40. Diese beiden Plasmide unterscheiden sich nur durch das Vorhandensein bzw. Fehlen der Spaltstellen ClaI und HindIII an den Enden des URA3-Gens. Das Plasmid pTG12010#40 weist eine HindIII-Restriktionsstelle am 3'-Ende des URA3-Gens auf, jedoch keine ClaI-Stelle am 5'-Ende. Das Plasmid pTG12010#36 weist keine HindIII-Spaltstelle am 3'-Ende auf, jedoch eine ClaI-Spaltstelle am 5'-Ende des Gens.
Dieser Eigenschaft bedient man sich, um das Plasmid zu erhalten, das das URA3-Gen, das von der HindIII- und der ClaI-Spaltstelle begrenzt ist und das die Codiersequenz von GCY1 unterbricht, zu erhalten.
Konstruktion des Plasmids pTG12036
Das Plasmid pTG12036 wurde in 4 Stufen ausgehend von pTG10802 konstruiert. Das Plasmid pTG10801 (das das Ausgangsmaterial für das Plasmid pTG10802 darstellt) ist ein Plasmid de pUC-Typs, in dem eine Abfolge von Restriktionsspaltstellen zwischen die XhoI- und die XhoI-Stelle insertiert worden ist. Diese Abfolge von Spaltstellen umfaßt die HindIII-, die SnabI-, die ClaI- und die SpeI-Spaltstellen. Zwischen der HindIII und der ClaI-Stelle wurde die HindIII/ClaI-Kassette von pTG10470 (wie im folgenden beschrieben), die den TEF1-Promoter, die humane p450c21-DNA und den PGK-Terminator umfaßt, zwischen die HindIII- und die ClaI-Stelle von pTG10801 insertiert, um zu pTG10802 zu gelangen. Dieses Plasmid wurde anschließend mit XhoI verdaut, und die eingeführte Kassette wird also deletiert, um ein von XhoI-Spaltstellen begrenztes PCR-Fragment einzuführen. Dieses 2,5 Kb große Fragment stammt von der Amplifikation des Oligonukleotidpaars OTG11844 (tttgctcgaggttacagaagggc, SEQ ID NO: 13) und OTG11845 (gattctcgagcaattggctgacta, SEQ ID NO: 14) auf dem Plasmid pTG12010 (#40), wodurch man zu einem Fragment gelangt, das von XhoI-Stellen begrenzt ist und das das GCY1-Gen, das von dem URA3-Gen, welches am 5'-Ende von einer ClaI-Spaltstelle begrenzt ist, unterbrochen ist. Dieses Fragment wurde zwischen die XhoI-Spaltstellen des Plasmids pTG10802 kloniert, um zu dem Plasmid pTG12035 zu gelangen. Um die fehlende HindIII-Spaltstelle einzuführen, bediente man sich des Plasmids pTG12010 (#36). Dieses Plasmid ist im wesentlichen mit pTG12010 (#40) identisch, verfügt jedoch über eine HindIII-Spaltstelle am 3'-Ende des URA3-Gens an der Grenze zu dem GCY1-Gen und verfügt über keine ClaI-Spaltstelle am 5'-Ende des URA3-Gens dort, wo es mit dem GCY1-Gen zusammenstößt. Man führt nun eine in-vivo Rekombination in E. coli zwischen dem 2,2 Kb großen NcoI-BamHI-Fragment von pTG12010 (#36) (das in 5'-3'-Richtung ein Fragment des URA3-Gens und am 3'-Ende ein Fragment des GCY1-Gens trägt) und einem Teil des Plasmids ptG12035, das heißt, dem großen StuI/AfIII-Fragment mit 4,45 Kb, durch. Das erhaltene Plasmid, pTG12036, weist das GCY1-Gen auf, das von dem URA3-Gen, welches von den Spaltstellen ClaI bzw. HindIII am 5'- bzw. 3'-Ende begrenzt ist, unterbrochen ist.
Konstruktion des Plasmids pTG12086
Dieses Fragment wird anschließend gegen die Expressionskassette von P450c21, die auf dem 2,33 Kb großen ClaI/HindIII-Fragment des Plasmids pTG10469 (siehe weiter unten) liegt, ausgetauscht, um zu dem Plasmid pTG12036 zu gelangen.
Konstruktion von Expressionsplasmiden für Cytochrom P450c21
Für die Überexpression dieses Proteins in Hefe verwendete man zwei Arten von Promoter, nämlich TEF1 („Transcription elongation factor1") und TDH3 („Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3). In jedem Fall handelt es sich bei dem Transkriptionsterminator um den PGK-Terminator.
In diesen Plasmiden liegt auf dem SalI/MluI-Fragment die cDNA des menschlichen P450c21.
Konstruktion der Plasmide pTG10470 und pTG10469
Das Plasmid pTG10289 wurde durch Modifikation von pMAc21 (Expression and functional study of wildtype and mutant human cytochrome P450c21 in Saccharomyces cerevisiae.
Wu Da, Hu MC, Chung BC DNA Cell Biol 1991 Apr; 10(3): 201–9)), Verdau mit KpnI, MluI und Einführung des Oligonukleotids OTG5868 erhalten. Die cDNA dieses Plasmids stammt von der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung pc21/3c. Es handelt sich um das 1,6 Kb große EcoRI/BamHI-Fragment, das als Grundlage für die Konstruktion von unterschiedlichen Plasmiden gedient hat. Die durchgeführten Modifikationen sind in der Arbeit oben sowie in der Arbeit (Expression of human 21-hydroxylase (P450c21) in bacterial and mammalian cells: A system to characterize normal and mutant enzyme Meng-Chun Hu and Bon-chu Chung DNA and Cell Biology 1991 Apr; 10(3) 201–209) beschrieben.
Bei diesem Arbeitsschritt wurde der nicht codierende Teil von P450c21 des Plasmids pMAc21, der die Expressionskassette von P450c21 enthält, sowie die KpnI-Stelle, die sich dort befand, entfernt. Das Plasmid pTG10292 wurde durch Übertragung der menschlichen c21 cDNA (SalI/MluI-Fragment) des Plasmids pTG10289 in das Plasmid pTG10031 mit Hilfe der SalI- und der MluI-Spaltstelle erhalten. Das Plasmid pTG10475 wurde durch PCR und Rekombination erhalten. Es wurde nämlich ausgehend von dem Plasmid PTG10292 ein Fragment der menschlichen P450c21-cDNA, das ungefähr 250 Nukleotide darstellte, mit Hilfe der Oligonukleotide OTG7410 (GGAATTCCGTCGACAAAAATGCTGCTCCTGGGCCTGCTGC, SEQ ID NO: 15) und OTG5927 (CCTCAATGGTCCTCTTGGAGTTCAGCACC, SEQ ID NO: 16) amplifiziert. Dieses Fragment ist die Codiersequenz des menschlichen P450c21, die von einer SalI-Spaltstelle und der Sequenz AAAA begrenzt wird, wie dies bei Oligonukleotid OTG7410 beschrieben ist. Dieses Fragment wurde mit SalI verdaut und anschließend in das lineare Fragment von pTG10292, das mit SalI verdaut wurde, ligiert, und anschließend wurde ein Rekombinationsversuch mit dem Stamm BJ5183 durchgeführt. Das erhaltene Plasmid, pTG10475, trägt eine cDNA von P450c21 mit einer Codiersequenz, die mit derjenigen der natürlichen cDNA identisch ist, im Gegensatz zu dem Plasmid pMAc21 auf einem Fragment, das mit den Vektoren, die wir im Laboratorium verwenden, kompatibel ist, das heißt ein Fragment, das von den Restriktionsspaltstellen SalI und MluI begrenzt wird. Dieses Fragment weist die folgende Umgebung um das ATG-Codon für die Translationsinitiation auf GTCGACAAAAATGCTGCTCCTGGGCCTGCTGC (SEQ ID NO: 17). Ausgehend von diesem Plasmid wurde das SalI/MluI-Fragment, das die cDNA des menschlichen P450c21 trägt, in das Plasmid pTG10158 (Degryse et al 1996) mittels klassischer Klonierung transferiert, um zu dem Plasmid pTG10472 zu gelangen. Dasselbe SalI/MluI-Fragment des Plasmids pTG10472 wurde anschließend durch Rekombination in das Plasmid pTG 10085 (Degryse et al 1996) transferiert, um zu dem Plasmid pTG 10469 zu gelangen. Dasselbe Fragment, das die P450c21-cDNA auf einem SalI/MluI-Fragment trägt, wurde in das Plasmid pGT10092 transferiert, um zu dem Plasmid pTG10470 (Degryse et al 1996) zu gelangen. Dieses Plasmid trägt also die cDNA des menschlichen P450c21 unter der Kontrolle des TEF1-Promoters und eines PGK-Terminators mit einem Selektionsmarker URA3-d mit einer Umgebung des ATG-Initiationscodons wie zuvor beschrieben.
Konstruktion des Plasmids pTG12086
Dieses Plasmid dient der Integration einer Expressionskassette für P450c21 sowie gleichzeitig der Disruption des GCY1-Gens.
Dieses Plasmid wurde ausgehend von dem Plasmid pTG12036 und dem Plasmid pTG10614 konstruiert.
Das letztgenannte Plasmid wurde ausgehend von pTG10212 (Degryse et al Yeast 11: 629–640 (1995)) konstruiert, bei dem es sich um ein Hefe-Expressionsplasmid auf Grundlage eines TDH3-Promoters, eines PGK-Terminators und eines URA3-d-Selektionsmarkers handelt.
Durch homologe Rekombination in E. coli wird der Selektionsmarker durch den Selektionsmarker des Plasmids pTG10054 (Degryse et al 1995) ersetzt, zu diesem Zweck wird das 2,1 Kb große MluI/FspI-Fragment von pTG10054, das den URA3-Marker, der von Rekombinationssequenzen flankiert ist, enthält, mit dem großen HindIII-Fragment von pTG10212 rekombiniert, wodurch man zu dem Plasmid pTG10610 gelangt, das dieselben Charakteristiken wie pTG10212 (Degryse et al 1995) aufweist und einen URA3-Marker in derselben Orientierung wie pTG10054 enthält. Das SalI/MluI-Fragment, das die cDNA des menschlichen Cytochroms P450c21 enthält, des Plasmids pTG10472 (siehe weiter oben) wird in das Plasmid pTG10610 transferiert, um zu dem Plasmid pTG10614 zu gelangen. Das ClaI/HindIII-Fragment dieses Plasmids enthält in 5'-3'-Richtung den TDH3-Promoter, die cDNA des menschlichen P450c21, die von SalI- und MluI-Schnittstellen begrenzt wird, und anschließend den PGK-Terminator enthält, wird in das Plasmid pTG12036 transferiert, um zu dem Plasmid pTG12086 zu gelangen, das also die Sequenz des GCY1- Gens, die durch die TDH3-Expressionskassette des menschlichen Cytochroms P450c21 unterbrochen wird, enthält.
Konstruktion des Plasmids pTG12045
Die einzige SphI-Spaltstelle des Plasmids pPolyIII wird durch Insertion des komplementären Oligonukleotidpaares OTG11975 (AAATCGATAACATG, SEQ ID NO: 18) und OTG11976 (TTATCGATTTCATG, SEQ ID NO: 19) zerstört. Die SphI-Spaltstelle von pPOLYIII wird zerstört und gegen eine ClaI-Stelle ausgetauscht, um zu dem Plasmid PCG12040 zu gelangen. In das Plasmid pTG12040 führt man zwischen die einzigen ClaI- und EcoRI-Stellen ein ClaI/EcoRI-Fragment von genomischer DNA ein, das dem 0,7 Kb großen 3'-Teil des YPR1-Gens entspricht und das durch Amplifikation mit den Oligonukleotiden OTG11981 (ATTGATATCGATAAAAAGCACGGCGTTGAG, SEQ ID NO: 20) und OTG11982 (TCTCGGAATTCAGGTACTGCAGCCAG, SEQ ID NO: 21) erhalten wurde, um zu dem Plasmid pTG12041 zu gelangen. In diesem 2,84 Kb großen Plasmid pTG12041 wird der 5'-Teil des YPR1-Gens (0,66 Kb), der mit den Oligonukleotiden OTG11314 (tacgctcgagACGTTGGTGTCATTGATATTCA, SEQ ID NO: 22) und OTG11980 (CAACTAAGCTTCATTCAAATAGATAGCCGC, SEQ ID NO: 23) ausgehend von genomischer DNA von Wildhefe amplifiziert wurde, in Form eines XhoI/HindIII-Fragments zwischen die SalI- und die HindIII-Spaltstelle des Plasmids pTG12041 kloniert. Man gelangt zu dem 3,5 Kb großen Plasmid pTG12042. Dieses Plasmid trägt das von den Spaltstellen ClaI und HindIII unterbrochene YPR1-Gen. Zwischen diese Spaltstellen wird die Kassette des P450c21 Cytochroms in Form eines 2,33 Kb großen ClaI/HindIII-Fragments, das von dem Plasmid pTG10469 stammt, kloniert. Auf diese Weise erhält man das Plasmid pTG12045.
Konstruktion des Plasmids pTG10497
Bei diesem Plasmid handelt es sich um ein Expressionsplasmid mit niedriger Kopienzahl (des Typs ARS CEN), das eine Expressionskassette für das menschliche Cytochrom P450c21 enthält, die sich unter der Kontrolle des TDH3-Promoters und des PGK-Terminators befindet. Dieses Plasmid wurde ausgehend von dem Plasmid pTG10434 konstruiert, welches den URA3-Selektionsmarker sowie den TEF1-Promoter, den PGK-Terminator sowie einen Hefe-Replikationsursprung des Typs ARSH4/CEN6 (Degryse et al 1995) enthält.
Dieses Plasmid wurde so modifiziert, daß es einen LEU2-Marker und einen TDH3-Promoter statt den URA3-Markern bzw. dem TEF1-Promoter enthält. Zu diesem Zweck wird das SpeI/MluI-Fragment, das den LEU2-Marker enthält, der von den Rekombinationsfragmenten, die der PGK-Terminator und ein Fragment des Replikationsursprungs sind, begrenzt wird, durch Rekombination anstelle der URA3-Region des mit HindIII verdauten Plasmids pTG10434 kloniert, um zu dem Plasmid pTG10466 zu gelangen. In diesem Plasmid pTG10466 wird der TEF1-Promoter gegen den TDH3-Promoter ausgetauscht, und zwar dadurch, daß man in E. coli das HindIII/EcoRI-Fragment von pTG10212 (Degryse et al 1995) (das den Replikationsursprung von E. coli sowie den TDH3-Promoter und PGK-Terminator enthält) mit dem MluI/FspI-Fragment von pTG10466, das den LEU2-Marker und den Replikationsursprung ARSCEN, die von Rekombinationssequenzen begrenzt sind, enthält, rekombiniert; auf diese Weise erhält man das Plasmid pTG10612. Zwischen die SalI- und die MluI-Spaltstelle dieses Plasmids gibt man die Expressionskassette TDH3::humanes Cytochrom P450c21 und Terminator, um zu dem Plasmid pTG10497 zu gelangen.
Konstruktion von defizienten Stämmen
Um zu dem Stamm ohne GCY1-Aktivität zu gelangen wird der Stamm FY 167928c mit dem mit den Enzymen SphI und EcoRI linearisierten Plasmid pTG121010 nach dem zuvor beschriebenen Lithiumacetatverfahren transformiert. Die transformierten Klone werden auf einem uracilfreien Medium selektiert und anschließend durch Kolonie-Amplifikation mit Hilfe der Oligonukleotidpaare OTG11285, OTG11289 und
OTG11285, OTG11306, wobei als Matrize ein Extrakt oder ein Präparat von genomischer DNA der Hefe eingesetzt wird, unter den oben beschriebenen Bedingungen durchmustert. Die Kolonien, die die PCR-DNA-Produkte der erwarteten Größe von 1,9 Kb bzw. 1,4 Kb aufweisen, werden anschließend auf einem reichen Medium kultiviert, um eine biologische Umwandlung des 17OH-Progesterons gemäß Dumas et al (Eur J Biochem 1996 Jun 1; 238(2): 495–504 11 beta-hydroxylase activity in recombinant yeast mitochondria. In vivo conversion of 11-deoxycortisol to hydrocortisone) durchzuführen. Die Substratkonzentration beträgt 100 mg/l, die Kohlenstoffquelle ist Galactose und die optische Dichte beträgt 0,1. Das Kulturvolumen beträgt 10 ml, die Inkubationsdauer beträgt 24 Stunden bei 30°C. Nach 24stündiger Inkubation werden die positiven Klone durch Extraktion von einem ml Medium (mit Zellen) mit 2 ml Dichlormethan und anschließender Analyse der organischen Phase mittels Umkehrphasen-Hochdruckchromatographie wie oben beschrieben (Dumas et al 1996) ausgewertet. Die Stämme TGY194 #10 und TGY194#11 sind ohne 20-Keto-Reduktaseaktivität auf 17OH-Progesteron und ergeben in der PCR ein positives Signal.
Das Konstrukt der Disruption des Gens YPR1 (YDR368w) durch das Gen URA3 in dem Plasmid pPOLYIII, um zu pTG12011 zu gelangen, wurde durch vier aufeinanderfolgende PCRs erhalten. Einerseits wurden drei unabhängige PCRs durchgeführt, um den 5'-Teil des Gens YPR1 (PCR 5), das funktionelle URA3-Gen, das von den YPR1-Sequenzen begrenzt ist, (PCR 6), und den 3'-Teil des GCY1-Gens (PCR 7) zu erhalten. Die DNA der PCR5 wurde durch Amplifikation an einer genomischen DNA-Matrize mit den Oligonukleotiden OTG11314 (tacgctcgagACGTTGGTGTCATTGATATTCA, (SEQ ID NO: 7) und OTG11315 (CTTCATTCAAATAGATAGCCG, (SEQ ID NO: 8) erhalten, ebenso wurde die DNA der PCR7 durch Amplifikation mit Hilfe der Oligonukleotide OTG11316 (TATGGCTAAAAAGCACGGCGTT, (SEQ ID NO: 9) und OTG11317 (cgatctcgagTTTCTCGTTGTTCAGGTACTG, (SEQ ID NO: 10) an derselben Matrize erhalten. Das von der YPR1-Region am 5'- und am 3'-Ende flankierte URA3-Gen wird mit Hilfe der Oligonukleotide OTG11463 (CGGCTATCTATTTGAATGAAGatcgattttcaattcaattcatcattttttttttattcttttttttg, (SEQ ID NO: 11) und OTG11464 (AACGCCGTGCTTTTTAGCCATAAGCTTgggtaataactgatataattaaattgaactc, (SEQ ID NO: 12) an einer wie oben beschrieben linearisierten pTG10054-Matrize amplifiziert. Die Produkte der PCR5, PCR6 und PCR7 wurden äquimolar vermischt und anschließend mittels PCR mit Hilfe der Olignukleotide OTG11314 und OTG11317 wie oben amplifiziert, um zu einem 1,X Kb großen PCR8-Produkt zu gelangen. Dieses Produkt PCR8 wurde mit dem Enzym XhoI verdaut und anschließend in das mit XhoI verdaute Plasmid pPOLYIII subkloniert. Die Orientierung der Insertion in das Plasmid pPOLYIII wurde durch Verdauung mit den Enzymen NcoI und EcoRI bestimmt.
Interessanterweise wird beim Plasmid pTG12010 und pTG12011 das Fehlen einer ClaI-Spaltstelle bzw. einer HindIII-Spaltstelle festgestellt. Die Klonierungsverbindungsstellen wurden durch Nukleotidsequenzierung überprüft.
Konstruktion von Stamm TGY195
Das Plasmid pTG12011 wird mit dem Enzym XhoI verdaut, und das Verdauungsprodukt wird anschließend für die Transformation des Stamms Fy 1679-28c unter Verwendung der oben beschriebenen Lithiumchloridmethode zu transformieren. Die Transformanten werden auf einem uracilfreien Medium selektiert. Die Transformanten werden durch Amplifikation mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide, die bei der Konstruktion von Plasmid pTG12011 eingesetzt wurden, amplifiziert. Die in diesem Test positiven Klone werden anschließend mittels der weiter oben beschriebenen Methode der biologischen Umwandlung von 17OH-Progesteron in Gegenwart von Glucose als Kohlenstoffquelle durchmustert. Ein Klon, TGY195#4, wird aufgrund von neuen Eigenschaften ausgewählt.
Konstruktion von Stamm TGY197
Ein Klon, TGY195#4, der eine unter diesen Bedingungen reduzierte 20-Keto-Reduktaseaktivität aufweist, wird für eine neue Transformation mit Hilfe des Plasmids pgcy1::LEU2 wie oben für den Stamm Fy1679-28c beschrieben ausgewählt. Die Klone, die in Abwesenheit von Leucin zu wachsen vermögen, werden anschließend für eine erneute biologische Umwandlung von 17OH-Progesteron wie oben beschrieben in Gegenwart von Glucose oder Galactose ausgewählt. Ein Klon, TGY197#a, mit einer unter den beiden Bedingungen der biologischen Umwandlung verringerten Aktivität wird ausgewählt. So ist die 20-Keto-Reduktaseaktivität, die zu Beginn 12% (bei 100 mg/l Substrat) betrug, auf ungefähr 0,2% reduziert, was also eine Reduktion um mehr als das 60fache darstellt.
Konstruktion von Stamm TGY245
Der Stamm TGY245 wird ausgehend von dem Stamm TGY195#4 konstruiert. Ausgehend von dem Stamm TGY195#4 erhält man zuerst den Stamm TGY212#1, dann den Stamm TGY243#1 und schließlich den Stamm TGY245.
Der Stamm TGY195#4 wird gleichzeitig mit dem Plasmid YRP7 (1 μg) und mit 5 μg des Plasmids pTG12045, verdaut mit NotI, transformiert. Die transformierten Stämme werden auf tryptophanfreiem Medium selektiert. Kolonien (678 Kolonien) werden auf ein tryptophanhaltiges Medium vereinzelt (um sie von dem Plasmid YRP7 zu befreien) und auf einem Medium, das Tryptophan und 5-Fluororotat (5FO) vereinzelt, um auf diejenigen Kolonien zu selektieren, die das URA3-Gen, das das GCY1-Gen unterbricht, verloren haben. Bei dieser Durchmusterung wird eine Kolonie, nämlich TGY212#1, selektiert. Mit dieser Kolonie wird wie oben beschrieben mit 100 μg/ml des Substrats 17OH-Progesteron ein Biokonversationsversuch durchgeführt, der Stamm wird in mit den erforderlichen Aminosäuren und mit Uracil versetztem Minimalmedium gezüchtet. Dieser Stamm ist fähig, 17OH-Progesteron mit einer Umsatzrate in der Größenordnung von 47% in 24 Stunden unter schwacher 4-Pregnen-17α-20α-diol-3-on-Produktion unter diesen Bedingungen (< 0,5%) in 11-Desoxycortisol umzuwandeln. Unter gewissen Bedingungen (reiches definiertes Medium des Kappeli-Typs mit Galactose als Kohlenstoffquelle und Bedienen der Kultur bei hoher Dichte: OD 600 nm = 5), ist die Fähigkeit zur Reduktion des Ketons erhöht, um bei einer auf 1,5% des Ausgangssubstrats reduzierten Biokonversionsfähigkeit 11% des Ausgangssubstrats zu erreichen. Unter diesen Bedingungen beeinflußt das wahrscheinliche Vorliegen des GCY1-Gens die Biokonversion von 17OH-Progesteron negativ. Es wurde daher entschieden, das GCY1-Gen zu disrumpieren, um seine Aktivität zu verhindern.
Zu diesem Zweck wurde der Stamm TGY212#1 mit 3 μg des Plasmids pTG12010#36, das mit den Restriktionsenzymen SphI und EcoRI linearisiert worden war, transformiert. Es wurden 27 Transformanten auf einem für die Auxotrophien von TGY212#1 angereicherten Minimalmedium, das jedoch kein Uracil enthielt, selektiert. Mit diesen Kolonien wurden Biokonversionstests in einem mit Galactose als Kohlenstoffquelle versetzten Minimalmedium durchgeführt, da es sich bei der Galactose um einen bekannten Induktor von GCY1 handelt. Alle TGY243-Klone wiesen die Fähigkeit, 17OH- Progesteron in 11-Desoxycortisol umzuwandeln, auf, jedoch ohne nachweisbare Mengen an 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on zu produzieren. Ein Klon mit der Bezeichnung TGY243#1 wurde selektiert, um anstatt des URA3-Gens eine Expressionskassette für menschliches P450c21 einzuführen.
Dieser Stamm TGY243#1 wird mit dem Plasmid YRP7 (2 μg) und mit dem Plasmid pTG12086, das mit dem Enzym XhoI (5 μg) linearisiert worden war, transformiert. Das transformierende Fragment von pTG12086 enthält die Codiersequenz von GCY1, die durch eine Expressionskassette für das menschliche P450c21 (TDH3::menschliche P450c21-cDNA::PGK°-Terminator) unterbrochen ist. Die Kolonien, die in Abwesenheit von Tryptophan wachsen, werden selektiert. Diese 381 Kolonien werden anschließend auf ein Medium überführt, das Tryptophan und 5-Fluororotat enthält. Ungefähr zehn Kolonien werden anschließend in einem reichhaltigen Medium des YPG-Typs, das mit Tryptophan, Histidin, Leucin und Uracil in einer Konzentration von 50 μg/ml angereichert ist, geprüft. Die Stämme werden 17OH-Progesteron in einer Konzentration von 100 μg/ml ausgehend von OD 600 nm = 0,1 16 Stunden lang umwandeln gelassen.
Unter diesen 10 Klonen wird ein Klon, nämlich TGY245#1D, nach zwei Kriterien ausgewählt, nämlich die Fähigkeit, 17OH-Progesteron zu 11-Desoxycortisol umzuwandeln und zweitens auf fehlende Bildung von 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on, was die Disruption von GCY1 anzeigt.
Eigenschaft der GCY1-defizienten Stämme:
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß das Knock-Out von CGY1 die durch Galactose induzierbare 20α-HSD-Aktivität eliminiert. So wurde die In-vivo-Produktion von 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on ausgehend von 17α-Hydroxyprogesteron (100 μg/ml) an kultivierten Wildstämmen und TGY170-Stämmen (gcyI-Δ::LEU2), die entweder im Glucosemedium oder im Galactosemedium kultiviert wurden, geprüft (3). Bei der Galactosemediumkultur wurde eine ungefähr 95%ige Reduktion der Produktion von 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on des mutierten Stamms im Vergleich zu dem Wildstamm beobachtet. Bei dem Glucosemedium ist die Verringerung schwacher, was offenbar anzeigt, daß das Produkt des GCY1-Gens eine durch Galactose induzierbare 20α-HSD-Aktivität aufweist. Unabhängig von der eingesetzten Kohlenstoffquelle liegt in der Mutante gculI-Δ eine Restaktivität vor, die im wesentlichen identisch ist.
Eigenschaften der GCY1, YPR1-defizienten Doppelmutante:
Angesichts der Tatsache, daß gefunden wurde, daß Gcylp und Yprlp mit der 20α-HSD-Aktivität assoziiert sind (siehe oben), und daß es sich bei Yprlp um das nächste Homolog von Gcylp handelt (Aminosäureidentität 65%), wurde eine doppelte Disruption von GCY1 und von YPR1 durchgeführt und auf ihre 20α-HSD-Aktivität geprüft. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß der für beide Gene defiziente Stamm (TGY197) im wesentlichen frei von 20α-HSD-Aktivität ist.
Insbesondere wurden die Hefen TGY197 (gcy1::LEU2, ypr1::URA3) erzeugt und in vivo auf ihre 20α-HSD-Aktivität geprüft. Die Zellen wurden entweder mit Glucose oder mit Galactose als Kohlenstoffquelle in Gegenwart von 100 μg/ml 17α-Hydroxyprogesteron kultiviert. Nach 72 h kann das 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on in der Fermentationsbrühe nicht nachgewiesen werden, was zeigt, daß die Inaktivierung der beiden Gene zu einer Suppression der nachweisbaren 20α-HSD-Aktivität führt.
Substratspezifität von Wildtyp-Stämmen und mutierten Stämmen
Es wurde eine Reihe von Bestandteilen, die bereits als Substrate für verschiedene Arten von Reduktasen (Aldose-, Aldehyd- und Carbonylreduktasen) beschrieben wurden, an Wildtyp-Homogenisaten und an Mutantenstämmen unter unterschiedlichen Kulturbedingungen geprüft (Tabelle II). Es wurde beobachtet, daß Gcylp und Ypr1P die einzigen Aldo-Keto-Reduktasen aus der Hefe sind, die 17α-Hydroxyprogesteron als Substrat nutzen.
Es scheint, daß Gcylp alle geprüften Substrate nutzt, da in allen Fällen eine Induktion durch Galactose die Aktivität erhöht. Im Glucosemedium wurde bei allen Bestandteilen mit Ausnahme von 17α-Hydroxyprogesteron eine Basalaktivität beobachtet, unabhängig davon, ob GcyIP und YprIp vorhanden oder nicht vorhanden waren. Im Galactosemedium wurde für die beiden geprüften Aldehyde eine hohe Aktivität bei den Mutantenstämmen beobachtet, die jedoch weniger ausgeprägt war als bei den Wildtypstämmen. Dies zeigt, daß ein für Aldehyde spezifisches Enzym, wobei es sich nicht um GcyIP handelt, durch Galactose induzierbar ist.
In einem neulich erschienenen Bericht über die Physiologie von Hefen unter osmotischem Streß wurde GCY1 als reagierend identifiziert. Die Sequenzierung eines aus einer Glyceroldehydrogenase von Aspergillus niger isolierten Peptids zeigte eine Homologie zwischen zwei Hefeproteinen, nämlich Gcylp und Yprlp. Die Induktion von GCY1 unter osmotischem Streß (zusätzlich zu der Induktion durch Galactose) kann anzeigen, daß GCY1 eine Glyceroldehydrogenaseaktivität aufweist, wie dies bei Norbeck und Blomberg vorgeschlagen wurde. Solch eine Aktivität wurde jedoch bis jetzt noch nicht nachgewiesen.
Die Reduktion von 17α-Hydroxyprogesteron zu 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on in S. Cerevisiae beruht in erster Linie auf dem Produkt des GCY-Gens und in geringerem Ausmaß auf dem Produkt des YPR1-Gens. Gemäß der von Jez et al. (1997) vorgeschlagenen Nomenklatur sollten diese Enzyme in die Unterfamilie AKR1C eingereiht werden. Bei den Säugetieren wurden HSDs, die zur AKR-Familie gehören, vorgeschlagen, um die Verfügbarkeit von Steroidhormonen zu regulieren. Die physiologische Rolle dieser Enzyme bei der Hefe ist nach wie vor unbekannt, da man annimmt, daß die Hefen in einer natürlichen Umgebung nicht der Gegenwart von Steroiden ausgesetzt sein können. Was immer die biologische Bedeutung solch einer Aktivität in der Hefe ist, ihre Entfernung trägt zur Verbesserung der Produktion von Corticosteroiden von Hefen bei, insbesondere von erfindungsgemäß genetisch modifizierten Hefen.
Beispiel für die Biokonversion mit menschlichem P450c21 in der Hefe in Gegenwart und Abwesenheit von GCY1 und YPR1.
Um zu zeigen, daß die Disruption von GCY1 und YPR1 für eine spezifische Biokonversion in der Hefe S. cerevisiae unerläßlich ist, wurde die Fähigkeit der Stämme Fy1679-28c/pTG10497 (Fy/pTG10497), TGY212#1 und TGY245#2D zur Biokonversion von 17OH-Progesteron verglichen.
Der Stamm Fy/pTG10497 trägt die beiden Wildgene GCY1 und YPR1 und das Ein-Kopie-Plasmid des ARSCEN-Typs („Autonomously Replicating Sequence Centromére") für die Expression von Human-P450c21. Die cDNA des Human-P450c21 steht in diesem Plasmid unter der Kontrolle des TEF1-Promoters.
Der STamm TG212#1 trägt eine in den YPR1-Lokus integrierte Kopie der Expressionskassette des Gens für das Human-P450c21 (TEF1::Human-P450c21::PGK-Terminator) und verfügt über eine Wildtypkopie des GCY1-Gens. TGY245#2D verfügt über keine Kopien des YPR1- und des GCY1-Gens, statt dessen sind in jeden der Loci eine Kopie der Kassette TEF1::Human-P450c21 bzw. eine Kopie von TDH3:P450c21 integriert.
Diese Stämme wurden in Minimalmedium mit einem Zusatz von Casaminosäuren 48 Stunden lang kultiviert. Die Stämme werden dann in frischem Kappeli-Medium mit einem Zusatz von Uracil, Histidin und Tryptophan in Gegenwart von 200 mg/l 17OH-Progesteron suspendiert. Nach 72 stündiger Inkubation wird das Medium in Gegenwart der Hefezellen extrahiert und wie oben durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert. Das Vorhandensein von 17OH-Progesteron, 11-Desoxycortisol und 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on wird bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle III dargestellt. Jedes Produkt ist in Prozent der Gesamtheit der Produkte ausgedrückt.
Aus diesem Versuch geht klar hervor, daß die Disruption von GCY1 und YPR1 signifikant die Menge an 4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on von 7–11% auf ein Niveau jenseits unserer Nachweisgrenzen (Empfindlichkeit von 0,5 bis 1 mg/l) verringert.
LITERATUR

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Tabelle I

ORF	Bezeichnung des Gens	% Aminosäureidentität mit 20αHSD
YOR120W	GCY1	44
YDR368W	YPR1	43
YHR104W	-	41
YBR149W	-	40
YJR096W	-	39
YDL124W	-	32

Tabelle III

Produkt	Fy/10497	TGY212#1	TGY245#2D
17OH-Progesteron	74	87	28
11-Desoxycortisol	19	20	82
4-Pregnen-17α,20α-diol-3-on	7	11	0

Tabelle II

	Fy1679.28c		TGY170		TGY197
	Glucose	Galactose	Glucose	Galactose	Glucose	Galactose
Xylose	8	50	5	8	3	5
Methylglyoxal	75	376	92	88	56	104
Glyceraldehyd	32	1119	40	357	42	384
Nitrobenzaldehyd	59	1117	69	334	50	395
17α-Hydroxyprogesteron	0,04	1,44	0,006	0,01	nd	nd
Die Aktivitäten sind in μM/min/mg Protein angegeben nd: Nicht detektiert

SEQUENZBESCHREIBUNG
SCHLÜSSEL ZU DEN FIGUREN
1:

Figure → Figur

2:

Figure → Figur
Temps → Zeit
4-pregnene-17a,20a-diol-3-one → 4-Pregnen-17a,20a-diol-3-on

3:

Figure → Figur
4-pregnene-17a,20a-diol-3-one → 4-Pregnen-17a,20a-diol-3-on

4, 5:

Figure → Figur
Partie E. coli → Teil E. coli
pb → Bp
ou → oder
Replicon E. coli et gène de résistance à l'ampicilline (β-lactamase) → E. coli-Replikon und Ampicillin-Resistenzgen (β-Lactamase)

6:

Figure → Figur
Replicon E. coli et gène de résistance à l'ampicilline (β-lactamase) → E. coli-Replikon und Ampicillin- Resistenzgen (β-Lactamase)
pb → Bp
Partie → Teil

Claims

Hefestamm mit einer verringerten 20α-Hydroxysteroiddehydrogenase (20α HSD)-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß er folgendes aufweist: – eine genetische Modifikation, die das GCY1-Gen inaktiviert, oder – eine genetische Modifikation, die das YPR1-Gen inaktiviert, oder – eine genetische Modifikation, die das GCY1- und das YPR1-Gen inaktiviert, mit Ausnahme der Stämme gcyD0 und gcyDD0.
Hefestamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Genmodifikation mindestens eine Mutation, Substitution, Deletion und/oder Insertion von einem oder mehreren Basenpaaren in der Regulator- oder Codierregion des bzw. der betreffenden Gene umfaßt.
Hefestamm nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der genetischen Modifikation um eine vollständige oder teilweise Deletion des bzw. der betroffenen Gene handelt.
Hefestamm nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die teilweise oder vollständige Deletion des bzw. der betroffenen Gene mittels der Gendisruptionstechnik durch heterologe Sequenzen ersetzt wird.
Hefestamm nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der heterologen Sequenz um ein Auxotrophieselektionsgen, das einen Nährstoffanspruch des Wirtshefenstamms komplementiert, ein dominantes Selektionsgen wie ein Antibiotikumresistenzgen oder ein Reportergen handelt.
Hefestamm nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Auxotrophieselektionsgen um das URA3-Gen, das LEU2-Gen, das TRP1-Gen, das HIS3-Gen oder das ADE2-Gen handelt.
Hefestamm nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Hefe der Gattung Saccharomyces handelt.
Hefestamm nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Saccharomyces cerevisiae-Hefe handelt.
Hefestamm nach einem der Ansprüche 1 bis 8, der ein disrumpiertes GCY1- und YPR1-Gen umfaßt.
Verfahren zur Herstellung von Steroidderivaten aus Hydroxysteroidverbindungen, bei denen man eine Hefe einsetzt, die eine verringerte 20α-Hydroxysteroiddehydrogenase (20αHSD)-Aktivität aufweist und ein nicht funktionelles GCY1- und/oder YPR1-Gen aufweist, oder ein von solch einer Hefe stammendes Präparat.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Hefe folgendes aufweist: – eine genetische Modifikation, die das GCY1-Gen inaktiviert, oder – eine genetische Modifikation, die das YPR1-Gen inaktiviert, oder – eine genetische Modifikation, die das GCY1- und das YPR1-Gen inaktiviert.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei es sich bei dem Hydroxysteroid um Hydroxyprogesteron oder seine Vorstufen handelt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem Hydroxysteroid um 17α-Hydroxyprogesteron und bei dem Steroidderivat und um 11-Desoxycortisol handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefe ein disrumpiertes GCY1- und YPR1-Gen aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Hefe um eine Hefe der Gattung Saccharomyces handelt.
Verwendung einer Hefe, die eine verringerte 20α-Hydroxysteroiddehydrogenase (20αHSD)-Aktivität aufweist und ein nicht funktionelles GCY1- und/oder YPR1-Gen aufweist, oder eines von solch einer Hefe stammenden Präparats für die in-vitro oder ex-vivo Herstellung, Produktion, -Synthese und/oder -Modifikation von Steroidverbindungen.
Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefe folgendes aufweist: – eine genetische Modifikation, die das GCY1-Gen inaktiviert, oder – eine genetische Modifikation, die das YPR1-Gen inaktiviert, oder – eine genetische Modifikation, die das GCY1- und das YPR1-Gen inaktiviert.
Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefe ein disrumpiertes GCY1- und YPR1-Gen aufweist.
Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Hefe um eine Hefe der Gattung Saccharomyces handelt.