CN115975962A

CN115975962A - 网状路径产物定向合成

Info

Publication number: CN115975962A
Application number: CN202211741254.XA
Authority: CN
Inventors: 元英进; 张若思; 王颖; 肖文海; 姚明东
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及网状路径产物定向合成。与利用天然微生物内源路径转化甾体底物相比，本发明在酵母底盘下，利用重新构建人工异源网状路径，通过理性组合路径组分蛋白，可实现定向合成节点产物。通过组合表达不同催化特异性的路径组分同源蛋白，可实现路径转化效率的进一步提升。同时利用在微生物底盘下构建人工孕烯醇酮合成路径，并通过引入特定下游雄烯二酮合成路径组分，实现以简单碳源为底物，定向合成雄烯二酮路径节点化合物。

Description

网状路径产物定向合成

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及网状路径产物定向合成。

背景技术

脊索动物中，甾体类激素合成路径由众多非特异性催化酶组成，这些酶可修饰多种结构相似的底物，因而酶之间往往共用多个底物，路径间反应交叉最终使得甾体合成路径呈现呈复杂网状催化，这大大增加了微生物定向异源合成网状路径中间节点化合物的难度。

甾体激素是一类以环戊烷多氢菲母核为基本结构是四环脂肪族碳氢化合物，该类化合物种类繁多，目前全世界生产的甾体药物已有400多种，以其抗炎、抗过敏、调节内分泌等功效得到广泛应用，到2017年甾体激素药物全球销售额达1000亿美元，为第二大类化学药物。由CYP17-3β-HSD构成的“孕烯醇酮-雄烯二酮”合成路径位于脊椎动物类固醇合成途径中的交叉路口，其中包含多种甾体激素药物的关键前体(孕烯醇酮、孕酮、17-羟基孕酮、17-羟基孕烯醇酮、DHEA、雄烯二酮、睾酮)。

甾体激素中间体生产工艺的发展历经植物提取皂素法、化学全合成法、半合成法、新型的微生物合成法等阶段。植物提取法和微生物转化法是生产甾体激素类药物的主要方法。但动植物提取法成本较高，来源受限、同时伴有环境污染等问题。化学全合成甾体分子会涉及流程长、反应复杂、环境污染等局限。

与从动物来源分离甾体相比，微生物合成甾体具有低病毒/朊病毒污染的风险。微生物合成甾体也可以避免化学合成涉及的繁琐反应步骤。在过去的研究中，酿酒酵母、大肠杆菌、解脂耶氏酵母都被应用于孕烯醇酮或其他甾体合成的研究中，其中酿酒酵母的实验中，实现了由葡萄糖为底物从头合成孕烯醇酮及下游产物氢化可的松，酿酒酵母、大肠杆菌、解脂耶氏酵母实现了由生物转化甾醇底物合成孕烯醇酮。通过引入P450scc催化系统至酿酒酵母或大肠杆菌中，并在培养环境中添加P450scc催化系统的直接底物甾醇，可实现孕烯醇酮的生物转化。在异源表达P450scc系统及P450c17系统的解脂酵母二倍体底盘细胞的培养环境中进行固醇饲喂，可使之以甾醇为底物进行生物转化，用于合成孕烯醇酮或17α-羟基孕烯醇酮。而甾体类较强的疏水性、常用微生物分枝杆菌的鲁棒性较差、灭菌成本较高，使微生物转化效率较低。

合成生物学提供了一种新的微生物合成法，人工构建异源合成路径的功能微生物，能低能耗、高效、环境友好地生产特定结构的甾体激素类药物，可以仅以葡萄糖、甘油等为单一碳源即可生产特定甾体类化合物。1998年，Catherine Duport等通过敲除酿酒酵母固有基因erg5并引入外源基因DHCR7，实现了菜油甾醇的合成，提供了孕烯醇酮的合成前体；而后引入牛来源的P450scc催化系统和3β-HSD，实现了以葡萄糖为底物，孕酮的从头合成。2019年，本课题组基于高产菜油甾醇底盘，通过酶来源筛选和启动子辅配，构建了从头合成孕烯醇酮的解脂酵母工程菌。2003年，Florence Ménard Szczebara等在高产孕酮的酿酒酵母底盘基础上，对ATF2敲除，同时引入CYP17A1、CYP21A1、CYP11B1，成功实现了氢化可的松的从头合成。2019年，专利US10400261B2基于酿酒酵母，对氢化可的松路径基因进行多拷贝整合，获得了氢化可的松高产菌株。

皮质激素、雄激素和雌激素类固醇已被广泛应用于医疗领域。这些位于动物类固醇激素合成路径的下游产物的合成，都需经历Δ⁵-向Δ⁴-型类固醇转化的过程(Δ⁵-和Δ⁴-：分别位于5.6和4.5位的烯类双键)，该过程以孕烯醇酮(P5)为底物，经3β-羟类固醇脱氢酶(3β-hsd)和17α-羟化酶/17，20-裂解酶(Cyp17)协同催化。其中CYP17以Δ⁵-和Δ⁴-类固醇为底物，进行17α-羟基化修饰，同时在细胞色素b5(Cyb5)参与的条件下，CYP17会表现更强17，20-裂解酶活性(C17-C20键解理)，CYP17可对；而3β-HSD具有异构酶活性，可将Δ⁵-类固醇转化为相应的Δ⁴-异构体，并实现代谢通量由Δ⁵-路径向Δ⁴-路径迁移。然而在以孕烯醇酮为底物合成Δ⁴-类固醇的过程中，由于CYP17和3β-HSD之间共享多个底物，17α-羟基化、17，20-裂解和Δ⁵-Δ⁴异构化不是严格按顺序发生的，这给异源定向合成目标Δ⁴-类固醇带来很大挑战。

甾体类激素往往对微生物具有毒性。在含有甾体化合物的环境下，微生物内源代谢可对外源甾体母核进行修饰(羟化等)以降低其细胞毒性。利用这个特性，人们利用分枝杆菌(Mycobacterium)等微生物内源代谢为媒介实现以甾醇、甾体中间体为底物通过生物转化合成目标甾体。

传统利用微生物内源代谢生物转化甾体类底物合成目标甾体存在以下缺点：①传统生物转化微生物底盘对甾体母核较强修饰能活性可能不适宜特定目标甾体化合物合成需要，同时可能会与目标合成路径竞争甾体底物，造成副产物积累与底物损失。因此选用代谢背景较为纯净和清晰的解脂耶氏酵母底盘更具优势。②分枝杆菌(Mycobacterium)等传统生物转化微生物甾体内源修饰路径中，许多关键催化反应相关基因尚不明确，这大大增加了生物转化过程中实现中间节点产物定向合成的路径改造难度。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了网状路径产物定向合成。

本发明提供了网状路径产物定向合成。与利用天然微生物内源路径转化甾体底物相比，本发明在酵母底盘下，利用重新构建人工异源网状路径，通过理性组合路径组分蛋白，可实现定向合成节点产物。通过组合表达不同催化特异性的路径组分同源蛋白，可实现路径转化效率的进一步提升。同时利用在微生物底盘下构建人工孕烯醇酮合成路径，并通过引入特定下游雄烯二酮合成路径组分，实现以简单碳源为底物，定向合成雄烯二酮路径节点化合物。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了表达如下任意项在合成甾体类化合物和/或甾体激素药物中的应用：

(I)、来源于Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Xenopuslaevis的CYP17A1和POR；和/或

(II)、来源于Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Sus scrofa的CYB5；和/或

(III)、来源于Mus musculus、Bos taurus、Vaccinia virus、Arabidopsisthaliana、Mycobacterium tuberculosis、Homo sapiens(I型)、Homo sapiens(II型)、Homosapiens(I型，L237S突变)或Homo sapiens(II型，L236S突变)的3β-HSD；和/或

(IV)、来源于Sus scrofa的mCYP11A1。

在本发明的一些具体实施方案中，所述CYP17A1、POR、CYB5、3β-HSD和/或mCYP11A1经过密码子优化，添加序列1和/或序列2合成得到；

所述密码子优化采用的为解脂耶氏酵母；

所述序列1添加5’端，所述序列1包括：

(Ⅰ)、如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

(Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(Ⅳ)、与(Ⅰ)～(Ⅲ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；

所述序列2添加3’端，所述序列2包括：

(Ⅰ)、如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或

所述甾体包括：孕烯醇酮、孕酮、17-羟孕酮、17-羟孕烯醇酮、去氢表雄酮、雄烯二酮和/或睾酮；

以所述孕烯醇酮(P5)为底物的转化实验中，表现出最强孕烯醇酮转化效率的为Vv_3β-HSD；所述转化效率为6.8％；表现了次强催化效率的包括I型人源及突变体3β-HSD；所述催化效率为4.6～4.8％；

以17-羟基孕烯醇酮(17OHP5)为底物的转化实验中，表现出较强转化效率的包括I型人源及突变体3β-HSD、II型人源及突变体3β-HSD；所述I型人源3β-HSD得孕酮转化率最高为3.1％；

以所述去氢表雄酮(DHEA)为底物，表现较强催化活性的包括II型人源、牛源、分枝杆菌源3β-HSD；所述II型人源3β-HSD转化效率为10.5％。

本发明还提供了模块，包括表达如下任意项：

(II)、来源于Equus caballus、Ovis aries或Mesocricetus auratus或Susscrofa的CYB5；和/或

(IV)、来源于Sus scrofa的mCYP11A1。

在上述研究的基础上，本发明还提供了质粒，包括所述表达元件。

本发明还提供了宿主，包括所述质粒。

在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主包括模块一、模块二、模块三、模块四、模块五、模块六、模块七、模块A、模块B、模块C或模块D中的一种或多种：

所述模块一包括来源于Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Xenopus laevis的CYP17A1和POR；所述模块一包括IntD整合位点和/或两端带有LoxP位点的Leu2标签；和/或

所述模块二包括来源于Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Susscrofa的CYB5；所述模块二包括IntB整合位点和/或Ura3标签；和/或

所述模块三包括来源于Mus musculus、Bos taurus、Vaccinia virus、Arabidopsis thaliana、Mycobacterium tuberculosis、Homo sapiens(I型)、Homosapiens(II型)、Homo sapiens(I型，L237S突变)或Homo sapiens(II型，L236S突变)的3β-HSD；所述模块三连接的载体包括pINA1269-Nat；和/或

所述模块四包括来源于Equus caballus的CYP17A1和POR；所述模块四包括IntF整合位点和/或两端带有LoxP位点的Leu2标签；和/或

所述模块五包括：来源于Ovis aries的CYP17A1和POR；所述模块五敲除Leu2标签；和/或

所述模块六包括；来源于Homo sapiens(II型)的3β-HSD；所述模块六包括IntC整合位点和/或两端带有LoxP位点的Leu2标签；和/或

所述模块七包括：来源于Mesocricetus auratus的CYP17A1和POR、来源于Homosapiens(II型)的3β-HSD和来源于Vaccinia virus的3β-HSD；所述CYP17A1和POR包括IntD整合位点和/或两端带有LoxP位点的Leu2标签；所述来源于Vaccinia virus的3β-HSD连接的载体包括pINA1269-Nat；所述来源于Homo sapiens(II型)的3β-HSD连接的载体包括pUC57-Kan-Simple；和/或

所述模块A包括：来源于Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Xenopus laevis的CYP17A1和POR；所述模块A包括IntD整合位点和/或两端带有LoxP位点的Leu2标签；和/或

所述模块B包括：来源于Equus caballus、Ovis aries或Mesocricetus auratus的CYB5；所述模块B包括IntB整合位点和/或Ura3标签；和/或

所述模块C包括：来源于Mus musculus、Bos taurus、Vaccinia virus、Arabidopsis thaliana、Mycobacterium tuberculosis或Homo sapiens(II型)的3β-HSD和来源于Sus scrofa的mCYP11A1；所述模块C连接的载体包括pINA1269；和/或

所述模块D包括：来源于Ovis aries和Mesocricetus auratus的CYP17A1和POR；所述模块D包括IntF整合位点和/或两端带有LoxP位点的Leu2标签。

在本发明的一些具体实施方案中，所述模块一的构建包括：IntD整合位点左臂，终止子1拼接；将终止子2末端序列、两端带有LoxP位点的亮氨酸营养筛选标签Leu2、IntD整合位点右臂拼接得IntD-L和IntD-R；CYP17A1和POR与经BsmBI酶切后的表达模块连接得到整合质粒，将带有相同物种来源的CYP17A1和POR模块与pUC18H组装，得到整合质粒，经过酶切后获得模块一；

所述终止子1为酿酒酵母GPM1t终止子；所述终止子2为酿酒酵母FBA1t；

所述拼接的方法包括OE-PCR；所述表达模块包括TEF1inp-LIP2t-GPDt、GPDt-TEF1inp-OCT1t-FBA1t；所述CYP17A1和POR模块来源包括Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Xenopus laevis；所述pUC18H为IntD-L、IntD、HincII酶切后的pUC18H；所述组装采用的方法包括Gibson；所述酶切包括采用NotI酶切。

在本发明的一些具体实施方案中，所述模块二的构建包括：将IntB整合位点左臂、标签、IntB整合位点右臂、启动子、终止子分别和CYB5通过拼接起来得到整合质粒，经过酶切后获得模块二；

所述标签包括营养缺陷型尿嘧啶标签Ura3；所述启动子包括TEF1in；所述终止子包括ACOt；所述CYB5来源包括Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Susscrofa；所述拼接采用的方法包括Gibson；所述酶切包括采用NotI酶切。

在本发明的一些具体实施方案中，所述模块三的构建包括：3β-HSD通过组装整合入载体，通过PCR反应在上述基因5'端引入序列3，以及在基因3'端引入序列4，经过线性化的载体组装后，整合重组质粒，即模块三；

所述3β-HSD来源包括Mus musculus、Bos taurus、Vaccinia virus、Arabidopsisthaliana、Mycobacterium tuberculosis、Homo sapiens(I型)、Homo sapiens(II型)、Homosapiens(I型，L237S突变)或Homo sapiens(II型，L236S突变)；

所述载体包括pINA1269-Nat；

所述序列3包括：

(Ⅰ)、如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或

所述序列4包括：

(Ⅰ)、如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或

所述线性化采用的酶包括BamHI、KpnI；

所述3β-HSD来源于Homo sapiens(I型)的活性较高且以DHEA为主要底物，所述3β-HSD来源于Homo sapiens(II型)倾向以P5和17OHP5为底物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述模块四的构建包括：将IntF整合位点左臂、pUC18H、两端带有LoxP位点的亮氨酸营养筛选标签Leu2、IntF整合位点右臂、CYP17A1和POR(方法同模块一构建)通过拼接起来得到两端包含酶切位点的片段，经过酶切后获得模块四；

所述pUC18H为HincII酶切后的pUC18H；

所述CYP17A1和POR来源包括Equus caballus；

所述拼接采用的方法包括Gibson；所述酶切位点包括NotI；所述酶切包括采用NotI酶切。

在本发明的一些具体实施方案中，所述模块五的构建包括：敲除SyBE_Yl2091004的Leu2筛选标记，获得无Leu2标签的SyBE_Yl2091004；

所述敲除采用的方法包括Cre-loxP系统。

在本发明的一些具体实施方案中，所述模块六的构建包括：将IntC整合位点左臂、人工启动子hp8d、Hs_3β-HSD2、解脂耶氏酵母终止子OCTt、两端带有LoxP位点的亮氨酸营养筛选标签Leu2、IntC整合位点右臂通过OE-PCR方法拼接起来得到两端包含NotI酶切位点的片段；上述片段与经HindIII线性化的质粒pUC57-Kan-Simple连接得到整合质粒。

在本发明的一些具体实施方案中，所述模块七的构建包括：将表达黄金仓鼠(Mesocricetus auratus)来源CYP17A1-POR的模块一、模块六、表达Vv_3β-HSD的模块三同时整合入ATCC201249。

在本发明的一些具体实施方案中，所述模块A的构建包括：所述模块A的构建包括：IntD整合位点左臂，终止子1拼接；将终止子2末端序列、两端带有LoxP位点的亮氨酸营养筛选标签Leu2、IntD整合位点右臂拼接得IntD-L和IntD-R；CYP17A1和POR与经BsmBI酶切后的表达模块连接，将带有相同物种来源的CYP17A1和POR模块与IntD-L、IntD-R、pUC18H组装，得到整合质粒，经过酶切后获得模块A；

所述拼接的方法包括OE-PCR；所述表达模块包括TEF1inp-LIP2t-GPDt、GPDt-TEF1inp-OCT1t-FBA1t；所述CYP17A1和POR模块来源包括Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Xenopus laevis；所述pUC18H为IntD-L、IntD、HincII酶切后的pUC18H；所述组装采用的方法包括Gibson；所述酶切包括采用NotI酶切；

所述整合质粒包括pIntD-Oa_CYP17-POR、pIntD-Ma_CYP17-POR、pIntD-Ec_CYP17-POR、pIntD-Xl_CYP17-POR。

在本发明的一些具体实施方案中，所述模块B的构建包括：将IntB整合位点左臂、标签、IntB整合位点右臂、启动子、终止子分别和CYB5通过拼接起来得到整合质粒，经过酶切后获得模块B；

所述标签包括营养缺陷型尿嘧啶标签Ura3；所述启动子包括TEF1in；所述终止子包括ACOt；所述CYB5来源包括Equus caballus、Ovis aries或Mesocricetus auratus；所述拼接采用的方法包括Gibson；所述酶切包括采用NotI酶切。

在本发明的一些具体实施方案中，所述模块C的构建包括：mCYP11A1分别整合于带有启动子1的表达盒中、3β-HSD分别整合于带有启动子2的表达盒中，并将mCYP11A1表达盒与3β-HSD表达盒通过组装入经酶切后的pINA1269整合质粒，最后经NotI酶切后将质粒线性化，得到模块C；

所述mCYP11A1来源包括Sus scrofa；所述启动子1包括TEF1p；所述3β-HSD来源包括Mus musculus、Bos taurus、Vaccinia virus、Arabidopsis thaliana、Mycobacteriumtuberculosis或Homo sapiens(II型)；所述启动子2包括EXP1p；所述组装采用的方法包括Gibson；所述pINA1269酶切采用的酶包括SalI、ClaI。

在本发明的一些具体实施方案中，所述模块D的构建包括：将IntF整合位点左臂、pUC18H、两端带有LoxP位点的亮氨酸营养筛选标签Leu2、IntD整合位点右臂、CYP17A1和POR模块通过拼接起来得到两端包含酶切位点的片段，经过酶切后获得模块D；

所述pUC18H为HincII酶切后的pUC18H；所述CYP17A1和POR模块来源包括Ovisaries和Mesocricetus auratus；所述拼接采用的方法包括Gibson；所述酶切位点包括NotI；所述酶切包括采用NotI酶切。

本发明还提供了如下任意项在合成甾体类化合物和/或甾体激素药物中的应用：

(I)、所述表达元件；和/或

(II)、所述质粒；和/或

(III)、所述宿主。

在本发明的一些具体实施方案中，所述甾体类化合物和/或甾体激素药物包括孕酮、孕烯醇酮、17-羟孕烯醇酮、17-羟孕酮、去氢表雄酮、雄烯二酮和/或睾酮；

在本发明的一些具体实施方案中，所述孕酮利用碳源和/或3β-HSD在微生物底盘中从头合成。

在本发明的一些具体实施方案中，所述17-羟孕酮利用碳源、3β-HSD、CYP17A1和POR在微生物底盘中从头合成。

在本发明的一些具体实施方案中，所述17-羟孕烯醇酮利用碳源、CYP17A1和POR在微生物底盘中从头合成。

在本发明的一些具体实施方案中，所述去氢表雄酮利用碳源、CYP17A1、POR和/或CYB5在微生物底盘中从头合成。

在本发明的一些具体实施方案中，所述雄烯二酮和睾酮利用碳源、CYP17A1、POR、CYB5和/或3β-HSD在微生物底盘从头合成。

在本发明的一些具体实施方案中，所述碳源包括葡萄糖；所述微生物底盘包括高产菜油甾醇解脂耶氏酵母底盘菌株SyBE_Yl2060077和/或野生型解脂耶氏酵母菌株ATCC201249；

所述CYP17A1和POR来源包括Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetusauratus或Xenopus laevis；

所述CYB5来源包括Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Susscrofa。

在本发明的一些具体实施方案中，所述雄烯二酮的定向合成包括表达3β-HSD的上游模块与表达CYP17A1、POR和/或CYB5的下游模块混合共培养。

在本发明的一些具体实施方案中，所述3β-HSD的来源包括Bos taurus；所述CYP17A1、POR和/或的CYB5来源包括Mycobacterium tuberculosis和/或Ovis aries；

在本发明的一些具体实施方案中，所述上游模块包括包括所述模块C；

所述下游模块包括所述模块A、所述模块B、所述模块四、所述模块二或所述模块五中的一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述上游模块的构建包括：所述mCYP11A1于启动子1下表达，所述3β-HSD于启动子2下表达，二者同时整合至pBR322位点；所述启动子1包括TEF1p；所述启动子2包括EXP1p；

所述下游模块的构建包括：所述CYP17A1和POR均于启动子下表达，整合于底盘菌株基因组IntD位点上；所述启动子包括TEF1inp；所述底盘菌株包括高产菜油甾醇解脂耶氏酵母底盘菌株SyBE_Yl2060077和/或野生型解脂耶氏酵母菌株ATCC201249。

在本发明的一些具体实施方案中，雄烯二酮的定向合成量最高的组合包括表达所述模块C的宿主与表达所述模块五、所述模块四和/或模块二的宿主混合共培养；所述模块C选自Bos taurus来源；所述模块二选自Equus caballus来源。

在本发明的一些具体实施方案中，所述17-羟孕酮的合成包括共表达孕烯醇酮路径和/或3β-HSD的上游模块与仅表达CYP17A1，CYB5和POR的下游模块混合共培养。

所述17-羟孕酮的合成最高的组合包括表达所述模块C的宿主与表达所述模块A和/或模块B的宿主混合共培养；所述模块C选自Bos taurus来源；所述模块A和/或模块B选自Ovis aries来源。

在本发明的一些具体实施方案中，所述雄烯二酮的定向合成和/或17-羟孕酮的合成中对甾体类底物高效17α-羟基化的CYP17A1包括Mesocricetus auratus来源和/或Ovisaries来源。

在本发明的一些具体实施方案中，所述雄烯二酮的定向合成和/或17-羟孕酮的合成中对甾体类底物高效17,20-裂解活性的CYP17A1包括Mesocricetus auratus来源和/或Equus caballus来源。

在本发明的一些具体实施方案中，以所述P5为底物合成P4、17OHP5、17OHP4或DHEA中的一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，以所述P5为底物合成P4包括表达3β-HSD；所述3β-HSD来源包括Vaccinia virus、Bos taurus、Mycobacterium tuberculosis、Homosapiens(I型)或Homo sapiens(II型)中的一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，以所述P5为底物合成17OHP5包括共表达CYP17A1、POR；所述CYP17A1和POR来源包括Ovis aries和/或Mesocricetus auratus。

在本发明的一些具体实施方案中，以所述P5为底物合成17OHP4包括共表达3β-HSD、CYP17A1和POR；所述3β-HSD来源包括Homo sapiens(II型)和/或Vaccinia virus；所述CYP17A1和POR来源包括Ovis aries。

在本发明的一些具体实施方案中，以所述P5为底物合成DHEA包括共表达CYP17A1、POR和/或CYB5；所述CYP17A1、POR来源包括Ovis aries和/或Equus caballus；所述CYB5来源包括Equus caballus。

在本发明的一些具体实施方案中，以所述17OHP5为底物合成17OHP4。

在本发明的一些具体实施方案中，以所述17OHP5为底物合成17OHP4包括表达3β-HSD；所述3β-HSD来源包括Homo sapiens(I型)和/或Homo sapiens(II型)。

在本发明的一些具体实施方案中，以所述17OHP5为底物合成DHEA。

在本发明的一些具体实施方案中，以所述17OHP5为底物合成DHEA包括共表达CYP17A1、POR和/或CYB5；所述CYP17A1、POR来源包括Ovis aries；所述CYB5来源包括Mesocricetus auratus、Equus caballus或Sus scrofa。

在本发明的一些具体实施方案中，以所述DHEA为底物合成4AD和TS。

在本发明的一些具体实施方案中，以所述17OHP5为底物合成17OHP4包括表达3β-HSD；所述3β-HSD来源包括Vaccinia virus、Mycobacterium tuberculosis、Homo sapiens(I型)、Homo sapiens(II型)或Bos taurus的一种或多种；

在本发明的一些具体实施方案中，以所述17OHP4合成4AD和TS。

在本发明的一些具体实施方案中，以所述7OHP4合成4AD和TS包括共表达CYP17A1、POR和/或CYB5；所述CYP17A1、POR来源包括Mesocricetus auratus、Equus caballus或Ovisaries；所述CYB5来源包括Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Susscrofa。

本发明提供了一种通过组合表达不同路径模块，实现复杂网状路径节点路径产物定向合成的方法；

a)如：雄烯二酮的定向合成(如实施例7所述)；

b)如：17-羟孕酮的合成：上游模块菌：共表达孕烯醇酮路径和3β-HSD；下游模块菌：仅表达CYP17A1，CYB5和POR。混菌共培养上游模块和下游模块即可实现由葡萄糖合成17-羟孕酮；

两种在异源合成中，可对甾体类底物高效17α-羟基化的CYP17A1：Ma_CYP17A1、Oa_CYP17A1；

两种在异源合成中，具备对甾体类底物高效17，20-裂解活性的CYP17A1：Ma_CYP17A1、Ec_CYP17A1；

酵母底盘中组合表达特定网状路径产物实现节点产物定向合成；

a)以P5为底物合成P4：表达3β-HSD；

b)以P5为底物合成17OHP5：共表达CYP17A1、POR；

c)以P5为底物合成17OHP4：共表达3β-HSD、CYP17A1、POR；

d)以P5为底物合成DHEA：共表达CYP17A1、POR、CYB5；

组合表达催化特异性互补的同源蛋白，构建高效生物转化合成路径；

a)对于以P5为底物合成P4：单表达Vv_3β-HSD；

b)对于以P5为底物合成P4：单表达Bt_3β-HSD；

c)对于以P5为底物合成P4：单表达Mt_3β-HSD；

d)对于以P5为底物合成P4：单表达Hs_3β-HSD1(I型人源Hs_3β-HSD)；

e)对于以P5为底物合成P4：单表达Hs_3β-HSD2(II型人源Hs_3β-HSD)；

f)对于以P5为底物合成P4：组合表达a)～e)中3β-HSD；

g)对于以17OHP5为底物合成17OHP4：单表达Hs_3β-HSD1(I型人源Hs_3β-HSD)；

h)对于以17OHP5为底物合成17OHP4：单表达Hs_3β-HSD2(II型人源Hs_3β-HSD)；

i)对于以17OHP5为底物合成17OHP4：组合表达Hs_3β-HSD1和Hs_3β-HSD2；

j)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：单表达Vv_3β-HSD；

k)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：单表达Mt_3β-HSD；

l)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：单表达Hs_3β-HSD1(I型人源Hs_3β-HSD)；

m)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：单表达Hs_3β-HSD2(II型人源Hs_3β-HSD)；

n)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：单表达Bt_3β-HSD2；

o)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：组合表达j)～n)中3β-HSD；

p)对于以P5为底物合成DHEA：共表达Oa_CYP17A1、Oa_POR、Ec_CYP17A1、Ec_POR、Ec_CYB5；

q)对于以P5为底物合成17OHP4：共表达Hs_3β-HSD2(II型人源Hs_3β-HSD)、Vv_3β-HSD、Oa_CYP17A1、Oa_POR；

r)对于以P5为底物合成17OHP5：共表达Oa_CYP17A1、Oa_POR；

s)对于以P5为底物合成17OHP5：共表达Ma_CYP17A1、Ma_POR；

t)对于以P5为底物合成17OHP5：组合表达r)～s)中CYP17A1和POR；

u)对于以17OHP5合成DHEA：共表达Oa_CYP17A1、Ma_CYB5、Oa_POR；

v)对于以17OHP5合成DHEA：共表达Oa_CYP17A1、Ec_CYB5、Oa_POR；

w)对于以17OHP5合成DHEA：共表达Oa_CYP17A1、Ss_CYB5、Oa_POR；

x)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ma_CYP17A1、Ss_CYB5、Ma_POR；

y)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ec_CYP17A1、Ss_CYB5、Ec_POR；

z)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Oa_CYP17A1、Ss_CYB5、Oa_POR；

aa)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ma_CYP17A1、Ec_CYB5、Ma_POR；

ab)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ec_CYP17A1、Ec_CYB5、Ec_POR；

ac)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Oa_CYP17A1、Ec_CYB5、Oa_POR；

ad)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ec_CYP17A1、Oa_CYB5、Ec_POR；

ae)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ec_CYP17A1、Ma_CYB5、Ec_POR；

af)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ma_CYP17A1、Oa_CYB5、Ma_POR；

ag)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ma_CYP17A1、Ma_CYB5、Ma_POR。

在本发明的一些具体实施方案中，以所述孕烯醇酮(P5)为底物的转化实验中，表现出最强孕烯醇酮转化效率的为Vv_3β-HSD；所述转化效率为6.8％；表现了次强催化效率的包括I型人源及突变体3β-HSD；所述催化效率为4.6～4.8％；

在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主包括含所述模块一的

SyBE_Yl2091001～SyBE_Yl2091004菌株，含所述模块一和所述模块二的SyBE_Yl2091005～SyBE_Yl2091016和SyBE_Yl2090013～SyBE_Yl2090016菌株，含所述模块五、所述模块四和来源于Equus caballus模块二的SyBE_Yl2091030菌株，含所述模块七、所述模块六和来源于Vaccinia virus模块三的SyBE_Yl2090007菌株。

在本发明的一些具体实施方案中，培养所述SyBE_Yl2091001～SyBE_Yl2091004菌株和SyBE_Yl2091005～SyBE_Yl2091016菌株，可以定向合成17-羟孕烯醇酮；

培养所述SyBE_Yl2091030菌株，以实现高效转化P5合成DHEA或4AD，P4合成DHEA或4AD；在以P5为底物的生物转化中，所述SyBE_Yl2091030菌株的DHEA合成量达12.6mg/L，较所述SyBE_Yl2091016高7.32倍；在以P4为底物的生物转化中，所述SyBE_Yl2091030菌株实现了13.9mg/L的雄烯二酮合成量，较所述菌株SyBE_Yl2091016菌株产量高86.2倍；

培养所述SyBE_Yl2090007菌株，以P5为底物定向合成17OHP4；所述17OHP4合成量达3.90mg/。

在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主还包括上游模块菌株和下游模块菌株；

所述上游模块菌株包括含所述模块三的SyBE_Yl2090018、SyBE_Yl2090006、SyBE_Yl2091025～SyBE_Yl2091028；所述下游模块菌株包括含所述模块A、模块B的SyBE_Yl2091006和含所述模块A、模块B的SyBE_Yl2091016，所述SyBE_Yl2091030。

在本发明的一些具体实施方案中，单培养所述SyBE_Yl2090018、SyBE_Yl2090006、SyBE_Yl2091025～SyBE_Yl2091028菌株获得孕酮。

在本发明的一些具体实施方案中，混合共培养所述SyBE_Yl2091025和SyBE_Yl2091006，合成17-羟孕酮0.25mg/L，17-羟孕烯醇酮0.74mg/L，雄烯二酮产量为0.88mg/L。

在本发明的一些具体实施方案中，混合共培养所述SyBE_Yl2091025和SyBE_Yl2091016混菌体系中合成17-羟孕酮0.91mg/L，17-羟孕酮0.29mg/L，雄烯二酮产量为1.03mg/L。

在本发明的一些具体实施方案中，混合共培养所述SyBE_Yl2091026-SyBE_Yl2091006，合成去氢表雄酮2.13mg/L。

在本发明的一些具体实施方案中，混合共培养所述SyBE_Yl2091025和SyBE_Yl2091030，以雄烯二酮为主要产物，合成雄烯二酮5.02mg/L，睾酮1.09mg/L。

在本发明的一些具体实施方案中，所述SyBE_Yl2091025中的模块三来源于Bostaurus；所述SyBE_Yl2091026中的模块三来源于Vaccinia virus；所述SyBE_Yl2091006中的模块一、模块二来源于Mesocricetus auratus；所述SyBE_Yl2091016中的模块一、模块二来源于Ovis aries。

本发明还提供了药物，包括如下任意项以及药学上可接受的辅料或助剂：

(I)、所述表达元件；和/或

(II)、所述质粒；和/或

(III)、所述宿主。

本发明还提供了药物组合，包括所述药物以及其他任意有效成分。

本发明还提供了合成甾体类化合物和/或甾体激素药物的方法，包括取所述宿主，培养，收集培养物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述方法包括：

(I)、利用碳源和/或3β-HSD在微生物底盘中从头合成孕酮；和/或

(II)、利用碳源、3β-HSD、CYP17A1和POR在微生物底盘中从头合成17-羟孕酮；和/或

(III)、利用碳源、CYP17A1和POR在微生物底盘中从头合成17-羟孕烯醇酮；和/或

(Ⅳ)、利用碳源、CYP17A1、POR和/或CYB5在微生物底盘中从头合成去氢表雄酮；和/或

(Ⅴ)、利用碳源、CYP17A1、POR、CYB5和/或3β-HSD在微生物底盘从头合成雄烯二酮、睾酮；和/或

(Ⅵ)、雄烯二酮的定向合成：表达3β-HSD的上游模块与表达CYP17A1、POR和/或CYB5的下游模块混合共培养；和/或

(Ⅶ)、17-羟孕酮的合成：共表达孕烯醇酮路径和/或3β-HSD的上游模块与仅表达CYP17A1，CYB5和POR的下游模块混合共培养；和/或

(Ⅷ)、以P5为底物合成P4、17OHP5、17OHP4或DHEA中的一种或多种；和/或

(IⅩ)、以17OHP5为底物合成17OHP4；和/或

(Ⅹ)、以17OHP5为底物合成DHEA；和/或

(ⅩⅠ)、以DHEA为底物合成4AD和TS；和/或

(ⅩII)、以17OHP4合成4AD和TS。

所述CYB5来源包括Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Susscrofa；

在本发明的一些具体实施方案中，所述3β-HSD的来源包括Bos taurus；所述CYP17A1、POR和/或的CYB5来源包括Mycobacterium tuberculosis和/或Ovis aries。

在本发明的一些具体实施方案中，所述雄烯二酮的定向合成和/或17-羟孕酮的合成中对甾体类底物高效17,20-裂解活性的CYP17A1包括Mesocricetus auratus来源和/或Equus caballus来源；

在本发明的一些具体实施方案中，所述以P5为底物合成P4包括表达3β-HSD；所述3β-HSD来源包括Vaccinia virus、Bos taurus、Mycobacterium tuberculosis、Homosapiens(I型)或Homo sapiens(II型)中的一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述以P5为底物合成17OHP5包括共表达CYP17A1、POR；所述CYP17A1和POR来源包括Ovis aries和/或Mesocricetus auratus。

在本发明的一些具体实施方案中，所述以P5为底物合成17OHP4包括共表达3β-HSD、CYP17A1和POR；所述3β-HSD来源包括Homo sapiens(II型)和/或Vaccinia virus；所述CYP17A1和POR来源包括Ovis aries。

在本发明的一些具体实施方案中，所述以P5为底物合成DHEA包括共表达CYP17A1、POR和/或CYB5；所述CYP17A1、POR来源包括Ovis aries和/或Equus caballus；所述CYB5来源包括Equus caballus。

在本发明的一些具体实施方案中，所述以17OHP5为底物合成17OHP4包括表达3β-HSD；所述3β-HSD来源包括Homo sapiens(I型)和/或Homo sapiens(II型)。

在本发明的一些具体实施方案中，所述以17OHP5为底物合成DHEA包括共表达CYP17A1、POR和/或CYB5；所述CYP17A1、POR来源包括Ovis aries；所述CYB5来源包括Mesocricetus auratus、Equus caballus或Sus scrofa。

在本发明的一些具体实施方案中，所述以17OHP5为底物合成17OHP4包括表达3β-HSD；所述3β-HSD来源包括Vaccinia virus、Mycobacterium tuberculosis、Homo sapiens(I型)、Homo sapiens(II型)或Bos taurus的一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述以7OHP4合成4AD和TS包括共表达CYP17A1、POR和/或CYB5；所述CYP17A1、POR来源包括Mesocricetus auratus、Equus caballus或Ovisaries；所述CYB5来源包括Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Susscrofa。

本发明提供了一种通过组合表达不同路径模块，实现复杂网状路径节点路径产物定向合成的方法：

a)如：雄烯二酮的定向合成(如实施例7所述)；

a)以P5为底物合成P4：表达3β-HSD；

b)以P5为底物合成17OHP5：共表达CYP17A1、POR；

c)以P5为底物合成17OHP4：共表达3β-HSD、CYP17A1、POR；

d)以P5为底物合成DHEA：共表达CYP17A1、POR、CYB5；

a)对于以P5为底物合成P4：单表达Vv_3β-HSD；

b)对于以P5为底物合成P4：单表达Bt_3β-HSD；

c)对于以P5为底物合成P4：单表达Mt_3β-HSD；

d)对于以P5为底物合成P4：单表达Hs_3β-HSD1(I型人源Hs_3β-HSD)；

e)对于以P5为底物合成P4：单表达Hs_3β-HSD2(II型人源Hs_3β-HSD)；

f)对于以P5为底物合成P4：组合表达a)～e)中3β-HSD；

j)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：单表达Vv_3β-HSD；

k)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：单表达Mt_3β-HSD；

n)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：单表达Bt_3β-HSD2；

r)对于以P5为底物合成17OHP5：共表达Oa_CYP17A1、Oa_POR；

s)对于以P5为底物合成17OHP5：共表达Ma_CYP17A1、Ma_POR；

t)对于以P5为底物合成17OHP5：组合表达r)～s)中CYP17A1和POR；

u)对于以17OHP5合成DHEA：共表达Oa_CYP17A1、Ma_CYB5、Oa_POR；

v)对于以17OHP5合成DHEA：共表达Oa_CYP17A1、Ec_CYB5、Oa_POR；

w)对于以17OHP5合成DHEA：共表达Oa_CYP17A1、Ss_CYB5、Oa_POR；

具体地，合成甾体类化合物和/或甾体激素药物的方法，包括：培养所述宿主，加入类固醇底物母液孵育，对孕烯醇酮(P5)、孕酮(P4)、17-羟孕烯醇酮(17OHP5)、17-羟孕酮(17OHP4)、去氢表雄酮(DHEA)、雄烯二酮(4AD)或睾酮(TS)定量；

所述培养包括在种子培养基中、生物转化培养基中或YPD发酵培养基中培养；

所述种子培养基的配方包括：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；采用所述种子培养基培养的温度为30℃、转速为220rpm、培养时间为14～16h；

所述生物转化培养基的配方包括：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；采用所述生物转化培养基培养的温度28℃、转速为220rpm、培养时间为24h；

所述YPD发酵培养基的配方包括：50g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；采用所述YPD发酵培养基培养的温度28℃、转速为220rpm、培养时间为8天；

合成所述甾体类化合物包括3β-HSD异构化转化、17-羟化转化、17，20-裂解转化、DHEA合成和/或4AD合成。

所述3β-HSD异构化转化加入的类固醇底物母液包括P4和17OHP4溶液；所述P4和17OHP4溶液的浓度为1.75g/L(50％EtOH-Tween80)；

所述17-羟化转化加入的类固醇底物母液包括P4和P5溶液；所述P4和P5溶液的浓度为1.75g/L(50％EtOH-Tween80)；

所述17，20-裂解转化加入的类固醇底物母液包括17OHP4和17OHP5溶液；所述17OHP4和17OHP5溶液的浓度为1.75g/L(50％EtOH-Tween80)；

所述DHEA合成加入的类固醇底物母液包括P5溶液；所述P5溶液的浓度为3.5g/L(50％EtOH-Tween80)；

所述4AD合成加入的类固醇底物母液包括P4溶液；所述P4溶液的浓度为3.5g/L(50％EtOH-Tween80)；

所述孕烯醇酮定量的方法包括：取培养后的宿主，离心，重悬，煮沸，加入皂化反应溶液反应，加入萃取溶剂，浓缩，检测；

所述离心转速为12000g，离心时间为2min；所述重悬采用的溶液为盐酸；所述盐酸的浓度为3mol/L；所述煮沸得温度为100℃；所述皂化反应溶液为氢氧化钾-甲醇溶液；所述氢氧化钾-甲醇溶液的浓度为2mol/L；所述萃取溶剂为正己烷；所述浓缩采用的为真空离心浓缩仪；所述浓缩的温度为25℃，时间为30min，转速为7000rpm；

所述孕酮、17-羟孕烯醇酮、17-羟孕酮、DHEA或雄烯二酮定量的方法包括：取培养后的宿主，加入玻璃珠和萃取溶剂，浓缩，检测；

所述萃取溶剂为乙酸乙酯；所述浓缩的温度为25℃，时间为1200min，转速为7000rpm。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1中孕烯醇酮合成雄烯二酮路径；

图2示实施例1中孕烯醇酮合成孕酮；

图3示实施例1中孕烯醇酮合成去氢表雄酮；

图4示实施例1中孕烯醇酮合成17-羟孕酮；

图5示实施例1中孕烯醇酮合成17-羟孕烯醇酮；

图6示实施例1中不同来源3β-HSD在解脂酵母背景下分别以孕烯醇酮、17-羟孕烯醇酮、DHEA为底物异构化效率；

图7示实施例2中在解脂酵母背景下，不同来源CYP17A1以孕烯醇酮、孕酮为底物17α-羟基化效率；其中，左图示在解脂酵母背景下，不同来源CYP17A1以孕烯醇酮为底物17α-羟基化效率；右图示在解脂酵母背景下，不同来源CYP17A1以孕酮为底物17α-羟基化效率；

图8示实施例2中在解脂酵母背景下，不同CYP17A1和CYB5来源组合以17-羟孕烯醇酮、17-羟孕酮为底物的17，20-裂解效率；其中，图左示在解脂酵母背景下，不同CYP17A1和CYB5来源组合以17-羟孕烯醇酮为底物的17，20-裂解效率；图右示在解脂酵母背景下，不同CYP17A1和CYB5来源组合以17-羟孕酮为底物的17，20-裂解效率；

图9示实施例3中重组菌株以孕烯醇酮为底物合成去氢表雄酮效率；

图10示实施例3中重组菌株以孕酮为底物合成雄烯二酮产量；其中，图左示SyBE_Yl2091016；图右示SyBE_Yl2091030；

图11示实施例4中菌株SyBE_Yl2090007以孕烯醇酮为底物合成17-羟孕酮；

图12示实施例5中不同来源3β-HSD在重组酵母中合成孕酮效果测试；

图13示实施例6中混菌体系合成雄烯二酮的产量(柱图)；其中，图左示在SyBE_Yl2091025-SyBE_Yl2091016混菌合成雄烯二酮的产量；图右示在

SyBE_Yl2091025-SyBE_Yl2091006混菌合成雄烯二酮的产量；

图14示实施例7中混菌合成去氢表雄酮；

图15示实施例8中利用生物转化测试不同来源CYP17A1、CYB5组分催化17α-羟基化、17，20-裂解效率；其中，左图示以P4为底物催化17α-羟基化的效率、右图示以17OHP4为底物催化17，20-裂解效率；

图16示实施例8中混菌体系从头合成4AD的产量(柱图)；其中，图左示SyBE_Yl2091025-SyBE_Yl2091016混菌合成4AD的产量；图右示

SyBE_Yl2091025-SyBE_Yl2091030混菌从头合成4AD的产量。

具体实施方式

本发明公开了网状路径产物定向合成，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明以在解脂耶氏酵母中定向合成雄烯二酮路径节点产物为例，提供了一种在微生物底盘对网状路径解耦实现目标化合物定向合成的方法。简单地说，本发明利用①利用解脂耶氏酵母底盘②利用酶催化底物特异性构建激素类甾体合成路径，③依据目标化合物合成需要，选择性表达路径组分蛋白构建合成路径。④利用微生物底盘从头合成甾体激素类化合物。通过以上方法组合优化实现特定目标类固醇在微生物系统中高效合成。

解脂耶氏酵母作为非常规酵母，用于甾体合成上具有以下优势：①基因组序列已知，可基因操作，增殖能力强，有利于代谢改造及大规模生产。②乙酰辅酶A作为合成甾体的前体物质，其代谢通量在解脂酵母中高，有利于甾体合成。③该物种在代谢改造后异源蛋白表达量高，同时细胞转录后糖基化修饰与酿酒酵母相比，更接近哺乳动物细胞，有利于哺乳动物来源的蛋白表达，进而合成动物源甾体。④GRAS(generally regard as safe)级别的安全性，可被考虑用作药物合成的底盘。⑤解脂耶氏酵母底物谱广泛，除葡萄糖外还可利用油类为底物，因此可以利用工业副产物及废弃物生产目的产物。⑥解脂酵母在以油为碳源时，胞内脂类积累会导致脂滴变大，为储存非极性产物(如甾体)提供贮存空间，利于减轻产物积累给细胞带来的负担。⑦与传统的甾体异源合成的传统宿主酿酒酵母相比，解脂酵母没有ATF2(alcohol O-acetyltransferase)的同源基因，该基因会导致酿酒酵母中的甾体酯化，阻碍甾体在细胞中进一步生物转化。

本发明在代谢背景较为纯净和清晰的酵母底盘下，外源甾体合成路径与微生物内源代谢正交，使得甾体生物转化可在较为纯净的背景下进行，更好地实现中间节点产物定向合成。

利用微生物从头合成甾体激素类化合物的探索较为有限，本发明实现了利用简单碳源到雄烯二酮网状路径节点产物的定向合成。

构建人工合成路径可以通过对不同催化特异性蛋白组合与异源表达，实现路径节点化合物定向合成与路径通量强化。

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供实现目标化合物定向合成的方法。

本发明提供了如下：

1、在微生物底盘中构建人工路径实现甾体化合物合成。

2、在解脂耶氏酵母底盘中构建人工路径实现甾体化合物合成。

3、利用组合表达实施例1中：9种3β-HSD、4种CYP17A1在微生物底盘从头合成17-羟孕酮的方法。

4、利用组合表达实施例1表格中：4种CYP17A1在微生物底盘从头合成17-羟孕烯醇酮的方法。

5、利用组合表达实施例1表格中：4种CYP17A1、4种CYB5在微生物底盘从头合成去氢表雄酮的方法。

6、利用组合表达实施例1表格中：4种CYP17A1、4种CYB5、9种3β-HSD在微生物底盘从头合成雄烯二酮、睾酮的方法。

7、利用组合表达实施例1表格中：9种3β-HSD、4种CYP17A1在解脂耶氏酵母底盘从头合成17-羟孕酮的方法。

8、利用组合表达实施例1表格中：4种CYP17A1在解脂耶氏酵母底盘从头合成17-羟孕烯醇酮的方法。

9、利用组合表达实施例1表格中：4种CYP17A1、4种CYB5在解脂耶氏酵母底盘从头合成去氢表雄酮的方法。

10、利用组合表达实施例1表格中：4种CYP17A1、4种CYB5、9种3β-HSD在解脂耶氏酵母底盘从头合成雄烯二酮、睾酮的方法。

11、利用牛源3β-HSD，构建可利用简单碳源从头合成孕酮的工程菌的方法。

12、利用人源3β-HSD，构建可利用简单碳源从头合成孕酮的工程菌的方法。

13、利用牛痘病毒源3β-HSD，构建可利用简单碳源从头合成孕酮的工程菌的方法。

14、利用分枝杆菌源3β-HSD，构建可利用简单碳源从头合成孕酮的工程菌的方法。

15、一种通过组合表达不同路径模块，实现复杂网状路径节点路径产物定向合成的方法。

a)如：雄烯二酮的定向合成(如实施例7所述)

b)如：17-羟孕酮的合成：上游模块菌：共表达孕烯醇酮路径和3β-HSD；下游模块菌：仅表达CYP17A1，CYB5和POR。混菌共培养上游模块和下游模块即可实现由葡萄糖合成17-羟孕酮。

16、两种在异源合成中，可对甾体类底物高效17α-羟基化的CYP17A1：Ma_CYP17A1、Oa_CYP17A1

17、两种在异源合成中，具备对甾体类底物高效17，20-裂解活性的CYP17A1：Ma_CYP17A1、Ec_CYP17A1

18、酵母底盘中组合表达特定网状路径产物实现节点产物定向合成。

a)以P5为底物合成P4：表达3β-HSD

b)以P5为底物合成17OHP5：共表达CYP17A1、POR

c)以P5为底物合成17OHP4：共表达3β-HSD、CYP17A1、POR

d)以P5为底物合成DHEA：共表达CYP17A1、POR、CYB5

19、组合表达催化特异性互补的同源蛋白，构建高效生物转化合成路径

a)对于以P5为底物合成P4：单表达Vv_3β-HSD

b)对于以P5为底物合成P4：单表达Bt_3β-HSD

c)对于以P5为底物合成P4：单表达Mt_3β-HSD

d)对于以P5为底物合成P4：单表达Hs_3β-HSD1(I型人源Hs_3β-HSD)

e)对于以P5为底物合成P4：单表达Hs_3β-HSD2(II型人源Hs_3β-HSD)

f)对于以P5为底物合成P4：组合表达a)～e)中3β-HSD

g)对于以17OHP5为底物合成17OHP4：单表达Hs_3β-HSD1(I型人源Hs_3β-HSD)

h)对于以17OHP5为底物合成17OHP4：单表达Hs_3β-HSD2(II型人源Hs_3β-HSD)

i)对于以17OHP5为底物合成17OHP4：组合表达Hs_3β-HSD1和Hs_3β-HSD2

j)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：单表达Vv_3β-HSD

k)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：单表达Mt_3β-HSD

l)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：单表达Hs_3β-HSD1(I型人源Hs_3β-HSD)

m)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：单表达Hs_3β-HSD2(II型人源Hs_3β-HSD)

n)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：单表达Bt_3β-HSD2

o)对于以DHEA为底物合成4AD和TS(睾酮)：组合表达j)～n)中3β-HSD

p)对于以P5为底物合成DHEA：共表达Oa_CYP17A1、Oa_POR、Ec_CYP17A1、Ec_POR、Ec_CYB5

q)对于以P5为底物合成17OHP4：共表达Hs_3β-HSD2(II型人源Hs_3β-HSD)、Vv_3β-HSD、Oa_CYP17A1、Oa_POR

r)对于以P5为底物合成17OHP5：共表达Oa_CYP17A1、Oa_POR

s)对于以P5为底物合成17OHP5：共表达Ma_CYP17A1、Ma_POR

t)对于以P5为底物合成17OHP5：组合表达r)～s)中CYP17A1和POR

u)对于以17OHP5合成DHEA：共表达Oa_CYP17A1、Ma_CYB5、Oa_POR

v)对于以17OHP5合成DHEA：共表达Oa_CYP17A1、Ec_CYB5、Oa_POR

w)对于以17OHP5合成DHEA：共表达Oa_CYP17A1、Ss_CYB5、Oa_POR

x)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ma_CYP17A1、Ss_CYB5、Ma_POR

y)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ec_CYP17A1、Ss_CYB5、Ec_POR

z)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Oa_CYP17A1、Ss_CYB5、Oa_PORaa)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ma_CYP17A1、Ec_CYB5、Ma_POR

ab)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ec_CYP17A1、Ec_CYB5、Ec_PORac)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Oa_CYP17A1、Ec_CYB5、Oa_PORad)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ec_CYP17A1、Oa_CYB5、Ec_PORae)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ec_CYP17A1、Ma_CYB5、Ec_PORaf)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ma_CYP17A1、Oa_CYB5、Ma_POR

ag)对于以17OHP4合成4AD和TS(睾酮)：共表达Ma_CYP17A1、Ma_CYB5、Ma_POR

本发明涉及的重组菌株及质粒如表1、表2所示：

表1：本发明涉及的重组菌株

表2：本发明涉及的质粒

本发明涉及的优化后的序列：

Ss_mCYP11A1(SEQ NO：5)：

ATGATCTCTACCAAGACCCCCCGACCCTTCTCTGAGATCCCCTCCCCCGGAGACAAC

GGTTGGATTAACCTGTACCGATTCTGGAAGGAGAAGGGAACCCAGAAGATCCACTA

CCACCACGTGCAGAACTTCCAGAAGTACGGCCCCATCTACCGAGAGAAGCTGGGAA

ACCTGGAGTCCGTCTACATCATTGACCCCGAGGACGTGGCCCTGCTGTTCAAGTTCG

AGGGCCCCAACCCCGAGCGATACAACATTCCCCCCTGGGTCGCCTACCACCAGCACT

ACCAGAAGCCCGTGGGTGTCCTGCTGAAGAAGTCTGGCGCTTGGAAGAAGGACCGA

CTGGTCCTGAACACCGAGGTCATGGCCCCCGAGGCTATCAAGAACTTCATTCCCCTG

CTGGACACCGTGTCCCAGGACTTCGTGGGCGTCCTGCACCGACGAATCAAGCAGCA

GGGTTCTGGCAAGTTCTCCGGAGACATTCGAGAGGACCTGTTCCGATTCGCCTTCGA

GTCTATCACCAACGTCATTTTCGGCGAGCGACTGGGAATGCTGGAGGAGATCGTGG

ACCCCGAGGCCCAGAAGTTCATTGACGCTGTCTACCAGATGTTCCACACCTCCGTGC

CTATGCTGAACCTGCCTCCCGACCTGTTCCGACTGTTCCGAACCAAGACCTGGCGAG

ATCACGTCGCCGCTTGGGACACCATCTTCAACAAGGCCGAGAAGTACACCCAGAAC

TTCTACTGGGACCTGCGACGAAAGCGAGAGTTCAACAACTACCCCGGAATTCTGTAC

CGACTGCTGGGTAACGACAAGCTGCTGTCTGAGGACGTCAAGGCCAACGTGACCGA

GATGCTGGCTGGCGGAGTGGACACCACCTCTATGACCCTGCAGTGGCACCTGTACG

AGATGGCCCGATCCCTGAACGTCCAGGAGATGCTGCGAGAGGAGGTGCTGAACGCC

CGACGACAGGCTCAGGGAGACACCTCCAAGATGCTGCAGCTGGTCCCCCTGCTGAA

GGCTTCTATCAAGGAGACTCTGCGACTGCACCCCATTTCCGTGACCCTGCAGCGATA

CCTGGTCAACGACCTGGTGCTGCGAGACTACATGATCCCTGCTAAGACCCTGGTGCA

GGTCGCTGTGTACGCTATGGGTCGAGATCCCGCTTTCTTCTCTAACCCCGGACAGTT

CGACCCTACCCGATGGCTGGGCAAGGAGCGGGACCTGATCCACTTCCGAAACCTGG

GATTCGGTTGGGGCGTCCGACAGTGCGTCGGACGACGAATTGCCGAGCTGGAGATG

ACCCTGTTCCTGATCCACATTCTGGAGAACTTCAAGGTCGAGCTGCAGCACTTCTCC

GACGTGGACACCATCTTCAACCTGATTCTGATGCCCGACAAGCCCATTTTCCTGGTG

TTCCGACCCTTCAACCAGGACCCCCTGCAGGCTTAA

Oa_CYP17A1(SEQ NO：6)：

ATGTGGGTCCTGCTGGCCGTCTTCCTGCTGACCCTGGCCTACCTGTTCTGGCCCAAG

ACCAAGCACTCCGGCGCCAAGTACCCCCGATCCCTGCCCTCCCTGCCCCTGGTTGGC

TCCCTGCCTTTCCTCCCCCGACGAGGCCAGCAGCACGAGAACTTCTTCAAGCTGCAG

GAGAAGTACGGCCCCATCTACTCCTTCCGACTGGGCTCCAAGACCACCGTCATGATT

GGTCACCACCAGCTGGCCCGAGAGGTCCTGCTCAAGAAGGGTAAGGAGTTTTCCGG

CCGACCCAAGGTCGCTACCCTGGACATCCTGTCCGACAACCAGAAGGGCATCGCCTT

CGCTGACCACGGCGCCCACTGGCAGCTGCACCGAAAGCTGGTCCTCAACGCCTTTGC

CCTGTTCAAGGACGGCAACCTGAAGCTGGAGAAGATCATTAACCAGGAGGCTAACG

TCCTGTGCGACTTCCTGGCCACCCAGCACGGCCAGTCCATCGACCTCTCCGAGCCCC

TGTCCCTCGCCGTGACCAACATCATTTCCTTCATTTGCTTCAACTTCTCCTTTAAGAA

CGAGGACCCCGCCCTCAAGGCCATCCAGAACGTTAACGACGGCATTCTCGAGGTGC

TCGGCAAGGAGGTGCTGCTGGACATCTTCCCTGCCCTGAAGATCTTCCCCTCCAAGG

CCATGGAGAAGATGAAGGGCTGCGTGGAGACTCGAAACGAGCTGCTGTCCGAGATT

CTGGAGAAGTGCCAGGAGAACTTCACCTCCGACTCTATTACCAACCTGCTGCACATC

CTGATGCAGGCCAAGGTCAACGCTGACAACAACAACACCGGCCCCGAGCAGGACTC

CAAGCTGCTGTCCAACCGACACATGCTCGCCACCATCGCCGACATCTTCGGCGCCGG

CGTCGAGACTACCACCTCCGTCATCAAGTGGATCGTCGCCTACCTGCTGCACCACCC

CTCCCTGAAGAAGCGAATCCAGGACTCCATCGACCAGAACATCGGATTCAACCGAA

CCCCCACCATCTCCGACCGAAACCGACTGGTCCTGCTCGAGGCCACCATCCGAGAG

GTCCTCCGAATCCGACCCGTCGCCCCCATGCTCATCCCCCACAAGGCCATCATCGAC

TCCTCCATCGGCGACCTGACCATCGACAAGGGCACCGACGTCGTCGTCAACCTGTGG

GCCCTGCACCACAACGAGAAGGAGTGGCAGCAGCCCGACCTCTTCATGCCCGAGCG

ATTTCTGGACCCCACCGGAACCCAGCTGATCTCCCCCTCCCTGTCCTACCTCCCCTTC

GGCGCCGGTCCCCGATCCTGTGTCGGCGAGATGCTCGCCCGACAGGAGCTGTTTCTG

TTTATGTCTCGACTCCTGCAGCGATTCAACCTGGAGATCCCCGACGACGGCAAGCTC

CCCTCCCTGGAGGGCAACCCCTCCCTGGTTCTGCAGATCAAGCCCTTCAAGGTCAAG

ATCGAGGTCCGACAGGCCTGGAAGGAGGCCCAGGCCGAGGGTTCTACCTCCTAA

Ma_CYP17A1(SEQ NO：7)：

ATGTGGGAGCTGGTCGCCCTGCTGCTGCTGACCCTGGCCTACTTCTTCTGGTCCAAG

TCCAAGACCTGCGGCGCCAAGTCCCCCAAGTCCCTGCCCTTCCTGCCCCTGGTCGGC

TCCCTGCCTTTTATCCCCCGACACGGCCACCCCCACGTCAACTTCTTCAAGCTGCAG

GAGAAGTACGGCCCCATCTACTCCCTCCGACTGGGCTCCACCACCACCGTCATCATT

GGCCAGTACCAGCTCGCCAAGGAGGTCCTGGTCAAGAAGGGTAAGGAGTTCTCCGG

CCGACCCCACATGGTTACCCTGGGCCTGCTGTCCGACCAGGGCAAGGGCATCGCTTT

CGCCGACTCCGGCGGATCTTGGCAGCTGCACCGAAAGCTGGCCCTCTCCTCCTTTGC

TCTGTTCCGAGATGGTAACCAGAAGCTGGAGAAGATCATCTGCCAGAAGGCTTCCTC

CCTGTGTGACTTTCTGCTGACCCACAACGAGGAGTCCATCGACCTGTCCGAGCCCAT

CTTCAACTCCATCACCAACATCATCTGCATCATTTGCTTCGGCATCTCCTACGAGAAC

CGAGATCCTATCCTCGCCACCATCAAGTCCTTTACCGAGGGCATTCTGAACTCCCTC

GGCAACGACCACCTCGTCGATATCTTCCCCTGGCTGACCATCTTCCCCAACAAGACC

GTCGATATGATCAAGAAGAACGTCAAGATCCGAGATGAAGTGCTGTCCGGCATCCT

GGAGAAGTGCAAGGAGAAGTTTAACTCCGACTCCATCTCCTCCCTGATGGACCTGCT

GATCCAGGCCAAGACCAACGCCGACAACAACAACACCTCCGAGGGCCAGGGCTCCA

ACGCCTTCTCCGACATGCACATCCTGGCCACCATCGCCGACATCTTCGGCGCCGGAA

TCGAGACTACCGCCTCCGTCCTGTCTTGGATCATCGCCTTCCTCCTGCACAACCCCGA

GGTCAAGAAGAAGATCCAGAAGGAGATTGACCAGAACATCGGATTCTCCCGAACCC

CCACCTTCAACGACCGAAACCACCTGCTGATGCTGGAGGCCACCATCCGAGAGGTC

CTGCGAATCCGACCCGTCGCCCCCATGCTGATCCCCCACCGAGCCAACTCCGACATG

TCCATCGGCGAGTTCTCCATCCCCAAGTTCACCCCCGTCATCATCAACCTGTGGGCC

CTGCACCACTCCGAGAAGGAGTGGGACCAGCCCGACCGATTCATGCCCGAGCGATT

TCTGGACCCCACCGGATCTCACCTCATCACCCCCTCCCTCTCCTACCTGCCCTTCGGC

GCCGGCGCTCGATCCTGTATCGGCGAGGTCCTCGCCCGACAGGAGCTGTTCCTGTTT

ATGGCCCACCTCCTGCAGCGATTCGACCTCGACGTCCCCGACGACGAGCAGCCCCCT

TGCCTGAAGGGTAACGCCAACGTCGTGTTTCTGATCGACCCCTTCAAGGTCAAGATT

ACCGTCCGACAGGCCTGGAAGGACGCCCAGGCCGAGGTTAACACCTGGCGACCCTA

A

Ec_CYP17A1(SEQ NO：8)：

ATGTGGGAGCTGCTGGCCTTCCTGCTGCTGGCCATCGCCTACTTCTTCCGACCCAAG

GTCAAGTGCCCCGGCGCCAAGTACCCCAAGTCCCTGCCCTACCTGCCCCTGGTCGGC

TCCCTGCCTTTCCTCCCCCGACACGGCCACCCCCACGTCAACTTCTTCAAGCTCCAGA

AGAAGTACGGTCCTATCTACTCCCTGCGAATGGGCACCAAGACCACCGTCATGGTCG

GTCACTACCAGCTGGCCAAGGAGGTCCTGATCAAGAAGGGTAAGGAGTTCTCCGGC

CGACCCCAGGTCGCCACCCTGAACATCCTCTCCGACAACCAGAAGGGCGTCGCCTTC

GCTGACCACGGCGCCCCTTGGCAGCTGCACCGAAAGCTGGTCCGAGCCGCCTTCGCC

CTGTTCAAGGACGGCAACCAGAAGCTGGAGAAGATCATTTGCCACGAGACTTCCCT

GCTGTGCGACCTCCTGGCCACCCAGAACGGCCAGACCATCGACCTGTCCTCCCCCCT

CTTCCTGGCCGTGACCAACGTCATCTGCTGGATCTGCTTCAACTCCTCCTACATGAA

GGGCGACCCCGCCCTCGAGACTATGCAGAACTACCACAAGGGCATTCTCGAGACTC

TCGAGAAGGACAACGTCGTCGATATTTTCCCCGCCCTGAAGATCTTCCCCAACAAGT

CCCTGGAGAAGATGCGACACTGTGTGAACATCCGAAACGAGCTGCTGTCCAAGATC

TTCGAGAAGCACAAGGAGAACTTTAACTCCGACTCCATCACCTCCATGCTCGACCTC

CTGATCCAGGCCAAGAAGAACTCCGACAACAACAACACCGGCCCCGACCAGGACTC

CAAGCTCCTGTCCGACAAGCACATCCTCGCCACCATCGGCGACATCTTCGGCGCCGG

CGTCGAGACTACCACCTCCGTCGTCAAGTGGATCGTCGCCTTCCTGCTCCACGACCC

CCAGCTGAAGAAGAAGATCCAGGAGGAGATCGACCAGAACGTCGGATTCTCCCGAA

CCCCCACCCTGTCCGACCGAAACCGACTGCTGCTGCTGGAGGCCACCATCCGAGAG

GTTCTCCGAATCCGACCCGTCGCCCCCATGCTGATCCCCCACAAGGCCCTCGTCGAT

TCCTCCATCGGCGAGTTCGCCGTCGATGACGGCACCAACGTCATTATTAACCTGTGG

GCCCTGCACCACAACGAGAAGGAGTGGCACCAGCCCGACCGATTCATGCCCGAGCG

ATTTCTGGACCCCACCGGCTCCCAGCTGATCTCCCCCTCCCTGTCCTACCTGCCCTTC

GGCGCCGGTCCCCGATCCTGTATCGGCGAGCTCCTCGCCCGACAGGAGCTGTTTCTG

TTCACCGCCTGGCTCCTGCAGCGATTCAACCTGGAGGTCCCCGACGACGGCCAGCTC

CCTTCCCTGGAGGGCCACCCTACCGCCGTCTTTCTGATTGACTCCTTCAAGGTCAAG

ATTAACGTCCGACAGGCCTGGCGAGAGGCTCAGGCCGAGGGTTCCACCTAA

Xl_CYP17A1(SEQ NO：9)：

ATGATCTCCTACGTCGCCGGCGCCCTGCTGCTGGCTTTCGGTCTGGCCCTGATCTCCG

TCTGGAAGTTCGCTGGTGGCAAGCACCGAGGCGCTAAGTACCCCAACTCCCTGCCCT

GCCTGCCCTTCATCGGTTCCCTGCTGCACATCGGCAACCACCTGCCCCCCCACATCCT

GTTTTGCAAGCTCCAGGAGAAGTACGGCTCCCTGTACTCCTTCCGAATGGGCTCCCA

CTACATCGTCATCGTCAACCACCACGAGCACGCCAAGGAGGTCCTCCTCAAGAAGG

GCAAGACCTTTGGCGGCCGACCCCGAGCCGTTACCACCGACATCCTCACCCGAAAC

GCCAAGGACATCGCCTTCGCCAACTACTCCCCCTCCTGGAAGTTCCACCGAAAGGTC

GTCCACGCCGCCCTCTCCATGTTTGGCGAGGGTACTGTCGCCATCGAGAAGATCATC

TCCCGAGAGGCCACCTCCCTGTGCCAGTCCCTCATCTCCTTCCAGGACAACCCCCTG

GACATGGCCCCCGAGCTCACCCGAGCCGTTACCAACGTCGTCTGCGCCCTGTGCTTC

AACACCCGATACAAGCGATGCGACCCCGAGTTCGAGGAGATGCTGGCCTACTCCAA

GGGCATCGTCGATACCGTGGCCAAGGACTCTCTGGTCGATATTTTCCCCTGGCTGCA

GATCTTCCCCAACAAGGACCTGGACATTCTGAAGCGATCCGTGGCCATCCGAGACA

AGCTGCTGCAGAAGAAGCTCAAGGAGCACAAGGAGGCTTTCTGCAACGAGGAGGTT

AACGACCTGCTGGACGCCCTGCTGAAGGCCAAGCTGTCCATGGAGAACAACAACTC

CAACATCTCCCAGGAGGTCGGCCTCACCGACGACCACCTGCTGATGACCGTCGGCG

ACATTTTCGTCGCCGGCGTGGAGACTACCACCACCGTCCTGAAGTGGACCATGGCCT

ACCTCCTGCACTACCCCGAGGTCCAGACCAAGATTCAGGAGGAGCTGGACTTCAAG

GTTGGCTTCGGCCGACACCCCGTCCTGTCCGACCGACGAATTCTGCCCTACCTCGAC

GCCACCATCTCCGAGGTCCTCCGAATCCGACCCGTCGCCCCCCTGCTGATCCCCCAC

GTTGCCCTGCAGGAGTCCTCCATCGCCGAGTACACCATCCCCCAGGACGCCCGAGTC

GTGATTAACCTGTGGTCCCTGCACCACGACCCCAACGAGTGGGAGAACCCCGAGGA

GTTCAACCCCGAGCGATTTCTCGACGAGAACGGAAACCACGTCTACTCCCCCTCTCA

GTCTTACCTGCCCTTCGGCGCCGGCATCCGAGTCTGCCTGGGCGAGGCTCTGGCCAA

GATGGAGGTCTTTCTGTTCCTGTCCTGGATTCTGCAGCGATTCACCCTGGAGCTGCCC

GCCGGCGACTCTCTCCCTGACCTGGACGGCAAGTTTGGCGTGGTTCTGCAGGTCAAG

AAGTTTCGAGTTACCACCAAGCTGCGAGAGGCCTGGAAGAACATCGACCTCACCAC

CTAA

Oa_POR(SEQ NO：10)：

ATGAACATGGGCGACTCCAACATGGACGCTGGCACCACCACCCCCGAGACTGTGGC

CGAGGAGGTCAGCTTATTTTCCACCACCGACATGATCCTGTTCTCCCTGATCGTCGG

CGTCATGACCTACTGGTTCCTCTTCCGAAAGAAGAAGGAGGAGGTCCCCGAGTTCAC

CAAGATTCAGACCACCACCTCCTCCGTCAAGGACCGATCCTTCGTGGAGAAGATGA

AGAAGACCGGCCGAAACATCATCGTCTTTTACGGCTCCCAGACCGGTACTGCCGAG

GAGTTCGCCAACCGACTCTCCAAGGACGCCCACCGATACGGCATGCGAGGCATGGC

CGCCGACCCCGAGGAGTACGACCTCGCTGACCTCTCCTCCCTCCCCGAGATCGAGAA

GGCCCTGGCTGTTTTCTGCATGGCCACCTACGGTGAGGGCGACCCCACCGACAACGC

CCAGGACTTTTACGACTGGCTGCAGGAGACTGACGTCGATCTCTCCGGCGTCAAGTA

CGCCGTTTTCGCCCTGGGTAACAAGACCTACGAGCACTTCAACGCTATGGGCAAGTA

CGTCGATAAGCGACTGGAGCAGCTGGGCGCCCAGCGAATTTTTGACCTGGGTCTGG

GCGACGACGACGGCAACCTGGAGGAGGACTTCATCACCTGGCGAGAGCAGTTCTGG

CCCGCCGTCTGCGAGCACTTTGGAGTCGAGGCTACCGGCGAGGAGTCTTCCATTCGA

CAGTACGAGCTGATGGTGCACACCGACATGGACATGGCCAAGGTCTACACCGGCGA

GATGGGCCGACTGAAGTCCTACGAGAACCAGAAGCCCCCCTTCGACGCCAAGAACC

CCTTCCTGGCCGTGGTCACCACCAACCGAAAGCTGAACCAGGGTACTGAGCGACAC

CTGATGCACCTGGAGCTGGACATCTCCGACTCCAAGATCCGATACGAGTCCGGCGA

CCACGTCGCCGTCTACCCTGCCAACGACTCCGCCCTGGTCAACCAGCTGGGCGAGAT

CCTCGGCGCCGACCTCGACGTCATCATGTCCCTGAACAACCTCGACGAGGAGTCCAA

CAAGAAGCACCCCTTCCCCTGCCCCACCTCCTACCGAACCGCCCTGACCTACTACCT

GGACATCACCAACCCCCCCCGAACCAACGTCCTCTACGAGCTGGCCCAGTACGCCTC

CGAGCCCGCTGAGCAGGAGCAGCTCCGAAAGATGGCCTCCTCCTCCGGCGAGGGCA

AGGAGCTGTACCTCCGATGGGTCCTGGAGGCCCGACGACACATTCTCGCCATTCTGC

AGGACTACCCCTCCCTGCGACCCCCCATCGACCACCTGTGCGAGCTCCTGCCCCGAC

TCCAGGCCCGATACTACTCCATTGCCTCTTCCTCCAAGGTTCACCCCAACTCCGTTCA

CATCTGCGCCGTCGCCGTCGAGTACGAGACTAAGACCGGTCGAATCAACAAGGGCG

TCGCCACCTCCTGGCTGCGAGCCAAGGAGCCCGCCTCCGAGAACGGCGGTCGAGCT

CTGGTCCCCATGTACGTGCGAAAGTCCCAGTTCCGACTGCCCTTCAAGGCCACCACC

CCCGTCATCATGGTTGGCCCCGGCACCGGCGTGGCCCCTTTTATCGGCTTCATCCAG

GAGCGAGCCTGGCTGCGACAGCAGGGCAAGGAGGTTGGCGAGACTCTCCTGTACTA

CGGCTGCCGACGATCCGACGAGGACTACCTGTACCGAGAGGAGCTGGCCGGCTTCC

ACAAGGACGGCACCCTGACCCAGCTCAACGTTGCCTTCTCTCGAGAGCAGCCCCAG

AAGGTCTACGTCCAGCACCTGCTCAAGAAGGACAAGGAGCACCTGTGGAAGCTGAT

TCACGAGGGAGGCGCTCACATCTACGTCTGCGGCGACGCCCGAAACATGGCCCGAG

ATGTTCAGAACACCTTCTACGACATCGTCGCCGAGCAGGGAGCCATGGAGCAGGCC

CAGGCCGTCGATTACGTGAAGAAGCTGATGACCAAGGGACGATACTCCCTGGACGT

CTGGTCCTAA

Ma_POR(SEQ NO：11)：

ATGACCGAGGCCGTGGCCGAGGAGGTCAGCTTATTTTCCACCACCGACGTCGTCCTG

TTCTCCCTGATCGTCGGCGTCCTGACCTACTGGTTCATCTTCCGAAAGAAGAAGGAG

GAGGTCCCCGAGTTTTCTAAGATTCAGACCGCCACCCCCTCCGTCAAGGAGTCCTCT

TTCGTTGAGAAGATGAAGAAGACCGGCCGAAACATCATCGTGTTCTACGGATCTCA

GACCGGTACTGCCGAGGAGTTTGCCAACCGACTCTCCAAGGACGCCCACCGATACG

GCATGCGAGGCATGTCCGCCGACCCCGAGGAGTACGACCTCGCCGACCTCTCCTCTC

TGCCCGAGATTGACAAGTCCCTGGTCGTTTTCTGCATGGCCACCTACGGAGAGGGCG

ACCCCACCGACAACGCCCAGGACTTCTACGACTGGCTGCAGGAGACTGACGTCGAT

CTGACCGGCGTGAAGTTCGCCGTCTTCGGCCTGGGCAACAAGACCTACGAGCACTTT

AACGCCATGGGCAAGTACGTCGATCAGCGACTGGAGCAGCTGGGCGCCCAGCGAAT

CTTCGAGCTGGGTCTGGGCGACGACGACGGCAACCTCGAGGAGGACTTCATCACCT

GGCGAGAGCAGTTCTGGCCCGCCGTCTGCGAGTTCTTTGGAGTCGAGGCTACCGGCG

AGGAGTCTTCCATCCGACAGTACGAGCTGCTGGTCCACGAGGACATCGACGCCGCC

AAGGTCTACACCGGCGAGATGGGCCGACTGAAGTCCTACGAGAACCAGAAGCCCCC

CTTTGACGCCAAGAACCCCTTCCTCGCCGCCGTCACCACCAACCGAAAGCTGAACCA

GGGTACTGAGCGACACCTGATGCACCTGGAGCTGGACATCTCCGACTCCAAGATCC

GATACGAGTCCGGTGACCACGTCGCCGTCTACCCCGCCAACGACTCCACCCTGGTCA

ACCAGATCGGCGAGATTCTCGGCGCCGACCTCGACGTCGTGATGTCCCTGAACAACC

TGGACGAGGAGTCCAACAAGAAGCACCCCTTCCCCTGCCCCACCACCTACCGAACC

GCTCTCACCTACTACCTGGACATCACCAACCCCCCCCGAACCAACGTCCTCTACGAG

CTGGCCCAGTACGCCTCCGAGCCCTCCGAGCAGGAGCAGCTCCACAAGATGGCCTC

CTCCTCCGGCGAGGGCAAGGAGCTGTACCTCTCCTGGGTCGTCGAGGCCCGACGAC

ACATTCTCGCCATCCTCCAGGACTACCCCTCCCTGCGACCCCCCATCGACCACCTGT

GTGAGCTCCTCCCTCGACTGCAGGCCCGATACTACTCCATCGCCTCCTCCTCTAAGG

TCCACCCCAACTCCGTCCACATCTGCGCCGTCGCCGTCGAGTACGAGGCCAAGTCCG

GCCGAGTGAACAAGGGCGTTGCCACCTCCTGGCTGCGAGCCAAGGAGCCCGCCGGT

GAGAACGGCCGACGAGCTCTGGTCCCCATGTTTGTCCGAAAGTCCCAGTTTCGACTG

CCCTTCAAGTCTGTCACCCCCGTTATTATGGTTGGTCCCGGCACCGGCATTGCCCCCT

TCATGGGCTTCATTCAGGAGCGAGCCTGGCTGCGAGAGCAGGGCAAGGAGGTCGGC

GAGACTCTCCTGTACTACGGCTGCCGACGATCCGACGAGGACTACCTGTACCGAGA

GGAGCTGGCCCGATTCCACAAGGACGGTGCCCTGACCCAGCTGAACGTGGCCTTTTC

CCGAGAGCAGGCCCACAAGGTCTACGTCCAGCACCTGCTGAAGCGAGACAGAGAGC

ACCTGTGGAAGCTGATCCACGAGGGCGGAGCTCACATCTACGTCTGCGGCGACGCC

CGAAACATGGCCAAGGACGTCCAGAACACCTTCTACGACATTGTCGCCGAGTTTGG

CCCCATGGAGCACGCCCAGGCCGTCGATTACGTGAAGAAGCTGATGACCAAGGGTC

GATACTCCCTGGACGTCTGGTCCTAA

Ec_POR(SEQ NO：12)：

ATGGGCGACTCCAACATGGACGCCTCCGCCCCCACCTCCGAGACTGTCGCTGAGGA

GGTCAGCTTATTTTCCATGATGGACATGTTCCTGTTCTCCCTGATCGTCGGCCTGCTG

ACCTACTGGTTCCTCTTCCGAAAGAAGAAGGACGAGATCCCCGAGTTCACCAAGAT

CCAGACCACCACCACCTCCGTCAAGGACTCCTCCTTCGTCGAGAAGATGAAGAAGA

CCGGCCGAAACATCATCGTCTTCTACGGCTCCCAGACCGGAACCGCCGAGGAGTTC

GCCAACCGACTCTCCAAGGACGCCCACCGATACGGCATGCGAGGTATGGCCGCCGA

CCCCGAGGAGTACGACCTCGCTGACCTCGGCTCCCTCTCCGAGATCGAGAACTCCCT

GGCCGTCTTCTGCATGGCCACCTACGGAGAGGGTGACCCCACCGACAACGCCCAGG

ACTTCTACGACTGGCTGCAGGAGGCCGACGTCGATCTGTCCGGCGTCAAGTACGCCG

TCTTCGGTCTGGGCAACAAGACCTACGAGCACTTTAACGCCATGGGCAAGTACGTCG

ATAAGCGACTGGAGCAGCTCGGTGCCCAGCGAATCTTCGAGCTGGGTCTGGGCGAC

GACGACGGTAACCTGGAGGAGGACTTCATCACCTGGCGAGAGCAGTTCTGGCCCGC

CGTGTGCGAGCACTTTGGAGTCGAGGCTACCGGCGAGGAGTCCTCCATTCGACAGT

ACGAGCTGCTGGTGCACACCGACATTGACGCCGCCAAGGTCTACGTGGGCGAGATG

GGCCGACTGAAGTCCTACGAGACTCAGAAGCCCCCCTTTGACGCCAAGAACCCCTTC

CTGGCCGTTGTCACCACCAACCGAAAGCTGAACCAGGGTACTGAGCGACACCTGAT

GCACCTGGAGCTGGACATCTCCGACTCCAAGATCCGATACGAGTCCGGCGACCACG

TCGCCGTCTACCCCGCTAACGACTCCGCCCTGGTCAACCAGCTGGGCGAGATCCTCG

GCGCCGACCTCGACGTCATCATGTCCCTGAACAACCTCGACGAGGAGTCCAACAAG

AAGCACCCCTTCCCCTGCCCCACCTCCTACCGAACCGCCCTGACCTACTACCTGGAC

ATCACCAACCCCCCCCGAACCAACGTCCTCTACGAGCTGGCCCAGTACGCCTCCGAG

CCCTTCGAGCAGGAGCAGCTGCGAAAGATGGCCTCCTCCTCCGGCGAGGGCAAGGA

GCTGTACCTCACCTGGGTCGTCGAGGCCCGACGACACATTCTCGCCATCCTGCAGGA

CTACCCCTCCCTGCGACCCCCCATCGACCACCTGTGCGAGCTCCTGCCCCGACTGCA

GGCCCGATACTACTCCATCGCCTCCTCCTCTAAGGTCCACCCCAACTCCGTCCACAT

CTGCGCCGTCGCCGTCGAGTACGAGACTAAGACCGGCCGAATTAACAAGGGCGTTG

CCACCACCTGGCTGCGAGCCAAGGAGCCCGCCAAGGAGAACGGCCGACGAGCCCTC

GTCCCCATGTTCGTGCGAAAGTCCCAGTTTCGACTGCCCTTCAAGGCCACCACCCCC

GTCATCATGGTCGGCCCCGGCACCGGAATCGCCCCTTTCATTGGCTTCATCCAGGAG

CGAGCCTGGCTGCAGCAGCAGGGCAAGGAGGTTGGCGAGACTCTCCTGTACTACGG

CTGCCGACGATCCGACGAGGACTACCTGTACCGAGATGAACTGGCCCAGTTCCACC

GAGATGGTTCTCTGACCCAGCTCAACGTGGCCTTCTCTCGAGAGCAGGCCCACAAGG

TCTACGTCCAGCACCTGCTGAAGCGAGACAAGGAGCACCTGTGGAAGCTGATCCAC

GAGGGCGGCGCCCACATTTACGTCTGCGGCGACGCCCGAAACATGGCCCGAGATGT

TCAGAACACCTTCTACGACATCGTCGCCGAGCTGGGAACCATGGAGCACGCCCAGG

CCGTCGATTACATTAAGAAGCTGATGACCAAGGGTCGATACTCCCTGGACGTCTGGT

CCTAA

Xl_POR(SEQ NO：13)：

ATGGGCGAGTCCTGCACCGAGCAGGACATGTGCACCTCCGAGCAGGGCAACGGCTC

CCCCGAGGAGGCTTTCTTCTCCATGGCCGACATGTTCCTGCTGTCCCTGATCGTCGGC

CTGCTGACCTACTGGTTTTTCTTTCGAAAGAAGAAGGAGGAGACTATCGAGTTCACC

AAGATCCAGCCCACCGTGAACAACTCCGTTCGAGAGTCCTCCTTTATCGAGAAGATG

AAGAAGACCGGCAAGAACATCGTCGTCTTCTACGGCTCCCAGACCGGCACCGGCGA

GGAGTTCGCCAACCGACTGGCCAAGGACGCCCACCGATACGGCGTCCGAGGAATGG

CCGCCGACCCCGAGGAGTTCGAGATGGCCGACCTGTCCCGACTGACCGAGATTGAG

AACGCCCTGGCTGTCTTCTGCATGGCCACCTACGGCGAGGGCGACCCCACCGACAA

CGCCCAGGACTTTTACGACTGGCTGCAGGAGACTGACATCGACCTGACCGGCCTGA

AGTACGCCGTTTTCGGACTGGGCAACAAGACCTACGAGCACTTTAACGCCATGGGC

AAGTACGTCGATAAGCGACTGGAGGAGCTGGGCGCCGAGCGAATCTTTGAGCTGGG

TATGGGCGACGACGACGGCAACCTGGAGGAGGACTTCATCACCTGGCGAGAGCAGT

TCTGGCCCGCCGTGTGCGAGCACTTTGGTGTGGAGGCTACCGGAGAGGACTCCTCCA

TTCGACAGTACGAGCTGGTGGTGCACACCGACGAGAACATGAACAAGGTCTACACC

GGAGAGATGGGCCGACTGAAGTCCTACGAGACTCAGAAGCCCCCCTTCGACGCCAA

GAACCCCTTCCTGGCCAACGTCACCGTCAACCGAAAGCTGAACGAGGGCGGCGACC

GACACCTGATGCACCTGGAGCTGGACGTTACCGGCTCTAAGATCCGATACGAGTCC

GGAGATCATGTCGCCGTCTACCCCGCCAACGACACCGCCCTGGTCAACAAGCTGGG

AGAGATTCTGGGCGCCGACCTGGACACCGTGATTTCCCTGAACAACCTGGACGAGG

AGTCCAACAAGAAGCACCCCTTCCCCTGCCCCACCACCTACCGAACCGCCCTGACCT

ACTACCTGGACATCACCAACCCCCCCCGAACCAACGTCCTCTACGAGCTGGCCCAGT

ACGCCACCGACTCCAAGGAGCAGGAGAACCTGCGAAAGATGGCCTCCTCCGCCCAG

GACGGCAAGGGCCTGTACCTCTCCTGGGTCGTCGAGTCCCGACGAAACATTCTGGCC

ATCCTGGAGGACGTGCCCTCCCTGCGACCCCCTCTGGACCACCTGTGCGAGCTGCTG

CCCCGACTGCAGGCTCGATACTACTCTATCGCCTCCTCCTCCAAGGTCCACCCCTCCT

CCATCCACGTGTGCGCCGTCCTCGTCGAGTACGAGACTAAGACCGGCCGAGAGAAC

AAGGGCGTTGCCACCAACTGGCTCAAGAACAAGCAGCCCTCCGACAACGGCCACAA

GTCCTCCGTCCCCATGTACGTTCGAAAGTCTCAGTTCCGACTCCCCTTCAAGCCCTCC

ACCCCCGTCATCATGATCGGCCCCGGCACCGGCATCGCCCCTTTCATCGGCTTTATC

CAGGAGCGAGAGTGGCTCAAGCAGCAGGGCAAGGACGTTGGCGAGACTGTCCTGTA

CTACGGCTGCCGACACGAGCACGAGGACTTTCTGTACAAGGACGAGCTGAAGCGAT

ACCACAAGGACGGCGTCCTGACCCAGCTCAACGTCGCCTTCTCCCGAGATCAAGAC

CGAAAGGTGTACGTCCAGCACCTGCTCAAGGACAACAAGGAGATGGTGTGGAAGCT

GATTCACGAGGACAACGCTCACATTTACGTCTGCGGCGACGCCCGAAACATGGCTC

GAGATGTTCAGAACACCTTCTACGACATCGTGGCCGAGTACGGCAAGATCGACCAC

GCCCAGGCCGTCGATTACATCAAGAAGCTGATGACCAAGGGACGATACTCCCAGGA

CGTTTGGTCCTAA

Oa_CYB5(SEQ NO：14)：

ATGGCCGAGGAGTCTAGTAAACCAGTCAAGTACTACACCCTAGAGGAAATCCAGAA

GCACAACCACAGCAAATCGACCTGGCTGATTCTGCACTACAAGGTCTACGACCTCAC

AAAGTTCCTGGAAGAGCACCCGGGAGGAGAGGAGGTGCTTAGAGAGCAGGCTGGT

GGTGATGCAACTGAGAACTTTGAGGACGTTGGCCATTCAACGGATGCCCGAGAACT

TAGCAAGACCTTCATCATTGGCGAGCTGCATCCCGACGACCGGTCCAAGATCACCA

AGCCCTCTGAGTCCATCATCACAACTATTGACTCCAACTCGTCGTGGTGGACCAACT

GGCTCATTCCTGCCATTTCTGCTCTGGTGGTTGCGCTCATGTACCATTTGTATACTTC

TGAAAATTAA

Ma_CYB5(SEQ NO：15)：

ATGGCCGGCCAGGCAGACAAGGATGTCAAATACTATACGTTGGAAGAAATCCAGAA

GCACAAAGACTCCAAGTCTACGTGGGTCATTCTTCACCACAAGGTCTACGACCTGAC

CAAGTTTCTGGAGGAACATCCCGGTGGCGAGGAGGTACTTCGGGAGCAGGCTGGAG

GAGATGCCACCGAGAACTTTGAGGATGTGGGCCACTCGACCGACGCTCGAGAGCTC

TCAAAGACATTCATCATTGGAGAGCTGCATCCTGACGACCGCAGCAAGATTGCCAA

GCCCAGCGAGAGTCTCATCACCACTGTGGAGTCCAACTCCTCTTGGTGGACCAACTG

GGTTATTCCGGCAGTTTCTGCGCTGGCCGTGGCTCTGATGTACCGACTCTACATGGG

CAGACGACTGACCTGTTTCTCGAAACCTGGAACAGGGGAGGGTCTGCCCCAACGAC

GAGGTGAAAAGAAGCCTGTGTTGATCACTTCGGCCGATAGAAATCTACCACTTAAG

GGCAAGTAA

Ec_CYB5(SEQ NO：16)：

ATGGCCGAGCAGAGCGACAAGGCAGTCAAGTACTACACCCTCGAAGAGATCAAGA

AGCACAACCACTCGAAATCTACCTGGCTGATTCTGCACCACAAGGTCTATGACCTCA

CCAAGTTCCTGGAGGATCATCCAGGAGGAGAGGAGGTGCTTCGAGAACAGGCTGGT

GGTGATGCCACAGAGAACTTTGAGGATATTGGCCATTCTACAGACGCGAGAGAACT

TAGTAAAACGTTCATCATCGGCGAGCTGCATCCCGACGACCGGTCCAAGATTGCCA

AGCCCGTGGAGACTTTGATCACCACTGTGGACTCCAATTCATCGTGGTGGACCAACT

GGGTCATTCCTGCCATTTCTGCTGTAGTTGTTGCTCTCATGTACCGAATCTACACTGC

AGAAGATTAA

Ss_CYB(SEQ NO：17)：

ATGGCCGAGCAGTCCGACAAGGCCGTCAAGTACTACACCCTGGAGGAGATCCAGAA

GCACAACAACTCCAAGTCCACCTGGCTGATCCTGCACCACAAGGTCTACGACCTGAC

CAAGTTCCTGGAGGAGCACCCCGGCGGTGAGGAGGTCCTGCGAGAGCAGGCCGGCG

GTGACGCTACCGAGAACTTCGAGGACGTCGGCCACTCCACCGACGCCCGAGAGCTG

TCCAAGACCTTTATCATTGGCGAGCTCCACCCCGACGACCGATCCAAGATCGCCAAG

CCCTCCGAGACTCTGATCACCACCGTCGAGTCCAACTCCTCCTGGTGGACCAACTGG

GTCATCCCCGCCATCTCCGCCCTGGTTGTCTCCCTGATGTACCACTTCTACACCTCCG

AGAACTAA

Hs_3β-HSD2(L236S)(SEQ NO：18)：

ATGGGTTGGTCCTGTCTGGTGACCGGAGCTGGTGGACTGCTGGGTCAGCGAATCGTG

CGACTGCTGGTCGAGGAGAAGGAGCTGAAGGAGATTCGAGCCCTGGACAAGGCTTT

CCGACCCGAGCTGCGAGAGGAGTTCTCTAAGCTGCAGAACCGAACCAAGCTGACCG

TGCTGGAGGGAGACATCCTGGACGAGCCCTTCCTGAAGCGAGCCTGTCAGGACGTC

TCCGTGGTCATTCACACCGATTGCATCATTGACGTGTTCGGCGTCACCCACCGAGAG

TCTATCATGAACGTGAACGTCAAGGGAACCCAGCTGCTGCTGGAGGCCTGTGTGCA

GGCTTCCGTGCCCGTCTTCATCTACACCTCTTCCATTGAGGTCGCCGGACCCAACTCT

TACAAGGAGATCATTCAGAACGGTCACGAGGAGGAGCCTCTGGAGAACACCTGGCC

TACCCCCTACCCCTACTCCAAGAAGCTGGCCGAGAAGGCTGTCCTGGCCGCTAACGG

CTGGAACCTGAAGAACGGAGACACCCTGTACACCTGCGCTCTGCGACCCACCTACA

TCTACGGAGAGGGTGGCCCCTTCCTGTCTGCCTCCATCAACGAGGCTCTGAACAACA

ACGGTATTCTGTCTTCCGTGGGCAAGTTCTCTACCGTCAACCCCGTGTACGTCGGAA

ACGTGGCTTGGGCTCACATCCTGGCTTCGCGAGCTCTGCGAGATCCCAAGAAGGCCC

CCTCCGTCCGAGGACAGTTCTACTACATCTCCGACGACACCCCCCACCAGTCTTACG

ACAACCTGAACTACATTCTGTCTAAGGAGTTCGGTCTGCGACTGGACTCTCGATGGT

CCCTGCCCCTGACCCTGATGTACTGGATCGGCTTCCTGCTGGAGGTGGTGTCTTTCCT

GCTGTCCCCCATCTACTCTTACCAGCCCCCCTTCAACCGACACACCGTGACCCTGTCT

AACTCCGTCTTCACCTTCTCCTACAAGAAGGCCCAGCGGGACCTGGCTTACAAGCCC

CTGTACTCTTGGGAGGAGGCTAAGCAGAAGACCGTGGAGTGGGTCGGATCCCTGGT

GGACCGACACAAGGAGACTCTGAAGTCTAAGACCCAGTAA

Hs_3β-HSD2(SEQ NO：19)：

ATGGGTTGGTCCTGTCTGGTGACCGGAGCTGGTGGACTGCTGGGTCAGCGAATCGTG

CGACTGCTGGTCGAGGAGAAGGAGCTGAAGGAGATTCGAGCCCTGGACAAGGCTTT

CCGACCCGAGCTGCGAGAGGAGTTCTCTAAGCTGCAGAACCGAACCAAGCTGACCG

TGCTGGAGGGAGACATCCTGGACGAGCCCTTCCTGAAGCGAGCCTGTCAGGACGTC

TCCGTGGTCATTCACACCGCTTGCATCATTGACGTGTTCGGCGTCACCCACCGAGAG

TCTATCATGAACGTGAACGTCAAGGGAACCCAGCTGCTGCTGGAGGCCTGTGTGCA

GGCTTCCGTGCCCGTCTTCATCTACACCTCTTCCATTGAGGTCGCCGGACCCAACTCT

TACAAGGAGATCATTCAGAACGGTCACGAGGAGGAGCCTCTGGAGAACACCTGGCC

TACCCCCTACCCCTACTCCAAGAAGCTGGCCGAGAAGGCTGTCCTGGCCGCTAACGG

CTGGAACCTGAAGAACGGAGACACCCTGTACACCTGCGCTCTGCGACCCACCTACA

TCTACGGAGAGGGTGGCCCCTTCCTGTCTGCCTCCATCAACGAGGCTCTGAACAACA

ACGGTATTCTGTCTTCCGTGGGCAAGTTCTCTACCGTCAACCCCGTGTACGTCGGAA

ACGTGGCTTGGGCTCACATCCTGGCTCTGCGAGCTCTGCGAGATCCCAAGAAGGCCC

CCTCCGTCCGAGGACAGTTCTACTACATCTCCGACGACACCCCCCACCAGTCTTACG

ACAACCTGAACTACATTCTGTCTAAGGAGTTCGGTCTGCGACTGGACTCTCGATGGT

CCCTGCCCCTGACCCTGATGTACTGGATCGGCTTCCTGCTGGAGGTGGTGTCTTTCCT

GCTGTCCCCCATCTACTCTTACCAGCCCCCCTTCAACCGACACACCGTGACCCTGTCT

AACTCCGTCTTCACCTTCTCCTACAAGAAGGCCCAGCGGGACCTGGCTTACAAGCCC

CTGTACTCTTGGGAGGAGGCTAAGCAGAAGACCGTGGAGTGGGTCGGATCCCTGGT

GGACCGACACAAGGAGACTCTGAAGTCTAAGACCCAGTAA

Hs_3β-HSD1(SEQ NO：20)：

ATGACCGGCTGGTCCTGCCTGGTGACCGGTGCTGGTGGCTTCCTGGGCCAGCGAATC

ATCCGACTGCTGGTCAAGGAGAAGGAGCTGAAGGAGATCCGAGTGCTGGACAAGGC

CTTCGGCCCCGAGCTGCGAGAGGAGTTTTCCAAGCTGCAGAACAAGACCAAGCTGA

CCGTCCTGGAGGGCGACATCCTGGACGAGCCCTTTCTGAAGCGAGCCTGCCAGGAC

GTCAGCGTTATTATCCACACCGCCTGTATTATCGACGTCTTCGGCGTCACCCACCGA

GAGTCCATTATGAACGTCAACGTCAAGGGAACCCAGCTGCTGCTGGAGGCCTGCGT

CCAGGCTTCCGTCCCTGTCTTCATCTACACCTCCTCCATCGAGGTCGCTGGCCCCAAC

TCCTACAAGGAGATCATCCAGAACGGCCACGAGGAGGAGCCCCTGGAGAACACCTG

GCCCGCTCCTTACCCCCACTCCAAGAAGCTCGCCGAGAAGGCCGTGCTGGCCGCTAA

CGGTTGGAACCTGAAGAACGGCGGCACCCTCTACACCTGTGCCCTGCGACCCATGTA

CATCTACGGTGAGGGCTCCCGATTCCTGTCCGCCTCCATTAACGAGGCTCTCAACAA

CAACGGCATCCTGTCCTCCGTCGGCAAGTTCTCCACCGTCAACCCCGTCTACGTCGG

CAACGTCGCCTGGGCTCACATCCTCGCCCTCCGAGCTCTGCAGGACCCTAAGAAGGC

CCCCTCCATTCGAGGTCAGTTCTACTACATCTCCGACGACACCCCCCACCAGTCCTA

CGACAACCTCAACTACACCCTCTCCAAGGAGTTCGGCCTGCGACTCGACTCCCGATG

GTCCTTCCCCCTGTCCCTGATGTACTGGATCGGCTTCCTGCTGGAGATCGTCAGCTTT

TTACTGCGACCCATCTACACCTACCGACCCCCCTTCAACCGACACATCGTGACCCTC

TCTAACTCCGTCTTCACCTTCTCCTACAAGAAGGCTCAGCGAGACTTGGCCTACAAG

CCCCTGTACTCCTGGGAGGAGGCCAAGCAGAAGACCGTCGAGTGGGTCGGCTCTCT

GGTCGATCGACACAAGGAGACTCTGAAGTCCAAGACCCAGTAA

Hs_3β-HSD1(L237S)(SEQ NO：21)：

ATGACCGGCTGGTCCTGCCTGGTGACCGGTGCTGGTGGCTTCCTGGGCCAGCGAATC

ATCCGACTGCTGGTCAAGGAGAAGGAGCTGAAGGAGATCCGAGTGCTGGACAAGGC

CTTCGGCCCCGAGCTGCGAGAGGAGTTTTCCAAGCTGCAGAACAAGACCAAGCTGA

CCGTCCTGGAGGGCGACATCCTGGACGAGCCCTTTCTGAAGCGAGCCTGCCAGGAC

GTCAGCGTTATTATCCACACCGCCTGTATTATCGACGTCTTCGGCGTCACCCACCGA

GAGTCCATTATGAACGTCAACGTCAAGGGAACCCAGCTGCTGCTGGAGGCCTGCGT

CCAGGCTTCCGTCCCTGTCTTCATCTACACCTCCTCCATCGAGGTCGCTGGCCCCAAC

TCCTACAAGGAGATCATCCAGAACGGCCACGAGGAGGAGCCCCTGGAGAACACCTG

GCCCGCTCCTTACCCCCACTCCAAGAAGCTCGCCGAGAAGGCCGTGCTGGCCGCTAA

CGGTTGGAACCTGAAGAACGGCGGCACCCTCTACACCTGTGCCCTGCGACCCATGTA

CATCTACGGTGAGGGCTCCCGATTCCTGTCCGCCTCCATTAACGAGGCTCTCAACAA

CAACGGCATCCTGTCCTCCGTCGGCAAGTTCTCCACCGTCAACCCCGTCTACGTCGG

CAACGTCGCCTGGGCTCACATCCTCGCCTCCCGAGCTCTGCAGGACCCTAAGAAGGC

CCCCTCCATTCGAGGTCAGTTCTACTACATCTCCGACGACACCCCCCACCAGTCCTA

CGACAACCTCAACTACACCCTCTCCAAGGAGTTCGGCCTGCGACTCGACTCCCGATG

GTCCTTCCCCCTGTCCCTGATGTACTGGATCGGCTTCCTGCTGGAGATCGTCAGCTTT

TTACTGCGACCCATCTACACCTACCGACCCCCCTTCAACCGACACATCGTGACCCTC

TCTAACTCCGTCTTCACCTTCTCCTACAAGAAGGCTCAGCGAGACTTGGCCTACAAG

CCCCTGTACTCCTGGGAGGAGGCCAAGCAGAAGACCGTCGAGTGGGTCGGCTCTCT

GGTCGATCGACACAAGGAGACTCTGAAGTCCAAGACCCAGTAA

Mm_3β-HSD(SEQ NO：22)：

ATGCCCGGATGGTCCTGTCTGGTGACCGGAGCTGGCGGATTCCTGGGTCAGCGAATC

ATTCAGCTGCTGGTGCAGGAGGAGGACCTGGAGGAGATTCGAGTGCTGGACAAGGT

CTTCCGACCCGAGACTCGAAAGGAGTTCTTCAACCTGGAGACTTCCATTAAGGTGAC

CGTCCTGGAGGGAGACATCCTGGACACCCAGTACCTGCGACGAGCCTGCCAGGGTA

TTTCTGTGGTCATCCACACCGCCGCTATCATTGACGTGACCGGCGTCATTCCCCGAC

AGACCATCCTGGACGTGAACCTGAAGGGAACCCAGAACCTGCTGGAGGCCTGTATT

CAGGCTTCCGTCCCCGCCTTCATCTTCTCTTCCTCTGTGGACGTCGCTGGTCCCAACT

CTTACAAGGAGATCGTGCTGAACGGCCACGAGGAGGAGTGCCACGAGTCCACCTGG

TCTGACCCCTACCCCTACTCCAAGAAGATGGCCGAGAAGGCTGTCCTGGCCGCTAAC

GGATCTATGCTGAAGAACGGTGGTACCCTGCAGACCTGTGCTCTGCGACCCATGTGC

ATCTACGGAGAGCGATCCCCCCTGATCTCTAACATCATTATCATGGCTCTGAAGCAC

AAGGGCATTCTGCGATCCTTCGGAAAGTTCAACACCGCCAACCCCGTGTACGTCGGA

AACGTGGCTTGGGCTCACATCCTGGCTGCTCGAGGTCTGCGAGATCCCAAGAAGTCT

CCCAACATTCAGGGCGAGTTCTACTACATCTCCGACGACACCCCCCACCAGTCTTTC

GACGACATTTCCTACACCCTGTCTAAGGAGTGGGGATTCTGTCTGGACTCCTCTTGG

TCCCTGCCTGTGCCTCTGCTGTACTGGCTGGCCTTCCTGCTGGAGACTGTGTCTTTCC

TGCTGTCTCCCATCTACCGATACATCCCCCCCTTCAACCGACACCTGGTGACCCTGTC

CGGTTCTACCTTCACCTTCTCCTACAAGAAGGCTCAGCGGGACCTGGGTTACGAGCC

TCTGGTGTCCTGGGAGGAGGCCAAGCAGAAGACCTCTGAGTGGATCGGCACCCTGG

TCGAGCAGCACCGAGAGACTCTGGACACCAAGTCTCAGTAA

At_3β-HSD(SEQ NO：23)：

ATGGCCGCTCCCGACTCTTCCATCAACAACCACCAGCTGCAGTACTCTGTGAACGTC

CAGGGAACCCAGAACGTCATCGACGCTTGTGTGGACGTCGGTGTGAAGCGACTGAT

CTACACCTCTTCCCCCTCTGTGGTCTTCGACGGCGTGCACGGAATCCTGAACGGCAC

CGAGTCCATGGCTTACCCCATTAAGCACAACGACTCTTACTCCGCTACCAAGGCCGA

GGGAGAGGAGCTGATTATGAAGGCCAACGGTCGAAACGGCCTGCTGACCTGTTGCA

TCCGACCCTCTTCCATTTTCGGTCCTGGCGACCGACTGCTGGTCCCTTCTCTGGTGGC

CGCTGCCCGAGCTGGCAAGTCCAAGTTCATCATTGGAGACGGTAACAACCTGTACG

ACTTCACCTACGTCGAGAACGTGGCTCACGCTCACGTCTGCGCTGAGCGAGCTCTGG

CTTCTGGAGGAGACGTGTCCACCAAGGCTGCCGGACAGGTGTTCGCCTTCTCCTAABt_3β-HSD(SEQNO：24)：

ATGGCCGGATGGTCTTGTCTGGTGACCGGTGGAGGTGGCTTCCTGGGTCAGCGAATC

ATTTGCCTGCTGGTCGAGGAGAAGGACCTGCAGGAGATCCGAGTGCTGGACAAGGT

CTTCCGACCCGAGGTGCGAGAGGAGTTCTCTAAGCTGCAGTCCAAGATCAAGCTGA

CCCTGCTGGAGGGCGACATTCTGGACGAGCAGTGTCTGAAGGGAGCTTGCCAGGGT

ACCTCTGTGGTCATCCACACCGCCTCCGTGATTGACGTCCGAAACGCTGTCCCCCGA

GAGACTATTATGAACGTGAACGTCAAGGGAACCCAGCTGCTGCTGGAGGCCTGTGT

GCAGGCTTCTGTGCCCGTCTTCATCCACACCTCCACCATTGAGGTCGCCGGTCCCAA

CTCTTACCGAGAGATCATTCAGGACGGCCGAGAGGAGGAGCACCACGAGTCTGCTT

GGTCTTCCCCCTACCCCTACTCCAAGAAGCTGGCCGAGAAGGCTGTGCTGGGTGCCA

ACGGCTGGGCTCTGAAGAACGGAGGTACCCTGTACACCTGTGCCCTGCGACCCATGT

ACATCTACGGCGAGGGATCTCCCTTCCTGTCCGCCTACATGCACGGCGCTCTGAACA

ACAACGGAATTCTGACCAACCACTGCAAGTTCTCCCGAGTGAACCCCGTGTACGTCG

GTAACGTCGCTTGGGCTCACATCCTGGCTCTGCGAGCTCTGCGAGATCCCAAGAAGG

TGCCCAACATCCAGGGACAGTTCTACTACATTTCTGACGACACCCCCCACCAGTCCT

ACGACGACCTGAACTACACCCTGTCTAAGGAGTGGGGCTTCTGTCTGGACTCTCGAA

TGTCCCTGCCCATTTCCCTGCAGTACTGGCTGGCCTTCCTGCTGGAGATCGTCTCTTT

CCTGCTGTCCCCCATCTACAAGTACAACCCCTGCTTCAACCGACACCTGGTGACCCT

GTCTAACTCCGTCTTCACCTTCTCTTACAAGAAGGCTCAGCGGGACCTGGGTTACGA

GCCTCTGTACACCTGGGAGGAGGCTAAGCAGAAGACCAAGGAGTGGATCGGATCCC

TGGTGAAGCAGCACAAGGAGACTCTGAAGACCAAGATTCACTAA

Mt_3β-HSD(SEQ NO：25)：

ATGCTGCGACGAATGGGAGACGCCTCTCTGACCACCGAGCTGGGTCGAGTGCTGGT

CACCGGTGGAGCTGGTTTCGTCGGAGCTAACCTGGTGACCACCCTGCTGGACCGAG

GACACTGGGTCCGATCTTTCGACCGAGCTCCTTCCCTGCTGCCTGCTCACCCTCAGCT

GGAGGTGCTGCAGGGCGACATCACCGACGCTGACGTCTGTGCCGCTGCCGTGGACG

GAATCGACACCATTTTCCACACCGCTGCCATCATTGAGCTGATGGGTGGCGCCTCTG

TCACCGACGAGTACCGACAGCGATCCTTCGCTGTGAACGTCGGAGGTACCGAGAAC

CTGCTGCACGCTGGACAGCGAGCTGGTGTCCAGCGATTCGTGTACACCTCTTCCAAC

TCCGTGGTCATGGGCGGACAGAACATTGCCGGTGGCGACGAGACTCTGCCCTACAC

CGACCGATTCAACGACCTGTACACCGAGACTAAGGTGGTCGCCGAGCGATTCGTCCT

GGCTCAGAACGGTGTGGACGGCATGCTGACCTGCGCCATCCGACCCTCTGGAATTTG

GGGAAACGGTGACCAGACCATGTTCCGAAAGCTGTTCGAGTCCGTGCTGAAGGGTC

ACGTGAAGGTCCTGGTGGGCCGAAAGTCTGCTCGACTGGACAACTCCTACGTCCAC

AACCTGATCCACGGTTTCATTCTGGCTGCCGCTCACCTGGTGCCTGACGGTACCGCT

CCTGGACAGGCTTACTTCATCAACGACGCCGAGCCCATTAACATGTTCGAGTTCGCC

CGACCCGTCCTGGAGGCTTGTGGTCAGCGATGGCCCAAGATGCGAATCTCTGGCCCC

GCTGTCCGATGGGTCATGACCGGATGGCAGCGACTGCACTTCCGATTCGGTTTCCCT

GCTCCTCTGCTGGAGCCTCTGGCTGTGGAGCGACTGTACCTGGACAACTACTTCTCT

ATTGCCAAGGCTCGACGGGACCTGGGTTACGAGCCTCTGTTCACCACCCAGCAGGCT

CTGACCGAGTGCCTGCCCTACTACGTCTCCCTGTTCGAGCAGATGAAGAACGAGGCC

CGAGCTGAGAAGACCGCCGCTACCGTGAAGCCCTAA

Vv_3β-HSD(SEQ NO：26)：

ATGGCTGTGTACGCTGTCACCGGTGGAGCTGGATTCCTGGGTCGATACATCGTGAAG

CTGCTGATTTCCGCTGACGACGTCCAGGAGATCCGAGTGATCGACATTGTCGAGGAC

CCCCAGCCCATTACCTCTAAGGTGAAGGTCATCAACTACATTCAGTGTGACATCAAC

GACTTCGACAAGGTGCGAGAGGCCCTGGACGGTGTCAACCTGATCATTCACACCGC

CGCTCTGGTGGACGTCTTCGGCAAGTACACCGACAACGAGATCATGAAGGTGAACT

ACTACGGAACCCAGACCATTCTGGCCGCTTGCGTCGACCTGGGTATCAAGTACCTGA

TCTACACCTCTTCCATGGAGGCCATTGGTCCCAACAAGCACGGCGACCCCTTCATCG

GACACGAGCACACCCTGTACGACATTTCCCCCGGACACGTGTACGCCAAGTCTAAG

CGAATGGCTGAGCAGCTGGTCATGAAGGCCAACAACTCCGTCATCATGAACGGCGC

TAAGCTGTACACCTGTTGCCTGCGACCCACCGGAATCTACGGAGAGGGCGACAAGC

TGACCAAGGTCTTCTACGAGCAGTGTAAGCAGCACGGAAACATCATGTACCGAACC

GTGGACGACGACGCTGTCCACTCCCGAGTGTACGTCGGTAACGTGGCTTGGATGCAC

GTCCTGGCCGCTAAGTACATCCAGTACCCCGGTTCTGAGATTAAGGGCAACGCCTAC

TTCTGTTACGACTACTCTCCCTCCTGCTCTTACGACATGTTCAACCTGCTGCTGATGA

AGCCCCTGGGCATCGAGCAGGGATCTCGAATTCCCCGATGGATGCTGAAGATGTAC

GCTTGCAAGAACGACATGAAGCGAATCCTGTTCCGAAAGCCCTCCCTGCTGAACAA

CTACACCCTGAAGATTTCTAACACCACCTTCGAGGTGCGAACCAACAACGCCGAGCT

GGACTTCAACTACTCCCCCATTTTCAACGTGGACGTCGCTTTCGAGCGAACCCGAAA

GTGGCTGGAGGAGTCTGAGTAA

Homo sapiens(I型，L237S突变)的3β-HSD，突变位点为下划线AA处(SEQ NO：27)：

Homo sapiens(II型，L236S突变)的3β-HSD，突变位点为下划线AA处(SEQ NO：28)：

本发明提供的网状路径产物定向合成中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：4AD路径关键组分底物特异性异源表征(3β-HSD)与孕酮的定向合成

1、底盘菌株的获得

野生型解脂耶氏酵母菌株编号为ATCC201249由元英进课题组提供。在Multiplexgene editing ofthe Yarrowia lipolytica genome using the CRISPR-Cas9 system文献中所提及。

2、外源功能基因元件的获得

本发明涉及的基因CYP17A1(17-alpha-hydroxylase/17，20-lyase)、POR(NADPH-cytochrome P450 reductase)、3β-HSD(3β-hydroxysteroid dehydrogenase)、CYB5(细胞色素B5，Cytochrome b5)、mCYP11A1(成熟P450scc)来源见表3。

表3本发明涉及的基因来源

本发明所用的以上四个组分基因均为经过解脂耶氏酵母密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点后，在基因两端额外添加5’端gcggccgcggtctcca(如SEQ NO：1所示)；3’taaaggagaccgcggccgc(如SEQ NO：2所示)通过人工合成得到。孕烯醇酮合成雄烯二酮路径如图1所示，合成路径中包括孕烯醇酮合成孕酮(图2)、孕烯醇酮合成去氢表雄酮(图3)、孕烯醇酮合成17-羟孕酮(图4)、孕烯醇酮合成17-羟孕烯醇酮(图5)等步骤。

3、试验方法：

种子培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；

生物转化培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉。

类固醇底物母液：1.75g/L(50％EtOH-Tween80)P4溶液、1.75g/L(50％

EtOH-Tween80)17OHP4溶液

3β-HSD异构化转化实验：将重组菌株RS3B-1～RS3B-9(见下述模块化整合质粒的构建部分)接种于5mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养14～16h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2分别接种于5mL生物转化培养基中，在28℃、220rpm培养24h，分别加入150μL P4溶液、17OHP4溶液继续孵育40h得到发酵液，并通过下述方法对甾体产物定量。

孕烯醇酮定量方法：取1mL的发酵液，12000g离心2min收集菌体，并水洗两次。加入1mL 3mol/L盐酸重悬菌体，置于100℃沸水中煮沸5min，12000rpm离心1min收集细胞沉淀。用1mL蒸馏水洗细胞沉淀3次。向破碎的细胞沉淀中加入，420μL 2mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，在37℃恒温培养箱中反应2h。将皂化反应离心管取出，冷却至室温(25℃±5℃)后，加入等体积的正己烷，涡旋震荡10min，12000rpm离心1min，取上层正己烷相至新的离心管中。对下层用正己烷重复萃取一次，两次的正己烷相合并。将正己烷相用真空离心浓缩仪浓缩(样品溶剂为正己烷时：25℃，30min，7000rpm)，浓缩后管中剩余的固体则为甾体类物质，加入100μL MSTFA于37℃反应2h，加入100μL正己烷，过滤后于气相质谱检测。

孕酮、17-羟孕烯醇酮、17-羟孕酮、DHEA、雄烯二酮定量方法：取1mL的发酵液，加入玻璃珠和700μL乙酸乙酯振荡萃取10min，收集上层有机相并用新鲜乙酸乙酯重新萃取一次水相，两次萃取有机相合并，并用真空离心浓缩仪浓缩液体(样品溶剂为乙酸乙酯时：25℃，1200min，7000rpm)，浓缩后管中剩余的固体则为甾体类物质，加入100μLMSTFA于37℃反应2h，加入100μL正己烷并过滤。P5、P4、DHEA、4AD、17OHP4、17OHP5于GC-MS下检测。(17OHP4、17OHP5产量以P5标准曲线相对定量)

4、模块化整合质粒的构建

模块三的构建：在人体中存在两种不同催化特异性的3β-HSD：I型3β-HSD活性较高且以DHEA为主要底物，II型3β-HSD倾向以P5和17OHP5为底物。本发明将上述两种人源3β-HSD经密码子优化后，依次简写为Hs_3β-HSD1和Hs_3β-HSD2。1999年Moisan等指出Hs_3β-HSD2的L236S突变可提升该蛋白的最大反应速率，该突变蛋白简写为Hs_3β-HSD2mut。经过同原序列比较，本发明也对Hs_3β-HSD1引入相应突变L237S，并命名为Hs_3β-HSD1mut。本实施例还选取了具有种属代表性的五个不同来源的3β-HSD，分别是小鼠Mus musculus来源的Mm_3β-HSD，牛Bos taurus来源的3β-HSD2、牛痘病毒Vaccinia virus来源的3β-HSD、结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis来源的3β-HSD、以及拟南芥Arabidopsis thaliana来源的At_3β-HSD，经密码子优化后，依次简写为Mm_3β-HSD、Bt_3β-HSD、Vv_3β-HSD、Mt_3β-HSD和At_3β-HSD。为了方便通过Gibson组装整合入载体pINA1269-Nat(将商业载体质粒pINA1269 BglII和ClaI酶切位点之间的LEU2标记替换为诺尔斯菌素抗性标记Nat后的载体质粒。)，通过PCR反应在上述基因5'端引入载体BamHI位点上游21bp同源臂序列gggaacccgaaactaaggatc(如SEQ NO：3所示)，以及在基因3'端引入载体KpnI位点下游21bp同源臂序列gtacctccatggcctgtcccc(如SEQ NO：4所示)。经过与BamHI、KpnI线性化的载体组装后，得到9个相应的pINA1269-Nat-3β-HSD整合重组质粒pRS3B-1～pRS3B-9(即pINA1269-Nat-Mm_3β-HSD、pINA1269-Nat-Bt_3β-HSD、pINA1269-Nat-Vv_3β-HSD、pINA1269-Nat-At_3β-HSD、pINA1269-Nat-Mt_3β-HSD、pINA1269-Nat-Hs_3β-HSD1、pINA1269-Nat-Hs_3β-HSD2、pINA1269-Nat-Hs_3β-HSD1mut、pINA1269-Nat-Hs_3β-HSD2mut)，即模块三。上述构建的质粒分别转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行单、双酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。pINA1269为整合型质粒名称，该质粒经NotI酶切线性化后，可用于整合于酵母基因组的pBR322位点，其中pBR322为整合位点名称。

5、实验结果

以相应异构体合成量表征甾体底物转化效率。3β-HSD全细胞催化结果如图6所示。

从三种底物的全细胞转化结果可以看出：(1)在以孕烯醇酮(P5)为底物的转化实验中，其中Vv_3β-HSD表现出最强孕烯醇酮转化效率，达6.8％。I型人源及突变体3β-HSD表现了次强催化效率，达4.6～4.8％(2)对于以17-羟基孕烯醇酮(17OHP5)为底物的转化实验中，四种人源3β-HSD及突变体均表现出较强转化效率，其中I型人源3β-HSD得孕酮转化率最高达到3.1％。(3)以去氢表雄酮(DHEA)为底物时，II型人源、牛源、分枝杆菌源均表现较强催化活性，其中II型人源3β-HSD转化效率高达10.5％。

通过在野生型酵母底盘单独表达异源3β-HSD，本发明实现了以P5为底物合成4AD路径节点产物：P4。此外，不同来源的3β-HSD全细胞催化效率表现较强底物偏好性差异：(1)除人、低催化活性的拟南芥源外的几种3β-HSD对孕烯醇酮均表现较强底物偏好性，而对17OHP5转化能力相对较低；(2)与3β-HSD在人体细胞内表现的底物倾向性不同，解脂耶氏酵母体系下人源3β-HSD对三种甾体底物普遍表现较均衡的催化能力。特别的，野生型II型人源3β-HSD表现了高于I型人源3β-HSD的DHEA转化能力。

实施例2：4AD路径关键组分底物特异性异源表征(CYP17A1)与17-羟孕烯醇酮的定向合成

1、实验材料的获得

CYP17羟化酶处于类固醇合成代谢路径中关键节点，催化以C21类固醇为底物的17α-羟化及17，20-裂解反应。其中细胞色素b5(CYB5，Cytochrome b5)的参与会促进CYP17的17，20-裂解酶活性。CYP17A1催化活性具有很强物种特异性，根据底物催化特异性，CYP17A1通常被分为△^4，5型、△⁵型和△⁴型。本研究CYP17的选择基于Gilep及其同事整理的多来源CYP17体外催化活性参数，由于报道中唯一△⁴型CYP17催化活性较弱，依据体外酶活参数以及蛋白进化关系，本发明仅选取绵羊源(Ovis aries)△⁵型CYP17A1和黄金仓鼠(Mesocricetus auratus)、马(Equus caballus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)源的△^4，5型CYP17A1，并经密码子优化后依次简写为Oa_CYP17A1、Ma_CYP17A1、Ec_CYP17A1、Xl_CYP17A1。类似的，上述CYP17A1原配体NADPH细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450reductase，POR)同样经密码子优化后简写为Oa_POR、Ma_POR、Ec_POR、Xl_POR。考虑到CYP17的17，20-裂解酶活性受CYB5影响，来自绵羊、黄金仓鼠、马、猪(Sus scrofa)源的CYB5被引入测试，4个CYB5经密码子优化后分别缩写为Oa_CYB5、Ma_CYB5、Ec_CYB5、Ss_CYB5。

野生型醇解脂耶氏酵母的获得的获得同实施例1中所述。

模块一的构建：将IntD整合位点左臂、酿酒酵母GPM1t终止子通过OE-PCR方法拼接起来；将酿酒酵母FBA1t终止子40bp末端序列、两端带有LoxP位点的亮氨酸营养筛选标签Leu2、IntD整合位点右臂通过OE-PCR方法拼接起来得到两端包含NotI酶切位点的片段，分别命名为IntD-L和IntD-R；后将4种不同来源的人工合成的CYP17A1和POR分别与经BsmBI酶切后的表达模块TEF1inp-LIP2t-GPDt、GPDt-TEF1inp-OCT1t-FBA1t连接得到整合质粒，将带有相同物种来源的CYP17A1和POR模块与IntD-L、IntD、HincII酶切后的pUC18H通过Gibson组装，得到整合质粒，经过NotI酶切后获得模块一。模块二的构建：将IntB整合位点左臂、营养缺陷型尿嘧啶标签Ura3、IntB整合位点右臂、启动子TEF1in、终止子ACOt分别和4种来源的CYB5通过Gibson法拼接起来得到整合质粒，经过NotI酶切后获得模块二。上述构建的模块整合质粒分别转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行单、双酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。

模块四的构建：将IntF整合位点左臂、HincII酶切后的pUC18H、两端带有LoxP位点的亮氨酸营养筛选标签Leu2、IntF整合位点右臂、Equus caballus来源的CYP17A1和POR(方法同模块一构建)通过Gibson方法拼接起来得到两端包含NotI酶切位点的片段，经过NotI酶切后获得模块四。

17-羟化转化实验验证菌株的构建，将含有4种含有不同来源基因的模块一分别整合入ATCC201249中，获得菌株SyBE_Yl2091001～SyBE_Yl2091004。

17，20-裂解转化实验验证菌株的构建，将将含有4种含有不同来源基因的模块二分别整合入上述构建的菌株SyBE_Yl2091001～SyBE_Yl2091004中，获得菌株SyBE_Yl2091005～SyBE_Yl2091016及SyBE_Yl2090013～SyBE_Yl2090016。

2、实验方法

生物转化培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；

种子培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；

YPD发酵培养基：50g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉。

类固醇底物母液：1.75g/L(50％EtOH-Tween80)P5溶液、1.75g/L(50％

EtOH-Tween80)P4溶液、1.75g/L(50％EtOH-Tween80)17OHP5溶液、1.75g/L(50％

EtOH-Tween80)17OHP4溶液

17-羟化转化实验：将SyBE_Yl2091001～SyBE_Yl2091004接种于5mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养14～16h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2分别接种于5mL生物转化培养基中，在28℃、220rpm培养24h，分别加入150μL P4和P5底物母液继续孵育16h，取1mL样品按实例1中方法检测17OHP4含量。

17，20-裂解转化实验：将SyBE_Yl2091005～SyBE_Yl2091016接种于5mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养14～16h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2分别接种于5mL生物转化培养基中，在28℃、220rpm培养24h，分别加入150μL 17OHP4和17OHP5底物母液继续孵育144h，取1mL样品按实例1中方法检测DHEA或4AD含量。

3、实验结果

17-羟化转化实验：通过在野生型酵母底盘单独表达异源3β-HSD，本发明实现了以P5为底物合成4AD路径节点产物：17OHP5。由实验结果可知(图7)，绵羊、黄金仓鼠、非洲爪蟾源CYP17A1均对孕酮的17α-羟基化活性为以孕烯醇酮为底物催化下的1.2～14.5倍。在测试的△^4，5型CYP17A1中，虽然黄金仓鼠源CYP17A1分别以孕烯醇酮和孕酮为底物的条件下均表现最强17α-羟基化活性，但分别只有△⁵型绵羊源CYP17A1活性的39.2％和13.8％。来自马和非洲爪蟾的CYP17A1对两种底物均表现了非常弱的催化活性。

17，20-裂解转化实验：由实验结果可知(图8)，所有测试菌株对两种底物均表现17，20-裂解酶活性。(1)对于3种测试的△^4，5型CYP17A1：含有非洲爪蟾源CYP17A1的工程菌均表现低17，20-裂解酶活性，表明该来源CYP17在当前体系下不能有效实现功能性表达；对于黄金仓鼠源和马源CYP17A1，CYB5的参与均能对17，20-裂解酶活性有明显提升。(2)对△⁵型绵羊源CYP17A1：该来源蛋白对17-羟基孕烯醇酮较17-羟基孕酮有更强底物偏好性及生物转化能力；该来源蛋白对17α-羟基孕酮的17，20-裂解酶活性有很强CYB5来源依赖性。(3)对于CYB5：在大多数情况下，CYB5可以对CYP17A1的17，20-裂解酶活性起到促进作用；猪和马来源CYB5作为高效配体，当与多来源CYP17A1适配时，往往能更大程度促进后者对17α-羟基孕酮的转化效率。

对于解脂耶氏酵母异源4AD路径重建的酶来源选择上，本发明总结可知：(1)对于异构(脱氢)反应，Vv_3β-HSD是以P5为底物催化反应的优先蛋白；(野生型)I型和II型Hs_3β-HSD是以7OHP5、DHEA为底物催化反应的优先蛋白(2)以P5和P4为底物时，Oa_CYP17A1为催化17α-羟基化反应的最优选来源；(3)对于17α-羟基孕烯醇酮为底物的17，20-裂解反应，虽然绵羊来源蛋白具备高催化活性，△^4，5型黄金仓鼠来源CYP17A1也是可靠的备选来源；对于17α-羟基孕酮为底物的17，20-裂解反应，马来源CYP17A1可实现被CYB5调控的高效催化；同时猪、黄金仓鼠源和马来源CYB5均可作为高效配体用于路径搭建。

实施例3：以P5为底物合成DHEA、以P4为底物合成4AD

1、实验材料的获得

菌株SyBE_Yl2091005～SyBE_Yl2091016的获得同实施例2所述。

模块四的获得同实施例2所述。

模块五的构建：利用Cre-loxP系统敲除SyBE_Yl2091004的Leu2筛选标记，获得无Leu2标签的SyBE_Yl2091004。将NotI线性化后的模块四和含有马源Ec_CYB5的模块二通过酵母转化整合于无Leu2标签的SyBE_Yl2091004基因组，获得菌株SyBE_Yl2091030。

2、实验方法

种子培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；

生物转化培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉。

类固醇底物母液：3.5g/L(50％EtOH-Tween80)P5溶液、3.5g/L(50％EtOH-Tween80)P4溶液

DHEA合成实验：将SyBE_Yl2091030(实验组)、SyBE_Yl2091016(对照)接种于5mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养14～16h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2分别接种于5mL生物转化培养基中，在28℃、220rpm培养24h，分别加入150μL P5底物母液继续孵育120h，取1mL样品按实例1中方法检测DHEA含量。

4AD合成实验：将SyBE_Yl2091030(实验组)、SyBE_Yl2091016(对照)分别接种于5mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养14～16h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2分别接种于5mL生物转化培养基中，在28℃、220rpm培养24h，分别加入150μL P4底物母液继续孵育120h，取1mL样品按实例1中方法检测4AD含量。

3、实验结果

本实施例通过在菌株SyBE_Yl2091030中组合表征Oa_CYP17A1(强17α-羟基化活性)、Ec_CYP17A1(强17，20-裂解活性)、Ec_CYB5(对Oa_CYP17A1和Ec_CYP17A1的17，20-裂解活性均有较强促进作用)以实现高效转化P5/P4合成DHEA/4AD。

DHEA合成实验：在以P5为底物的生物转化中，SyBE_Yl2091030的DHEA合成量达12.6mg/L，较对照组SyBE_Yl2091016高7.32倍(图9)。

4AD合成实验：在以P4为底物的生物转化中，菌株SyBE_Yl2091030实现了13.9mg/L的雄烯二酮合成量，较对照菌株SyBE_Yl2091016产量高86.2倍(图10)。

在本实施例，本发明实现了以P5为底物定向合成DHEA以及以P4为底物定向合成4AD，并通过组合表达高效路径组分蛋白实现了催化效率提升。

实施例4：以P5为底物合成17OHP4

由P5合成17OHP4涉及两类反应：以P4或P5为底物的17α-羟基化反应、以P5或17OHP5为底物的异构化反应。本发明选择了Ma_CYP17A1催化两种17α-羟基化反应，并选择对两种中间体(P5、17OHP5)表现较强催化特异性的Hs_3β-HSD2、以及对P5强催化特异性的Vv_3β-HSD。并将上述三个高效催化蛋白共同用于17OHP4路径构建。

1、实验材料的获得

模块一、二、三、四构建同实例1、2所述。

模块六的构建：将IntC整合位点左臂、人工启动子hp8d、Hs_3β-HSD2、解脂耶氏酵母终止子OCTt、两端带有LoxP位点的亮氨酸营养筛选标签Leu2、IntC整合位点右臂通过OE-PCR方法拼接起来得到两端包含NotI酶切位点的片段；上述片段与经HindIII线性化的质粒pUC57-Kan-Simple连接得到整合质粒，即模块六。上述构建的模块整合质粒分别转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行单、双酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。

模块七的构建：将表达黄金仓鼠(Mesocricetus auratus)来源CYP17A1-POR的模块一(pIntD-Ma_CYP17-POR)、模块六、表达Vv_3β-HSD的模块三同时整合入ATCC201249，获得解脂酵母重组菌株SyBE_Yl2090007。

2、实验方法

种子培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；

生物转化培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉。

类固醇底物母液：3.5g/L(50％EtOH-Tween80)P5溶液。

4AD合成实验：将SyBE_Yl2090007分别接种于5mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养14～16h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.2分别接种于5mL生物转化培养基中，在28℃、220rpm培养24h，加入150μL P5底物母液继续孵育120h，取1mL样品按实例1中方法检测17OHP4含量。(17OHP4以P5标准曲线相对定量)

3、实验结果

菌株模块七的17OHP4合成量达3.90mg/L(图11)。在本实施例，本发明实现了以P5为底物定向合成17OHP4，并通过组合表达高效路径组分蛋白实现了催化效率提升。

实施例5：利用葡萄糖从头合成孕酮

1、底盘菌株的获得

由元英进课题组提供，高产菜油甾醇解脂耶氏酵母底盘菌株编号为SyBE_Yl2060077，野生型解脂耶氏酵母菌株编号为ATCC201249。SyBE_Yl2060077菌株在文献Pregnenolone Overproduction in Yarrowia lipolyticaby Integrative ComponentsPairing ofthe Cytochrome P450scc System中提及。

2、外源功能基因元件的获得

本发明涉及的基因CYP17A1(17-alpha-hydroxylase/17，20-lyase)、POR(NADPH-cytochrome P450 reductase)、3β-HSD(3β-hydroxysteroid dehydrogenase)、CYB5(细胞色素B5，Cytochrome b5)、mCYP11A1(成熟P450scc)来源见表4。

表4本发明涉及的基因来源

本发明所用的以上四个组分基因均为经过解脂耶氏酵母密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点后，在基因两端额外添加5’端gcggccgcggtctcca(如SEQ NO：1所示)；3’taaaggagaccgcggccgc(如SEQ NO：2所示)通过人工合成得到。

3、试验方法：

种子培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；

YPD发酵培养基：50g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉。

孕烯醇酮(P5)、菜油甾醇(Campsterol)定量方法：取1mL的发酵液，12000g离心2min收集菌体，并水洗两次。加入1mL 3mol/L盐酸重悬菌体，置于100℃沸水中煮沸5min，12000rpm离心1min收集细胞沉淀。用1mL蒸馏水洗细胞沉淀3次。向破碎的细胞沉淀中加入，420μL 2mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，在37℃恒温培养箱中反应2h。将皂化反应离心管取出，冷却至室温(25℃±5℃)后，加入等体积的正己烷，涡旋震荡10min，12000rpm离心1min，取上层正己烷相至新的离心管中。对下层用正己烷重复萃取一次，两次的正己烷相合并。将正己烷相用真空离心浓缩仪浓缩(样品溶剂为正己烷时：25℃，30min，7000rpm)，浓缩后管中剩余的固体则为甾体类物质，加入100μL MSTFA于37℃反应2h，加入100μL正己烷，过滤后于气相质谱检测。

孕酮、17-羟孕烯醇酮(17OHP5)、17-羟孕酮(17OHP4)、去氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮定量方法：取1mL的发酵液，加入玻璃珠和700μL乙酸乙酯振荡萃取10min，收集上层有机相并用新鲜乙酸乙酯重新萃取一次水相，两次萃取有机相合并，并用真空离心浓缩仪浓缩液体(样品溶剂为乙酸乙酯时：25℃，1200min，7000rpm)，浓缩后管中剩余的固体则为甾体类物质。孕酮(P4)、去氢表雄酮(DHEA)、雄烯二酮(4AD)、睾酮(TS)样品，加入100μL MSTFA于37℃反应2h，加入100μL正己烷并过滤后于气相质谱检测，17-羟孕烯醇酮、17-羟孕酮样品经200μL无水乙醇溶解过滤后于超高效液相色谱检测。

4、模块化整合质粒的构建

对于上游模块菌株构建；mCYP11A1于TEF1p启动子下表达，3β-HSD于EXP1p启动子下表达，二者同时整合至pBR322位点。对于下游模块菌株构建，CYP17A1、POR均于启动子TEF1inp下表达，整合于底盘菌株基因组IntD位点上。

模块A的构建：将IntD整合位点左臂、酿酒酵母GPM1t终止子通过OE-PCR方法拼接起来；将酿酒酵母FBA1t终止子40bp末端序列、两端带有LoxP位点的亮氨酸营养筛选标签Leu2、IntD整合位点右臂通过OE-PCR方法拼接起来得到两端包含NotI酶切位点的片段，分别命名为IntD-L和IntD-R；后将4种不同来源的人工合成的CYP17A1和POR分别与经BsmBI酶切后的表达模块TEF1inp-LIP2t-GPDt、GPDt-TEF1inp-OCT1t-FBA1t连接得到整合质粒，将带有相同物种来源的CYP17A1和POR模块与IntD-L、IntD、HincII酶切后的pUC18H通过Gibson组装，得到整合质粒，经过NotI酶切后获得模块A。模块B的构建：将IntB整合位点左臂、影响缺陷型尿嘧啶标签Ura3、IntB整合位点右臂、启动子TEF1in、终止子ACOt分别和3种来源的CYB5通过Gibson法拼接起来得到整合质粒，经过NotI酶切后获得模块B。模块C的构建：猪来源mCYP11A1分别整合于带有TEF1p启动子的表达盒中、6种不同来源得3β-HSD分别整合于带有EXP1p启动子的表达盒中，并将mCYP11A1表达盒分别6种不同3β-HSD表达盒通过Gibson组装入经SalI、ClaI酶切后的pINA1269整合质粒，最后经NotI酶切后将质粒线性化，得到模块C。上述构建的模块A～C整合质粒分别转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行单、双酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。

5、实验结果

上游模块：通过将6种不同模块C整合入酵母SyBE_Yl2060077中，得到上游模块SyBE_Yl2090018、SyBE_Yl2090006、SyBE_Yl2091025～SyBE_Yl2091028

首先本发明通过上游模块菌株单培养获得孕酮。将上游模块菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养14～16h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.1分别接种于50mLYPD发酵培养基中，于28℃、220rpm条件下培养，监测发酵过程中的菌体密度(OD₆₀₀)及孕酮产量。将带有Vaccinia virus来源、II型Homo sapiens来源和Bos taurus来源的上游模块菌株于含50g/L葡萄糖的YPD发酵培养基中，28℃ 220rpm培养8天，可分别获得孕酮产量9.56mg/L、9.12mg/L和5.53mg/L(图12)。在本实施例中各来源物种3β-HSD的孕酮从头合成能力与实施例1生物转化实验结果不完全一致，表明3β-HSD催化效率受到不同反应条件、宿主基因型影响。其中II型人源3β-HSD(Hs_3β-HSD)在从头合成和全细胞催化合成孕酮实验中表现催化优势。

实施例6：利用葡萄糖从头合成17-羟孕酮和17-羟孕烯醇酮

1、菌株的获得

模块A、模块B、SyBE_Yl2091025、SyBE_Yl2091006、SyBE_Yl2091016如实施例5所述。

2、实验方法

种子培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；

YPD发酵培养基：50g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉。

3、实验结果

本发明首先含有相同物种来源基因的模块A、模块B整合至野生型解脂耶氏酵母菌株ATCC201249中，获得菌株SyBE_Yl2091006(含Mesocricetus auratus基因)和SyBE_Yl2091016(含Ovis aries基因)作为下游模块菌株。将含有不同物种来源基因的实施例5所述的模块C分别整合至高产菜油甾醇解脂耶氏酵母底盘菌SyBE_Yl2060077中，获得菌株SyBE_Yl2091025～SyBE_Yl2091028、SyBE_Yl2090006和SyBE_Yl2090018，作为上游模块菌株。

本发明通过组合模块混菌发酵获得目标类固醇。将带有Bos taurus来源的上游模块菌株SyBE_Yl2091025、2个下游模块菌株SyBE_Yl2091006和SyBE_Yl2091016分别接种于5mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养14～16h。将菌株SyBE_Yl2091025分别与SyBE_Yl2091006和SyBE_Yl2091016以10:1的OD₆₀₀比例，以终OD₆₀₀＝0.1分别接种于50mLYPD发酵培养基中，于28℃、220rpm条件下培养8天，监测发酵过程中的菌体密度(OD₆₀₀)及类固醇产量。

在SyBE_Yl2091025-SyBE_Yl2091006混菌体系中，合成17-羟孕酮0.25mg/L，17-羟孕烯醇酮0.74mg/L，雄烯二酮产量为0.88mg/L。在SyBE_Yl2091025-SyBE_Yl2091016混菌体系中合成17-羟孕酮0.91mg/L，17-羟孕酮0.29mg/L，雄烯二酮产量为1.03mg/L(图13)。至此本发明实现了利用混菌系统从头合成17-羟孕烯醇和17-羟孕酮。混菌体系合成的Δ⁴甾体(P4，17OHP4，4AD)在总甾体产物中占比达56.5～83.1％。难以转化的中间产物17OHP5占比仅为甾体总量的12.2％～37.3％，远高于单菌系统中的17OHP5占比(90.4～99.1％)。这些结果表明，共培养体系设计通过迫使底物P5优先被3β-HSD利用，成功缓解3β-HSD与CYP17A1间底物竞争，使更多甾体通量用于△⁴-甾体合成。

实施例7：利用葡萄糖从头合成去氢表雄酮

1、菌株的获得

SyBE_Yl2091026、SyBE_Yl2091006如实施例5所述。

2、实验方法

种子培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；

YPD发酵培养基：50g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉。

3、实验结果

将上游模块菌株SyBE_Yl2091026、下游模块菌株SyBE_Yl2091006分别接种于5mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养14～16h。将菌株SyBE_Yl2091026与SyBE_Yl2091006以10:1的OD₆₀₀比例，以终OD₆₀₀＝0.1分别接种于50mLYPD发酵培养基中，于28℃、220rpm条件下培养8天，监测发酵过程中的菌体密度(OD₆₀₀)及类固醇产量。

在SyBE_Yl2091026-SyBE_Yl2091006混菌体系中，合成去氢表雄酮2.13mg/L(图14)。与实施例6中利用牛源3β-HSD表达工程菌作为上游模块，并倾向于4AD合成的混菌体系相比，当前混菌体系的甾体合成倾向于DHEA积累，证明不同3β-HSD来源菌株对系统甾体合成与代谢流走向影响较大。

实施例8：利用葡萄糖从头合成雄烯二酮和睾酮

1、实验材料的获得

野生型醇解脂耶氏酵母的获得、模块化整合质粒(模块A～C)的构建与外源功能基因元件的获得同实施例5中所述。

模块D的构建：将IntF整合位点左臂、HincII酶切后的pUC18H、两端带有LoxP位点的亮氨酸营养筛选标签Leu2、IntD整合位点右臂、实施例5带有相同物种来源(Ovis aries和Mesocricetus auratus)的CYP17A1和POR模块通过Gibson方法拼接起来得到两端包含NotI酶切位点的片段，经过NotI酶切后获得模块D。

SyBE_Yl2091030的获得同实施例3所述

17-羟化转化实验验证菌株的构建，将含有4种含有不同来源基因的模块A分别整合入ATCC201249中，获得菌株SyBE_Yl2091001～SyBE_Yl2091004。

17，20-裂解转化实验验证菌株的构建，将将含有3种含有不同来源基因的模块B分别整合入上述构建的菌株SyBE_Yl2091001～SyBE_Yl2091004中，获得菌株SyBE_Yl2091005～SyBE_Yl2091016.

2、实验方法

生物转化培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；

种子培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；

YPD发酵培养基：50g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉。

类固醇底物母液：1.75g/L(50％EtOH-Tween80)孕酮、1.75g/L(50％EtOH-Tween80)17-羟孕酮溶液

17-羟化转化实验：将SyBE_Yl2091001-SyBE_Yl2091004接种于5mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养14～16h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.1分别接种于5mL生物转化培养基中，在28℃、220rpm培养24h，加入150μL孕酮底物母液继续孵育16h，取1mL样品按实例1中方法检测17OHP4含量

17，20-裂解转化实验：将SyBE_Yl2091005-SyBE_Yl2091016接种于5mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养14～16h，以初始菌体浓度OD₆₀₀＝0.1分别接种于5mL生物转化培养基中，在28℃、220rpm培养24h，加入150μL 17-羟孕酮底物母液继续孵育120h，取1mL样品按实例1中方法检测雄烯二酮含量。

混菌合成雄烯二酮实验：将上游模块菌株SyBE_Yl2091025、两种下游模块菌株SyBE_Yl2091016、SyBE_Yl2091030分别接种于5mL种子培养基中，在30℃、220rpm培养14～16h。将上游模块菌株和两种下游模块菌株分别以10:1的OD₆₀₀比例，以终OD₆₀₀＝0.1分别接种于50mLYPD发酵培养基中，于28℃、220rpm条件下培养8天，测定类固醇产量。

3、实验结果

在生物转化实验中，含有Ovis aries来源CYP17A1的菌株表现出对孕酮最强的17-羟化能力。

由图15(左)可看出，Ec_CYP17A1和Xl_CYP17A1对P4的17α-羟基化催化活性较弱。Ma_CYP17A1、Oa_CYP17A1对P4的17α-羟基化活性较强。在测试的△^4，5型CYP17A1中Ma_CYP17A1对P4的17α-羟基化活性最强，但仅为△⁵型绵羊源CYP17A1相应活性的13.8％。

由图15(右)可看出，Ma_CYP17A1和Ec_CYP17A1在以17OHP4为底物时17，20-裂解活性最强。而Oa_CYP17A1对17OHP4的17，20-裂解活性依赖于CYB5来源选择。其中Oa_CYB5和Ec_CYB5与上述三种来源CYP17A1匹配时，可使CYP17A1表现较强17，20-裂解活性。

由图16可知，17，20-裂解转化实验中，在当前的CYP17A1-CYB5组合中Equuscaballus来源的CYP17A1和CYB5表现了普适17，20-裂解能力。因此在下游菌株的重新构建中，利用Cre-loxp的方法，移除SyBE_Yl2091004的Leu2标签，并引入带有Equus caballus来源基因的模块二和模块四，获得菌株SyBE_Yl2091030。在

SyBE_Yl2091025-SyBE_Yl2091030混菌发酵实验中，雄烯二酮为主要产物，获得雄烯二酮5.02mg/L，睾酮1.09mg/L。在SyBE_Yl2091025-SyBE_Yl2091030混菌发酵实验中雄烯二酮较优化前的共培养体系提高3.9倍。上述结果表明通过引入强17，20-裂解能力的Equuscaballus来源的Ec_CYP17A1，强17α-羟基化能力的绵羊源Oa_CYP17A1，以及可同时促进Ec_CYP17A1和Oa_CYP17A1的17，20-裂解能力的马源Ec_CYB5，可有效提升下游路径的底物转化效率有效拉动甾体中间体向4AD转化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.表达如下任意项在合成甾体类化合物和/或甾体激素药物中的应用：

(I)、来源于Equus caballus、Ovis aries、Mesocricetus auratus或Xenopus laevis的CYP17A1和POR；和/或

(III)、来源于Mus musculus、Bos taurus、Vaccinia virus、Arabidopsis thaliana、Mycobacterium tuberculosis、Homo sapiens(I型)、Homo sapiens(II型)、Homo sapiens(I型，L237S突变)或Homo sapiens(II型，L236S突变)的3β-HSD；和/或(IV)、来源于Susscrofa的mCYP11A1。

2.模块，其特征在于，包括表达如下任意项：

(II)、来源于Equus caballus、Ovis aries或Mesocricetus auratus或Sus scrofa的CYB5；和/或

(III)、来源于Mus musculus、Bos taurus、Vaccinia virus、Arabidopsis thaliana、Mycobacterium tuberculosis、Homo sapiens(I型)、Homo sapiens(II型)、Homo sapiens(I型，L237S突变)或Homo sapiens(II型，L236S突变)的3β-HSD；和/或

(IV)、来源于Sus scrofa的mCYP11A1。

3.质粒，其特征在于，包括如权利要求2所述的表达元件。

4.宿主，其特征在于，包括如权利要求3所述的质粒。

5.如权利要求4所述的宿主，其特征在于，包括模块一、模块二、模块三、模块四、模块五、模块六、模块七、模块A、模块B、模块C或模块D中的一种或多种：

所述模块三包括来源于Mus musculus、Bos taurus、Vaccinia virus、Arabidopsisthaliana、Mycobacterium tuberculosis、Homo sapiens(I型)、Homo sapiens(II型)、Homosapiens(I型，L237S突变)或Homo sapiens(II型，L236S突变)的3β-HSD；所述模块三连接的载体包括pINA1269-Nat；和/或

所述模块C包括：来源于Mus musculus、Bos taurus、Vaccinia virus、Arabidopsisthaliana、Mycobacterium tuberculosis或Homo sapiens(II型)的3β-HSD和来源于Susscrofa的mCYP11A1；所述模块C连接的载体包括pINA1269；和/或

6.如下任意项在合成甾体类化合物和/或甾体激素药物中的应用：

(I)、如权利要求2所述的表达元件；和/或

(II)、如权利要求3所述的质粒；和/或

(III)、如权利要求4或5所述的宿主。

7.药物，其特征在于，包括如下任意项以及药学上可接受的辅料或助剂：

(I)、如权利要求2所述的表达元件；和/或

(II)、如权利要求3所述的质粒；和/或

(III)、如权利要求4或5所述的宿主。

8.药物组合，其特征在于，包括如权利要求7所述的药物以及其他任意有效成分。

9.合成甾体类化合物和/或甾体激素药物的方法，其特征在于，包括取如权利要求4或5所述的宿主，培养，收集培养物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，包括：

(IⅩ)、以17OHP5为底物合成17OHP4；和/或

(Ⅹ)、以17OHP5为底物合成DHEA；和/或

(ⅩⅠ)、以DHEA为底物合成4AD和TS；和/或

(ⅩII)、以17OHP4合成4AD和TS。