JP7443658B2 - C-8ステロール異性化の最適化 - Google Patents
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Description
(1)C8-ステロールイソメラーゼ活性を有する酵素を含む、本明細書で定義されるコレステロール産生酵母細胞であって、ステロールの総量に基づいて少なくとも約80%の7-デヒドロコレステロール(7-DHC)を含み、好ましくは少なくとも約82、85、88、90、92、95、97、98又は100%までの7-DHCを含むステロールミックスを産生するコレステロール産生酵母細胞。
(2)コレスタ-8-エノールに対する7-DHCの比は、20の範囲である、本明細書で定義され且つ(1)によるコレステロール産生酵母細胞。
(3)コレスタ-8-エノールに対する7-DHCの比は、少なくとも2倍だけ増加される、本明細書で定義され且つ(1)によるコレステロール産生酵母細胞。
(4)配列番号6によるポリペプチドと少なくとも42%、例えば少なくとも43、44、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、75、80、90、92、95、98又は100%までなどの同一性を有する、C8-ステロールイソメラーゼ活性を有する異種酵素を発現する、本明細書で定義されるか又は(1)、(2)、(3)によるコレステロール産生酵母細胞。
(5)C8-ステロールイソメラーゼ活性を有する異種酵素を発現し、前記酵素は、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)などのサッカロミセス属(Saccharomyces)、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)などのヤロウイア属(Yarrowia)、K.ラクティス(K.lactis)などのクルイベロミセス属(Klyveromyces)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などのシゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、P.パストリス(P.pastoris)などのピキア属(Pichia)、C.アルビカンス(C.albicans)などのカンジダ属(Candida)、P.ロックフォルティ(P.roqueforti)などのペニシリウム属(Penicillium)、A.ニデュランス(A.nidulans)などのアスペルギルス属(Aspergillus)、C.ネオフォルマンス(C.neoformans)などのクリプトコックス属(Cryptococcus)、イネいもち病菌(Magneporte oryzae)などのマグネポルテ(Magneporte)、メタリジウム・アクリダム(Metarhizium acridum)などのメタリジウム属(Metarhizium)及びトウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)などの黒穂菌属(Ustilago)からなる群から選択される、本明細書で定義され且つ(4)によるコレステロール産生酵母細胞。
(6)ERG5及びERG6は、不活化されている、本明細書で定義され且つ(1)、(2)、(3)、(4)、(5)によるコレステロール産生酵母細胞。
(7)ステロールΔ24-レダクターゼ活性を有するEC1.3.1.72から選択される異種酵素を発現し、好ましくは、その異種酵素は、植物又は脊椎動物に由来し、より好ましくはヒト、ブタ、イヌ、マウス、ラット、ウマ又はゼブラフィッシュ(Danio rerio)に由来する、本明細書で定義され且つ(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)よるコレステロール産生酵母細胞。
(8)C5-デサチュラーゼ活性を有する異種酵素を発現し、好ましくは、異種酵素は、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)から、より好ましくは配列番号14と少なくとも45%、例えば少なくとも50、52、60、70、80、90、92、95、98又は100%までなどの同一性を有するポリペプチドから入手可能である、本明細書で定義されるか又は(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)よるコレステロール産生酵母細胞。
9.ステロールを生成するための、好ましくはビタミンD3前駆物質を生成するための、より好ましくは7-DHCを生成するための、本明細書で定義され且つ(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)よるコレステロール産生酵母細胞の使用。
(10)7-DHCは、ビタミンD3に更に変換される、本明細書で定義されるか又は(9)よるコレステロール産生酵母細胞の使用。
(11)7-DHCは、25-ヒドロキシビタミンD3に更に変換される、本明細書で定義され且つ(9)、(10)よる使用。
(12)酵母細胞によって産生されるステロールミックス中のコレスタ-8-エノールの量を低減するプロセスであって、C8-ステロールイソメラーゼ活性を有する異種酵素を発現する工程を含み、前記酵素は、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)などのサッカロミセス属(Saccharomyces)、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)などのヤロウイア属(Yarrowia)、K.ラクティス(K.lactis)などのクルイベロミセス属(Klyveromyces)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などのシゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、P.パストリス(P.pastoris)などのピキア属(Pichia)、C.アルビカンス(C.albicans)などのカンジダ属(Candida)、P.ロックフォルティ(P.roqueforti)などのペニシリウム属(Penicillium)、A.ニデュランス(A.nidulans)などのアスペルギルス属(Aspergillus)、C.ネオフォルマンス(C.neoformans)などのクリプトコックス属(Cryptococcus)、イネいもち病菌(Magneporte oryzae)などのマグネポルテ(Magneporte)、メタリジウム・アクリダム(Metarhizium acridum)などのメタリジウム属(Metarhizium)及びトウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)などの黒穂菌属(Ustilago)からなる群から選択され、好ましくはトウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)又はサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)から選択される、プロセス。
(13)酵母細胞において、ステロールミックス、好ましくはビタミンD3前駆物質、より好ましくは少なくとも80%の7-DHCを有するステロールミックスを生成するプロセスであって、
(a)ERG5及びERG6を不活化する工程、
(b)コレスタ-7,24-ジエノール、チモステロール又はトリエノールに対してステロールΔ24-レダクターゼ活性を有するEC1.3.1.72から選択される異種酵素、好ましくは植物又は脊椎動物ステロールΔ24-レダクターゼ、より好ましくは脊椎動物ステロールΔ24-レダクターゼを発現する工程、
(c)C8-ステロールイソメラーゼ活性を有する異種酵素を発現する工程であって、前記酵素は、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)などのサッカロミセス属(Saccharomyces)、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)などのヤロウイア属(Yarrowia)、K.ラクティス(K.lactis)などのクルイベロミセス属(Klyveromyces)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などのシゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、P.パストリス(P.pastoris)などのピキア属(Pichia)、C.アルビカンス(C.albicans)などのカンジダ属(Candida)、P.ロックフォルティ(P.roqueforti)などのペニシリウム属(Penicillium)、A.ニデュランス(A.nidulans)などのアスペルギルス属(Aspergillus)、C.ネオフォルマンス(C.neoformans)などのクリプトコックス属(Cryptococcus)、イネいもち病菌(Magneporte oryzae)などのマグネポルテ(Magneporte)、メタリジウム・アクリダム(Metarhizium acridum)などのメタリジウム属(Metarhizium)及びトウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)などの黒穂菌属(Ustilago)からなる群から選択され、好ましくはトウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)又はサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)から選択される、工程、
(d)ステロール産生に適切な条件下で前記酵母細胞を培養する工程であって、ステロールミックス中に存在するコレスタ-8-エノールに対する7-DHCの比は、8.7を超える、工程
を含むプロセス。
[実施例1:一般的方法、株及びプラスミド]
本明細書に記載のすべての基礎的分子生物学及びDNA操作手順は、一般に、Sambrookら(1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York)又はAusubelら(1998.Current Protocols in Molecular Biology.Wiley:New York)に準拠して実施した。使用されたS.セレビジエ(S.cerevisiae)株及びプラスミドの遺伝子型を表1及び2に示す。実施例4に記載のように、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)7-DHC産生酵母株Y2159を作製した。示されるすべての株は、MATαである。
すべてのERG2カセットを以下のように作製した。オープンリーディングフレームを推定アミノ酸配列に基づいてコドン最適化し、5’-XbaI(TCTAGAACAAAatg...)部位及び3’-PstI部位を用いて合成した。XbaI-PstI-消化ERG2断片をXbaI-PstI-消化pMB7621に挿入することにより、これらをクローン化し、それによりSRP40遺伝子及びPTR2遺伝子間の染色体XI上の遺伝子間遺伝子座INT59に標的化することが可能となる(およその位置615,000)。
株を以下のように培養した。試験される株を最初にYPD寒天上にプレーティングし、30℃において48時間インキュベートした。YPD前培養物2mLをこれらのプレートから接種し、30℃において24時間ローラーホイール上で増殖させた。24穴マイクロタイタープレートにおいて、前培養物からYPD0.8mL+エタノール10g/Lを最終OD6000.5に接種した。マイクロタイタープレートを加湿環境内で30℃において増殖し、軌道3mmの振盪機で800rpmにおいて振盪した。接種から24及び48時間後、エタノール16μlをそれぞれのウェルにフィードとして添加した。接種から72時間後、ステロール含有量に関して細胞をサンプリングした。
XbaI部位を5’末端に(TCTAGAACAAAatg...)、PstI部位を3’末端に組み込んで、野生型S.セレビジエ(S.cerevisiae)ARE1をDNA2.0によって合成した。固有のXbaI及びPstI部位を用いて、erg4Δ::HygR欠失プラスミドにこれをクローニングした。続いて、LEU2を使用して、KpnI-AgeIクローニングによってHygR部位を置換した。その結果がプラスミドpHyD459であった。
Claims (15)
- C8-ステロールイソメラーゼ活性を有する異種酵素を含み及び発現する、コレステロール産生酵母細胞であって、少なくとも80%の7-デヒドロコレステロール(7-DHC)を含むステロールミックスを産生し、
前記酵素は、配列番号6によるポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有する、
コレステロール産生酵母細胞。 - コレスタ-8-エノールに対する7-DHCの比は、20の範囲である、請求項1に記載のコレステロール産生酵母細胞。
- コレスタ-8-エノールに対する7-DHCの比は、少なくとも2倍だけ増加される、請求項1に記載のコレステロール産生酵母細胞。
- C8-ステロールイソメラーゼ活性を有する異種酵素を発現し、前記酵素は、トウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)に由来する、請求項1~3のいずれか一項に記載のコレステロール産生酵母細胞。
- ERG5及びERG6は、不活化されている、請求項1~4のいずれか一項に記載のコレステロール産生酵母細胞。
- ステロールΔ24-レダクターゼ活性を有するEC1.3.1.72から選択される異種酵素を発現する、請求項1~5のいずれか一項に記載のコレステロール産生酵母細胞。
- C5-デサチュラーゼ活性を有する異種酵素を発現する、請求項1~6のいずれか一項に記載のコレステロール産生酵母細胞。
- ステロールを生成するための、請求項1~7のいずれか一項に記載のコレステロール産生酵母細胞の使用。
- 前記7-DHCは、ビタミンD3に更に変換される、請求項8に記載のコレステロール産生酵母細胞の使用。
- 前記7-DHCは、25-ヒドロキシビタミンD3に更に変換される、請求項8又は9に記載の使用。
- 酵母細胞によって産生されるステロールミックス中のコレスタ-8-エノールの量を低減するプロセスであって、コレステロール産生酵母細胞においてC8-ステロールイソメラーゼ活性を有する異種酵素を発現する工程を含み、前記酵素は、配列番号6によるポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有する、プロセス。
- 前記酵素が、トウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)に由来する、請求項11に記載のプロセス。
- 酵母細胞において、ステロールミックスを生成するプロセスであって、
(a)ERG5及びERG6を不活化する工程、
(b)コレスタ-7,24-ジエノール、チモステロール又はトリエノールに対するステロールΔ24-レダクターゼ活性を有するEC1.3.1.72から選択される異種酵素を発現する工程、
(c)C8-ステロールイソメラーゼ活性を有する異種酵素を発現する工程であって、前記酵素は、配列番号6によるポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有する、工程、
(d)ステロール産生に適切な条件下で前記酵母細胞を培養する工程であって、ステロールミックス中に存在するコレスタ-8-エノールに対する7-DHCの比は、8.7を超える、工程
を含むプロセス。 - 前記C8-ステロールイソメラーゼ活性を有する異種酵素が、トウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)に由来する、請求項13に記載のプロセス。
- 前記ステロールΔ24-レダクターゼ活性を有するEC1.3.1.72から選択される異種酵素が、植物又は脊椎動物ステロールΔ24-レダクターゼである、請求項13又は14に記載のプロセス。
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